一、腺相关病毒载体应用的研究进展（论文文献综述）
张浩[1]（2021）在《肝调畅情志功能失常病变机制探索 ——从ALLO介导海马脑区GABAAR δ亚基探查PMDD肝气郁证发病及药物干预机制》文中研究说明目的:肝主疏泄理论,自提出至今,一直是藏象学说的关键组成部分,对藏象学的发展与完善、疾病的预防与治疗发挥了至关重要的价值。随着技术手段的革新和研究的不断深入,肝主疏泄理论被不断地丰富完善,推动着该理论由现象描述迈向本质阐明。本研究系统梳理肝主疏泄的理论及该理论指导下的相关实验研究,在课题组前期深厚工作基础上,着眼经前烦躁障碍症（Premenstrual Dysphoric Disorder,PMDD）发展国际前沿:PMDD发病由“ALLO介导的GABAAR变化”的认识含混问题,从病证结合角度,探索肝疏泄失常所致PMDD肝气郁证发病及病变机制,揭示“ALLO介导的GABAAR变化”在PMDD肝气郁证脑中枢病变中的可能机制,促进肝主疏泄与疏泄失常理论“从现象描述迈向本质阐明”,揭示肝主疏泄科学内涵,并充分验证中药复方舒郁胶囊的有效性与科学性,为开发针对性治疗药物、丰富中医理论的现代科学内涵提供有价值线索。真正解决PMDD国际一线治疗药物应答率<60%,精神性副作用大,起效慢,部分患者会产生耐药性的问题。方法:理论梳理与实验研究相结合:一方面,系统梳理中国知网收录的“肝主疏泄与疏泄失常理论”及PMDD病证研究相关文献,发现待解决的关键科学问题;另一方面,紧扣上述问题并结合PMDD临床发现,采用改良强迫游泳实验制备肝疏泄失常所致PMDD肝气郁证大鼠模型;通过强迫游泳实验悬浮不动潜伏期、时间和次数,高架十字迷宫实验开放臂进入次数和时间百分比,光热甩尾实验潜伏期,作为PMDD肝气郁证模型大鼠抑郁样情绪评判主要依据;采用ELISA、RT-q PCR、Western-Blot等分子生物学技术探查模型大鼠外周血及海马脑区ALLO水平及其介导GABAARδ亚基的表达;腺相关病毒载体注射使GABAARδ亚基低表达或过表达,反证上述发现,并以舒郁胶囊干预来揭示ALLO介导GABAAR的深层病理及神经生物学关键机制。（1）采用改良强迫游泳应激,制备有效的PMDD肝气郁证大鼠模型;予以氟西汀和舒郁胶囊干预,考察模型大鼠病证行为表征改善情况,验证该模型的可靠性和药物的有效性。（2）采用ELISA检测各组大鼠血清及海马脑区孕酮、5α二氢皮质酮、四氢孕酮、5α还原酶、3α-类固醇脱氢酶等微观指标的变化,考察孕酮代谢为四氢孕酮过程中的相关激素含量及关键酶含量变化,以此探讨舒郁胶囊干预PMDD肝气郁证过程的关键微观机制。（3）基于上述激素代谢通路变化结果,为了验证其下游作用靶点,采用RT-q PCR、Western-Blot、免疫组化方法检测GABAARδ亚基。并分别采用脑立体定位技术在PMDD肝气郁证模型大鼠海马脑区内定向注射GABAARδ亚基的低表达腺相关病毒载体及过表达腺相关病毒载体,通过系列行为学考察模型大鼠病证行为表征改善情况,并检测GABAARδ亚基干扰敲减腺相关病毒载体及过表达载体腺相关病毒载体注射后各组大鼠海马脑区GABAARδ亚基的基因和蛋白表达,为药物的作用靶点提供辅助证据。（4）通过舒郁胶囊对GABAARδ亚基腺相关病毒载体注射后各组大鼠进行药物干预,并进行系列行为学评估,并采用RT-q PCR、Western-Blot、免疫组化方法检测GABAARδ亚基,精准锁定舒郁胶囊的治疗靶点。结果:（1）动物行为检测结果显示:强迫游泳实验表明模型组大鼠非接受期悬浮不动时间、悬浮不动次数较接受期显着增加（p<0.001,p<0.001）,悬浮不动潜伏期较接受期显着减少（p<0.001）;高架十字迷宫实验表明模型组大鼠非接受期开放臂时间百分比和开放臂进入次数百分比较接受期显着降低（p<0.001,p<0.001）;光热甩尾实验表明模型组大鼠非接受期甩尾潜伏期明显缩短（p<0.001）。予以阳性对照药氟西汀和中药舒郁胶囊干预后,上述异常变化均得到有效缓解消失（p>0.05）,提示应激组大鼠上述行为参数有典型的动情周期依赖性改变,而应用氟西汀和舒郁胶囊可有效改善此症状。（2）ELISA生化检测结果显示:大鼠血清和海马脑区各组间孕酮、5α二氢皮质酮、四氢孕酮、5α还原酶、3α-类固醇脱氢酶等指标存在明显差异,模型组5α二氢皮质酮、ALLO、5α还原酶、3α-类固醇脱氢酶指标均较对照组显着性降低（血清:p<0.05,p<0.01;海马:p<0.05,p<0.05,p<0.0001,p<0.05）,氟西汀和舒郁胶囊给药后上述变化消失（p>0.05）;孕酮在血清及海马脑区中的含量结果表明,模型组较正常组显着增多（p<0.01,p<0.05）,氟西汀和舒郁胶囊给药后有效改善了上述变化。（3）RT-qPCR、Western Blot、免疫组化结果显示:对照组大鼠和模型组大鼠之间海马脑区GABAARδ表达量未见明显差异（p>0.05）;在对照组及模型组大鼠注射R＿Gabrd干扰腺相关病毒载体后海马脑区GABAARδ亚基表达量明显减少（p<0.0001）,注射R＿Gabrd基因过表达AAV9病毒载体后海马脑区GABAARδ亚基表达量明显增多（p<0.0001）。病毒载体表达后,GABAARδ表达量的调减会诱发正常大鼠PMDD肝气郁证行为表型,表现为非接受期强迫游泳实验悬浮不动时间、悬浮不动次数较接受期显着增加（p<0.01,p<0.01）,悬浮不动潜伏期较接受期显着减少（p<0.001）。GABAARδ表达量调增对PMDD肝气郁发病无影响。（4）在GABAARδ表达量调减的模型大鼠中给予中药舒郁胶囊干预,强迫游泳实验悬浮不动时间和悬浮不动次数及悬浮不动潜伏期、高架十字迷宫实验大鼠进入开放臂的时间和次数百分比、光热甩尾实验甩尾潜伏期等各项行为学指标均无明显改善效果（p>0.05,p>0.05,p>0.05）,对GABAARδ亚基表达量亦无明显改善效果。结论:（1）肝调畅情志失常所致PMDD肝气郁证深层发病机制之一是:5α还原酶、3α-类固醇脱氢酶含量发生改变,导致孕酮到四氢孕酮代谢途径异常。中药舒郁胶囊干预可以通过提高该途径中酶含量,从而改善PMDD肝气郁证大鼠异常行为症状。（2）中药组方新药舒郁胶囊治疗肝调畅情志失常所致PMDD肝气郁证作用的关键靶点之一是GABAARδ亚基,提示该药物可能通过调控四氢孕酮代谢途径,从而靶向GABAARδ亚基来发挥治疗效果。（3）“舒郁胶囊治疗作用”的可能假说:中药复方舒郁胶囊有效成分提取物或配伍组合,含有的雌孕激素及其衍生物,与内源性雌激素结构和功能类似,可调节雌孕激素含量,亦或是产生酶功能物质,改善了四氢孕酮代谢水平,使得孕酮到四氢孕酮代谢途径增强,从而对PMDD肝气郁证产生治疗作用。综上:海马脑区是肝调畅情志失常所致PMDD肝气郁证患者发病关键脑区,患者经前ALLO及其代谢通路异常变化是其深层发病机制,GABAARδ亚基是肝调畅情志功能失常的靶标。舒郁胶囊通过提高5α还原酶、3α-类固醇脱氢酶含量改善PMDD肝气郁证患者临床症状。
常宇鑫[2]（2021）在《AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建》文中进行了进一步梳理研究背景肢体痉挛是脊髓损伤（SCI）后的最常见的并发症之一,据报道,12%～37%的急性脊髓损伤患者患有肌肉痉挛,而这一比例在慢性脊髓损伤患者中高达65%～78%。尽管严重的痉挛极大地影响了患者的生活质量和脊髓损伤后的恢复,但目前临床上对痉挛的治疗方式仍局限于对症处理。因此,开发一种新的抗痉挛疗法和康复模式,对于脊髓损伤患者的功能恢复和生活质量的提高至关重要。神经营养因子3（NT3）不仅能够降低运动神经元的兴奋性,而且是感觉神经元和运动神经元生存所必需的神经营养因子。研究表明,来自周围肌肉传入信号的输入对于恢复运动功能和重建脊髓损伤段的神经回路至关重要,而这可能是因为周围的肌肉纺锤体合成了NT3。同时,NT3在肌肉中的过度表达会重新平衡兴奋性和抑制性的输入。然而其能否使脊髓损伤后大鼠的脊髓反射正常化尚未得到证实。此外,运动被认为是临床上最简单,最安全,最有效的治疗方法,它能通过平衡感觉的输入和运动的输出来改善运动功能,从而改善患者的生活质量。同时强化训练可使脊髓的本体感受反射正常化。单一的治疗方法可能可以改善某种特定的功能,却无法做到面面俱到,而基于个体化医疗的某些疗法的组合,将预计取得更好的疗效。以病毒为载体的基因治疗能够将治疗基因特异性地输送到病变部位,使其在局部或全身长期稳定的表达,因此目前被广泛应用于中枢系统疾病的诊疗中。其中,腺相关病毒由于其安全、高效的优势被认为是最有希望的基因治疗载体。在众多血清型的AAV载体中,AAV9型腺相关病毒被认为是AAV载体中治疗中枢系统疾病的“标准”载体,但是由于AAV9型腺相关病毒载体穿过血脑屏障的效率仍未能达到预期,导致其治疗中枢系统疾病的效果欠佳。提高病毒的使用剂量或者调整给药途径例如鞘内给药是人们解决上述问题的两种尝试,但是前者会导致体内其他外周器官过大的暴露而产生毒性反应,而后者增加了显着的并发症风险。于是人们将目光聚集到了另外一种可能性的方式——通过对AAV载体的衣壳结构蛋白进行改造,从而改变其转染效率。研究目的构建编码人NT3的重组腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）,探究编码人NT3的重组腺相关病毒（AAV-NT3）与运动干预相结合的联合疗法对脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用,并探究这种联合疗法减轻痉挛的作用机制,为临床工作中脊髓损伤后肌肉痉挛的防治提供理论基础。此外,构建具有更高传递效率的重组AAV,并探究不同的给药途径其对大脑、脊髓等中枢神经系统的传递效率及对外周组织器官的毒性,为基因治疗在中枢神经系统疾病中的应用起到指导和借鉴意义。研究方法1.编码人NT3的腺相关病毒的构建与验证:将绿色荧光蛋白（f-GFP）、神经营养因子3（NT3）及辅助质粒插入到由人类CMV启动子驱动的AAV载体中,然后通过HEK293细胞包装生产重组AAV。使用Western Blot法检测病毒注射后大鼠后肢肌肉与脊髓背根神经节中NT3蛋白表达的变化。2.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用:通过游泳测试及大鼠后肢肌肉的H反射评价大鼠的痉挛频率,并通过BBB评分评价大鼠的后肢运动功能。3.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究:运用免疫荧光染色法探究脊髓运动神经元和中间神经元的可塑性变化,并运用Western Blot法检测重组氯化钾协同转运蛋白2（KCC2转运体）的表达。4.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建:将多肽序列插入AAV载体的衣壳蛋白基因组进行改造,生产出多种不同的腺相关病毒基因载体,并通过小鼠尾静脉注射和血脑屏障3D体外模型进行筛选。5.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率:通过静脉注射和侧脑室注射两种主流的中枢神经系统给药途径,探究AAV-CPP.16是否可以在脊髓中高效、稳定地表达,以及其对外周器官的暴露毒性。结果1.成功构建了NT3重组腺相关病毒,并将其成功转染至大鼠体内;相比于对照组与AAV-GFP组,后肢肌肉注射了AAV-NT3的大鼠,其后肢肌肉与脊髓背根神经节（DRG）中NT3的表达水平显着增加。2.游泳测试及H反射的RDD显示AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能降低肌肉痉挛的发生频率,但是只有AAV-NT3和联合治疗可以增加后肢BBB评分。3.联合疗法可以明显增加脊髓运动神经元的数量和面积,但是单独的AAVNT3基因疗法不具有此作用;联合治疗可以显着增加脊髓胆碱能中间神经元的面积与GABA能中间神经元的数量;AAV-NT3的基因疗法与联合治疗组脊髓中KCC2的表达显着增加。4.相比于对照组wt AAV9,注射了AAV-CPP.16的小鼠大脑内RFP阳性细胞百分比显着提高,同时在血脑屏障3D体外模型中表达的荧光强度明显增加。5.经静脉及侧脑室给药后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓中绿色荧光蛋白的表达量提高,并且有更高比例的运动神经元与GFP标记的细胞相重合。6.经静脉注射后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓DRG及除肝脏和心脏外的外周组织器官中GFP阳性细胞的比例显着增高;经侧脑室注射后,AAV9与AAV-.CPP.16在外周组织器官中几乎不表达GFP蛋白。结论1.AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能减轻损伤后的肌肉痉挛;与单纯的基因治疗或运动干预相比,联合治疗有一定的疗效趋势,但差异并不显着。2.AAV-NT3的基因疗法对运动神经元的作用效果有限,而单纯的运动干预无法改善后肢的运动功能。二者的联合治疗不仅可以通过改变脊髓运动神经元、中间神经元的兴奋性以及增加脊髓内KCC2的含量来减轻脊髓损伤后的肌肉痉挛,也可以显着改善后肢的运动功能。3.相比于wt AAV9,AAV-CPP.16在多种品系小鼠及食蟹猴体内均具有更高的血脑屏障穿透效率和大脑细胞转染效率,并且随着病毒剂量的提升,其效率也随之显着提升。4.经静脉内或侧脑室给药后,相对于AAV9,AAV-CPP.16将基因传递给成年小鼠脊髓及运动神经元的效率均显着提高。5.静脉注射AAV-CPP.16不会带来明显的DRG与肝脏毒性,但是会引起外周组织的大量暴露;而在侧脑室给药途径下,极高传递效率的AAV-CPP.16不会造成明显的DGR毒性,其对外周组织也几乎不具有暴露毒性。
鲁愿[3]（2021）在《卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探》文中研究指明肿瘤是威胁宠物生命健康的最主要病因之一,而宠物自发肿瘤与人类肿瘤发生、发展的机制相对保守,所以参照人类肿瘤的研究方法,开发宠物肿瘤治疗方法是非常必要的。以PD-1/PD-L1阻断为代表的免疫检查点阻断疗法已在临床肿瘤治疗中取得了喜人的进展,但也存在患者响应率低的应用局限。这可能与肿瘤所处的免疫抑制微环境有关。所以靶向肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,简称TME）,可能是突破免疫检查点阻断疗法应用局限的一种有效手段。卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,简称BCG）和细胞焦亡,均已被证明可在肿瘤部位激起强烈的抗肿瘤免疫反应,是很好的重塑TME免疫状态的工具。目前BCG仅在临床非肌层浸润性膀胱癌的治疗中得到应用,而在其他肿瘤类型,例如三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,简称TNBC）中的应用和研究相对较少。此外,诱发焦亡的gasdermin蛋白家族N端结构域(the N-terminal gasdermin domain,GSDMNT)具有很强的细胞毒性,常规的基因递送载体包装策略无法避免包装时GSDMNT的表达,因此很难获得携带GSDMNT的重组载体,所以目前缺乏将GSDMNT安全有效递送至肿瘤细胞的方法。本研究以BCG及焦亡为手段,构建了利用BCG或焦亡激活TME内抗肿瘤免疫的溶瘤策略,研究了BCG或焦亡对动物肿瘤模型的溶瘤机制,探索了PD-L1阻断剂与BCG或焦亡联合使用对TNBC小鼠模型的疗效,并进一步在宠物肿瘤临床治疗应用中进行了初步探索。本研究主要取得了以下结果:1利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫1)在TNBC小鼠模型中证实,单倍剂量BCG治疗能够上调肿瘤中趋化因子相关基因和抗肿瘤效应基因的表达,下调免疫抑制相关基因的表达,增加肿瘤浸润淋巴细胞数量,重塑TME免疫抑制状态;三倍剂量BCG治疗可以显着抑制肿瘤生长,但也存在小鼠体重下降的不良反应。2)利用Bulk RNA-seq和q RT-PCR证实,单倍剂量BCG治疗可以上调TNBC小鼠模型肿瘤中免疫筛查位点PD-1和PD-L1的表达;在此基础上开发了单倍剂量BCG联合PD-L1抑制剂的溶瘤方案,并在TNBC小鼠模型中证实该联合治疗方案具有显着溶瘤效果且没有体重下降的不良反应。2构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫1)筛选出一个在昆虫Sf9细胞中不表达的哺乳动物启动子m CBA,证实了以m CBA启动子驱动GSDMNT可以避免昆虫Sf9细胞的焦亡;由此开发了利用哺乳动物启动子m CBA和杆状病毒/昆虫Sf9细胞包装表达焦亡蛋白重组腺相关病毒载体的策略,并获得了可以介导肿瘤细胞焦亡的溶瘤腺相关病毒载体P1（Oncolytic AAV P1,简称o AAV-P1）。2)证实将GSDMNT基因序列翻转并在两侧加上两对反向lox P序列可避免HEK293T细胞的焦亡,加入Cre重组酶则又可恢复GSDMNT的表达从而介导焦亡,由此开发了利用Cre重组酶和三质粒/HEK 293T细胞包装表达焦亡蛋白重组腺相关病毒载体的策略,并获得了可以介导肿瘤细胞焦亡的溶瘤腺相关病毒载体P2（Oncolytic AAV P2,简称o AAV-P2）。3)在肿瘤细胞及多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,简称GBM）大鼠模型中证实了o AAV-P2相对o AAV-P1有更好、更快的溶瘤效果,并证实此种差异与昆虫Sf9细胞包装的AAV感染性弱及m CBA启动子活性相对弱均有关。4)在GBM大鼠模型中证实,o AAV-P2介导的焦亡可以暂时性打开血脑屏障,破坏GBM的TME,招募淋巴细胞杀伤肿瘤,延长GBM大鼠模型的生存期;在TNBC小鼠模型中证实,o AAV-P2治疗可以上调肿瘤中趋化因子相关基因和抗肿瘤效应基因的表达,下调免疫抑制相关基因的表达,增加肿瘤内淋巴细胞浸润,改变TME免疫抑制状态。5)通过对TNBC小鼠模型肿瘤Bulk RNA-seq分析,发现o AAV-P2治疗可以增加肿瘤内免疫筛查位点PD-L1和PD-L2的表达,由此开发了o AAV-P2联合PD-L1阻断剂的溶瘤方案,并在TNBC小鼠模型进行了验证,证实了该联合方案具有很好的肿瘤治疗效果,可显着抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长。本研究以TME为靶点,开发了BCG联合PD-L1阻断剂的溶瘤方案,该方案可有效治疗TNBC,为宠物临床发病率较高的乳腺癌提供了有效治疗方案;同时本研究构建了两种表达焦亡蛋白重组腺相关病毒的包装策略,获得了具有溶瘤效果的o AAV-P1和o AAV-P2;且这两种包装策略具有良好的扩展性和安全性,也可用于其他毒性蛋白的重组腺相关病毒载体的包装,为靶向TME的宠物肿瘤治疗提供了更多的备选工具。
路艳杰[4]（2021）在《锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究》文中进行了进一步梳理聚乙烯亚胺（PEI）是一类应用广泛的非病毒基因载体,其表面带有许多在生理条件pH环境下可发生质子化的氨基,使其具有较好的细胞摄取能力和内小体逃逸能力。但未经过改性的PEI正电荷密度会随着分子量增大而增多,从而导致细胞毒性增大、血液相容性差等缺点,严重限制其临床应用。本实验开发新型的PEI类聚合物（SIPEI）,将含羧酸的锍类化合物（SI）和低分子量PEI经过酰胺键连接,得到具有可降解、正电荷密度小等优点的PEI修饰产物,以期望改进PEI性质,获得低毒高转染活性的基因递送载体。本实验以3种不同链长SI和4个低分子量PEI为原料,通过3种用量配比缩合获得36个聚合物SIPEI,并经红外光谱、核磁共振氢谱进行鉴定。通过凝胶电泳阻滞实验对SIPEI与DNA的复合能力进行研究,通过纳米粒度、电动电势检测SIPEI/DNA复合物的粒径大小和Zeta电势,使用MTT法评价SIPEI的细胞毒性,采用荧光显微镜观察SIPEI/DNA复合物在细胞内分布情况及转染效果。通过红外谱图和核磁氢谱分析,SIPEI成功缩合,同时PEI的改性程度随反应物比例呈正向变化。通过溶解度检测,筛选出16个溶解性较好的SIPEI。经过凝胶电泳阻滞实验,得到10个与DNA质粒具有复合能力的SIPEI。对SIPEI/DNA复合物的粒径大小及Zeta电势检测发现,各复合物的粒径在150～300 nm之间,Zeta电势多数为正电势,在+5～+25 m V之间。对10个SIPEI进行细胞毒性检测,结果显示各聚合物的细胞毒性均与对照PEI 25k无显着差异,并且各聚合物随着给药浓度或时间增加,其细胞毒性也随之增加。细胞内分布实验结果表明,7个SIPEI的DNA复合物能有效被细胞摄取且大部分分布在细胞核的周围,之后对其转染性能进行研究,筛选出4个转染效果较PEI 1.8k强的SIPEI化合物,分别为5SIPEI 1.8k-0.25、5SIPEI 1.8k-0.5、8SIPEI 1.8k-0.25、10SIPEI 1.8k-0.25,这4个SIPEI的转染效果与PEI 25k相当。本实验发现,SI官能团上的正电荷可以与DNA中磷酸根有效键合,使修饰后的低分子量PEI能复合DNA形成纳米颗粒,可达到提高转染效率的目的。但是修饰后产物细胞毒性较低分子量PEI有所升高,表明SI官能团毒性较强,需要进一步优化结构,从而得到细胞毒性低,转染效率高的基因载体。
杨小娟[5]（2021）在《重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒对宫颈癌细胞的作用研究》文中进行了进一步梳理目的本实验拟制备重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒（rAAV-ENO1mAb-5）,介导重组ENO1单抗可变区基因靶向进入细胞质,体外研究rAAV-ENO1mAb-5对宫颈癌Hela细胞糖酵解的影响,及其对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用。方法1.在实验室前期基础上,选择ENO1单抗H5的可变区序列,中间用Linker--（GGGGS）3连接,Xba I和Hind III为酶切位点,将其克隆在pAAV2-MCS载体上,得到重组质粒AAV-ENO1 mAb-5,将重组质粒AAV-ENO1 mAb-5和辅助质粒（p Helper、pAAV-RC）共转染到AAV293细胞中,得到rAAV-ENO1mAb-5。同时将带有绿色荧光蛋白的pAAV-IRES-Zs Green5转入AAV293细胞中,作为空载体对照（rAAV-GFP）。2.采用Na Cl-PEG8000和冰乙醇沉淀法进行粗纯化和浓缩,并用TCID50法测定二者的滴度。3.通过糖酵解试剂盒测定rAAV-ENO1mAb-5对Hela细胞糖酵解产物（丙酮酸和乳酸）的抑制作用。4.通过MTT实验、划痕实验体外检测rAAV-ENO1mAb-5对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用。结果1.成功制备rAAV-ENO1mAb-5和rAAV-GFP,转染效率为90%,二者滴度均为2.0×107PFU/ml。2.rAAV-ENO1mAb-5对Hela细胞糖酵解产物（丙酮酸和乳酸）的生成有明显抑制作用（P<0.01）。3.当rAAV-ENO1mAb-5的MOI值达到80时,Hela细胞增殖率为（48.38±3.94）%,与rAAV-GFP组和PBS组相比有显着统计学差异（P<0.001）。4.划痕实验中,rAAV-ENO1mAb-5对Hela细胞有显着的迁移抑制作用,与rAAV-GFP组和PBS组相比具有明显统计学差异（P<0.01）。结论1.rAAV-ENO1mAb-5高效、靶向负载ENO1单克隆抗体可变区基因进入细胞质;2.rAAV-ENO1mAb-5能够明显抑制宫颈癌Hela细胞乳酸和丙酮酸生成;3.rAAV-ENO1mAb-5可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移。
陈鑫[6]（2021）在《重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究》文中研究表明肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是由各种感染、免疫反应、理化因素等长时间的刺激下,肝脏中各类细胞外基质（extracellular matrix,ECM）代谢失衡,造成纤维结缔组织异常增生和肝脏结构紊乱。临床上肝纤维化的早期症状并不典型,目前尚缺乏灵敏的早期诊断指标。研究发现,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）激活并分化为肌成纤维细胞,是细胞外基质分泌的主要细胞来源。因此,肝星状细胞的活化被认为是肝纤维化启动和持续阶段的中心环节。肝星状细胞的活化过程受各种非编码RNA（noncoding RNA,nc RNA）的联合调控,深入研究肝纤维化发生的分子机制将为研发新型治疗手段提供一定的研究基础。非编码RNA在肝纤维化发生、发展的过程中具有重要的调控作用。其中,微小RNA（micro RNA,miRNA）和长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）在肝纤维化相关的机制探究和临床意义已有大量的研究报道。近年来,环状RNA（circular RNA,circRNA）作为一类新兴的非编码RNA分子被发现,其与各类疾病的生理过程密切相关。内源性circRNAs是通过反向剪切以共价键形成的环状RNA分子,其稳定性高可耐受核酸酶的降解,在不同的物种间具有保守性,在组织和细胞不同的发育阶段和生理状态呈现特异性表达。circRNAs的分子结构特性使其作为新型的临床诊断标记物在开发上具有明显的优势,现已发展成生物医学的热点研究领域之一。circRNAs在各类疾病中的功能及作用机制逐渐引起研究者们的广泛关注,然而,有关circRNAs在肝纤维化中的表达谱分析和具体机制尚有待阐明。在本研究中,构建了小鼠肝纤维化进展和逆转模型,采用肝脏原位灌流技术,分离提取小鼠肝脏的原代肝星状细胞。运用高通量测序技术,分析肝纤维化小鼠原代肝星状细胞中的circRNAs表达谱,鉴定发现大量的circRNAs分子存在差异性表达。其中,circFBXW4的表达水平在肝纤维化进展期显着降低,并随肝纤维化的逆转过程表达恢复,提示circFBXW4可能与肝纤维化发生、发展的病理过程密切相关,引起了我们的重点关注并对其展开了功能学探究。研究中采用重组腺相关病毒为载体,介导circFBXW4靶向肝脏的基因治疗,实验发现提高circFBXW4的水平可抑制肝纤维化过程中的肝损伤,减少肝组织中的纤维增生和胶原沉积,一定程度上修复了肝脏结构紊乱的现象。同时,运用慢病毒生物载体构建了circFBXW4过表达的稳转肝星状细胞株,发现过表达circFBXW4抑制肝星状细胞由静息态向激活态的转化,阻滞其细胞周期,减少活化态肝星状细胞的恶性增殖。此外,利用非病毒载体系统中的阳离子脂质体介导法,发现干扰circFBXW4的生物信号对肝星状细胞具有反向调控功能。以上结果提示,circFBXW4可能是一种抗肝纤维化的RNA分子。在机制探究方面,大部分外显子来源且定位在细胞质中的circRNAs,常通过竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ce RNA）参与调控目的基因的表达,进而影响生物学功能。因此,本研究进一步运用micro RNAs芯片技术,分析原代肝星状细胞中micro RNAs的差异表达,并通过生物信息学预测circFBXW4可能结合的micro RNAs分子,经验证发现circFBXW4可靶向结合miR-18b-3p,并调控其表达水平。micro RNAs芯片分析及实验检测均发现,miR-18b-3p在肝纤维化的过程中表达上调,其具有促进肝星状细胞中纤维介质表达的功能,并且circFBXW4与miR-18b-3p的表达呈负相关关系。抑癌基因F框/WD-40域蛋白7（F box and WD 40 domain containing protein 7,FBXW7）是miR-18b-3p的靶基因之一,本研究发现circFBXW4通过靶向结合miR-18b-3p进而调控FBXW7信号通路。此课题在动物、组织、细胞、分子等多个维度,进行了关于circFBXW4表型及机制的初步探究。发现circFBXW4是调节肝星状细胞活化和肝纤维化发展的关键生物分子,其可能作为一种预测肝纤维化进展和逆转病理过程的潜在生物标志物。
张胜[7]（2020）在《表达猪伪狂犬病毒gD和gB蛋白的重组腺相关病毒的构建及小鼠免疫试验》文中研究说明伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）是严重危害养猪业的传染性病原体,g B和g D糖蛋白是PRV重要的免疫原性蛋白,PRV的g B和g D蛋白的编码基因是开发PRV的重组载体疫苗的目标基因。本文利用重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus,r AAV）表达系统,以PRV临床变异毒株PRV/JXFC/2015株基因组为样本,通过PCR技术构建表达PRV的g B和g D糖蛋白的重组AAV2/9型腺相关病毒,并研究了该活病毒载体的生物学特性以及其对小鼠的免疫原性,该工作为开发新的PRV疫苗奠定了宝贵的基础。主要内容如下:1.表达PRV的g B和g D糖蛋白的腺相关病毒的构建本研究以PRV临床变异毒株PRV/JXFC/2015株基因组为样本,进行g D和g B蛋白的编码基因的PCR扩增,将g D和g B基因片段分别酶切替换连接到p AAV核心质粒上,为了便于验证表达系统的功能,我们构建得到用于包装r AAV的核心质粒是分别携带红色荧光蛋白（Mcherry）和绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的核心质粒p AAV-PRV-g D-P2A-Mcherry、p AAV-PRV-g B-P2A-EGFP。上述质粒经过酶切与测序验证正确。2.表达PRV的g B和g D糖蛋白的腺相关病毒的制备采用三质粒转染HEK-293T细胞制备r AAV的方法,成功制备出了表达PRV的g B和g D糖蛋白的重组AAV2/9型腺相关病毒,批号分别为r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP-Z20200103和r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry-Z20200103,滴度分别是2.5×1012vg/m L和5.00×1012vg/m L。3.表达PRV的g B和g D糖蛋白的腺相关病毒对C57小鼠的免疫试验将r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP、r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry通过小鼠右后肢胫前肌内注射进行免疫,试验组的每组免疫5只C57小鼠,每只的免疫剂量为5×1012vg/kg,试验组分别是:第一组（r AAV-PRV-g B-P2A-EGFP）、第二组（r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry）、第三组（r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP和r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry相同剂量混合）;商品疫苗阳性对照组,免疫5只小鼠,每只的免疫剂量为10μL/g;PBS阴性对照组,免疫5只小鼠。免疫后第2,12,16,20,24,28周采血,用野毒PRV/JXFC/2015毒株检测血清中和抗体水平。并对免疫后第28周采血收集的血清样本,进行PRV/JXFC/2015野毒株和CH-18野毒株交叉中和试验。小鼠血清中和抗体实验的结果表明:针对PRV/JXFC/2015野毒株的病毒血清中和抗体检测,阴性对照PBS组以及r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP组的所有时间点的5只小鼠的混合血清的中和抗体水平为0,其中r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP和r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry相同剂量混合注射组的混合血清的中和抗体水平分别是1:8、1:19.95、1:22.9、1:5.6、1:5.01、1:31.6;阳性对照商品疫苗组的混合血清的中和抗体水平分别是1:16、1:16、1:16、1:16、1:16、1:22.38;r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组的混合血清的中和抗体水平分别是1:5、1:64、1:32、1:44、1:39.8、1:56.2。对28周的混合血清做的针对CH-18野毒株的交叉中和检测,r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP组混合血清中和抗体水平为0,r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组混合血清中和抗体水平≥1:256,r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP和r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组的混合血清的中和抗体水平为1:89.125,阳性对照商品疫苗组混合血清的中和抗体水平为1:42,阴性对照PBS组的混合血清的中和抗体水平为0。进一步的测定各组在各个时间点的5只小鼠的混合血清中的IFN-γ、IL-4细胞因子含量,结果显示,r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组最高为1973.65 pg/m L的IFN-γ水平和161.01 pg/m L的IL-4水平,商品疫苗IFN-γ水平最高为1959 pg/m L,IL-4水平最高为103.89 pg/m L。细胞因子测定实验结果表明r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组产生出了比商品疫苗组更高的免疫细胞因子表达水平。总之,r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组在试验中效果显着,通过单针免疫小鼠后,在小鼠体内激发了非常明显并且持久的体液免疫与细胞免疫应答,达到较长的免疫效力保护周期和更高的持续保护效力。
孙英杰[8]（2020）在《腺相关病毒9型在小鼠体内的分布研究及安全性评价》文中提出背景杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是一种X连锁隐性遗传病,临床症状表现为肌肉的进行性加重的损伤,且具有致死性。全世界每年约5000个新生儿中就有1个患病。该病的致病基因是DMD基因,其突变会导致抗肌萎缩蛋白（dystrophin）不能够正常合成,影响了该蛋白的正常功能进而引起肌肉损伤,导致疾病的发生。近些年来,随着对基因的研究的不断深入,DMD基因疗法逐渐产生并发展壮大。DMD非常适合使用基因疗法治疗。一方面是由于单个基因即DMD基因突变引起的疾病,在治疗时只需要考虑该致病基因即可。另一方面,由于肌肉细胞不分裂,寿命长,一次性的治疗可能带来长期甚至终生的益处。DMD的基因治疗旨在从基因层面根本上对DMD进行治疗。具体来说则是通过引入基因片段对突变或缺失的肌营养不良蛋白基因进行修复,恢复肌营养不良蛋白基因的功能,使骨骼肌、膈肌、心肌的肌肉功能恢复正常。合适的病毒转运载体是利用CRISPR/Cas9技术对DMD患者进行基因治疗的关键一步。腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是一种非病原性的人类缺陷病毒,是目前遗传病基因治疗的理想载体。其中腺相关病毒9型（adeno-associated virus serotype9,AAV9）分离自非人灵长动物,具有极低的免疫原性和毒性。AAV9介导的CRISPR/Cas9基因编辑作为DMD治疗的重要方法,也面临着相比其他疗法更为独特的挑战。虽然AAV9应用于DMD基因治疗已有一定成就,但AAV9在动物体内长期分布情况及安全性问题仍然缺乏相关研究。本研究中以小鼠为研究对象,分析不同注射方式、不同病毒滴度的AAV9病毒载体在小鼠体内的分布及表达情况,选出合适的病毒注射方式及剂量。并研究该注射方式和剂量下的AAV9病毒在小鼠体内的长期分布情况;最后通过解剖小鼠制作器官组织的病理切片对AAV9在小鼠体内的安全性进行分析。为后续探索基因治疗安全性研究提供实验基础。目的1.分析注射方式、注射剂量对AAV9病毒载体在小鼠体内的分布及表达情况的影响,初步选定注射方式及剂量。2.分析合适注射方式和剂量时AAV9病毒载体在小鼠体内的长期分布情况以及安全性。方法1.通过尾静脉注射和肌肉注射两种方式,向雄性Balb/c小鼠分别注射不同滴度的携带Luciferase荧光报告基因的AAV9病毒（AAV9-Luc）,正常饲养3天后,于生物荧光成像仪下观察在小鼠体内的表达情况。2.用前期实验确定的注射方案向雄性Balb/c小鼠注射AAV9-Luc,正常饲养30天后,于生物荧光成像仪下观察小鼠体内荧光的表达情况以及具体各个器官的荧光分布情况。3.采用前期实验确定的注射方式和注射剂量向雄性Balb/c小鼠注射AAV9-Luc,正常饲养14天后,观察小鼠器官的形态学大体变化以及病理切片的镜下形态变化。结果1.本研究发现尾静脉注射AAV9时,病毒可在小鼠体内均匀且广泛的分布和表达。当肌肉注射中剂量（4×1011VG/只）时,病毒表达局限在注射部位局部及四肢、膈肌等肌肉组织中,其他脏器未见明显表达。2.选择肌肉注射中剂量为注射方式和适合剂量,在30天的长期分布研究中,随着时间的延长,荧光的表达量逐渐增大,表达部位从局限于右后肢注射处渐渐扩大,且未见肌肉以外地其他器官有明显荧光表达。右后肢肌、右前肢肌中的荧光表达量随着时间的增加逐渐增大。3.AAV9病毒注射小鼠后,动物的主要脏器（肝、脾、肺、肾、胰、脑、睾丸）,主要肌肉（四肢肌、膈肌、肋间肌、心肌）肉眼观察形态均正常。没有出血、坏死、肿大、萎缩等异常现象。结论肌肉注射剂量为4×1011VG/只AAV9病毒时,病毒在小鼠体内局限分布于肌肉,而在非肌肉器官中几乎没有分布,是较为合适的注射方式和剂量。且该剂量时通过肌注时对于小鼠较为安全。
林寿凯[9]（2020）在《耳蜗外毛细胞Prestin过表达病毒载体的构建与应用研究》文中研究指明噪声性听力损失（noise-induced hearing loss,NIHL）是由于长期暴露在噪声环境中所引起的感音性耳聋,是最常见的职业病之一,NIHL目前尚无有效的治疗方法,根本原因在于耳蜗外毛细胞（Outer hair cells,OHCs）受到噪声的损害发生不可逆性死亡,Prestin蛋白是耳蜗OHCs特有的重要感音功能蛋白,是OHCs电运动以及耳蜗放大效应的分子基础,并在OHCs损伤时呈代偿性升高弥补听力损失。目的通过构建耳蜗毛细胞重组Prestin腺相关病毒-2（AAV-2）载体,为耳蜗Prestin蛋白调控研究提供工具,同时构建一种新型无创的内耳基因转染系统。方法以豚鼠Prestin基因为模板,PCR扩增与提取,利用基因工程技术构建AAV-2-Prestin载体,转染培养的耳蜗毛细胞（HEI-OC1细胞株）后1d、3d、5d采用Western blot检测Prestin的表达水平。将构建好的重组Prestin腺相关病毒2型载体,与原位凝胶混合后经鼓膜穿刺鼓室给药的圆窗途径转染豚鼠内耳,免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布,耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prestin的表达及分布,WB检测基底膜Prestin表达水平。结果构建pAAV-EGFP-Prestin原病毒质粒转染HEK-293T细胞后,第1d可见微弱绿色荧光蛋白表达,第3d可见绿色荧光蛋白表达达到高峰;AAV-2-Prestin病毒转染HEI-OC1细胞后,不同转染时间的各组Prestin蛋白表达水平显着增高（F=414.755,P<0.001）,3d和5d组Prestin蛋白表达显着高于1d（P<0.001）,3d组Prestin蛋白表达显着高于5d组（P<0.001）。豚鼠耳蜗给药后第7天开始出现绿色荧光蛋白表达,绿色荧光蛋白分布于耳蜗血管纹、前庭膜、基底膜和Corti器;基底膜铺片显示外毛细胞出现绿色荧光蛋白表达,未见于内毛细胞,14天绿色荧光蛋白表达水平明显增加;豚鼠耳蜗给药后第7天外毛细胞Prestin蛋白表达水平开始增加,14天后增加更显着（P<0.05）,内毛细胞未发现Prestin蛋白的表达。WB检测各组基底膜Prestin蛋白表达水平结果,方差分析结果显示具有统计学差异（F=3644.6729,P<0.05）,组间比较发现对照组与4天组无显着性差异（P>0.05）,7天组Prestin蛋白表达水平明显高于对照组和4天组（P<0.05）,14天组Prestin蛋白表达水平明显高于其它各组（P<0.05）。结论重组腺相关病毒-2-Prestin载体成功构建,具有较好的OHCs转染靶向性和持续性,原位凝胶混合重组相关病毒载体经鼓膜穿刺圆窗途径转染内耳毛细胞是一种新型无创内耳基因转染系统。
蒋羽清[10]（2019）在《重组腺相关病毒载体介导的miR-21过表达调节调亡因子PDCD4促进神经元轴突再生的研究》文中认为第一部分 改良Allen’s法建立大鼠损伤挫伤型脊髓中度损伤模型目的:采用改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓中度损伤模型,观察脊髓损伤组、假手术组在脊髓损伤后后肢功能评分（BBB评分）及组织学区别。方法:使用脊髓打击器建立大鼠胸9挫伤型脊髓中度损伤模型,对脊髓损伤后后肢运动功能变化采用BBB评分法评价,βⅢ-tubulin免疫荧光染色对两组脊髓损伤后的组织学变化进行观察。结果:大鼠胸9脊髓挫伤后,假手术组的神经元结构基本完整,形状正常,分布匀称,细胞间质匀称,神经元排列较整齐;而SCI组可见神经元结构欠完整,神经突出基本消失,细胞间质模糊混乱。脊髓损伤组与假手术组的BBB评分差异有统计学意义（p<0.05）。结论:1.成功建立大鼠挫伤型脊髓中度损伤模型;2.BBB评分脊髓损伤组明显低于假手术组。第二部分 大鼠脊髓损伤后miR-21及其凋亡因子PDCD4、PTEN的表达目的:阐明大鼠脊髓损伤后miR-21的基因表达变化及凋亡因子PDCD4、PTEN的表达、时间分布和其在脊髓损伤中的作用。方法:60只成年大鼠,SPF级,体重为200-250g,损伤组采取改良Allen’s法建立大鼠T9挫伤型脊髓损伤模型,假手术组只做椎板切除术,各组造模后4h、8h、1d、3d、7d取材,运用Real-time PCR检测脊髓损伤前后miR-21的表达变化;同时采用Western-blot检测miR-21相关靶基因PDCD4和PTEN的表达,观察miR-21是否通过调控其靶基因PDCD4和PTEN的表达影响脊髓损伤的修复。结果:与假手术组相比,miR-21的表达水平在SCI后4小时、8小时和1天均低于正常组织,各组与假手术组相比均存在统计学差异（P<0.05）;而损伤后3天和7天miR-21的水平则显着高于假手术组（P<0.05）,呈现先降低再升高的变化趋势。PDCD4在损伤后1天表达增加,3天其蛋白表达水平达到高峰,损伤后7天表达水平有所下降。与假手术组相比,损伤后1天和3天PDCD4的表达量与损伤前比较具有统计学差异（P<0.01）。p-PTEN的表达在脊髓损伤后1天最高,损伤后3天表达量有所下降,损伤后7天基本降至损伤前水平;脊髓损伤后1天（P<0.01）和3天（P<0.05）的表达水平与假手术组相比存在统计学差异。p-PTEN在SCI后7天回落至脊髓损伤前的表达水平。结论:在SCI的一周时间内,miR-21表达增高PDCD4和PTEN的表达水平则下降,表明了 miR-21在继发性损伤阶段抑制了凋亡因子PDCD4和PTEN的表达,在促进损伤后修复和抑制胶质疤痕的形成中发挥了重要作用。PDCD4和PTEN的表达与miR-21在脊髓损伤后表达的相关性,表明miR-21能够通过调控凋亡因子抑制胶质疤痕、促进损伤后修复。第三部分 重组腺相关病毒载体介导miR-21过表达通过抑制凋亡蛋白PDCD4促进轴突再生目的采取改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓损伤模型,研究重组腺相关病毒载体RAAV-miRNA-21对靶蛋白PDCD4的调节作用以及对神经元轴突生长的影响。方法分离并培养胎鼠脊髓原代神经元。通过hU6-MCS-CMV-EGFP rAAV载体,分别将 rAAV-pri-miRNA-21、rAAV-in-miRNA-21、rAAV-nc-miRNA 感染胎鼠脊髓神经元,通过β-Ⅲ tubulin标记的免疫荧光检测各组神经元轴突生长情况,Western blot检测PDCD4表达。结果在用rAAV-in-miRNA-21转导的神经元培养中,神经元要么延长很短的神经突,要么完全不延长。相比之下,过表达miRNA-21的神经元与正常对照组或nc-miRNA组相比,神经突生长明显增加（图7）。量化所有神经元轴突平均长度结果表明,miRNA-21显着增加所有神经元轴突的平均长度（415±16.7mm）,而对照组（198±11.2mm）和 nc-miRNA 组（185±10.6mm）（p<0.05）。量化最长神经元轴突的平均长度结果表明,miRNA-21显着增加平均长度最长的神经元轴突（234±7.1mm）,而对照组（121±3.9 毫米）和 nc-miRNA 组（109±4.7 毫米）,分别（p<0.04）。Western blot分析显示,与对照组相比,PDCD4表达下降35%（p<0.05）,PTEN蛋白水平无明显变化。结论过表达miR-21通过调节靶蛋白PDCD4的表达,增加神经突的伸展,促进出生后大鼠脊髓神经元的神经突生长。
二、腺相关病毒载体应用的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺相关病毒载体应用的研究进展（论文提纲范文）
（1）肝调畅情志功能失常病变机制探索 ——从ALLO介导海马脑区GABAAR δ亚基探查PMDD肝气郁证发病及药物干预机制（论文提纲范文）
| 鸣谢 |
| 提要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 概念厘定与理论梳理 |
| 1 经前期综合征(PMS) |
| 2 经前烦躁障碍症(PMDD) |
| 3 PMDD的亚型(证候)分型 |
| 3.1 PMDD肝气逆证 |
| 3.2 PMDD肝气郁证 |
| 第二章 PMDD发病机制 |
| 1 西医对PMDD发病的认识 |
| 1.1 神经类固醇激素失调 |
| 1.2 相关脑区功能改变 |
| 1.3 PMDD发病与脑内GABAAR |
| 2 中医对PMDD发病的认识 |
| 2.1 伏邪与PMDD发病 |
| 2.2 肝失疏泄与PMDD发病 |
| 2.3 体质因素与PMDD发病 |
| 3 PMDD的治疗药物 |
| 3.1 西医 |
| 3.2 中医 |
| 4 存在问题及本论文的切入点 |
| 第三章 实验研究 |
| 1 PMDD肝气郁证大鼠模型构建及药效评价 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.2.1 大鼠筛选 |
| 1.2.2 药物干预 |
| 1.2.3 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 2 PMDD肝气郁证模型大鼠外周及中枢ALLO水平及代谢通路表达变化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 孕酮、5α二氢皮质酮、四氢孕酮含量结果 |
| 2.3.2 5α还原酶、3α-类固醇脱氢酶含量结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 PMDD肝气郁证模型大鼠海马GABAARδ亚基表达及靶点验证 |
| 3.1 肝气郁证大鼠模型制备 |
| 3.2 模型大鼠海马GABAARδ亚基表达 |
| 3.3 模型大鼠GABAARδ亚基腺相关病毒载体表达 |
| 3.4 模型大鼠GABAARδ亚基腺相关病毒载体表达与结果验证 |
| 3.5 腺相关病毒载体表达的模型大鼠的药物干预 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.7 讨论 |
| 第四章 综合分析与初步结论 |
| 1 综合分析 |
| 2 初步结论 |
| 2.1 孕酮代谢途径异常是PMDD肝气郁证患者发病关键机制 |
| 2.2 海马脑区GABAARδ亚基是舒郁胶囊作用靶点 |
| 2.3 中药植物雌激素替代功效是舒郁胶囊可能作用机理 |
| 第五章 理论意义与应用价值 |
| 1 理论意义 |
| 2 应用价值 |
| 第六章 本研究主要创新与局限和问题与展望 |
| 1 本研究主要创新 |
| 1.1 提出“舒郁胶囊治疗作用”的可能假说 |
| 1.2 腺相关病毒载体表达精准锁定目标受体亚基 |
| 2 局限 |
| 3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
（2）AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛神经机制的研究进展 |
| 1.1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛概述 |
| 1.1.2 脊髓损伤后肌肉痉挛的发生机制 |
| 1.2 以构建新型腺相关病毒为代表的基因疗法 |
| 1.2.1 基因疗法概述 |
| 1.2.2 腺相关病毒作为基因疗法关键工具的研究进展 |
| 1.3 神经营养因子3 的研究现状 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 神经营养因子3 在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.4 运动干预与脊髓损伤可塑性 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 运动干预疗法在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.5 选题依据及研究意义 |
| 第2章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒的构建及其在大鼠后肢肌肉及背根神经节中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器与耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 2.2.2 重组腺相关病毒的注射 |
| 2.2.3 Western blot法检测NT3 蛋白的表达变化 |
| 2.2.4 大鼠脊髓组织NT3 的半定量分析 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 大鼠后肢肌肉中人神经营养因子3 的表达 |
| 2.3.2 大鼠脊髓背根神经节中神经营养因子3 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器与耗材 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 脊髓挫伤模型的建立 |
| 3.2.3 运动训练 |
| 3.2.4 游泳测试 |
| 3.2.5 BBB评分 |
| 3.2.6 H反射的RDD记录 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AAV-NT3、运动干预及二者的联合治疗对大鼠脊髓损伤后游泳测试时痉挛行为发生频率的影响 |
| 3.3.2 单独或联合治疗对后肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 单独或联合治疗对H反射RDD的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器与耗材 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 脊髓切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 4.2.2 免疫荧光定量 |
| 4.2.3 蛋白质印迹 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 单独或联合治疗后脊髓运动神经元及突触素(SYN)的变化 |
| 4.3.2 单独或联合治疗后 Ch AT 兴奋性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.3 单独或联合治疗后GABA抑制性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.4 单独或联合治疗后脊髓KCC2 蛋白表达的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16 的构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物与细胞系 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验试剂的配置 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 生产病毒载体所需的质粒构建 |
| 5.2.2 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 5.2.3 中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建模式 |
| 5.2.4 新一代血脑屏障3D体外模型构建、鉴定与AAV筛选 |
| 5.2.5 小鼠尾静脉注射进行AAV体内筛选 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小鼠体内筛选高效率转导的新型中枢靶向性病毒载体 |
| 5.3.2 血脑屏障3D体外模型验证AAV-CPP.16 穿透BBB的 能力 |
| 5.3.3 探索适宜的用于小鼠体内AAV-CPP.16 的病毒载量 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法与步骤 |
| 6.2.1 小鼠尾静脉注射 |
| 6.2.2 小鼠侧脑室病毒注射 |
| 6.2.3 脊髓和外周组织器官切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.2 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.3 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.4 IV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.3.5 ICV注射AAV-CPP.16 在小鼠大脑中的转导效率 |
| 6.3.6 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.7 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.8 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.9 ICV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.2 本研究的创新性 |
| 7.3 工作局限及未来方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 宠物肿瘤 |
| 1.2 肿瘤免疫疗法 |
| 1.3 免疫筛查阻断疗法 |
| 1.3.1 免疫筛查位点阻断疗法的机遇与挑战 |
| 1.4 肿瘤免疫疗法新靶点——肿瘤微环境 |
| 1.4.1 肿瘤微环境概述 |
| 1.4.2 “加热”肿瘤微环境的方法 |
| 1.5 卡介苗 |
| 1.5.1 卡介苗概述 |
| 1.5.2 卡介苗的非特异性效应及应用 |
| 1.5.3 卡介苗在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 1.6 焦亡 |
| 1.6.1 焦亡概述 |
| 1.6.2 焦亡的分子机制 |
| 1.6.3 焦亡在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.7 重组腺相关病毒载体 |
| 1.7.1 重组腺相关病毒载体概述 |
| 1.7.2 重组腺相关病毒载体的包装及纯化 |
| 1.7.3 重组腺相关病毒载体在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.7.4 携带细胞毒性基因重组腺相关病毒载体的包装策略 |
| 1.8 三阴性乳腺癌 |
| 1.9 多形性胶质母细胞瘤 |
| 第二章 目的及意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系、病毒和实验动物 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 流式抗体及药物 |
| 3.1.4 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.5 细胞培养及转染产品 |
| 3.1.6 主要的培养基、抗生素、缓冲液及其配制 |
| 3.1.7 实验设备 |
| 3.1.8 相关软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 感受态细胞的制备 |
| 3.2.2 质粒构建 |
| 3.2.3 细胞及BCG培养 |
| 3.2.4 4T1-luc及 C6-luc细胞系的构建 |
| 3.2.5 三阴性乳腺癌小鼠模型构建 |
| 3.2.6 BCG治疗对三阴性乳腺癌小鼠模型TME的影响 |
| 3.2.7 BCG治疗三阴性乳腺癌小鼠模型 |
| 3.2.8 BCG治疗对三阴性乳腺癌小鼠模型肿瘤转录组的影响 |
| 3.2.9 单倍剂量卡介苗和抗PD-L1 联合治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.10 三质粒包装系统包装r AAV |
| 3.2.11 杆状病毒包装系统包装r AAV |
| 3.2.12 r AAV纯化及滴度测定 |
| 3.2.13 哺乳动物启动子的筛选 |
| 3.2.14 利用杆状病毒包装系统包装表达GSDMD~(NT)的oAAV-P1 |
| 3.2.15 利用三质粒包装系统包装表达GSDMD~(NT)的oAAV-P2 |
| 3.2.16 oAAV-P1和oAAV-P2 细胞实验 |
| 3.2.17 oAAV-P1和oAAV-P2 治疗GBM大鼠模型 |
| 3.2.18 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.19 oAAV-P2 联合抗PD-L1 治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.20 oAAV-P2 治疗TNBC裸鼠模型 |
| 3.2.21 rAAV瘤内注射安全性实验 |
| 3.2.22 表达GSDM~(NT)蛋白oAAV系统通用性验证 |
| 3.2.23 利用诱导型启动子包装表达GSDMD~(NT)蛋白的rAAV |
| 3.2.24 oAAV-P2 在临床宠物肿瘤治疗中的应用 |
| 第四章 利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫 |
| 4.1 卡介苗治疗增加了TNBC小鼠模型TME中浸润淋巴细胞数量 |
| 4.2 卡介苗治疗抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长 |
| 4.3 卡介苗治疗上调了TNBC小鼠模型肿瘤内PD-L1 的表达 |
| 4.4 单倍剂量卡介苗联合PD-L1 阻滞剂可有效抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫 |
| 5.1 利用哺乳动物启动子包装rAAV-GSDM~(NT) |
| 5.1.1 哺乳动物启动子m CBA的鉴定 |
| 5.1.2 哺乳动物启动子m CBA的分析 |
| 5.1.3 oAAV-P1 的包装 |
| 5.2 利用四环素诱导型启动子包装rAAV-GSDM~(NT) |
| 5.3 利用Cre/lox重组酶系统包装r AAV-GSDM~(NT) (oAAV-P2) |
| 5.4 oAAV-P1和oAAV-P2 可以使肿瘤细胞焦亡 |
| 5.5 oAAV-P1和oAAV-P2 诱导细胞焦亡的效率不同 |
| 5.6 oAAV-P1 治疗原位多形性胶质母细胞瘤大鼠模型 |
| 5.7 oAAV-P2 治疗原位多形性胶质母细胞瘤大鼠模型 |
| 5.7.1 oAAV-P2在GBM大鼠模型中有很好的疗效 |
| 5.7.2 oAAV-P2在GBM大鼠模型中可以暂时性打开血脑屏障 |
| 5.7.3 oAAV-P2 治疗双侧接种瘤的GBM大鼠模型 |
| 5.8 oAAV-P2 治疗原位三阴性乳腺癌小鼠模型 |
| 5.9 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤浸润淋巴细胞单细胞转录组分析 |
| 5.10 oAAV-P2 治疗TNBC裸鼠模型 |
| 5.11 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤转录组分析 |
| 5.12 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤浸润淋巴细胞流式分析 |
| 5.13 oAAV-P2 联合PD-L1 阻断治疗TNBC小鼠模型 |
| 5.14 rAAV瘤内注射的安全性评价 |
| 5.15 表达GSDM~(NT)蛋白oAAV系统通用性验证 |
| 5.16 oAAV-P2 在临床宠物肿瘤治疗中的初步应用 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫 |
| 6.2 构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫 |
| 6.3 宠物肿瘤治疗前瞻 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.2 病毒型基因载体 |
| 1.2.1 逆转录病毒(RV) |
| 1.2.2 腺病毒(AV) |
| 1.2.3 腺相关病毒(AAV) |
| 1.2.4 慢病毒(LV) |
| 1.2.5 单纯疱疹病毒(HSV) |
| 1.3 非病毒型基因载体 |
| 1.3.1 阳离子脂质体 |
| 1.3.2 阳离子聚合物 |
| 1.4 锍类化合物研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 菌株及细胞株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 锍类聚合物的设计 |
| 2.2.2 锍类聚合物结构表征 |
| 2.2.3 锍类聚合物性能测试 |
| 2.2.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 2.2.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 2.2.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 锍类聚合物的合成及表征 |
| 3.1.1 化合物SI合成及表征 |
| 3.1.2 聚合物SIPEI合成及表征 |
| 3.2 锍类聚合物与DNA复合能力测定 |
| 3.3 锍类聚合物与 DNA复合物粒径大小与Zeta电势测定 |
| 3.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 3.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 3.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 锍类聚合物的合成 |
| 4.1.1 化合物SI的合成 |
| 4.1.2 聚合物SIPEI的合成 |
| 4.1.3 聚合物SIPEI的表征 |
| 4.2 纳米粒子制备通法 |
| 4.3 琼脂糖凝胶阻滞实验 |
| 4.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 4.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 4.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒对宫颈癌细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 宫颈癌现状 |
| 2 肿瘤代谢与糖酵解 |
| 2.1 ENO1 结构与功能 |
| 2.2 ENO1 与肿瘤发生发展 |
| 3 单克隆抗体 |
| 4 基因治疗和AAV |
| 5 研究目的、研究内容及创新性 |
| 第一章 重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒的制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒、菌珠及腺相关病毒载体系统 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及设备 |
| 1.1.4 主要实验试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 ENO1 单克隆抗体可变区基因测序 |
| 1.2.2 AAV293 细胞株培养 |
| 1.2.3 AAV载体包装ENO1 单克隆抗体可变区基因 |
| 1.2.4 重组腺相关病毒的收集、浓缩 |
| 1.2.5 重组腺相关病毒滴度测定及储存 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 杂交瘤细胞可变区基因测序结果 |
| 1.3.2 AAV包装ENO1 单克隆抗体可变区基因 |
| 1.3.3 重组腺相关病毒滴度的测定结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 重组ENO1 单抗可变区基因的腺相关病毒对宫颈癌细胞的作用研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要实验设备 |
| 2.1.4 常用溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Hela细胞的培养 |
| 2.2.2 细胞毒性实验(MTT) |
| 2.2.3 体外糖酵解抑制作用研究 |
| 2.2.4 细胞划痕实验 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒对Hela细胞的增殖抑制作用 |
| 2.3.2 重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒体外对Hela细胞糖酵解的抑制作用 |
| 2.3.3 重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒对Hela细胞迁移作用的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 重组腺相关病毒载体对ENO1单克隆抗体可变区基因的靶向胞内递送 |
| 2.4.2 重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒对抑制糖酵解作用研究 |
| 2.4.3 重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒抗宫颈癌作用研究 |
| 2.4.4 rAAV-ENO1mAb-5 与其他药物联合可发挥协同抗肿瘤作用 |
| 2.5 结语 |
| 2.5.1 本章小结 |
| 2.5.2 不足之处 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 腺相关病毒介导的基因治疗在肿瘤中的研究进展 |
| 1 AAV和 AAV载体 |
| 1.1 AAV的生物学功能 |
| 1.2 AAV载体的研究现状 |
| 1.3 AAV载体的靶向性 |
| 2 AAV载体介导的肿瘤基因治疗 |
| 2.1 AAV介导的抗血管生成治疗 |
| 2.2 AAV介导的自杀基因治疗 |
| 2.3 AAV介导的小RNA治疗 |
| 2.4 AAV介导的免疫相关治疗 |
| 2.5 AAV介导的肿瘤抑制治疗 |
| 2.6 AAV阻止信号转导 |
| 3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 发表的学术论文 |
| 参与专利 |
| 参与课题 |
（6）重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 实验物品 |
| 2.4 仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 小鼠肝纤维化形成和逆转模型的建立 |
| 3.2 原位灌流小鼠原代细胞 |
| 3.3 circFBXW4 腺相关病毒载体的构建与鉴定 |
| 3.4 circFBXW4 腺相关病毒的包装 |
| 3.5 小鼠尾静脉注射腺相关病毒 |
| 3.6 血清谷丙转氨酶的测定 |
| 3.7 血清谷草转氨酶的测定 |
| 3.8 肝组织羟脯氨酸的测定 |
| 3.9 肝组织苏木精-依红染色(hematoxylin eosin,HE)染色 |
| 3.10 肝组织Masson染色 |
| 3.11 免疫荧光染色 |
| 3.12 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色 |
| 3.13 肝星状细胞培养 |
| 3.14 脂质体介导细胞转染小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA) |
| 3.15 质粒大提和细胞转染 |
| 3.16 流式分析细胞周期 |
| 3.17 流式分析细胞凋亡 |
| 3.18 CCK8 细胞增殖试验 |
| 3.19 EDU-555 细胞增殖检测 |
| 3.20 DNA提取 |
| 3.21 双萤光素报告基因检测 |
| 3.22 RNA提取 |
| 3.23 细胞质、细胞核RNA分离提取 |
| 3.24 Real-time qPCR |
| 3.25 microRNA qPCR |
| 3.26 冰冻切片RNA荧光原位杂交 |
| 3.27 蛋白提取和变性 |
| 3.28 Western blot |
| 3.29 数据处理方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 小鼠肝纤维化模型的构建及鉴定 |
| 4.2 肝脏原代肝星状细胞中circRNAs高通量测序及分析 |
| 4.3 circFBXW4 在肝纤维化进展及逆转过程中的表达变化 |
| 4.4 环状RNA circFBXW4 的分子组成、稳定性及亚细胞定位 |
| 4.5 重组腺相关病毒载体介导的circFBXW4 过表达对小鼠肝纤维化的影响 |
| 4.6 慢病毒载体介导的circFBXW4 过表达对肝星状细胞活化,增殖及凋亡的影响 |
| 4.7 阳离子脂质体介导的circFBXW4 沉默对肝星状细胞活化及增殖的影响 |
| 4.8 原代肝星状细胞中micro RNA芯片检测及circFBXW4 ceRNA机制分析 |
| 4.9 miR-18b-3p对小鼠肝星状细胞活化的影响 |
| 4.10 原代肝星状细胞中circRNAs-microRNAs-mRNAs分子调控机制的研究 |
| 4.11 阳离子脂质体介导的FBXW7 过表达/沉默对肝星状细胞的影响 |
| 4.12 circFBXW4 靶向miR-18b-3p调控FBXW7 信号通路 |
| 5 讨论 |
| 5.1 第一部分:肝纤维化小鼠的原代肝星状细胞中差异表达的circRNAs高通量测序及分析 |
| 5.2 第二部分:重组腺相关病毒载体、慢病毒载体、阳离子脂质体介导circFBXW4 在体内、体外对肝纤维化和肝星状细胞活化的影响 |
| 5.3 第三部分:circFBXW4 通 过靶向miR-18b-3p调控FBXW7信号通 路的ceRNA机制研究 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 环状RNA在肝脏相关疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）表达猪伪狂犬病毒gD和gB蛋白的重组腺相关病毒的构建及小鼠免疫试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 伪狂犬病毒及猪伪狂犬病 |
| 1.1.1 伪狂犬病毒的特性 |
| 1.1.2 猪伪狂犬病在国内的流行情况 |
| 1.1.3 猪伪狂犬病的疫苗研究 |
| 1.2 腺相关病毒 |
| 1.2.1 腺相关病毒的结构特点 |
| 1.2.2 腺相关病毒的分类 |
| 1.2.3 腺相关病毒的主要天然血清型 |
| 1.2.4 腺相关病毒的主要亚型 |
| 1.3 重组腺相关病毒载体概述 |
| 1.4 重组腺相关病毒载体作为疫苗及新药的研究进展 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料和方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株、细胞、质粒 |
| 3.1.2 酶、试剂和耗材 |
| 3.1.3 培养基及相关试剂配制 |
| 3.1.4 主要仪器、设备、软件及引物 |
| 3.1.5 实验动物与试验场所 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PRV基因组的提取 |
| 3.2.2 猪伪狂犬病毒gB和gD基因的克隆 |
| 3.2.3 pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP和 pAAV-PRV-gD-P2A-Mcherry构建 |
| 3.2.4 细菌转化、菌落鉴定及质粒提取 |
| 3.2.5 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV的制备 |
| 3.2.6 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV对 C57 小鼠的免疫试验 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 猪伪狂犬病毒gB和gD基因的克隆 |
| 4.2 pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP和 pAAV-PRV-gD-P2A-Mcherry构建及鉴定 |
| 4.3 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV的制备 |
| 4.4 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV的SDS-PAGE银染 |
| 4.5 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV的ITR引物定量检测 |
| 4.6 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV的电镜观察 |
| 4.7 gD和gB蛋白在重组腺相关病毒中表达的鉴定 |
| 4.8 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV对 C57 小鼠的免疫试验 |
| 4.8.1 小鼠血清中和抗体测定 |
| 4.8.2 小鼠血清IFN-γ和IL-4 分泌量测定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 PRV/JXFC/2015 变异毒株的选择依据 |
| 5.2 rAAV载体的优缺点 |
| 5.3 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV的试验有效性的分析 |
| 5.4 表达PRV的gD和 gB蛋白的r AAV的对小鼠的免疫原性试验 |
| 5.5 本研究的意义及应用前景 |
| 5.6 本研究存在的问题及改进策略 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）腺相关病毒9型在小鼠体内的分布研究及安全性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 一、杜氏肌营养不良概述 |
| 二、腺相关病毒概述 |
| 三、腺相关病毒的分布和安全性评价 |
| 第一部分 腺相关病毒9型在小鼠体内的注射方式和剂量研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 腺相关病毒9型在小鼠体内的长期分布 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 腺相关病毒9型在小鼠体内的安全性评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 腺相关病毒在DMD治疗中的研究进展 |
| 一、腺相关病毒概述 |
| 二、腺相关病毒在DMD基因治疗的体外研究 |
| 三、腺相关病毒在DMD治疗中的应用 |
| 四、腺相关病毒作为载体治疗DMD的局限性 |
| 参考文献 |
| 个人简历及硕士期间发表论文及获奖情况 |
| 致谢 |
（9）耳蜗外毛细胞Prestin过表达病毒载体的构建与应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂与材料 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 细胞株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 豚鼠Prestin基因的扩增与提取 |
| 2.2.2 Prestin原腺相关病毒(pAAV)质粒构建 |
| 2.2.3 AAV-2-Prestin载体的制备 |
| 2.2.4 AAV-2-Prestin载体转染培养HEI-OC1细胞 |
| 2.2.5 重组Prestin腺相关病毒载体构建 |
| 2.2.6 原位凝胶制备 |
| 2.2.7 实验动物 |
| 2.2.8 鼓膜穿刺鼓室给药 |
| 2.2.9 免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布 |
| 2.2.10 耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白 |
| 2.2.11 耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测Prestin |
| 2.2.12 Western-Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pAAV-Prestin原病毒质粒验证 |
| 3.2 AAV-2-Prestin转染HEI-OC1细胞Prestin表达结果 |
| 3.3 重组腺相关病毒耳蜗转染分布 |
| 3.4 重组腺相关病毒毛细胞转染分布 |
| 3.5 基底膜毛细胞Prestin基因转染 |
| 3.6 基底膜毛细胞Prestin表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 不足之处及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表和完成的论文 |
| 攻读硕士学位期间申报的专利 |
（10）重组腺相关病毒载体介导的miR-21过表达调节调亡因子PDCD4促进神经元轴突再生的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 改良Allen's法建立大鼠挫伤型SCI模型 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料和试剂 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 大鼠脊髓损伤(SCI)模型的构建 |
| 1.2.2 术后动物饲养及护理 |
| 1.2.3 术后观察指标及方法 |
| 1.2.4 组织学观察(标本采集及免疫荧光染色) |
| 1.2.5 统计学处理 |
| 结果 |
| 1.1 大鼠挫伤型SCI模型的成功建立 |
| 1.2 观察生理状态和大鼠运动功能的检测 |
| 1.3 组织免疫荧光染色观察 |
| 讨论 |
| 1. SCI模型动物的选定 |
| 2. 建立SCI模型方法的选定 |
| 3. 致伤节段及损伤程度的选择 |
| 4. 模型效果的评价 |
| 第二章 大鼠脊髓损伤后miR-21及凋亡因子PDCD4、PTEN的表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 本实验中使用的引物序列 |
| 2.1.5 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组 |
| 2.2.2 动物模型的制备以及建模后处理同实验一。 |
| 2.2.3 实验样品采集 |
| 2.2.4 实时定量PCR检测脊髓组织中miR-21的表达 |
| 2.2.5 Western Blot检测脊髓组织中PDCD4和PTEN的表达 |
| 2.2.6 实验数据的统计学处理 |
| 结果 |
| 2.1 大鼠脊髓损伤后miR-21的表达 |
| 2.2 大鼠脊髓损伤后PDCD4、PTEN的表达 |
| 讨论 |
| 1. 脊髓损伤的治疗 |
| 2. miRNA在中枢神经系统的作用 |
| 3. miR-21参与疾病的主要机制 |
| 4. PDCD4的结构及功能 |
| 5. PTEN的结构及功能 |
| 第三部分 重组腺相关病毒载体介导miR-21过表达通过抑制凋亡蛋白PDCD4促进轴突再生 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 3.1 实验材料和试剂 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要实验仪器 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.1.4 本实验中使用的引物序列 |
| 3.1.5 本实验中使用的质粒 |
| 3.1.6 主要试剂配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞总RNA的提取 |
| 3.2.2 细胞总RNA反转录 |
| 3.2.3 RT-PCR检测细胞样品中miR-21的表达 |
| 3.2.4 脂质体转染实验 |
| 3.2.5 细胞总蛋白质的提取 |
| 3.2.6 细胞总蛋白质含量的测定(BCA法) |
| 3.2.7 大鼠脊髓神经元的分离与原代培养 |
| 3.2.8 rAAV-pri-miR-21感染大鼠脊髓神经元 |
| 3.2.9 大鼠脊髓神经元免疫荧光染色 |
| 3.2.10 Western Blot检测大鼠脊髓神经细胞中PDCD4和PTEN的表达 |
| 3.2.11 荧光素酶报告实验 |
| 3.2.12 实验数据的统计学处理 |
| 结果 |
| 3.1 胎鼠脊髓神经元原代培养及感染率 |
| 3.2 重组腺相关病毒载体成功过表达miR-21 |
| 3.3 miRNA-21过表达对PDCD4、PTEN的影响 |
| 3.4 miR-21过表达可促进轴突再生和突触形成 |
| 3.5 miR-21抑制靶蛋白PDCD4的表达 |
| 讨论 |
| 3.1 脊髓神经元应用rAAV-pri-miR-21的安全性及效果 |
| 3.2 miR-21对脊髓神经元PDCD4和PTEN表达的影响 |
| 3.3 miR-21对脊髓神经元轴突生长的影响 |
| 总结和展望 |
| 一、总结 |
| 二、不足及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA-21对脊髓损伤的保护作用机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 脊髓损伤简介 |
| 2.1 概念 |
| 2.2 MRI诊断 |
| 2.2.1 MRI诊断方法 |
| 2.2.2 MRI在脊髓损伤中的诊断价值 |
| 2.3 脊髓损伤的治疗 |
| 3. MicroRNA-21简介 |
| 3.1 概念 |
| 3.2 在疾病诊疗中的应用 |
| 4. MicroRNA-21对脊髓损伤的保护作用 |
| 4.1 microRNA-21在脊髓损伤中的抗凋亡作用 |
| 4.2 microRNA-21凋亡相关基因在脊髓损伤中的作用 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文和参加的课题 |
| 发表论文 |
| 参加的课题 |
| 英文缩略语表 |
| 致谢 |
四、腺相关病毒载体应用的研究进展（论文参考文献）
- [1]肝调畅情志功能失常病变机制探索 ——从ALLO介导海马脑区GABAAR δ亚基探查PMDD肝气郁证发病及药物干预机制[D]. 张浩. 山东中医药大学, 2021
- [2]AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建[D]. 常宇鑫. 吉林大学, 2021(01)
- [3]卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探[D]. 鲁愿. 华中农业大学, 2021(02)
- [4]锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究[D]. 路艳杰. 黑龙江八一农垦大学, 2021
- [5]重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒对宫颈癌细胞的作用研究[D]. 杨小娟. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [6]重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究[D]. 陈鑫. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]表达猪伪狂犬病毒gD和gB蛋白的重组腺相关病毒的构建及小鼠免疫试验[D]. 张胜. 华中农业大学, 2020(05)
- [8]腺相关病毒9型在小鼠体内的分布研究及安全性评价[D]. 孙英杰. 郑州大学, 2020(02)
- [9]耳蜗外毛细胞Prestin过表达病毒载体的构建与应用研究[D]. 林寿凯. 广东药科大学, 2020(01)
- [10]重组腺相关病毒载体介导的miR-21过表达调节调亡因子PDCD4促进神经元轴突再生的研究[D]. 蒋羽清. 苏州大学, 2019(05)