一、两种方法检测丙氨酸氨基转移酶的比较（论文文献综述）
何婷,倪雪晨,张萍萍,陈茹,宋晶晶,雷佳,王行国[1]（2021）在《大肠杆菌氨基转移酶的非天然氨基酸底物特异性研究》文中认为氨基转移酶催化L-氨基酸和α-酮酸之间的氨基转移.TLC（薄层层析）和甲臜颜色反应检测大肠杆菌4种氨基转移酶（TyrAT、IlvAT、AspAT和AvtAT）催化6种非天然氨基酸的转氨活性,发现AvtAT和AspAT无非天然氨基酸转氨活性. TyrAT能催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正缬氨酸的转氨反应,而IlvAT则催化DL-高苯丙氨酸、L-正缬氨酸、L-正亮氨酸、L-叔亮氨酸和L-新戊基甘氨酸的氨基转移.使用易错PCR突变和DL-高苯丙氨酸/L-正亮氨酸作氮源定向进化筛选,获得10个不同位点突变的TyrAT突变酶.酶活分析发现,这些突变酶虽酶活不同但尚未扩展TyrAT的非天然氨基酸底物特异性.10个突变酶中,每个酶蛋白210位都出现Cys替换Phe.与野生型酶比较,TyrAT的F210C突变明显改变酶的催化最适温度并且提高酶在37℃的催化效率.
牧其尔[2]（2021）在《聚乙二醇化凝胶多糖纳米颗粒型药物载体的合成及其生物相容性的研究》文中认为RNA干扰技术是指利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）通过高效、特异性的识别互补序列直接降解目标信使RNA（mRNA）的一种机制,然而如何将外源性小干扰RNA（siRNA）安全、有效的递送到靶细胞是RNA干扰技术研究的关键。阳离子聚合物载体因其生物相容性和生物降解性好,原材料价格便宜易得和低毒性等特点引起了研究者的关注。本课题组前期研究出的水溶性凝胶多糖（Curdlan）衍生物6AC-100具有良好的细胞转染效率,但是具有较大的细胞毒性,从而限制了在体内的应用。本论文通过对6AC-100进行修饰,成功的降低了其细胞毒性,解决了在体内和体外毒性高的问题。首先,我们合成了一种含有二硫键的聚乙二醇化PEG（命名为2S PEG）,然后以6AC-100为骨架,按照4种不同投料比（5%、10%、20%、40%）的2S PEG对其进行修饰,制备出了4种PEG化的Curdlan阳离子聚合物,分别命名为6AC-100-5%2S PEG、6AC-100-10%2S PEG、6AC-100-20%2S PEG和6AC-100-40%2S PEG。通过核磁共振波谱、凝胶渗透色谱、元素分析、琼脂糖凝胶电泳、激光粒度和电动电势对四种阳离子聚合物的结构、分子量、取代度、与siRNA的结合能力、粒径大小以及稳定性进行了测定。实验结果表明,四种阳离子聚合物的取代度分别为3.4%、3.94%、7.33%、10.71%。PEG化对四种阳离子聚合物的siRNA结合能力没有明显的抑制作用,当氮磷比（N/P）为2时,四种阳离子聚合物能够完全结合siRNA。由四种阳离子聚合物分别形成的颗粒,其粒径为纳米级,在最佳基因递送范围内,其ζ电位都较高,在溶液中的稳定性好。其次,对四种阳离子聚合物纳米颗粒的细胞毒性（Hep G2细胞、N2a细胞）、在Hep G2细胞上核酸（FITC-siRNA）递送能力和对红细胞的溶血作用进行了测定。实验结果表明,与未PEG化的6AC-100相比,四种阳离子聚合物纳米颗粒对Hep G2细胞、N2a细胞的毒性显着降低,在最高浓度90μg/m L时,细胞存活率分别能达到50%和55%以上,其中6AC-100-40%2S PEG的毒性最低,在最高浓度时,两种细胞上的存活率分别能达到65%和70%以上;在Hep G2细胞上递送FITC-siRNA的能力较高,能达到90%以上,其中6AC-100-40%2S PEG的转染FITC-siRNA的效率最高,转染效率为95.66%;四种阳离子聚合物纳米颗粒对红细胞的溶血作用与6AC-100相似。最后,我们选取细胞毒性低、转染效率高的6AC-100-40%2S PEG作为下一步实验的研究对象,在体内对其进行了血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的测定、半数致死量（LD50）和递送Cy3-siRNA能力的测定。实验结果表明,与未治疗组相比,6AC-100-40%2S PEG和6AC-100的ALT/AST值没有明显的差别,说明对小鼠的肝损伤程度低。6AC-100-40%2S PEG的LD50值为8.97 mg/每公斤体重,明显大于6AC-100的LD50值（6.82mg/每公斤体重）,说明其在体内的毒性低。6AC-100-40%2S PEG能把Cy3-siRNA递送到肺、肝脏、脾等器官。通过上面的实验,我们证实了6AC-100-40%2S PEG不仅毒性低,而且具有携带并释放核酸的能力,是一个极有潜力的核酸递送载体。综上所述,我们合成出了一种新型的、取代度高、毒性低、转染效率高、生物相容性好的阳离子聚合物纳米颗粒,为以后的阳离子聚合物纳米颗粒递送载体研究奠定了基础。
杨琪琳[3]（2021）在《黄酒酵母β-苯乙醇合成途径中关键酶的催化特性解析》文中认为β-苯乙醇具有典型的玫瑰芬芳,是料酒、香醋中最重要的芳香醇。料酒及香醋中的β-苯乙醇主要来自于黄酒原料,目前关于相关产品中β-苯乙醇合成代谢调控信息缺乏,阻碍了其中β-苯乙醇浓度的调节,限制了产品品质提升,困扰着生产企业。研究发现黄酒酵母是相关产品中β-苯乙醇的主要来源,但目前鲜有关于黄酒酵母β-苯乙醇合成代谢调控机理的报道,由于酿酒酵母亚种间复杂的代谢多样性,现有代谢网络模型也不能够准确反应我国特色菌株——黄酒酵母的代谢特性。本研究以黄酒、料酒、香醋酿造的核心微生物黄酒酵母HJ为研究对象,通过分子生物学手段从酶活水平揭示黄酒发酵过程中β-苯乙醇合成代谢途径酶的调控机理。主要结论如下:1.基于同源建模对关键酶的性质和结构进行预测分析。明确了黄酒酵母HJ（Saccharomyces cerevisiae,HJ）和酿酒酵母模式菌株S288C在β-苯乙醇合成途径关键酶的氨基酸序列信息,利用DNAMAN进行多序列比对,筛选出20个差异基因,进而使用Prot Param、TMHMM 2.0等生物信息学软件对差异蛋白的性质进行预测分析,基于同源建模和已有研究结果,初步选择β-苯乙醇主要合成途径艾利希途径的苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p以及醇脱氢酶Adh1p作为下一步研究的重点对象。2.苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p。对纯酶的酶学性质研究结果表明:苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的最适反应p H为6.0,最适反应温度为30℃;在最适条件下,Aro9pHJ的酶活(17.86 U·g-1)与Aro9pS288C(17.61 U·g-1)大小相当。动力学分析结果表明:Aro9p存在受酮酸抑制的现象,未得到苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的动力学参数,但当底物L-苯丙氨酸的浓度达到2 m M时,Aro9pHJ的反应速率(23.89μmol·（min?g）-1)高出Aro9pS288C(21.3μmol·（min?g）-1)12.16%。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:Aro9pHJ随着β-苯乙醇浓度的增加,耐受β-苯乙醇能力比Aro9pS288C强,当β-苯乙醇浓度为200 mg·L-1时,苯丙氨酸氨基转移酶Aro9pHJ的比酶活(18.69 U·g-1)高Aro9pS288C约30.52%。在添加40%vol的乙醇的条件下,Aro9pHJ的相对酶活剩余90.84%,Aro9pS288C的相对酶活剩余78.02%,表现为Aro9pHJ更耐受高浓度的β-苯乙醇和乙醇。3.苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组苯丙酮酸脱羧酶Aro10p。对纯酶的酶学性质研究结果表明,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的最适反应p H为7.0,最适反应温度为40℃;且在最适条件下,Aro10pHJ的比酶活(77.81U·g-1)比Aro10pS288C(62.0 U·g-1)高约25.49%。动力学分析结果表明:在同一底物苯丙酮酸的条件下,Aro10pHJ的kcat/Km值(35.7 L·（μmol?min）-1)表现和Aro10pS288C的kcat/Km值(35.8 L·（μmol?min）-1)相当,但Aro10pHJ与底物苯丙酮酸的亲和力相对强于Aro10pS288C。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:β-苯乙醇和乙醇会严重抑制苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的催化活性,Aro10pHJ耐受β-苯乙醇和乙醇的能力略高于酿酒酵母Aro10pS288C。4.醇脱氢酶Adh1p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组醇脱氢酶Adh1p。对纯酶的酶学性质研究结果表明,醇脱氢酶Adh1p的最适反应p H为7.5,最适反应温度为40℃;且在最适条件下,Adh1pHJ的比酶活(231.51 U·g-1)比Adh1pS288C(203.48 U·g-1)高约13.79%。动力学分析结果表明:以苯乙醛为底物时,Adh1pHJ与底物苯乙醛的亲和力大于Adh1pS288C,且Adh1pHJ的催化效率也较大。而以乙醛为底物时,Adh1pHJ与底物乙醛的亲和力和催化效率较小。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:外源添加0 mg·L-1-300 mg·L-1的β-苯乙醇的情况下,醇脱氢酶对底物乙醛的催化反应会仍旧保持高催化活性,且黄酒酵母菌株的Adh1pHJ耐受β-苯乙醇的能力相对来说高于酵母模式Adh1pS288C,而对底物苯乙醛,乙醇抑制一定的酶活,但黄酒酵母菌株Adh1pHJ耐受乙醇的能力相对高于酵母模式Adh1pS288C。综上所述,本研究通过基于对黄酒酵母HJ的β-苯乙醇合成代谢途径关键酶的功能性质与结构预测,进而对于来自黄酒酵母HJ和酿酒酵母模式菌株S288C的艾利希途径的苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p以及醇脱氢酶Adh1p的酶学性质进行比较分析,为调控传统发酵食品中β-苯乙醇含量提供方法学和理论依据,有助于解决料酒及香醋增香的共性关键科学问题,对于改进酿造技艺、提升产品品质和推动料酒及香醋行业的“供给侧”改革具有重要意义。
翟李欣[4]（2021）在《芽孢杆菌转氨酶的筛选改造及其在西他沙星前体合成中的应用》文中提出西他沙星（Sitafloxacin Hydrate）作为一种含有手性胺结构的广谱喹诺酮类抗菌药,一直因其五元环关键中间体的不对称合成而成为影响生产的关键技术难点。转氨酶（Transaminases,TAms;EC 2.6.1.X）广泛存在于自然界中并在生物的细胞氮代谢过程中发挥着非常重要的氨基转移作用,具有高对映选择性和区域选择性,高的反应速率和稳定性,环境友好性等多数优点。综上所述,开发一条先进的、稳定的、成本低廉的转氨酶催化生产西他沙星五元环关键中间体的工艺是市场的必然要求,对于推动该药品在国内市场的发展有重大意义。论文以实验室已经进行全基因组测序的3株芽孢杆菌为出发菌株,对其中的所有转氨酶基因进行了初步的生物信息学分析和分类,筛选出具有特定转氨活性潜力的转氨酶基因;并对该基因进行诱导表达纯化和活性验证;同时探究转氨酶的结构和相应的催化底物机理;通过整合现代药物化学、生物信息学、基因工程和蛋白质工程等技术,对转氨酶进行改造以应用于西他沙星关键中间体的合成,为建立利用芽孢杆菌产转氨酶的发酵工艺和利用该酶进行相关底物手性合成的工艺,最终实现规模化生产奠定基础。主要的研究结果如下:（1）通过基因组注释在三株芽孢杆菌的基因组中筛选出89个具有编码生物催化剂潜力的转氨酶基因,分别命名为Ota1-28,Otae1-32和Otaf1-29。对存在于三个芽孢杆菌基因组中的转氨酶基因进行结构域分析和分类,发现基因ota3和ota8为代表的7个基因所编码的转氨酶属于PLP-依赖性折叠Ⅳ型超家族;基因ota11和otaf29为代表的7个基因所编码的转氨酶属于谷氨酰胺转氨酶II型超家族;基因ota5和otae24编码的转氨酶具有氨基甲基转移酶叶酸结合结构域;而基因ota14编码的转氨酶属于NAD（P）+-依赖酶的醛脱氢酶超家族;基因otaf4编码的转氨酶属于氨基转移酶Ⅴ类超家族;其余71种转氨酶基因所编码的蛋白属于天冬氨酸转氨酶超家族（I型）。这71个转氨酶基因中的otae1和otaf13基因编码的酶不仅具有天冬氨酸转氨酶超家族（I型）的特征,而且还具有腺苷酸形成结构域,以及I类超家族和缩合酶的特征,即上述两种酶具有多个结构域。根据系统发育树和结构域分类,同属PLP-依赖性折叠Ⅳ型超家族（PLPDE＿IV）的转氨酶基因ota3、ota8、otae6、otae21、otaf1、otaf8和otaf26与来自Arthrobacter sp.KNK 168的典型的ω-ATs氨基酸序列具有非常高的同源性,并且具有ω-ATs的特征,而且这7个ω-转氨酶基因的活性位点（即催化位点,底物-辅因子结合口袋和PLP-绑定位点）具有高度保守性。因此,这7个转氨酶基因所表达的转氨酶（BPTA-1-7）可能拥有与来自Arthrobacter sp.KNK 168的典型的ω-ATs相似的生物化学活性。由于较低的序列相似度,这些酶可能是尚未被挖掘的新型转氨酶。（2）对高地芽孢杆菌W3基因组中的转氨酶基因ota3和来自Arthrobacter sp.KNK168的典型（R）-选择性ω-ATs基因进行了初步的生物信息学分析,发现这两个基因具有很高的同源性和较低的序列一致性（24.7%）。高保守性的结构域说明转氨酶基因ota3所表达的酶可能具有与之相似的转氨酶活性。BPTA-1和典型（R）-选择性ω-ATs在大肠杆菌体内,酵母体内和体外的哺乳动物网状细胞中的半衰期基本是一样的。两个蛋白都不具有由Sec移位子转运并被信号肽酶I（Lep）裂解的“标准”分泌信号肽。基因ota3的ORF覆盖了整条基因,而典型（R）-选择性ω-ATs却不是。BPTA-1的不稳定性指数（II）为29.92,典型（R）-选择性ω-ATs为43.08,说明BPTA-1的理论稳定性会更高。为了增加转氨酶基因ota3在大肠杆菌中表达水平,进一步促进重组酶BPTA-1更容易被纯化,ota3基因被执行了密码子优化,即基因otas3。两个基因表达纯化后的蛋白质分子质量均为～33.4 k Da。转氨酶BPTA-1优先利用（R）-苯乙胺作为氨基供体,并对（S）-苯乙胺显示几乎没有活性,暗示具有（R）-选择性。转氨酶BPTA-1催化反应的最优条件是45℃和p H值7.0,BPTA-1的稳定性保留在20℃和p H值7.0。（3）转氨酶BPTA-2与BPTA-1进行了比较分析,发现它们具有相同类型的转氨酶的共性,例如,催化位点是赖氨酸,并且它们都是同源二聚体,都不具有由Sec移位子转运并被信号肽酶I（Lep）裂解的“标准”分泌信号肽等。也揭示了两种酶在底物辅因子结合口袋,分子量和二级结构的比例上的差异。即残基V151可能是酶BPTA-1和BPTA-2活性差异的关键原因。BPTA-2的分子质量为～40.0 k Da。对二级结构研究发现酶BPTA-2具有较高的α-螺旋比例（30.5%）使其比酶BPTA-1（20.0%）具有更稳定的结构。AFM实验结果表明酶BPTA-1和酶BPTA-2可能在自然界中以聚合的形式存在,并以相同的形式进行相应的转氨反应。BPTA-2具有与BPTA-1相同的立体选择性,和较高的酶活性（2.1207±0.20 U/mg）。BPTA-2催化反应的最优条件是35℃和p H值9.0。酶BPTA-1比BPTA-2对p H和温度更敏感,因此所涉及的催化反应对周围环境有更高的要求。（4）通过AFM实验发现单点突变体I215M单个酶团簇的尺寸大于野生酶BPTA-1（直径是BPTA-1的1.32倍）。通过分析野生型和突变酶的酶活和生化特性发现,突变体I215M,I215F和Y32L相较于野生酶酶活分别提高了7.03倍,2.80倍,9.75倍;K155A,I215V和T252A完全丧失了酶活性。因此,残基K155和T252对酶催化活性的影响特别大。而所构建的单点突变体依旧无法催化合成（S）-5-苄基-5-氮杂螺[2.4]庚-7-胺。（5）多点突变体（L212M/I215M,Y32L/S190A/L212M/I215M,Y32L/Y159F/T252A和Y32W/Y159F/I215M/T252A）对（S）-5-苄基-5-氮杂螺[2.4]庚-7-胺的转化率分别为77.4%,79.0%,79.0%和77.1%。其中,突变体Y32L/Y159F/T252A和Y32W/Y159F/I215M/T252A可以接受和合成（R）-α-苯乙胺,尽管转化率极低（<8%）。从底物专一性的角度分析,突变体L212M/I215M和Y32L/S190A/L212M/I215M更适合用于抗生素西他沙星的工业生产。这项工作不仅为西他沙星水合物的中间体的生物酶生产奠定了实验基础和潜力,还提供了转氨酶BPTA-1活性和底物选择性之间的结构和功能关系的见解。并为快速筛选用于酶促生产的手性胺药物建立了理论和实验基础。
朱灵桓[5]（2021）在《代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇》文中研究说明β-苯乙醇（2-phenylethanol,2-PE）是一种具有玫瑰香气的芳香醇,因其优越的物化性质而被广泛应用于食品、日化、医药等领域。目前β-苯乙醇的工业生产方法以成本较高的物理提取法和污染严重的化学合成法为主,这极大地限制了β-苯乙醇的应用范围。利用微生物合成法制备β-苯乙醇具有产品品质优良、环境友好等优势,逐渐成为国内外研究的热点。本课题以酿酒酵母CICC31906 WT-A为研究对象,围绕β-苯乙醇的合成路径解析展开。通过莽草酸途径的改造,实现β-苯乙醇以葡萄糖为前体的从头合成;通过艾氏途径的异源酶表达,建立氨基受体回补的高效合成策略;基于组学技术,在酿酒酵母抗β-苯乙醇胁迫及高产菌株中,解析合成途经相关的调控机制,挖掘关键基因。主要研究内容和主要成果如下:（1）在酿酒酵母中构建以葡萄糖为前体的芳香醇合成途径。解除关键酶的反馈抑制,筛选并表达抗反馈抑制的异源酶,分别为大肠杆菌来源的抗反馈抑制的DAHP合酶(由基因aro GD146N编码)和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶双功能酶(由基因phe Afbr编码)。发现了限制酿酒酵母五功能酶Aro1p反应速率的关键节点是莽草酸,表达了大肠杆菌来源的莽草酸激酶基因aro L和莽草酸脱氢酶基因ydiB。敲除L-苯丙氨酸转氨酶基因ARO9同时过量表达苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10以减少苯丙酮酸分流,并比较敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1和过表达酮醛转移酶基因TKL1的合成效果。基于上述整合与游离高效表达系统的芳香醇合成途径的组装和表达,酿酒酵母以葡萄糖为碳源、酵母粉与不含硫酸铵和氨基酸的YNB为氮源,合成酪醇与β-苯乙醇的产量分别提高至543 mg/L和641 mg/L,是对照菌株WT-A的5.7倍和6.1倍。（2）利用异源酶的表达在酿酒酵母中搭建β-苯乙醇的高效转化途径。通过单因素筛选,将大肠杆菌来源的L-苯丙氨酸转氨酶Tyr B、乳酸乳球菌来源的苯丙酮酸脱羧酶Kdc A和酿酒酵母来源的乙醛脱氢酶Adh2融合表达于酿酒酵母中,以L-苯丙氨酸为主要氮源的摇瓶发酵得到β-苯乙醇产量为3.13 g/L。其次,引入链霉菌来源的L-谷氨酸氧化酶,实现转氨反应的氨基受体α-酮戊二酸的回补。发现丙酮酸脱羧酶基因PDC5的缺失对β-苯乙醇的合成具有明显的促进作用,整合上述因素对艾氏途径重构优化,以6.7g/L的L-苯丙氨酸为前体进行发酵,β-苯乙醇的产量由对照菌株WT-A的2.88 g/L提高至3.59 g/L,对L-苯丙氨酸的摩尔转化率为0.72 mol/mol。（3）基于转录组学,解析PDC5的敲除促进β-苯乙醇合成的调控机制。酿酒酵母pdc5△突变株RM22在以L-苯丙氨酸为前体的培养基中β-苯乙醇产量比对照菌株WT-A高28%。通过对照菌株WT-A和突变株RM22的转录组测序分析,发现涉及氧化还原、胁迫应答等功能的87个基因发生差异表达,其中60个基因显着上调,27个基因显着下调;与此相关的有27个途径,包括细胞内代谢、次级代谢产物的生物合成和氨基酸的生物合成等。通过对β-苯乙醇合成相关的差异表达基因进行分析与验证,确定编码芳香族氨基酸转氨酶基因ARO9的上调是引起菌株RM22中β-苯乙醇合成量增加的主要原因。（4）基于重测序与比较基因组学,在酿酒酵母中挖掘耐受和合成β-苯乙醇的关键基因。通过适应性进化的方法筛选出耐受高浓度β-苯乙醇胁迫的酿酒酵母菌株AD032,其耐受β-苯乙醇和合成β-苯乙醇的能力与对照菌株WT-A相比都有显着提高。从此菌株出发,得到的重组菌株KM032(AD032 pdc5△PTPI-tyr B-kdc A-ADH2 PTPI-LGOX)以6.7 g/L的L-苯丙氨酸为前体进行发酵,β-苯乙醇的产量为4.26 g/L,对L-苯丙氨酸的摩尔转化率为0.86 mol/mol。通过对菌株AD032的重测序和比较基因组学分析,发现涉及生物过程、细胞过程和分子功能等的113个基因或ORF的191个氨基酸位点发生突变。进一步探讨和挖掘与β-苯乙醇代谢相关的关键基因,突变基因中己糖转运蛋白（HXTs）、泛素（UBI4）以及相关调控因子（SWI1-SNF2）的过表达均能显着提高酵母细胞合成β-苯乙醇的能力。假定的芳基乙醛脱氢酶编码基因AAD15及突变体均不能将苯乙醛还原为β-苯乙醇。
刘皎皎[6]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中指出目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
贾佳静[7]（2021）在《血清丙氨酸氨基转移酶水平对血压水平及成人高血压发病风险的影响》文中进行了进一步梳理背景高血压疾病作为高致死性的心血管及脑血管疾病的重要诱发因素,影响全球约14亿人口。截止至2018年,我国18岁以上成年人高血压的患病率为23.20%,35-75岁成年人中患病率高达37.20%,给个人、家庭和社会造成了沉重的疾病负担。大量研究证据证实高血压疾病与肝脏脂肪蓄积及肝脏代谢异常引起的血清脂蛋白异常密切相关。然而,血清丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）水平作为肝脏脂肪蓄积的最敏感指标,与高血压疾病间的关联仍存在争议。本研究分别采用横断面研究和前瞻性队列研究两种研究设计方法,探讨了成年人群中血清ALT水平与高血压及血压水平之间的关联,并进一步分析了常见高血压危险因素对血清ALT水平与高血压间关联的交互作用,最后探讨了血清ALT水平下降对高血压发病风险的影响。方法第一部分血清丙氨酸氨基转移酶与血压水平及高血压患病风险的相关性研究采用横断面研究设计方法,基于国家免费孕前优生健康检查项目（National Free Preconception Checkups Project,NFPCP）,纳入 2016-2017 年在全国 31 个省、自治区和直辖市,共2907个县（区、市）参加NFPCP的人群作为研究对象。健康检查过程中,采用常规全自动生化分析仪,并根据仪器选择适用的试剂盒在340nm波长处连续监测血清样本中吸光度的下降速率,从而计算出血清ALT的活性单位;并采用经过验证的上臂式医用电子血压计测量其静坐状态下的上臂血压。本次研究中,将血清ALT水平分为3组。分组I包括ALT正常组（ALT≤40U/L）和ALT异常组（ALT>40U/L）;分组Ⅱ包含5层,即从最低血清ALT水平（≤20 U/L）至最高水平（>80U/L）每层依次增加20U/L;分组III包括四分位数分组,即Q1:≤14 U/L、Q2:14.01-20 U/L、Q3:20.01-30 U/L 和 Q4:>30 U/L。根据世界卫生组织（World health organization,WHO）的诊断标准,将高血压定义为 SBP≥140 mmHg和（或）DBP≥90mmHg。采用多因素Logistic回归模型评估血清ALT水平与高血压在总人群及不同亚组人群中的关联,关联强度指标包括比值比（Odds ratio,OR）及其95%置信区间（Confidence Intervals,CI）。采用多元线性回归模型评估血清ALT水平与收缩压（Systolic blood pressure,SBP）及舒张压（Diastolic blood pressure,DBP）水平的关联,估计不同血清ALT水平所对应的校正性别及年龄后血压水平的最小二乘均数（Least-squares means,LS-means）。采用限制性立方样条（Restricted cubic spline,RCS）函数拟合血清ALT水平与高血压的暴露反应关系。采用分层分析评估超重/肥胖、饮酒、吸烟、高血糖和乙肝表面抗原（HepatitisB surfaceantigen,HBsAg）阳性对血清ALT与高血压关联的交互作用。最后采用敏感性分析评价血清ALT水平与高血压关联的稳健性。第二部分血清丙氨酸氨基转移酶与血压水平及高血压发病风险的前瞻性研究采用前瞻性队列研究设计方法,基于开滦队列研究的数据,纳入2006年在开滦集团所属11家医院中进行健康体检的在职及离退休职工作为研究对象,随后每两年进行一次健康体检并收集相关资料作为随访信息。截止至2017年12月31日,共进行了6次随访,形成了资料充实且完备的前瞻性队列。体检过程中,采用统一标准的全自动生化分析仪和统一品牌的试剂盒测量血清ALT水平,所有操作均按照试剂盒说明书的要求严格执行;采用经校正的汞柱式血压计测量座位时右侧肱动脉血压,取连续测量3次测量血压读数的均值。本次研究中,将血清ALT水平分为3组。分组Ⅰ包括ALT正常组（ALT≤40U/L）和ALT异常组（ALT>40U/L）;分组Ⅱ包括血清ALT水平四分位数分组,即Q1:≤12 U/L、Q2:12.01-17 U/L、Q3:17.01-24 U/L 和 Q4:>24U/L;分组Ⅲ包含 5 层,即从正常范围内血清ALT最低水平（≤10U/L）至ALT异常（>40U/L）每层依次增加10U/L。将随访终点事件定义为5次随访过程中至少有2次定义为高血压。每次随访中高血压的定义为SBP≥140mmHg和（或）DBP≥90mmHg和（或）服用降压药物。采用多因素Cox回归模型评估基线血清ALT水平与高血压发病风险的关联,关联强度指标包括风险比（Hazardratio,HR）及其95%CI。考虑到多因素Cox回归可能会出现不符合等比例假设的情况,采用多因素加权Cox回归模型重新评估基线血清ALT水平与高血压发病风险的关联及在不同亚组人群中的关联,关联强度指标包括平均风险比（Averagehazardratio,AHR）及95%CI。采用多元线性回归模型评估基线血清ALT水平与末次随访SBP及DBP的关联,并估算基线不同ALT水平所对应的校正性别和年龄后血压水平的LS-means。采用RCS函数拟合基线血清ALT水平与高血压发病风险的暴露反应关系。采用分层分析评估基线超重/肥胖、饮酒、吸烟、高盐摄入、脂肪肝及高甘油三酯对血清ALT与高血压发病风险的交互作用。采用敏感性分析评价基线血清ALT水平与高血压发病风险关联的稳健性。最后分析血清ALT水平状态的改变（是否恢复正常）对高血压发病风险的影响。结果第一部分血清丙氨酸氨基转移酶与血压水平及高血压患病风险的相关性研究本研究最终纳入研究对象21,103,790人,其中男性10,095,225（47.84%）人,女性11,008,565（52.16%）人,平均年龄为29.55岁。人群中血清ALT异常（>40 U/L）率为 11.67%,高血压（SBP≥140mmHg | DBP≥90mmHg）患病率为 4.21%。经多因素调整后,高血压的OR随血清ALT水平的增加呈上升趋势;相对于ALT正常组,ALT异常组高血压的OR为1.53（95%CI:1.53-1.54）;与ALT水平为0-20U/L组相比,正常范围内ALT升高（20.01-40 U/L）、ALT轻度升高（40.01-60 U/L）、ALT中度升高（60.01-80U/L）以及ALT重度升高（>80U/L）人群中高血压的 OR 分别增加了 22%、65%、76%和 90%（OR,1.22,95%CI:1.21-1.22;OR,1.65,95%CI:1.64-1.66;OR,1.76,95%CI:1.64-1.66;OR,1.90,95%CI:1.88-1.92）（P趋势性检验<0.001）。分组Ⅲ中,随血清ALT水平的升高,高血压的OR值呈线性增加趋势（P趋势性检验<0.001）。血清ALT水平与高血压间的关联在各亚组人群中一致。经多因素调整后,ALT水平与SBP、DBP呈正向线性相关（P<0.001,P<0.001）。相对于血清ALT正常组,ALT异常组所对应的经年龄、性别调整后的SBP、DBP平均升高了 4.16 mmHg和2.63 mmHg。血清ALT水平每升高20U/L,经年龄、性别调整后的SBP、DBP平均升高1.83 mmHg和1.20 mmHg。血清ALT水平每升高一个四分位数,经年龄、性别调整后的SBP、DBP平均升高1.50 mmHg和1.00 mmHg。交互作用分析结果显示,体质指数（Body mass index,BMI）≥24kg/m2、饮酒及空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）≥6.1 mmol/L对ALT与高血压间的关联具有协同效应（P<0.001）;吸烟和HBsAg阳性对ALT与高血压间的关联具有拮抗效应（P<0.001）。第二部分血清丙氨酸氨基转移酶与血压水平及高血压发病风险的前瞻性研究本研究最终纳入研究对象47,396人,其中男性35,525（74.95%）人,女性11,871（25.05%）人,平均年龄为47.69岁。人群中血清ALT异常（>40U/L）率为6.04%,平均随访时间约为9.23年,高血压（SBP≥140mmHg | DBP≥90mmHg）的累积发病率为28.05%。经多因素调整后,高血压的HR随基线血清ALT水平的增加呈上升趋势;相对于ALT正常组,基线ALT异常组高血压的AHR为1.14（95%CI:1.07-1.22）;分组Ⅱ中,随血清ALT水平的升高,高血压的发病风险呈线性增加趋势（P趋势性检验<0.001）。即使血清ALT水平处于正常范围内,与0-10U/L相比,基线ALT水平在 10.01-20 U/L、20.01-30 U/L、30.01-40 U/L 和>40 U/L 组中高血压的 AHR分别增加了 10%、19%、34%和 31%（AHR,1.10,95%CI:1.04-1.17;AHR,1.19,95%CI:1.12-1.27;AHR,1.34,95%CI:1.23-1.44;AHR,1.31,95%CI:1.21-1.43）（P趋势性检验<0.001）。基线血清ALT水平与高血压发病风险的关联在各亚组人群中一致。经多因素调整后,基线ALT水平与SBP、DBP呈正向线性相关（P<0.001,P<0.001）。相对于ALT正常组,基线血清ALT异常组所对应的经年龄、性别调整后的SBP、DBP平均升高了 5.20 mmHg和3.03 mmHg。血清ALT水平每升高一个四分位数所对应的SBP、DBP平均升高1.63 mmHg和0.48 mmHg。基线正常范围内血清ALT水平每升高10U/L,经年龄、性别调整后的SBP、DBP平均升高2.00 mmHg 和 0.82 mmHg。交互作用分析结果显示,基线时BMI≥24 kg/m2、饮酒、脂肪肝及甘油三酯（Triglyceride,TG）≥2.26 mmol/L对高血压发病风险的影响可能大于基线血清ALT异常对高血压发病风险的影响（P<0.001）;吸烟和盐摄入增加对血清ALT水平与高血压的发病风险无加性交互作用。以基线及随访期间血清ALT水平均正常者作为参照组,基线和/或随访期间血清ALT异常者高血压的AHR均增加;相对于基线及随访期间血清ALT水平均异常者,基线血清ALT水平异常但随访期间血清ALT水平恢复正常者高血压的AHR降低了 34%,分别为 1.45（95%CI:1.27-1.65）和 1.11（95%CI:1.02-1.22）。结论血清ALT水平不仅与成人当前的血压水平及高血压患病风险相关联,还能影响其远期的血压水平及高血压的发病风险。同时,血清ALT水平与当前及远期的血压水平呈线性正相关。多个常见危险因素对血清ALT水平与高血压疾病间的关联具有交互作用。此外,血清ALT水平异常的人群中,ALT水平恢复正常则能够降低其高血压的发病风险。研究结果提示,保持肝脏健康状态有利于降低高血压的发生风险。
曾令江[8]（2021）在《莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究》文中指出莨菪碱（Hyoscyamine）是茄科药用植物产生的代表性抗胆碱天然药物,其消旋体为着名药物阿托品（Atropine）。莨菪碱和阿托品均属于托品烷生物碱（Tropane alkaloids,TA）,莨菪碱在临床上广泛用于胃肠道不适、止痛解痉、治疗癫痫、晕车晕船等。茄科药用植物是工业化生产提取莨菪碱的唯一有效来源。其中,颠茄（Atropa belladonna L.）、草本曼陀罗（Datura stramonium）、三分三（Anisodus acutangulus）和澳洲毒茄杂交种（Duboisia×hybrid）等是生产莨菪碱的主要药材。颠茄是被《中华人民共和国药典》收录且人工种植面积最大的莨菪碱的药用原料植物。然而,莨菪碱在这些茄科药用植物中的含量很低,这也成为莨菪碱工业化利用的主效限制因子,直接导致其有效供给不足、价格居高不下。因此,开展莨菪碱的生物合成研究,鉴定合成莨菪碱的关键酶和相关基因,阐明关键酶的活性及其催化机制,对于拓展关于TA生物合成的认识具有重要科学意义;采用代谢工程育种技术培育莨菪碱高产的颠茄,能够从源头上降低莨菪碱生产成本和解决药物资源供给不足的问题,具有重要经济价值。根据已有研究,科学家推测莨菪醛（Hyoscyamine aldehyde）是莨菪碱生物合成的直接前体,其可能会被特定的乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）还原生成莨菪碱,该酶有可能是提高莨菪碱产量的关键酶。此外,已有研究报道莨菪碱在莨菪碱6β-羟化酶（Hyoscyamine 6β-hydroxylase,H6H）催化下被转化为山莨菪碱并可进一步环氧化为东莨菪碱。因此阻断H6H介导的催化反应也是一种潜在的提高莨菪碱在植株中积累的代谢工程策略。本研究从颠茄中鉴定了一个在其侧根中高表达的乙醇脱氢酶基因并命名为莨菪碱脱氢酶基因（Hyoscyamine dehydrogenase,HDH）,对HDH催化活性和催化机制进行了研究,为采用代谢工程育种技术培育莨菪碱高产颠茄提供了一个重要基因;进一步研究HDH在颠茄莨菪碱生物合成中的代谢功能;考察了敲除Ab H6H基因对颠茄莨菪碱生物合成的影响。通过研究取得了以下结果:1.莨菪碱脱氢酶基因的克隆与表达研究采用表达相关性分析,从颠茄转录组中筛选获得了一个HDH候选基因的EST序列（aba＿locus＿4635）,随后采用末端快速扩增技术（Rapid-Amplification of c DNA Ends,RACE）获得了该候选基因1098 bp的全长c DNA。生物信息学分析结果显示,HDH属于氧化还原酶家族,编码1个含有366个氨基酸残基的多肽,其理论分子量为39 k Da。数字表达谱分析结果显示,HDH的组织表达模式与颠茄中已报道TA生物合成基因具有高度相似性,表现为在侧根中高水平表达。基于实时定量PCR的表达分析结果显示,HDH在颠茄侧根和主根中表达,在茎段和叶片中不表达;其在侧根中的表达量远高于在主根中的表达量。为进一步研究HDH在侧根中表达情况,从颠茄中克隆了1493 bp的HDH启动子（p HDH）片段。用p HDH驱动GUS报告基因表达,获得了转基因颠茄发根。对转基因颠茄发根的GUS染色和切片结果发现,p HDH主要在中柱鞘和内皮层特异性表达,这与TA生物合成途径中的PPAR和H6H等基因在中柱鞘表达结果具有高度相似性。上述关于HDH生物信息学和组织表达分析结果表明该基因极有可能是莨菪碱生物合成途径中的关键脱氢酶基因。2.莨菪碱脱氢酶的催化功能研究为研究HDH的催化功能,在大肠杆菌中重组并纯化获得了6×His-HDH重组蛋白,其分子量约为42.9 k Da,与HDH计算分子量吻合。HDH的底物（莨菪醛）极不稳定,很容易发生Retro-Claisen缩合反应。因此,莨菪醛不能在实验室制备也没有标准品可供购买。本研究采用体外连续催化的方法鉴定HDH还原莨菪醛功能:首先在酵母中表达CYP80F1并提取含有该酶的微粒体蛋白,在反应体系中加入海螺碱后,能够检测到莨菪醛（m/z为288.1584）的生成;在含有莨菪醛的该反应体系中加入纯化的重组HDH,能检测到莨菪碱的生产;而在对照反应体系中,未能检测到莨菪碱的生成。上述研究结果表明HDH能够将莨菪醛还原为莨菪碱。为进一步研究HDH作为还原酶的催化特性,使用莨菪醛的结构类似物苯乙醛作为底物对HDH的酶动力学进行了研究。HDH发挥还原酶催化活性的最适p H和温度分别为6.4和40°C。在最适反应条件下,HDH对苯乙醛的Km为44.46±10.73μM,kcat为228.4±21.39 min-1,kcat/Km为5.14 min-1.μM-1。由于HDH属于氧化还原酶家族,理论上能够氧化莨菪碱生成莨菪醛。以莨菪碱为底物,在反应体系中加入纯化的HDH,能够检测到莨菪醛。HDH发挥氧化酶催化活性的最适p H和温度分别为10.4和45°C。在最适反应条件下,HDH对莨菪碱的Km为33.36±4.69μM,kcat为7.49±0.51 min-1,kcat/Km为0.22 min-1.μM-1。通过比较HDH催化还原反应和催化氧化反应的kcat/Km,发现HDH的还原效率是其氧化效率的23.36倍。对HDH氧化莨菪碱的平衡常数测定结果表明,在p H 7.2（植物细胞生理p H）条件下HDH氧化活性很低。催化效率和平衡常数分析结果表明在植物细胞的生理p H条件下,HDH主要发挥还原酶功能。3.莨菪碱脱氢酶的催化机制研究为研究HDH将莨菪醛还原为莨菪碱的催化机制,采用结构生物学方法获得了分辨率为2.4?的HDH晶体结构。对HDH晶体结构分析发现,其是一个锌离子依赖的长链脱氢酶,包含两个结构域:一个由Rossman折叠组成的NADP（H）结合结构域;一个底物结合结构域。HDH催化活性中心包含一个由锌离子、Cys52、His74、Glu75和Cys168组成的四面体结构。Met124,Leu282和Ala305三个非极性氨基酸通过构型依赖的范德华力控制底物结合,构成了底物结合口袋。Ser54和Cys100两个极性氨基酸与底物的羰基形成氢键,是催化还原莨菪醛的关键残基。进一步采用点突变分析关键残基的功能,H74A点突变后,HDH对莨菪碱和苯乙醛均失去了催化活性;S54A还原苯乙醛的活性消失,其氧化活性极显着下降;C100G/Y/F三个点突变均保留了极低的催化活性。HDH点突变结果表明,Cys100可能与底物羰基形成氢键,从而稳定底物的朝向;Ser54在底物还原过程中,可能参与了质子传递。利用氘标记的[4-2H]NADPH研究了还原醛基的氢原子来源,只有以[4R-2H]NADPH作为辅因子时,才能检测到氘标记的还原产物,结果表明NADPH上的pro-R氢原子参与HDH催化的还原反应。4.过表达莨菪碱脱氢酶的代谢功能研究为研究HDH在莨菪碱生物合成代谢中的功能,采用基因工程技术获得了过表达HDH的颠茄发根。采用PCR对相关发根进行了检测,以区分对照发根和转HDH发根。在工程菌C58C1（p Ri A4、p BI121-HDH）中能够检测到423 bp的rol B基因片段、795 bp的NPTII片段和1184 bp的35S::HDH基因片段,在转HDH的发根也检测到上述相应基因片段。在对照农杆菌中C58C1（p Ri A4、p BI121）中能够检测到423 bp的rol B基因片段、795 bp的NPTII片段,但没有检测到1184 bp的35S::HDH基因片段;在用p BI121作为对照质粒转化的发根中,检测到rol B和NPTII的相应片段,而未能检测到35S::HDH片段。基因表达分析结果表明,转HDH基因发根中HDH表达量比对照得到了极大程度提高。分子检测结果表明,HDH基因整合到颠茄基因组中,同时其表达水平得到大幅度提高,意味着HDH介导的催化步骤得到强化。为了分析过表达HDH对颠茄TA合成的影响,采用LC-MS检测颠茄发根培养物中TA含量。结果显示对照发根中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量分别为1.35mg/g（DW）、0.69 mg/g（DW）和0.43 mg/g（DW）;过表达HDH的不同发根株系中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量分别为1.83～4.03 mg/g（DW）、1.16～1.73 mg/g（DW）和0.62～1.28 mg/g（DW）。上述研究结果表明在颠茄发根中过表达HDH能够有效促进莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的合成。虽然发根是代谢工程研究的有力工具,但由于其规模化培养技术并不成熟而难以实现商业化应用。本研究进一步采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法,培育获得了过表达HDH的颠茄植株。通过分子检测,鉴定出过表达HDH的转基因颠茄株系。过表达HDH颠茄植株中莨菪碱含量均得到显着提高。上述研究结果表明,HDH是一个能够有效提高颠茄植株中莨菪碱含量的重要基因。5.敲除莨菪碱6β-羟化酶提高莨菪碱含量的代谢工程研究莨菪碱6β-羟化酶（H6H）催化莨菪碱的6β-羟化转化为山莨菪碱,并能进一步将山莨菪碱环氧化为东莨菪碱。因此,敲除该基因可能会导致莨菪碱的积累水平提高。本文采用CRISPR/Cas9技术敲除颠茄H6H基因,并研究了敲除该基因对莨菪碱含量变化的影响。针对颠茄H6H第二外显子DNA序列设计了g RNA序列5’-TGGATTACCAGAAAAGCTGATGG-3’,并构建了植物表达载体p Cas9-H6H。在该表达载体中,g RNA由拟南芥U6启动子驱动表达;Cas9来源于酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）,由35S启动子驱动表达。经根癌农杆菌EHA105介导遗传转化获得了颠茄转基因植株,分子检测结果表明,在15株再生植物中,有11株为阳性转基因植物;转基因颠茄中H6H基因突变位点检测结果表明:11株转基因植物中,4株未发生编辑,7株被成功编辑,突变率约为63.6%;其中H9、H14和H15是纯合突变;H1为双等位突变;H4、H6和H8为单链突变。进一步对3个纯合突变的转基因颠茄植株进行生物碱含量分析,结果表明在纯合突变植株中均未检测到山莨菪碱和东莨菪碱,在根和叶中均出现莨菪碱的积累;在H9、H14和H15根中莨菪碱含量相对于野生型颠茄分别增加了3.68、4.21和4.28倍。在H9、H14和H15叶片中莨菪碱的含量分别比野生型增加了0.61、0.76和2.22倍。上述研究结果表明在颠茄植株中敲除H6H有效的阻止了莨菪碱向山莨菪碱和东莨菪碱的转化,从而增加了颠茄中莨菪碱的积累。综上所述,本研究包括两大部分研究内容:（1）莨菪碱脱氢酶（HDH）的分子生物学和生物化学研究;（2）莨菪碱的代谢工程研究。第一部分研究发现HDH在颠茄侧根中高水平表达并主要定位于中柱鞘和内皮层;HDH具有典型的氧化还原酶催化特征,既能将莨菪醛还原为莨菪碱,又能将莨菪碱氧化为莨菪醛,但在植物细胞生理p H条件下主要发挥还原酶的功能;酶动力学研究结果表明HDH是莨菪碱合成中的限速酶;HDH蛋白质晶体结构解析、关键氨基酸位点的突变和氘标记NADPH的饲喂示踪研究揭示了该酶的催化机制,其活性中心是一个由Zn2+、His74、Glu75、Cys52和Cys168组成的四面体结构;Met124、Leu282和Ala305三个非极性氨基酸构成底物结合口袋;His74、Ser54和Cys100是维持HDH催化活性的重要氨基酸;NADPH C4位的pro-R氢原子参与HDH催化的还原反应。第二部分研究发现过表达HDH能够提高颠茄发根和植株中莨菪碱的含量;敲除H6H能够阻断莨菪碱转化为山莨菪碱和东莨菪碱,并导致莨菪碱的积累和含量提高。HDH的表达分析和催化机制研究,对于完善TA生物合成的理论知识体系具有重要意义;开展莨菪碱的代谢工程研究并获得莨菪碱高含量的新材料,为解决莨菪碱药物资源供应问题提供了重要技术支撑。
上官丁从[9]（2021）在《α-氨基酸酯酰基转移酶的催化条件优化及分子改造》文中研究说明α-氨基酸酯酰基转移酶（SAET）是一种以α-氨基酸甲酯为酰基供体、氨基酸为酰基受体,催化合成二肽的合成酶,能够催化丙氨酸甲酯与谷氨酰胺合成丙谷二肽（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,L-alanyl-L-glutamine）。丙谷二肽具有较为优良的稳定性和水溶性,代谢迅速且无毒副作用,是谷氨酰胺营养补充剂的最佳替代品。本实验室前期构建了高效表达SAET工程菌QC01,获得了高活力的SAET,在此基础上,进行如下研究:（1）优化了SAET游离酶催化制备丙谷二肽的条件。经过一系列实验,得到了该酶的最佳催化条件:反应体系p H值维持在8.5、反应温度为27℃、底物比例（丙氨酸甲酯:谷氨酰胺）为1:0.8、底物浓度为200m M、加酶量为10U/m L、反应时间为40min,此时丙谷二肽的摩尔转化率高达84.22%。虽然使用SAET游离酶可以高效的合成丙谷二肽,转化率达到预期,但实验过程中,制酶工序较为繁琐、酶易失活,且在反应过程中需维持体系p H值,不利于工业生产应用。（2）优化了工程菌QC01全细胞催化制备丙谷二肽的条件。通过响应面实验,得出了最优的催化条件为:菌体浓度3g/L、底物比例为1:0.6、反应温度30℃、底物浓度300m M、反应起始p H值9.0、反应时间为40min,以此条件催化反应,丙谷二肽的摩尔转化率可以达到73.85%,比初始反应条件下的摩尔转化率提高了51.10%。（3）对SAET游离酶和表达菌QC01全细胞进行了固定化研究。实验表明,SAET游离酶稳定性不好,固定化效果较差;但在全细胞固定化中,通过对比不同包埋材料固定后的酶活回收率、固定化酶机械强度以及五轮反应表现等指标,最终确定了琼脂包埋固定法,具体操作为:1.5%的琼脂包埋2g（湿重）菌体。以此法固定全细胞,酶活力回收率高达86.94%,且有着较好的机械强度;经过10轮次反应后,酶活力留存率仍有57.03%。固定化后的酶稳定性优于游离酶和全细胞状态下的酶。（4）对SAET的催化机理进行了初步研究。通过序列比对、分子建模对接、定点诱变等手段,最终确定SAET属于丝氨酸水解酶家族,其催化三联体为Ser158、Asp297以及His329,并对SAET催化合成丙谷二肽的机理进行了合理推断。本文还根据该酶的催化特性,建立了SAET突变株的高通量筛选的方法,为该酶的分子改造及定向进化打下了基础。本文优化了SAET游离酶及全细胞催化制备丙谷二肽的条件,探究了该酶的固定化方法,为SAET的工业化应用提供了借鉴;本文还对SAET的催化机理进行了初步研究,为该酶的分子改造奠定了基础。
杜静[10]（2021）在《结核病初治患者药物性肝损伤危险因素分析》文中研究表明目的:探讨结核病初治患者发生抗结核药物性肝损伤（Anti-tuberculosis drug-induced liver injury,ATB-DILI）的危险因素,为合理规避初次接受抗结核药物治疗的结核病患者药物性肝损伤（Drug-induced liver injury,DILI）的发生提供科学的理论支持。方法:采用回顾性病例对照研究,纳入河北医科大学第三医院2014年1月至2019年12月收治的结核病初治患者177例,根据患者抗结核治疗期间是否发生ATB-DILI分成非ATB-DILI组和ATB-DILI组。收集整理两组患者进行抗结核治疗前性别、年龄、体重指数等一般情况;白蛋白、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶、凝血酶原时间、血清铁蛋白是否高于正常等化验指标;基础肝脏情况及肝毒性抗结核药物种类与数量等资料。应用单因素及多因素Logistic回归分析方法对基础肝脏情况（无基础肝病;慢性非病毒性肝病;慢性病毒性肝病）、肝毒性抗结核药物种类与数量（3种,异烟肼+利福平+吡嗪酰胺;2种,异烟肼+利福平;1种,异烟肼;无）、丙氨酸氨基转移酶基线水平、血清铁蛋白基线水平高等具有重要临床价值的指标进行统计分析,以比值比（Odds ratio,OR）为效应指标,探究结核病初治患者发生ATB-DILI的相关危险因素。结果:177例初治结核病患者中有36例发生了ATB-DILI,发病率为20.3%。经多因素Logistic回归分析显示:慢性病毒性肝病（OR=12.385,P=0.000）、血清铁蛋白基线水平高（OR=2.925,P=0.038）是结核病初治患者发生ATB-DILI的高危因子。丙氨酸氨基转移酶基线水平（OR=1.019,P=0.005）与患者抗结核药物性肝损伤的发生呈正相关。与应用3种肝毒性药物（异烟肼+利福平+吡嗪酰胺）相比,2种肝毒性药物（异烟肼+利福平）（OR=0.052,P=0.003）及1种肝毒性药物（异烟肼）（OR=0.020,P=0.002）使ATB-DILI的发生风险分别降低近94.8%、98.0%,减少肝毒性药物种类可能为ATB-DILI发生的保护因子。结论:结核病合并慢性病毒性肝病、血清铁蛋白基线水平高、丙氨酸氨基转移酶基线水平越高发生ATB-DILI的风险越高,是ATB-DILI的独立危险因素。
二、两种方法检测丙氨酸氨基转移酶的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、两种方法检测丙氨酸氨基转移酶的比较（论文提纲范文）
（1）大肠杆菌氨基转移酶的非天然氨基酸底物特异性研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验菌株、载体和试剂 |
| 1.2 基因克隆 |
| 1.3 酶蛋白表达与纯化 |
| 1.4 酶活性测定 |
| 1.5 易错PCR与定向进化筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 4种氨基转移酶基因克隆、酶蛋白表达纯化与酶活性 |
| 2.2 4种氨基转移酶对6种非天然氨基酸的催化活性 |
| 2.3 酪氨酸氨基转移酶基因突变与突变酶的非天然氨基酸底物特异性 |
| 2.4 F210C突变酶的酶学特性 |
| 3 讨论 |
（2）聚乙二醇化凝胶多糖纳米颗粒型药物载体的合成及其生物相容性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 基因治疗的发展过程 |
| 1.2 RNA干扰技术 |
| 1.2.1 RNA干扰技术 |
| 1.2.2 RNAi技术的发展史 |
| 1.2.3 RNAi的干扰机制 |
| 1.2.4 RNAi在基因治疗中的应用前景 |
| 1.3 siRNA递送研究 |
| 1.3.1 siRNA的概述 |
| 1.3.2 限制siRNA治疗的因素 |
| 1.3.3 解决siRNA治疗限制因素的途径 |
| 1.3.4 siRNA治疗的应用 |
| 1.4 基因递送载体的研究 |
| 1.4.1 基因递送载体 |
| 1.4.2 基因递送载体的分类 |
| 1.5 聚乙二醇化药物 |
| 1.5.1 PEG的概述 |
| 1.5.2 聚乙二醇化(PEG)药物 |
| 1.6 凝胶多糖(Curdlan)的研究 |
| 1.6.1 凝胶多糖(Curdlan)的概述 |
| 1.6.2 Curdlan的应用 |
| 1.7 论文的研究意义及其内容 |
| 1.7.1 研究意义 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第二章 聚乙二醇化凝胶多糖纳米颗粒的制备与表征 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 主要溶剂的预处理以及配置 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 siRNA序列 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 6AC-100 的合成 |
| 2.2.2 聚乙二醇化PEG(2S PEG)的合成 |
| 2.2.3 6AC-100-5% 2S PEG的合成 |
| 2.2.4 6AC-100-10% 2S PEG的合成 |
| 2.2.5 6AC-100-20% 2S PEG的合成 |
| 2.2.6 6AC-100-40% 2S PEG的合成 |
| 2.2.7 凝胶渗透色谱(GPC)的测定 |
| 2.2.8 与siRNA结合能力的测定 |
| 2.2.9 激光粒度(DLS)与电动电势(Zeta Potential)的测定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 6AC-100 的合成 |
| 2.3.2 聚乙二醇化PEG(2S PEG)的合成 |
| 2.3.3 四种阳离子聚合物的合成 |
| 2.3.4 核磁共振(~1H NMR、~(13)C NMR)结果分析 |
| 2.3.5 凝胶渗透色谱(GPC)结果分析 |
| 2.3.6 元素分析(Element Analysis,EA)测定结果分析 |
| 2.3.7 与siRNA结合能力的测定 |
| 2.3.8 激光粒度(DLS)与电动电势(Zeta Potential)的测定结果分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 聚乙二醇化凝胶多糖纳米颗粒在体外的生物相容性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 细胞 |
| 3.1.4 siRNA序列 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.2 实验内容 |
| 3.2.1 培养细胞 |
| 3.2.2 细胞毒性实验 |
| 3.2.3 四种阳离子聚合物纳米颗粒递送FITC-siRNA的活性研究 |
| 3.2.4 溶血实验 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 细胞毒性实验 |
| 3.3.2 四种阳离子聚合物纳米颗粒递送FITC-siRNA的活性研究 |
| 3.3.3 溶血实验 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 聚乙二醇化凝胶多糖纳米颗粒在体内的生物活性研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 siRNA序列 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.2.1 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平的测定 |
| 4.2.2 半数致死量(Median Lethal Dose,LD50)实验 |
| 4.2.3 体内递送Cy3-siRNA的测定 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平的测定 |
| 4.3.2 半数致死量(Median Lethal Dose,LD50)实验 |
| 4.3.3 体内递送Cy3-siRNA的测定 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）黄酒酵母β-苯乙醇合成途径中关键酶的催化特性解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 黄酒酵母的研究概况 |
| 1.2 酿酒酵母β-苯乙醇的合成途径的研究概况 |
| 1.2.1 β-苯乙醇的简介 |
| 1.2.2 酿酒酵母中β-苯乙醇合成途径的研究 |
| 1.2.3 酿酒酵母中β-苯乙醇合成途径关键酶基因的研究 |
| 1.2.4 β-苯乙醇合成途径中关键酶的结构特性研究进展 |
| 1.3 黄酒酵母β-苯乙醇的合成调控研究进展 |
| 1.4 同源建模理论 |
| 1.5 研究思路与主要内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株、质粒和工具酶 |
| 2.1.2 试剂、溶液和培养基 |
| 2.1.3 数据分析网站以及软件 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 关键基因的挖掘比对与结构预测分析 |
| 2.3.2 关键基因的克隆 |
| 2.3.3 重组工程菌的表达与纯化方法 |
| 2.3.4 酶活测定方法 |
| 2.3.5 酶学特性研究方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 基于同源建模对关键酶的性质和结构预测分析 |
| 3.1.1 DAHP合酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.2 五功能酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.3 分支酸变位酶的性质和结构预测分析 |
| 3.1.4 苯丙氨酸转运酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.5 苯丙氨酸氨基转移酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.6 苯丙酮酸脱羧酶和丙酮酸脱羧酶的性质和结构预测分析 |
| 3.1.7 醇脱氢酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.8 小结 |
| 3.2 苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的表达和酶学性质研究 |
| 3.2.1 基因ARO9的扩增与克隆 |
| 3.2.2 表达载体pET-28a(+)-ARO9的构建 |
| 3.2.3 重组苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的表达与纯化 |
| 3.2.4 重组苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的酶学性质研究 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的表达和酶学性质研究 |
| 3.3.1 基因ARO10的扩增与克隆 |
| 3.3.2 表达载体pET-28a(+)-ARO10的构建 |
| 3.3.3 重组苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的表达与纯化 |
| 3.3.4 重组苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的酶学性质研究 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 醇脱氢酶Adh1p的分离纯化和酶学性质研究与对比 |
| 3.4.1 基因ADH1的扩增与克隆 |
| 3.4.2 表达载体pET-28a(+)-ADH1的构建 |
| 3.4.3 重组醇脱氢酶Adh1p的表达与纯化 |
| 3.4.4 重组醇脱氢酶Adh1p的酶学性质研究 |
| 3.4.5 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录2:各基因片段序列信息 |
（4）芽孢杆菌转氨酶的筛选改造及其在西他沙星前体合成中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 手性胺化合物 |
| 1.1.1 手性胺化合物的简介及应用 |
| 1.1.2 手性胺化合物的制备 |
| 1.2 西他沙星 |
| 1.2.1 西他沙星的结构特征 |
| 1.2.2 西他沙星的药理作用 |
| 1.2.3 西他沙星及其中间体的合成 |
| 1.3 转氨酶 |
| 1.3.1 转氨酶的分类 |
| 1.3.2 转氨酶的催化机制 |
| 1.3.3 转氨酶的应用 |
| 1.4 转氨酶蛋白质工程 |
| 1.4.1 转氨酶稳定性和活性的改造 |
| 1.4.2 转氨酶对映选择性的改造 |
| 1.4.3 转氨酶底物谱的改造 |
| 1.5 论文的立题依据和主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 芽孢杆菌转氨酶基因的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种 |
| 2.2.2 研究方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 三株芽孢杆菌转氨酶基因筛选 |
| 2.3.2 三株芽孢杆菌转氨酶基因的结构域分析 |
| 2.3.3 转氨酶基因的同源性分析 |
| 2.3.4 PLP-依赖性折叠Ⅳ型转氨酶的生物信息学分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 高地芽孢杆菌W3 中转氨酶基因ota3 的异源表达及其酶催化特性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 高地芽孢杆菌W3 中转氨酶基因的同源性分析 |
| 3.3.2 蛋白质BPTA-1 的生物信息学分析 |
| 3.3.3 目的基因的克隆 |
| 3.3.4 基因ota3 的密码子优化 |
| 3.3.5 蛋白BPTA-1 的纯化和分子量的测定 |
| 3.3.6 酶活分析 |
| 3.3.7 pH和温度对酶BPTA-1 的活性及稳定性的影响 |
| 3.3.8 金属离子对酶BPTA-1 活性的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 高地芽孢杆菌W3 中转氨酶基因ota8 的酶结构和催化特性比较分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 蛋白BPTA-2 的生物信息学分析 |
| 4.3.2 蛋白BPTA-2 的同源建模 |
| 4.3.3 SDS-PAGE和凝胶过滤色谱分析 |
| 4.3.4 二级结构分析 |
| 4.3.5 原子力显微镜图片分析 |
| 4.3.6 酶活分析 |
| 4.3.7 pH和温度对酶活性及稳定性的影响 |
| 4.3.8 金属离子对酶活性的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 蛋白质工程提高转氨酶BPTA-1 催化(R)-苯乙胺的效率 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.2.5 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 蛋白BPTA-1 同源建模 |
| 5.3.2 突变体的计算机设计策略 |
| 5.3.3 突变体酶的克隆表达与纯化 |
| 5.3.4 突变体酶的原子力显微镜图片分析 |
| 5.3.5 突变体的酶活分析 |
| 5.3.6 突变体酶的生化特性 |
| 5.3.7 突变体酶的活性与结构分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 蛋白质工程改造转氨酶BPTA-1 手性合成西他沙星五元环关键中间体 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌种 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 实验试剂 |
| 6.2.4 培养基 |
| 6.2.5 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 突变体酶的克隆表达与纯化 |
| 6.3.2 突变体酶的原子力显微镜图片分析 |
| 6.3.3 突变体酶的酶活分析 |
| 6.3.4 突变体酶的生化特性 |
| 6.3.5 突变体酶的活性与结构分析 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 I:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 β-苯乙醇概述 |
| 1.1.2 β-苯乙醇的规模化合成 |
| 1.1.3 酵母合成β-苯乙醇 |
| 1.2 酿酒酵母的莽草酸途径及其调控机制 |
| 1.2.1 莽草酸合成途径及其调节 |
| 1.2.2 β-苯乙醇合成途径及相关调控 |
| 1.2.3 利用莽草酸途径合成芳香族化合物 |
| 1.3 酿酒酵母的艾氏合成途径及其调控机制 |
| 1.3.1 可逆的L-苯丙氨酸转氨酶 |
| 1.3.2 酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶家族及其相互作用 |
| 1.3.3 艾氏途径的脱氢反应 |
| 1.3.4 艾氏途径相关的其它重要反应 |
| 1.3.5 利用艾氏途径产β-苯乙醇 |
| 1.4 β-苯乙醇对酿酒酵母的抑制作用与应对策略 |
| 1.5 本论文主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据和研究意义 |
| 1.5.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 以葡萄糖为前体合成芳香醇的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 培养基与培养条件 |
| 2.2.3 实验仪器与药品 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 酶活力与NADP~+/NADPH测定方法 |
| 2.2.6 分析方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 莽草酸途径中反馈抑制的解除 |
| 2.3.2 酿酒酵母五功能酶Aro1 催化反应的分步分析 |
| 2.3.3 芳香醇合成支路的弱化与脱羧酶的表达 |
| 2.3.4 改善莽草酸途径前体PEP和E4P的供应 |
| 2.3.5 基于莽草酸途径的芳香醇合成策略的初步优化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 以L-苯丙氨酸为前体合成β-苯乙醇的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 培养基与培养条件 |
| 3.2.3 实验仪器与药品 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 基因表达水平验证 |
| 3.2.6 分析方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 酿酒酵母合成β-苯乙醇培养条件的初步优化 |
| 3.3.2 L-苯丙氨酸转氨酶的功能研究与筛选表达 |
| 3.3.3 不同来源苯丙酮酸脱羧酶的表达 |
| 3.3.4 艾氏途径相关酶在酿酒酵母中的融合表达 |
| 3.3.5 氨基受体的循环利用 |
| 3.3.6 丙酮酸脱羧酶基因PDC5 缺失促进β-苯乙醇的合成 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于转录组学分析基因PDC5 的缺失对酿酒酵母β-苯乙醇合成的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 培养基与培养条件 |
| 4.2.3 实验仪器与药品 |
| 4.2.4 酵母转录组测序及比较基因组学分析 |
| 4.2.5 基因表达水平测定 |
| 4.2.6 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 不同培养基中PDC5 的缺失对酿酒酵母合成β-苯乙醇的影响 |
| 4.3.2 基于转录组学解析PDC5 的缺失对β-苯乙醇合成的影响 |
| 4.3.3 突变株RM22 中促进β-苯乙醇合成的关键基因的挖掘与验证 |
| 4.3.4 突变株RM22 中促进β-苯乙醇合成的作用机制解析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 适应性进化高产β-苯乙醇突变株的比较基因组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 实验仪器与药品 |
| 5.2.4 适应性进化方法 |
| 5.2.5 酵母重测序及比较基因组学分析 |
| 5.2.6 关键基因过表达菌株的构建 |
| 5.2.7 分析方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 酿酒酵母耐β-苯乙醇适应性进化菌株的筛选 |
| 5.3.2 适应性进化菌株AD032 与对照菌株WT-A的重测序与比较基因组学分析 |
| 5.3.3 部分关键基因对酵母合成β-苯乙醇的影响 |
| 5.3.4 基于代谢调控改造的高产β-苯乙醇菌株的构建 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 异源途径基因优化后的序列 |
| 附录Ⅱ 本研究所用引物 |
| 附录Ⅲ 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（6）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（7）血清丙氨酸氨基转移酶水平对血压水平及成人高血压发病风险的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究背景 |
| 资料与方法 |
| 第一部分 血清丙氨酸氨基转移酶与血压水平及高血压患病风险的相关性研究 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 数据收集 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 研究设计 |
| 2.2 变量定义 |
| 3 质量控制 |
| 4 统计分析 |
| 4.1 数据预处理 |
| 4.2 统计描述 |
| 4.3 关联性研究 |
| 4.4 统计软件 |
| 5 技术路线图 |
| 第二部分 血清丙氨酸氨基转移酶与血压水平及高血压发病风险的前瞻性研究 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 基线资料收集 |
| 1.3 队列随访 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 研究设计 |
| 2.2 暴露定义 |
| 2.3 结局定义 |
| 2.4 发病时间定义 |
| 2.5 相关变量定义 |
| 3 质量控制 |
| 4 统计分析 |
| 4.1 数据预处理 |
| 4.2 统计描述 |
| 4.3 关联性研究 |
| 4.4 统计软件 |
| 5 技术路线图 |
| 结果与讨论 |
| 第一部分 血清丙氨酸氨基转移酶与血压水平及高血压患病风险的相关性研究 |
| 结果 |
| 1 研究对象的分布情况 |
| 1.1 研究对象的来源情况 |
| 1.2 研究对象的基本特征 |
| 1.3 ALT水平与ALT异常率在人群中的分布 |
| 1.4 血压水平及高血压患病率在人群中的分布 |
| 1.5 ALT异常率在各省份地区中的分布 |
| 1.6 高血压患病率在各省份地区中的分布 |
| 2 研究对象的一般情况比较 |
| 2.1 ALT正常组与ALT异常组研究对象的一般情况比较 |
| 2.2 血压正常组与高血压组研究对象的一般情况比较 |
| 3 ALT水平与高血压的关联性分析 |
| 3.1 血清ALT水平与高血压的相关性 |
| 3.2 血清ALT水平与高血压关联的亚组分析 |
| 3.2.1 不同性别亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.2.2 不同年龄亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.2.3 不同户口类型亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.2.4 是否饮酒亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.2.5 是否吸烟亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.2.6 不同人均盐消费水平亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.2.7 不同BMI水平亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.2.8 不同FBG水平亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.2.9 不同HBV状态亚组中血清ALT水平与高血压的关联 |
| 3.3 血清ALT水平与高血压的暴露反应关系 |
| 4 血清ALT水平与血压水平的关联性分析 |
| 4.1 血清ALT水平与血压水平的关联 |
| 4.2 各分组ALT水平升高所对应的平均血压升高水平 |
| 5 超重/肥胖、饮酒、吸烟、高血糖和乙肝表面抗原阳性对血清ALT与高血压关联的交互作用 |
| 6 血清ALT水平与高血压关联的敏感性分析 |
| 6.1 重新定义高血压后血清ALT水平与高血压的关联 |
| 6.2 重新定义ALT异常后血清ALT水平与高血压的关联 |
| 6.3 逐一剔除效应修饰因子后血清ALT水平与高血压的关联 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 血清丙氨酸氨基转移酶与血压水平及高血压发病风险的前瞻性研究 |
| 结果 |
| 1 研究对象的基本情况 |
| 1.1 研究对象健康体检医院的构成情况 |
| 1.2 研究对象的基本特征 |
| 1.3 ALT正常组与ALT异常组研究对象的基线特征比较 |
| 2 研究对象的高血压发病情况 |
| 2.1 随访过程中每年参检人数及高血压发病情况 |
| 2.2 不同基线特征人群中高血压发病率的比较 |
| 2.3 高血压疾病的生存分析和累积发病率 |
| 2.3.1 高血压疾病的生存曲线 |
| 2.3.2 高血压疾病的累积发病率曲线 |
| 3 血清ALT水平与高血压的发病风险 |
| 3.1 血清ALT水平与高血压的发病风险 |
| 3.2 血清ALT水平与高血压发病风险的亚组分析 |
| 3.2.1 不同性别亚组中血清ALT水平与高血压的发病风险 |
| 3.2.2 不同年龄亚组中血清ALT水平与高血压的发病风险 |
| 3.2.3 不同饮酒类别亚组中血清ALT水平与高血压发病风险 |
| 3.2.4 是否吸烟亚组中血清ALT水平与高血压发病风险 |
| 3.2.5 不同盐摄入量亚组中血清ALT水平与高血压发病风险 |
| 3.2.6 是否脂肪肝亚组中血清ALT水平与高血压发病风险 |
| 3.2.7 是否糖尿病亚组中血清ALT水平与高血压发病风险 |
| 3.2.8 不同BMI水平亚组中血清ALT水平与高血压发病风险 |
| 3.2.9 不同TG水平亚组中血清ALT水平与高血压发病风险 |
| 3.3 血清ALT水平与高血压发病风险的暴露反应关系 |
| 4 血清ALT水平对血压水平的影响 |
| 4.1 血清ALT水平对SBP的影响 |
| 4.2 血清ALT水平对DBP的影响 |
| 4.3 不同分组情况下血清ALT升高所对应的平均血压升高水平 |
| 5 超重/肥胖、饮酒、吸烟、高盐摄入、脂肪肝及高TG对血清ALT与高血压发病风险的交互作用 |
| 6 血清ALT水平与高血压发病风险的敏感性分析 |
| 6.1 排除第一次随访为高血压者后血清ALT水平与高血压的发病风险 |
| 6.2 排除白大衣高血压(5次随访中仅有1次诊断为高血压)者后血清ALT水平与高血压的发病风险 |
| 6.3 排除随访过程中有血压缺失者后血清ALT水平与高血压的发病风险 |
| 7 血清ALT状态改变与高血压的发病风险 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 结论 |
| 创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 文献综述 血清谷丙转氨酶与代谢综合征及其组分间关联的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附录 |
| 博士学习期间工作小结 |
| 致谢 |
（8）莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 药用托品烷生物碱的来源和临床药效 |
| 1.2 托品烷生物碱生物合成 |
| 1.2.1 托品烷生物碱生物合成途径 |
| 1.2.2 组学助力托品烷生物碱生物合成途径解析 |
| 1.2.3 腐胺N-甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase,PMT) |
| 1.2.4 腐胺N-甲基氧化酶(N-Methylputrescine oxidase,MPO) |
| 1.2.5 Ⅲ型聚酮合成酶(TypeⅢpolyketide synthase,PYKS) |
| 1.2.6 托品酮合成酶(Tropinone synthase,CYP82M3) |
| 1.2.7 托品酮还原酶(Tropinone reductase,TR) |
| 1.2.8 苯丙氨酸氨基转移酶(L-Phenylalanine:4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase,Ar AT4) |
| 1.2.9 苯丙酮酸还原酶(Phenylpyruvic acid reductase,PPAR) |
| 1.2.10 海螺碱生物合成二酶系统:苯乳酸葡萄糖基转移酶(Phenyllactate UDP-glycosyltransferase,UGT1)和海螺碱合成酶(Littorine synthase,LS) |
| 1.2.11 海螺碱变位酶(Littorine Mutase,CYP80F1) |
| 1.2.12 莨菪碱脱氢酶/莨菪醛还原酶(Hyoscyamine dehydrogenase/Hyoscyamine aldehyde reductase,HDH/HAR) |
| 1.2.13 莨菪碱6β-羟化酶(Hyoscyamine6β-hydroxylase,H6H) |
| 1.3 托品烷生物碱生物合成酶催化机制研究 |
| 1.3.1 腐胺N-甲基转移酶催化机制 |
| 1.3.2 III型聚酮合酶催化机制 |
| 1.3.3 托品酮还原酶I和II的催化机制 |
| 1.3.4 莨菪碱6β-羟化酶催化机制 |
| 1.4 商业化生产托品烷生物碱的瓶颈和技术改良 |
| 1.4.1 商业化生产托品烷生物碱的瓶颈 |
| 1.4.2 代谢工程提高托品烷生物碱产量 |
| 1.4.3 微生物工厂生产托品烷生物碱 |
| 第2章 绪论 |
| 2.1 选题依据、研究目的与意义 |
| 2.2 拟解决的科学问题 |
| 2.3 研究内容和技术路线 |
| 第3章 莨菪碱脱氢酶基因克隆与功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 质粒与菌株 |
| 3.1.3 常规试剂、耗材 |
| 3.1.4 自配试剂 |
| 3.1.5 培养基的配制 |
| 3.1.6 通用仪器设备 |
| 3.1.7 常规分子生物学方法 |
| 3.1.8 基于转录组挖掘HDH编码基因 |
| 3.1.9 HDH基因全长序列的获取 |
| 3.1.10 HDH基因的表达模式qPCR分析 |
| 3.1.11 颠茄基因组步移文库构建 |
| 3.1.12 HDH启动子克隆与pHDH::GUS载体构建 |
| 3.1.13 pHDH::GUS转基因毛状根获得 |
| 3.1.14 pHDH::GUS转基因毛状根组织化学染色 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 HDH候选基因的筛选 |
| 3.2.2 HDH候选基因克隆与表达分析 |
| 3.2.3 候选HDH启动子的表达分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第4章 莨菪碱脱氢酶催化活性鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 设备 |
| 4.1.4 HDH蛋白质表达和纯化 |
| 4.1.5 CYP80F1 蛋白质表达以及微体蛋白分离 |
| 4.1.6 HDH催化活性测定 |
| 4.1.7 HDH最适反应条件测定 |
| 4.1.8 HDH酶动力学参数K_m和V_(max)以及反应平衡常数测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HDH原核表达载体构建及大肠杆菌异源表达纯化 |
| 4.2.2 HDH催化莨菪醛还原生成莨菪碱 |
| 4.2.3 HDH氧化莨菪碱生成莨菪醛 |
| 4.2.4 HDH最适反应条件 |
| 4.2.5 HDH平衡常数测定 |
| 4.2.6 HDH酶动力学参数 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第5章 莨菪碱脱氢酶催化机制解析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 质粒与菌株 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 设备 |
| 5.1.4 HDH蛋白质大量诱导以及蛋白质纯化 |
| 5.1.5 HDH蛋白的晶体生长与结构解析 |
| 5.1.6 HDH蛋白的结构分析与分子对接 |
| 5.1.7 HDH点突变以及突变体活性分析 |
| 5.1.8 酶法合成[4-~2H]NADPH |
| 5.1.9 使用氘代[4-~2H]NADPH还原苯乙醛 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 获得HDH晶体以及结构解析 |
| 5.2.2 HDH蛋白结构解析 |
| 5.2.3 HDH蛋白的分子对接 |
| 5.2.4 HDH底物结合位点及催化关键残基 |
| 5.2.5 解析HDH催化机制 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第6章 过表达莨菪碱脱氢酶基因提高莨菪碱含量的代谢工程研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试剂与培养基配制 |
| 6.1.2 过表达HDH颠茄毛状根获得和分子检测 |
| 6.1.3 颠茄毛状根中托品烷生物碱的提取及含量测定 |
| 6.1.4 过表达HDH颠茄植株获得及分子检测 |
| 6.1.5 颠茄植株托品烷生物碱提取及含量测定 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 在颠茄发根中过表达HDH提高莨菪碱含量 |
| 6.2.2 过表达HDH培育莨菪碱含量提高的颠茄植株 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第7章 敲除莨菪碱6β-羟化酶基因提高莨菪碱含量的代谢工程研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 AbH6H编码区基因组序列的克隆与sg RNA设计 |
| 7.1.2 AbH6H敲除载体构建和工程菌的获得 |
| 7.1.3 AbH6H敲除转基因植株获得和分子检测 |
| 7.1.4 AbH6H敲除转基因纯合植株生物碱含量检测 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 AbH6H编码区基因组序列的克隆与sg RNA设计及载体构建 |
| 7.2.2 AbH6H基因组敲除转基因颠茄的获得与分子检测 |
| 7.2.3 敲除AbH6H的颠茄中托品烷生物碱含量分析 |
| 7.3 小结与讨论 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 特色与创新 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 学习期间发表论文及参加课题 |
（9）α-氨基酸酯酰基转移酶的催化条件优化及分子改造（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究现状 |
| 1.2.1 酶法生产丙谷二肽研究现状 |
| 1.2.2 α-氨基酸酯酰基转移酶研究现状 |
| 1.2.3 提高酶工业化应用价值的方法 |
| 1.3 本课题的立题意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 第二章 SAET游离酶催化条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 菌株 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 SAET游离酶的制备 |
| 2.3.2 丙谷二肽浓度及酶活力检测 |
| 2.3.3 丙谷二肽摩尔转化率计算 |
| 2.3.4 游离酶催化条件优化 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 丙谷二肽浓度的标准曲线 |
| 2.4.2 不同pH对转化率的影响 |
| 2.4.3 不同温度对转化率的影响 |
| 2.4.4 不同底物比例(浓度比)对转化率的影响 |
| 2.4.5 不同底物浓度对转化率的影响 |
| 2.4.6 不同加酶量对转化率的影响 |
| 2.4.7 反应时间对转化率的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 SAET全细胞催化条件优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 菌株 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SAET产酶菌株培养及全细胞悬液的制备 |
| 3.3.2 丙谷二肽浓度及酶活力检测 |
| 3.3.3 丙谷二肽摩尔转化率计算 |
| 3.3.4 响应面法优化全细胞催化条件 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Plackett-Burman实验 |
| 3.4.2 Box-Behnken实验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 SAET固定化方法及固定化酶酶学性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 菌株 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 QC01 菌活细胞悬液及SAET粗酶液的制备 |
| 4.3.2 丙谷二肽浓度及酶活力检测 |
| 4.3.3 固定化方法探究 |
| 4.3.4 固定化酶酶学性质探究 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 游离酶的固定化结果 |
| 4.4.2 全细胞固定化结果 |
| 4.4.3 琼脂包埋QC01 全细胞条件的确定 |
| 4.4.4 游离酶、全细胞及固定化酶的性质比较 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 SAET分子机制的初步探索及分子改造 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 菌株 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 SAET产酶菌株培养及产酶条件 |
| 5.3.2 丙谷二肽浓度及酶活力检测 |
| 5.3.3 序列比对,建立SAET酶蛋白的三维模型 |
| 5.3.4 定点诱变 |
| 5.3.5 SAET定向进化初步探索 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 SAET同源序列比对 |
| 5.4.2 SAET三维模型的建立及分子对接 |
| 5.4.3 SAET的定点突变与催化分子机制的初步推测 |
| 5.4.4 SAET酶活力筛选方法的建立 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间学术活动及成果情况 |
（10）结核病初治患者药物性肝损伤危险因素分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 结核病合并慢性肝病的临床诊疗思考 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、两种方法检测丙氨酸氨基转移酶的比较（论文参考文献）
- [1]大肠杆菌氨基转移酶的非天然氨基酸底物特异性研究[J]. 何婷,倪雪晨,张萍萍,陈茹,宋晶晶,雷佳,王行国. 湖北大学学报(自然科学版), 2021(04)
- [2]聚乙二醇化凝胶多糖纳米颗粒型药物载体的合成及其生物相容性的研究[D]. 牧其尔. 内蒙古大学, 2021(12)
- [3]黄酒酵母β-苯乙醇合成途径中关键酶的催化特性解析[D]. 杨琪琳. 江南大学, 2021
- [4]芽孢杆菌转氨酶的筛选改造及其在西他沙星前体合成中的应用[D]. 翟李欣. 江南大学, 2021(01)
- [5]代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇[D]. 朱灵桓. 江南大学, 2021(01)
- [6]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [7]血清丙氨酸氨基转移酶水平对血压水平及成人高血压发病风险的影响[D]. 贾佳静. 北京协和医学院, 2021(02)
- [8]莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究[D]. 曾令江. 西南大学, 2021
- [9]α-氨基酸酯酰基转移酶的催化条件优化及分子改造[D]. 上官丁从. 合肥工业大学, 2021(02)
- [10]结核病初治患者药物性肝损伤危险因素分析[D]. 杜静. 河北医科大学, 2021(02)