一、酒精性肝病大鼠模型的建立（论文文献综述）
边亮[1]（2021）在《桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1抗急性酒精性肝损伤作用的药效学再评价及作用机制研究》文中提出酒精性肝病（ALD）是由于酒精摄入过量所致的肝脏疾病,是世界上致死率最高的肝脏疾病之一。但在肝病药物市场上,除了抗肝炎病毒药物外,尚无针对ALD的特效药。因此,寻找和利用高效活性成分是当前研究的热点。桑葚多糖是从桑树的果实桑葚中提取分离纯化的一类多糖物质。相关研究表明,其具有良好的抗氧化、降血糖、免疫调节、抗肝损伤等生物活性,但是桑葚多糖的抗急性酒精性肝损伤作用机制并未阐述清楚,因此桑葚多糖作为潜在的抗急性酒精性肝损伤治疗制剂,具有深入研究的价值和意义。课题组前期开展了大量与桑葚多糖抗急性酒精性肝损伤药效评价的基础研究工作,明确了其抗急性酒精性肝损伤的生物活性部位,制备了多种不同分子量的桑葚多糖,对其结构表征、分子修饰进行了考察,并初步测定了其抗氧化、抗化学性肝损伤、抗酒精性肝损伤活性。在此基础上,本课题选取了两种抗酒精性肝损伤活性最好的桑葚多糖组分,MFPA1及MFPB1,拟对桑葚多糖的抗急性酒精性肝损伤作用机制进行研究,本研究首先建立了小鼠急性酒精性肝损伤模型,对桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1的药效进行了再评价,且从氧化应激及脂质代谢两方面出发,对小鼠的氧化应激水平及差异脂质、脂质代谢通路进行了探索,以期对桑葚多糖抗酒精性肝损伤作用机制进行全面具体的阐述。主要内容和结果如下:1.60只SPF级雄性小鼠随机划分为五组:空白组,模型组,联苯双酯阳性药组,MFPA1组,MFPB1组。建立了小鼠急性酒精性肝损伤模型,从生理生化指标检测,形态观察,组织病理学观察三个方面对桑葚多糖的药效进行了再评价,结果如下:急性酒精性肝损伤小鼠体重略有下降,肝指数升高,出现明显的生理生化指标紊乱,病理观察可见肝细胞肿胀、空泡化、坏死。与模型组比较,联苯双酯阳性药组和桑葚多糖组血清ALT、AST、TG水平显着降低,病理学观察显示肝细胞结构完整,形态清晰。以上结果表明,该模型诱导成功,桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1有良好的保肝效果。2.基于传统的氧化应激靶标,SOD、MDA、GSH-Px,考察了五组小鼠的氧化应激水平,并结合氧化应激信号通路对其进行了生物学解释。结果显示,桑葚多糖组分MFPA1及MFPB1组小鼠肝脏SOD含量显着升高,MDA水平显着降低;根据多元统计分析,模型组小鼠与其它四组有明显分离的趋势,其他四组无分离,说明桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1能够有效抑制酒精性肝损伤的氧化应激水平。3.采用了基于高分辨四极轨道阱质谱技术的脂质组学方法,鉴定了急性酒精性肝损伤中代谢紊乱的脂质,明确了桑葚多糖对脂质代谢异常的改善效果,阐述了桑葚多糖保肝作用的机理机制。肝脏脂质组学结果显示,急性酒精性肝损伤导致小鼠肝脏代谢紊乱,正常组与模型组小鼠肝脏中10种脂质含量有显着性差异,桑葚多糖通过改善其中的4种脂质从而调整异常脂质代谢。对上述四种脂质进行代谢途径分析,结果表明桑葚多糖可能通过干预亚油酸、α-亚麻酸和甘油磷脂代谢来发挥抗急性酒精性肝损伤作用。本研究为桑葚多糖作为治疗急性酒精性肝损伤的潜在药物提供了重要的科学依据和应用价值。
周梅月[2]（2021）在《健脾活血方修复酒精性肝病小鼠肠粘膜损伤的机制研究》文中研究指明目的通过建立酒精性肝病小鼠模型,研究健脾活血方对酒精性肝病模型小鼠的肝功能、肝脏病理、血浆内毒素、血浆TNF-α及肠屏障的影响,阐释健脾活血方治疗酒精性肝病的具体靶点和作用机理。方法1.实验一:预实验建立酒精性肝病小鼠模型及模型评估将20只C57BL/6N雄性小鼠随机分为正常组和模型组,每组10只小鼠,适应性喂养一周后,第1-5天所有小鼠给予Lieber-DeCarli对照液体饮食,第6-15天正常组小鼠给予Lieber-DeCarli对照液体饮食,模型组小鼠给予Lieber-DeCarli酒精液体饮食,第16天清晨对模型组小鼠进行大剂量酒精（5 g/kg）灌胃,对正常组小鼠进行等热量麦芽糖溶液（9g/kg）灌胃,灌胃9h后造模结束,收集小鼠血浆及肝脏组织,通过观察小鼠整体状态、记录体重变化、检测血浆肝功指标AST、ALT水平、肝脏HE染色评估造模是否成功。2.实验二:健脾活血方对酒精性肝病模型小鼠肝脏指数、肝功指标及肝脏病理的改善作用将40只C57BL/6N雄性小鼠随机分为正常组、模型组、谷氨酰胺组、健脾活血方组,每组10只小鼠,适应性喂养一周后,给予Lieber-DeCarli酒精液体饮食建立酒精性肝病小鼠模型,各组采取灌胃给药,正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃,谷氨酰胺组给予谷氨酰胺溶液（220mg/kg）灌胃,健脾活血方组给予健脾活血汤（16g/kg）灌胃,每日给药1次,连续给药8天。造模结束后,收集小鼠血浆、肝组织,通过计算各组小鼠肝脏指数、采用全自动生化分析仪检测血浆AST、ALT,采用HE染色法观察肝脏病理学变化,验证健脾活血方治疗酒精性肝病模型小鼠的治疗效果。3.实验三:健脾活血方对酒精性肝病模型小鼠干预作用及机制研究造模同实验二,收集各组小鼠血浆和小肠组织,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血浆TNF-α水平,光度测定法检测血浆内毒素水平,使用HE染色法观察小肠病理学变化,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小肠组织中紧密连接ZO-1、Occludin蛋白的表达变化,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测小肠组织中紧密连接ZO-1、Occludin基因水平的变化,探究健脾活血方治疗酒精性肝病的具体机制及靶点。结果1.实验一:预实验建立酒精性肝病小鼠模型及模型评估模型组与正常组小鼠给予酒精液体饮食造模前、后体重比较均无差异（P>0.05）,证实了造模期间正常组与模型组小鼠做到了等热量饲养;建立酒精性肝病小鼠模型期间,模型组小鼠整体状态比正常组小鼠差,造模结束后,模型组小鼠肝脏指数显着升高（P<0.05）、肝功能指标AST、ALT显着升高（P<0.01）,正常组小鼠肝脏病理正常,无明显改变,模型组小鼠肝脏病理出现大量脂肪变、肝细胞排列紊乱、细胞界限模糊不清、肝小叶结构不清,出现炎性细胞浸润,这些结果证实成功建立了酒精性肝病小鼠模型。2.实验二:健脾活血方对酒精性肝病模型小鼠肝脏指数、肝功指标及肝脏病理的改善作用各组小鼠给予酒精液体饮食建立酒精性肝病小鼠模型,各组小鼠体重造模前、后比较均无差异（P>0.05）,证实了造模期间各组小鼠做到了等热量饲养;造模结束后,模型组小鼠肝脏指数显着升高（P<0.01）,谷氨酰胺组、健脾活血方组小鼠肝脏指数显着降低（P<0.05）;建立酒精性肝病小鼠模型期间,模型组小鼠状态比正常组小鼠差,谷氨酰胺组、健脾活血方组小鼠状态优于模型组小鼠;造模结束后,模型组小鼠血浆AST、ALT水平显着升高（P<0.01）,与模型组相比,谷氨酰胺组、健脾活血方组的血浆AST、ALT水平显着降低（P<0.05）;小鼠肝脏组织病理学观察显示模型组小鼠肝脏发生大量脂肪变,存在炎性细胞浸润,谷氨酰胺组和健脾活血方组小鼠显示肝脏病理脂肪变及炎性细胞浸润等得到明显改善,健脾活血方组与谷氨酰胺组各项指标比较没有统计学差异。3.实验三:健脾活血方对酒精性肝病模型小鼠干预作用及机制研究造模结束后,模型组小鼠血浆TNF-α、内毒素水平显着升高（P<0.01）;谷氨酰胺组、健脾活血方组小鼠血浆TNF-α、内毒素水平显着降低（P<0.01）;与正常组比较,模型组小鼠肠道紧密连接ZO-1、Occludin蛋白显着减少（P<0.01）;与模型组相比,谷氨酰胺组、健脾活血方组小鼠肠道紧密连接ZO-1和Occludin蛋白水平显着增加（P<0.05）;与正常组相比,模型组小鼠肠道紧密连接ZO-1和Occludin基因水平显着降低（P<0.01）;与模型组相比,谷氨酰胺组、健脾活血方组小鼠肠道紧密连接ZO-1和Occludin基因水平显着升高（P<0.01）;小鼠小肠组织病理学观察显示模型组小鼠肠内组织形态紊乱,部分肠道腺体肠绒毛破损,杯状细胞和上皮细胞显着减少,上皮层完整性被破坏等改变;健脾活血方组和谷氨酰胺组小鼠肠道的病理得到明显改善,健脾活血方组与谷氨酰胺组各项指标比较没有统计学差异。结论1.通过对C57BL/6N小鼠喂养Lieber-DeCarli酒精液体饮食可成功建立酒精性肝病小鼠模型,可为后期实验提供稳定可重复的动物模型。2.健脾活血方可以降低酒精性肝病小鼠肝功指标AST、ALT,改善肝脏病理,对酒精性肝病小鼠具有良好的治疗效果,且治疗效果与阳性对照药相当。3.健脾活血方可能通过肠-肝轴机制,减轻肠道屏障功能受损,降低血浆内毒素及TNF-α水平,进而减轻肝损伤来治疗酒精性肝病小鼠。
宋远[3]（2021）在《穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究》文中研究说明背景酒精性肝损伤是由于酒精所致肝细胞功能受损的动态病理过程,随着其病理变化过程的加重,酒精性肝损伤可逐渐形成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化,甚至肝细胞癌等酒精性肝病,进而导致较为严重的临床结局。目前,酒精性肝损伤发生发展过程的分子机制尚不完全清楚,也无明确的治疗靶点。从流行病学角度看,由过量饮酒所致酒精性肝病的患病率存在明显的地域差异,目前尚无全国性统计数据,如有研究报道辽宁省部分城市酒精性肝病的患病率为6.10%,高于浙江省的4.34%。目前临床上治疗酒精性肝损伤的药物主要包括:糖皮质激素、抗氧化剂、营养补充剂、中药以及天然活性成分、抗体类药物等,药物治疗费用不一,且疗效报道也存在争议。目前明确酒精性肝损伤的病理进程和分子机制以及探索有效的治疗药物仍是需要解决的问题。穿心莲内酯是临床常用的具有抗炎、抗病毒、免疫调节等功效的中药成分,近年来的研究报道,穿心莲内酯还可能具有保肝利胆、保护心脑血管等作用,提示药物作用可能存在某些新功效值得开发,可以产生“老药新用”的生物学效应。作者通过前期课题研究基础以及临床观察发现,穿心莲内酯可能对肝脏酶学指标的改善具有较好的效果,但其具体的作用靶点尚未被明确阐述。因此,本研究首先利用文献计量学描述穿心莲内酯与肝损伤的研究现状,同时收集并分析了某三甲医院应用穿心莲内酯的病例现状,研究探讨穿心莲内酯在临床中的应用情况;其次,本研究构建了酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,从体外和体内两个层面对酒精性肝损伤发生发展的过程和具体的发病机制进行了实验研究,利用穿心莲内酯进行干预,探讨其对酒精性肝损伤的保护作用,从而为阐明酒精性肝损伤的发病机制和探寻新的临床治疗药物提供理论依据和实验数据。目的:（1）通过文献计量学以及分析某三甲医院应用穿心莲内酯成品药物开展临床治疗的病例情况,明确穿心莲内酯的研究热点和临床适应症以及可能的药理作用机制,为深入探寻穿心莲内酯药物在酒精性肝损伤中的应用提供研究路径。（2）分别构建酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,应用穿心莲内酯进行干预,探讨穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的可能机制。方法:（1）以CNKI、GNBR,Drugbank,Hetionet数据库为数据来源,检索主题词为“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”,检索时间范围为2000年1月1日-2020年12月31日,文献类型为期刊文献,提取其中的发表年份、引证关系及关键词等信息,通过自行编制的计算机代码进行可视化分析。（2）回顾性分析吉林省某三甲医院2015年1月至2019年12月期间住院治疗,且在院期间应用穿心莲内酯注射液的患者,通过方差分析、卡方检验、秩和检验等方法比较分析患者入院和出院时的血常规、肝功、肾功、血糖、血脂和血离子水平的变化情况。（3）选择健康成年雄性C57BL/6J小鼠,麻醉后,用75%酒精全身消毒放入超净工作台中,解剖小鼠,取出肝脏,制备小鼠原代肝细胞悬液并进行培养。经酒精染毒,同时应用低、中、高剂量（0.05、0.1、0.2mmol/L）穿心莲内酯进行干预,采用ELISA法检测细胞培养液中炎症相关因子的含量,q RT-PCR和Western Blot方法检测细胞内炎症相关信号通路基因和蛋白的表达变化情况。（4）选择8周龄雄性C57BL/6J小鼠,体重16-20g,随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、穿心莲内酯低、中、高剂量组,共六组,每组15只。空白对照组小鼠给予生理盐水灌胃,模型组小鼠给予市售高度白酒灌胃12w,阳性对照组小鼠给予高度白酒灌胃,同时给予水飞蓟宾灌胃,剂量为0.1g/kg·BW·d-1,穿心莲内酯低、中、高剂量组除给予高度白酒灌胃,同时分别给予穿心莲内酯0.05、0.1、0.2g/kg·BW·d-1灌胃。成模后,检测各组小鼠血清转氨酶、肝脏组织脂质代谢、抗氧化等各项生化指标的变化情况,同时利用q RT-PCR、Western Blot等方法检测小鼠肝组织中炎症相关信号通路基因和蛋白的表达情况。结果:（1）本研究利用文献计量学方法,以“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”为主题词,搜集2000年以来,发表在CNKI、GNBR、Drugbank和Hetionet数据库的全部期刊文献,结果表明,在CNKI数据库中穿心莲内酯与肝损伤相关的研究共34篇,年度发文数量逐渐上升,结合外文数据库研究结果发现,穿心莲内酯与肝损伤研究的作用机制与抗炎信号通路有关。（2）本研究纳入了2015年1月至2019年12月在某三甲医院住院治疗期间应用过穿心莲内酯注射液患者的病历资料,共207例,通过比较用药前后患者血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂及离子水平的变化情况发现,穿心莲内酯对患者血常规指标中白细胞、单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞以及肝功能指标中谷草转氨酶、前白蛋白等的改善具有明显效果,而用药前后患者的肾功能、血脂及离子水平无明显变化,提示穿心莲内酯具有一定的抗炎和保护肝脏的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,且呈现明显的剂量依赖性。酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞24h毒性作用的IC50值约为400 mmol/L,且酒精可导致小鼠原代肝细胞内的炎症反应相关因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平显着升高,而经不同浓度的穿心莲内酯干预表现对肝脏细胞的保护作用,尤以高剂量（0.2mmol/L）组作用效果最为显着。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,给予8周龄雄性C57BL/6J小鼠4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w后,可诱导小鼠出现肝脏重量和肝脏指数增加,血清转氨酶相关指标AST、ALT和γ-GT的水平显着升高（P<0.05）;肝脏组织氧化应激指标MDA显着升高、SOD和GSH显着下降（P<0.05）;肝组织内总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及ROS蓄积,表明经高度白酒灌胃12w后,小鼠出现明显的肝组织损伤。（5）穿心莲内酯对小鼠酒精性肝损伤具有明显的保护作用。分别给予酒精模型组小鼠不同浓度（0.05、0.1、0.2g/kg·BW）的穿心莲内酯,结果发现,高剂量穿心莲内酯（0.2g/kg·BW）组可显着降低小鼠的肝脏重量和肝脏指数,差异具有统计学意义（P<0.05）;且高剂量穿心莲内酯组小鼠血清转氨酶AST、ALT和γ-GT水平显着低于酒精模型组,而与空白对照组和阳性对照组无明显统计学差异;穿心莲内酯中、高剂量组小鼠肝组织中脂质过氧化指标MDA水平显着低于酒精模型组,差异具有统计学意义（P<0.05）,抗氧化指标SOD和GSH水平在高剂量穿心莲内酯组显着高于模型组,与阳性对照组无明显差异;穿心莲内酯可在一定程度上有效降低酒精诱导的肝组织脂质紊乱,且以高剂量组,即0.2g/kg·BW穿心莲内酯的保护效果最为明显,高剂量组穿心莲内酯组小鼠肝组织中TC和TG水平与阳性对照组相比,无统计学差异（P>0.05）;与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝脏ROS均明显下降,特别是中、高剂量组下降更加明显,差异具有统计学意义（P<0.05）,以高剂量组效果最为明显。且高剂量穿心莲内酯组小鼠肝组织ROS水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。（6）从各组小鼠肝组织病理学（HE染色）结果可以看出,空白对照组和阳性对照组小鼠肝细胞大小一致,肝细胞索以小叶中央动脉为中心呈辐射状排列;胞核大呈圆形,胞浆均匀红染;胆小管细胞结构完整,未见病变。与空白对照组小鼠相比,模型组小鼠肝组织结构紊乱,肝小叶和肝索结构消失,其中有大量脂肪空泡和炎细胞浸润,肝细胞胞浆稀疏,呈纤维化状态。与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝组织形态有所改善,尤以高剂量（0.2g/kg·BW）组小鼠表现最为明显,肝组织接近阳性对照组结构,其脂肪空泡、炎细胞浸润和纤维化状态均有明显改善。（7）穿心莲内酯对各组小鼠肝组织NF-κB、TNF-α和CYP2E1蛋白水平的表达均有明显影响,从免疫组化结果看,模型组小鼠肝组织中有大量NF-κB和TNF-α的原位表达。与模型组相比,随着干预剂量的增高,穿心莲内酯各剂量组NF-κB和TNF-α的蓄积逐渐减少,且呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组小鼠肝组织NF-κB和TNF-α的表达量已接近空白对照组和阳性对照组水平。从Western Blot结果看,模型组小鼠肝组织中NF-κB、TNF-α和CYP2E1表达水平均显着升高（P<0.05）,而经穿心莲内酯干预后,NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平均有所下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。穿心莲内酯各剂量组NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。结论:（1）通过文献计量学分析得出,穿心莲内酯与肝损伤相关研究可能的信号通路主要是炎症信号分子,如NF-κB p100、NF-κB p105、TNF-α等。（2）通过对穿心莲内酯的临床应用现状分析得出,穿心莲内酯是目前临床上常用的抗炎药物,对改善肝脏功能具有一定的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组（0.2 mmol/L）对酒精所致原代肝细胞损伤具有明显的保护作用。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,即给予4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w,可诱导小鼠出现血清转氨酶升高、肝脏脂质过氧化、ROS生成等肝脏功能受损及组织病理改变。（5）穿心莲内酯高剂量组（0.2g/kg·BW）可有效降低小鼠酒精性肝损伤时的血清转氨酶水平、氧化应激水平、肝脏脂质水平以及ROS生成。（6）穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用机制可能是通过抑制CYP2E1/ROS/NF-κB信号通路相关蛋白的表达实现的。
赵先银,刘梦扬,王丹,于海洋,陈倩,王涛[4]（2021）在《药食两用中草药防治酒精性肝病的研究进展》文中指出酒精性肝病是最常见的慢性肝病。近年来,酒精性肝病的发病率呈逐年上升趋势,已成为继吸烟和高血压以外的第三大致死原因。目前临床上主要通过戒酒以及药物辅助治疗对其进行干预,而药物的长期服用会产生不良反应。药食两用中草药具有不良反应少、患者依从性高、疗效佳的优势,是中医药防治慢性疾病的特色疗法。本文对近年来国内外关于药食同源改善酒精性肝病相关文献进行综述,为酒精性肝病治疗药物的开发提供思路与参考。
郑瑞鹏[5]（2020）在《基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究》文中指出慢性肝病是一种由病毒、酒精或药物等不同致病因素引起肝损伤的进行性疾病。慢性肝病的持续性进展,可导致进行性肝脏损伤、炎症和修复的恶性循环,患者通常会经历肝炎、肝纤维化和肝硬化等过程,如疾病不能被有效控制,最终可发展为肝癌。早期的肝炎主要是以肝脏局部炎症反应导致肝细胞受损为特征,炎症的持续存在则可进一步引发慢性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化的发生,患者一旦进入肝硬化阶段将导致肝脏的不可逆性损伤,最终形成肝癌。其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是肝癌的最常见类型。我国是肝病高发国家,据统计,2019年全世界一半以上的肝癌病例发生在中国,且80%的新增病例处于晚期癌症阶段。临床上主要采用手术切除或肝移植等外科手段对肝癌进行治疗,但肝癌患者的五年生存率极低,给社会公共卫生体系和患者身体健康带来了沉重的负担。因此,发现并干预慢性肝病的早期阶段,如肝炎和肝硬化的进程,对于延缓其进展并阻止肝癌的发生发展尤为重要。肠道菌群在机体的免疫调节、代谢平衡以及营养摄入等方面都发挥着重要的作用,被称为是一个被遗忘的代谢“器官”。肝脏通过门静脉、胆道与肠道连接,向肠道输送胆汁酸等生物活性物质维持机体需要,而肠道中的微生物及其代谢产物也会沿着门静脉逆行至肝脏进而对肝脏造成损伤,此通路被称为肠-肝轴。近年来随着高通量测序技术的发展,越来越多的临床研究表明肠道菌群紊乱在酒精性脂肪肝（Alcoholic liver disease,ALD）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）、肝硬化以及肝癌等多种慢性肝病的发生发展中发挥着重要作用。目前的研究多聚焦于肠道菌群与某种特定的肝病之间的关联性,但肠道菌群结构分布与慢性肝病的发生发展的关系有待于深入研究。肠道菌群失衡可导致有害菌增多,产生大量的细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,LPS通过与Toll-like Receptor 4（TLR4）受体结合,激活免疫细胞内MyD88-NF-κB通路,最终促进IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎性细胞因子的基因转录与合成分泌,从而加重炎症反应。益生菌可改善肠道菌群失衡并能延缓慢性肝病的发生和发展,从而降低肝病的恶化和死亡率。但益生菌不能在肠道中长期定殖,且不同菌株间功能差异巨大,对肝病的治疗作用仍具有较大争议。粪菌移植（Fecal microbiota transplantation,FMT）是一种将健康人的肠道菌群整体移植到患者胃肠道内,对肠道菌群进行重塑的方法,已广泛应用于难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性肠病、顽固性便秘以及肠道免疫缺陷等疾病。目前应用FMT治疗慢性肝病的研究较少,其原因与慢性肝病的肠道菌群结构特点未被彻底揭示相关。此外,FMT治疗慢性肝病的作用机制也并不明确。为了解多种慢性肝病患者肠道菌群的组成特点,进而探讨FMT对慢性肝病的治疗作用机制。本研究拟使用高通量测序技术（16S rRNA）检测肝炎、肝硬化、HCC患者以及健康人的肠道菌群,解析不同病因和不同阶段慢性肝病的肠道菌群结构和组成,探讨肠道菌群与慢性肝病疾病进展之间的关系。同时通过构建肝硬化大鼠模型,以FMT对肝硬化大鼠进行干预,并联合微生物组学和代谢组学技术探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制,为临床上慢性肝病的诊治技术开辟新的领域。一、慢性肝病肠道菌群结构多样性研究方法:（1）以肝炎、肝硬化、HCC患者以及健康个体为研究对象,使用16S rRNA高通量测序技术检测肠道菌群的结构和组成,分析慢性肝病不同阶段肠道菌群的变化;（2）根据HCC患者是否存在肝硬化,分为肝硬化肝癌（LC-HCC:52例）和非肝硬化性肝癌（NLC-HCC:23例）两组,通过与单纯肝硬化组对比,分析肝硬化的并发对HCC患者肠道菌群的影响;（3）根据疾病诱因将HCC分为乙肝病毒诱发的HCC组（HBV-HCC:35例）、丙肝病毒诱发的HCC组（HCV-HCC:25例）和酒精性HCC组（ALD-HCC:15例）,探讨不同病因对HCC患者肠道菌群结构和组成的影响。结果:（1）与健康组、肝炎组和HCC组相比,肝硬化组肠道菌群的多样性明显降低,疣微菌门和变形菌门的丰度明显增高（p﹤0.05）,软壁菌门丰度显着降低（p﹤0.001）;在属水平上,叶杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、肠球菌属和Erysipelatoclostridium菌属等菌属的丰度显着增高（p﹤0.05）,而青枯菌属、Catenibacterium菌属和Lachnospira菌属等菌属的丰度显着降低（p﹤0.05）。与健康组和肝炎组相比,尽管HCC组肠道菌群的多样性无明显变化（p﹥0.05）,但梭杆菌门的丰度显着增高（p﹤0.05）,同时劳特氏菌属、Clostridiates菌属以及Sarcina菌属等菌属的丰度显着增加（p﹤0.05）。这表明,在四组中,肝硬化组患者肠道菌群失调最为严重,尽管HCC组肠道菌群多样性无显着变化,但菌群种类的比例变化可能与HCC的发生相关。（2）与肝硬化组相比,LC-HCC组肠道菌群多样性无显着变化,而NLC-HCC组肠道菌群多样性显着增加（p﹤0.05）。菌属水平分析结果显示:与肝硬化相比,LC-HCC组中双歧杆菌菌属、阿克曼菌属等有益菌属以及考拉杆菌属等产短链脂肪酸菌属丰度显着降低（p﹤0.05）,拟杆菌属、脱硫弧菌属等产LPS菌属丰度显着增高（p﹤0.05）。结果提示肠道菌群中有益菌的减少以及有害菌的增多可能是肝硬化进展为HCC的原因之一。（3）在HBV-HCC组、HCV-HCC组和ALD-HCC组之间,α多样性和β多样性分析结果表明三组之间没有显着差异（p﹥0.05）。尽管在三组中发现了肠球菌属等18个差异性菌属,但在门水平上没有统计学差异（p﹥0.05）。由此可见,HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因无显着关联性。二、FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制研究方法:使用CCL4和CCL4联合酒精的方法分别构建了两种肝硬化大鼠模型,并每天给予健康大鼠的粪便菌液进行干预治疗。（1）连续造模12周后,比较分析各组大鼠的生活状态、体重、腹水形成时间、生存时间和死亡率;并应用全自动生化分析仪和HE染色技术对各组大鼠的肝功能指标以及肝脏的纤维化程度进行检测,探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗作用。（2）ELISA检测各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、和TNF-α炎症因子以及血浆中内毒素的含量;对各组大鼠血液、肠系膜淋巴结和肝脏组织中细菌含量以及肠道黏膜屏障的完整性进行检测;RT-PCR和Western-blot分别检测肝脏组织中TLR4-MyD88-NF-κB通路中相关信号分子的基因和蛋白的表达水平,初步探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗机制。结果:（1）与肝硬化组相比,FMT治疗组大鼠的生活状态得到有效改善,体重增加,腹水形成时间和生存时间明显延长,死亡率显着降低（p﹤0.01）;血清中ALT、AST和GGT等肝功能指标均显着改善（p﹤0.05,p﹤0.01）,而白蛋白指标则明显增高（p﹤0.05）;肝组织表面的结节数量减少,肝组织中假小叶结构减少,结缔组织增生程度减轻。以上结果表明,FMT可有效改善肝硬化大鼠的生活状态,恢复肝功能并延缓肝硬化的发展进程。（2）ELISA结果显示,FMT治疗组大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β促炎性细胞因子以及内毒素的含量均显着降低（p﹤0.05）;血液、肠系膜淋巴结和肝组织中的细菌菌落数均显着减少（p﹤0.05）,肠道黏膜的结构和屏障功能得到有效改善;大鼠肝组织中TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平均显着降低。以上结果表明,FMT可有效改善肝硬化大鼠的肠道黏膜结构和屏障功能,减少细菌移位;FMT可通过下调TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,减轻肝硬化大鼠的炎症水平。三、FMT对肝硬化大鼠的肠道菌群组成与代谢的影响方法:（1）应用16S rRNA高通量测序技术对各组大鼠的肠道菌群进行检测,分析比较各组大鼠肠道菌群的结构和组成,探讨FMT能否有效改善肝硬化大鼠肠道菌群的紊乱;（2）使用UPLC-Q/TOF-MS技术对各组大鼠血浆中差异性代谢物进行鉴别和分析,探讨FMT能否通过调节肝硬化大鼠的代谢模式进而发挥保护作用。结果:（1）肝硬化大鼠肠道菌群中乳杆菌科等有益菌属的丰度显着降低,而梭菌科和毛螺旋菌科等有害菌属的丰度显着增高,菌群结构和多样性紊乱;FMT治疗后,乳杆菌科等有益菌属的丰度增高,梭菌科和毛螺旋菌科等有害菌属的丰度降低,说明FMT可在一定程度上改善菌群结构,维持肠道微生态的平衡,进而通过肠-肝轴延缓肝硬化的进程。（2）肝硬化大鼠血浆中鞘氨醇和LysoPC（18:1（9Z））的含量显着降低,而视黄醇、8,9-环氧二十碳三烯酸、9-顺式视黄醛和花生四烯酸等代谢物的含量显着增高;FMT可调节花生四烯酸和视黄醇代谢通路。以上结果表明,FMT的治疗机制可能是通过改善肝硬化大鼠的肠道菌群的紊乱和调节花生四烯酸和视黄醇的代谢通路,进而延缓肝硬化的发展进程。结论:1.慢性肝病的发生与肠道菌群的紊乱密切相关,肝细胞癌（HCC）患者肠道菌群的紊乱与其是否并发肝硬化密切相关,而HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因（如HBV感染、HCV感染或过度饮酒）无显着关联性。肝硬化进展为HCC可能与双歧杆菌菌属、阿克曼菌属等有益菌属及考拉杆菌属等产短链脂肪酸菌属丰度的降低,且与拟杆菌属、脱硫弧菌属等产LPS的菌属丰度的增高有关。2.粪菌移植（FMT）可有效改善肝硬化大鼠的肠道黏膜结构和屏障功能,减少细菌移位,进而延缓肝硬化发展进程;FMT的作用机制可能与下调TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,抑制促炎性细胞因子产生有关;FMT可通过调节花生四烯酸和视黄醇等代谢通路,改变大鼠的代谢模式,进而延缓肝硬化大鼠的疾病进程。创新性:1.本研究表征了我国吉林省肝炎、肝硬化和肝细胞癌（HCC）等慢性肝病患者的肠道菌群结构,发现HCC肠道菌群的紊乱与其是否并发肝硬化密切相关,而HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因无显着关联性。2.本研究通过构建肝硬化大鼠模型验证了TLR4-MyD88-NF-κB通路相关信号分子在肝硬化发生发展中的作用。发现粪菌移植（FMT）可通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,改善肝硬化大鼠的相关症状。3.本研究联合微生物组学和代谢组学技术阐释了FMT对肝硬化大鼠的治疗机制,发现FMT可通过调整肝硬化大鼠的肠道菌群结构并通过调节花生四烯酸和视黄醇代谢紊乱,延缓肝硬化的发展进程。
许皖[6]（2020）在《葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的实验研究》文中研究指明研究背景:“酒精滥用”和“酒精依赖”是造成酒精性肝病高发病率和死亡率的主要危险因素,已成为仅次于病毒性肝病的第二大肝病,严重危害人类健康。酒精性肝脏疾病是由急性或慢性饮酒引起的肝脏代谢疾病,早期以单纯性脂肪肝病变为主,继而向脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等不可逆病变发展。尽管酒精性肝脏疾病对全球的经济和健康产生了深远的影响,但目前对于该病治疗药物的研究进展甚微,除戒酒和营养支持外,尚无令人满意的治疗策略。酒精性肝病当属中医“酒疸”、“酒痨”、“酒癖”、“酒臌”、“伤酒”、“酒中毒”等范畴。急性酒精性肝损伤的发生,主要是由于酒食不节,酒毒湿热之邪蕴阻中焦,继而伤及脾胃,致运化失司,水湿失运,变生痰浊,而后湿热搏结,阻滞中焦或土雍木郁,致肝脾同病。其病位在肝,涉及胆、脾、胃,酒毒湿热之邪蕴结体内是根本病机。葛花和枳椇子为我国传统解酒中药,古代医药文献有对两药同用解酒毒的记载。葛花发散宣透,引湿热从肌表而散枳椇子渗泄利尿,使湿热之邪从小便而下,二者配伍,散渗结合,分消湿浊,因势利导,使酒湿邪气排出体外,起到解酒保肝的作用。课题组前期已经完成单味中药葛花、枳椇子对急性酒精中毒性治疗,并进行了葛花枳椇子不同比例配伍对慢性酒精性肝损伤的实验研究,研究明确了二者配伍对酒精性肝损伤显示出一定的防治作用,可以不同程度地改善相关指标,起到解酒护肝的作用。研究目的:酒精性肝损伤是全球亟待解决的公共卫生问题之一,是疾病晚期难以治愈的进行性疾病,若早期阶段能及时防治,可阻止其向不可逆病变发展,故防治急性酒精性肝损伤尤为迫切,但目前相关研究较薄弱。乙醛介导的毒性,氧化应激和脂质代谢失衡通常认为与酒精性肝病的发病密切相关。转录因子Nrf2是防治氧化应激介导疾病的关键治疗靶标,Keap1-Nrf2-ARE信号通路是调控细胞保护酶的关键调节剂,在酒精性肝损伤的早期发挥着重要作用。故本课题在前期研究的基础上,以葛花和枳椇子配伍为研究对象,开展二者配伍对酒精引起的急性肝脏损伤保护作用的实验研究。采用白酒灌胃复制动物模型,动态观察肝损伤情况,通过生物化学、组织病理学、分子生物学等技术方法,探讨二者配伍能否激活Keap1-Nrf2-ARE通路诱导抗氧化酶活性而保肝。中医理论认为急性酒精性肝损伤的发生,主要是由于湿热毒邪蕴结体内,损伤及脾,致脾之运化功能失司,累及肝胆,诱发“伤酒”。越来越多的证据显示,水通道蛋白AQPs的正常表达可能是运化水湿,津液输布,维持体内水代谢稳态的分子生物学基础,而AQP表达异常可能是湿热证病理机制之一。酒精诱导的氧化应激在急性酒精性肝病的早期阶段发挥着重要作用,是引发脂质代谢异常,促进脂质过氧化,造成肝脏脂质蓄积的关键因素。水甘油通道蛋白AQP9是参与甘油和甘油三酯代谢的重要通道蛋白,在调控脂质代谢,维持甘油代谢平衡方面发挥着重要作用。故本研究同时尝试结合中医发病机制,探讨二者配伍能否影响水-甘油通道蛋白AQP9表达而调节肝中脂质代谢,从而研究药物对急性酒精性肝损伤的保护作用,为临床用药提供科学依据,并为开展其他酒精性相关疾病的研究提供思路和借鉴。研究方法:1.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠乙醇代谢的影响:小鼠按体重随机分成模型组、阳性对照药（水飞蓟宾）组、葛花组、枳椇子组、葛花枳椇子配伍Ⅰ（1:1）组、葛花枳椇子配伍Ⅱ（1:2）组、葛花枳椇子配伍Ⅲ（2:1）组,共计7组,每组15只。采用56%（V/V）红星二锅头白酒,一次大量灌胃（模型Ⅰ组）和连续多次灌胃（模型Ⅱ组）两种方法复制急性酒精性肝损伤动物模型。根据酒精在体内的代谢特点,分别于酒后不同时间点（1h、4h和10d）取材,运用顶空气相色谱法和紫外-可见分光光度法检测血液中乙醇浓度和肝中乙醇脱氢酶活性。2.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能、血脂水平和肝组织病理形态的影响:小鼠按体重随机分成空白组、模型组、阳性对照药（水飞蓟宾）组、葛花组、枳椇子组、葛花枳椇子配伍Ⅰ（1:1）组、葛花枳椇子配伍Ⅱ（1:2）组、葛花枳椇子配伍Ⅲ（2:1）组,共计8组,每组15只。采用56%（V/V）红星二锅头白酒,一次大量灌胃（模型Ⅰ组）和连续多次灌胃（模型Ⅱ组）两种方法复制急性酒精性肝损伤动物模型。根据血清酶学改变特点,分别于酒后不同时间点（4h、6h、12h、16h和10d）取材,检测肝功能（ALT、AST、ALP、ALB和TP含量）、血脂水平（TG和CHO含量）及肝组织形态变化。3.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织氧化应激的影响:运用紫外分光光度法检测酒后不同时间点（4 h、6 h、12 h、16 h和10 d）小鼠肝脏组织中SOD、MDA和GSH的吸光度,荧光分光光度法测定肝组织中ROS的吸光度,并计算其在组织中的活力。4.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用机制的探讨:运用RT-PCR和Western blot方法,分析检测酒后不同时间点（12 h和10 d）小鼠肝脏组织中Keap 1、Nrf2和AQP9 mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠血液乙醇浓度与肝中乙醇脱氢酶的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后1h和4h）:与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着降低血液中乙醇浓度,并升高肝脏乙醇脱氢酶活性,其中葛花-枳椇子（2:1）组在促进乙醇的代谢方面具有较好的治疗作用,显现出较好的解酒作用。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10d）:与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）血清中乙醇含量显着降低,肝组织中乙醇脱氢酶活性增强,即各给药组通过调控ADH脱氢酶系统,促进乙醛的消除,并减轻乙醇诱导的肝脏损伤,显现出一定的解酒作用。其中,葛花-枳椇子（2:1）组在加速酒精代谢方面,显现出较好的治疗作用,具有出较好的解酒作用。2.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能与肝组织病理形态学的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4h、6h、12h和16h）:与空白组相比,模型组小鼠血清AST、ALT和ALP水平显着升高,TP和ALB含量显着降低,光镜下肝小叶和肝索结构紊乱,肝细胞水肿或空泡变性,并伴有炎性细胞浸润、脂肪滴的形成,即酒精造成肝脏组织及功能受损,提示模型复制成功。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均可显着降低小鼠血清中AST、ALT和ALP水平,升高小鼠血清TP和ALB含量,从而改善小鼠的肝脏功能。葛花-枳椇子（2:1）组在改善酒精（酒后12h）造成的肝脏血清转氨酶及肝脏蛋白质合成功能异常方面优于其它各给药组。此外,各给药组均不同程度地改善酒精诱发的微泡样脂肪变性、脂质滴积聚、肝细胞水肿和炎性损伤等病理改变,对酒精诱发的急性肝损伤具有保护作用。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:与空白组相比,模型组小鼠血清ALT、AST和ALP含量显着升高,TP和ALB水平明显降低,表明酒精引起小鼠肝脏功能异常,造成了急性肝脏损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均不同程度地改善肝脏功能和蛋白合成功能。葛花-枳椇子（2:1）组在改善肝脏功能及蛋白合成功能方面优于其它各给药组,即该配伍组对酒精诱导的肝损伤具有较好的肝保护作用。此外,各给药组均不同程度地改善酒精诱发的肝细胞肿胀、微泡样脂肪变性、炎性细胞浸润和脂质滴积累等病理变化。3.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠血脂水平及其作用机制的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4h、6h、12h和16h）:与空白组相比,模型组小鼠血清TG和CHO水平显着升高,即酒精造成小鼠血脂功能的异常。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着改善血清脂质代谢紊乱。葛花-枳椇子（2:1）组在降低酒精（酒后12h）引起的血清TG和CHO水平升高方面优于其他各给药组。此外,葛花、枳椇子及其各配伍组（1:1、1:2和2:1）均能抑制AQP9的表达,减少肝细胞对甘油的摄入,改善脂质代谢,从而有效缓解肝脏脂肪变性,起到保护肝脏的作用。各给药组在调控AQP9表达,缓解酒精引起的脂质代谢异常方面,均无显着差异。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:模型组小鼠血清TG和CHO水平显着高于空白组,即急性酒精摄入造成小鼠脂质代谢紊乱。葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着降低血清TG和CHO的水平,并抑制AQP9的表达,对酒精造成的血脂异常具有一定的改善作用,起到保护肝脏的作用。葛花-枳椇子（2:1）组在改善急性酒精摄入造成的高脂血症方面优于其他各给药组,即该配伍组在减少肝脂质积累,缓解脂质代谢异常方面显现出较好的治疗作用。4.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏氧化与抗氧化平衡及其作用机制的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4 h、6 h、12 h和16 h）:与空白组相比,模型组小鼠肝脏SOD和GSH水平均明显降低,MDA和ROS活力均显着升高,即表明单次大剂量酒精灌胃会造成小鼠氧化应激损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均可增强抗氧化酶活性,促进肝细胞对脂质过氧化产物的清除,即各给药组均具有抗氧化应激作用,对酒精诱导的肝脏损伤具有潜在的保护作用。其中葛花-枳椇子（2:1）组在增强抗氧化活性,抑制脂质过氧化作用,缓解酒精（酒后12 h）介导的肝细胞氧化应激损伤方面显现出较好的治疗作用,即该配伍组可显着预防酒精引起的急性肝损伤。此外,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）可通过抑制Keap1表达,激活Nrf2表达,从而有效地抑制自由基的产生和脂质过氧化,缓解小鼠氧化应激反应,保护肝脏免受酒精诱导的肝细胞损伤。各给药组在调控Keap1-Nrf2-ARE信号传导通路,保护肝组织免受酒精诱导的氧化损伤方面,均无显着差异。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:与空白组相比,模型组小鼠在白酒连续灌胃10天后,肝脏SOD和GSH活性均明显降低,MDA和ROS含量均显着升高,即表明连续大量酒精摄入会造成小鼠氧化应激损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强肝脏内抗氧化酶的表达（SOD和GSH）,加快脂质过氧化物（MDA和ROS）分解代谢,减少酒精对小鼠肝组织的损害。此外,葛花-枳椇子（2:1）组在增强小鼠抗氧化能力,减轻脂质过氧化作用,改善氧化应激诱导的细胞损伤方面优于其他各给药组,即该配伍组对缓解酒精诱导的肝损伤表现出积极作用。研究结论:综上所述,本研究证实葛花、枳椇子及各配伍组（1:1,1:2和2:1）对酒精诱导的急性肝损伤具有保护作用。首先,各给药组通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强抗氧化酶活性,减轻脂质过氧化作用,改善氧化应激诱导的细胞损伤,从而缓解酒精对小鼠的肝脏损害,发挥保护肝脏的作用。其次,各给药组通过调控水-甘油通道蛋白AQP9的表达,降低甘油的渗透性,减少甘油的摄入,改善肝脏脂质代谢异常,从而缓解酒精诱导的氧化应激和肝脂肪变性,起到保护肝细胞的作用。值得注意的是,葛花-枳椇子（2:1）组在促进酒精代谢,改善肝脏功能,减轻肝脏脂肪变性,提高小鼠抗氧化能力方面显现出积极作用,即该配伍组对酒精诱导的肝脏损伤具有较好的保护作用。因此,本研究证实葛花枳椇子配伍对急性酒精性肝损伤显示出一定的防治作用,并明确了二者配伍产生相须为用、协同增效的功用,具有增强解酒保肝的效果,是治疗酒精性肝病的天然解酒保肝药物,为临床应用葛花枳椇子防治急性酒精性肝损伤提供了科学依据。
单佳铃[7]（2020）在《短穗兔耳草基于炎症信号通路对慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎治疗作用研究》文中提出目的:本课题通过建立大鼠慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎模型,分别考察藏药短穗兔耳草（Lagotisbrachystachys Maxim）总提物及不同极性部位异病同治慢性酒精性肝损伤及急性痛风性关节炎的作用;通过网络药理学的方法系统全面的分析藏药短穗兔耳草异病同治两种疾病的共同分子机制,寻找其可能的活性成分并为进一步研究其作用机制提供思路。方法:（1）采用梯度酒精灌胃8周建立大鼠慢性酒精性肝损伤模型,研究藏药短穗兔耳草提取物(0.5g·kg-1、1 g·kg-1、2g·kg-1)对Toll样受体（TLR）/髓样分化因子88（My D88）/核转录因子κB（NF-κB）和NOD样受体蛋白3（NALP3）信号通路的影响。检测血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、甘油三酯（TC）,总胆固醇（TG）、白介素-1β（IL-1β）水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝脏中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3的表达;苏木素-伊红（HE）染色观察肝脏病理学形态改变。（2）采用梯度酒精灌胃8周建立大鼠慢性酒精性肝损伤模型,研究藏药短穗兔耳草不同极性部位（水部位、30%乙醇部位、50%乙醇部位、95%乙醇部位）对TLR/My D88/NF-κB和NALP3信号通路的影响。同前检测血清中AST等指标水平,检测肝匀浆中谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平;Western blot法检测肝脏中TLR2、My D88、NF-κB和NALP3的表达;苏木素-伊红（HE）染色观察肝脏病理学形态改变。（3）通过向大鼠右后踝关节注射尿酸钠结晶（MSU）建立大鼠急性痛风性关节炎模型,研究藏药短穗兔耳草提取物(0.8g·kg-1、1.6 g·kg-1、3.2g·kg-1)对大鼠TLR/My D88/NF-κB和NALP3信号通路的影响。足趾容积测量仪检测大鼠右后踝关节的关节肿胀度;检测血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-1β水平;Western Blot法检测关节滑膜组织中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3的表达;苏木素-伊红（HE）染色观察关节滑膜病理学形态改变。（4）通过向大鼠右后踝关节注射尿酸钠结晶（MSU）建立大鼠急性痛风性关节炎模型,研究藏药短穗兔耳草不同极性部位（水部位、30%乙醇部位、50%乙醇部位、95%乙醇部位）对大鼠TLR/My D88/NF-κB和NALP3信号通路的影响。足趾容积测量仪检测大鼠右后踝关节的关节肿胀度;Western Blot法检测关节滑膜组织中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3的表达;苏木素-伊红（HE）染色观察关节滑膜病理学形态改变。（5）采用网络药理学的方法,预测藏药短穗兔耳草有效的活性成分、作用靶点及疾病靶点,探究短穗兔耳草―异病同治‖慢性酒精性肝损伤及急性痛风性关节炎的共同作用机制。通过TCMSP、Pharm Mapper Server、Swiss Target Prediction、CTD数据库检索并结合本课题组前期分离鉴定获得短穗兔耳草有效成分及其作用靶点;通过Gene Cards、OMIM、TTD数据库得到两种疾病的相关作用靶点;采用Cytoscape绘制有效成分-疾病-共有靶点网络图及共有靶点蛋白互作网络。通过DAVID网站对短穗兔耳草的GO过程和KEGG通路进行富集分析。结果:（1）短穗兔耳草提取物各剂量组能降低慢性酒精性肝损伤模型大鼠血清AST、ALT、TC、TG、IL-1β水平,其中高剂量效果尤为显着;Western Blot结果显示短穗兔耳草高剂量组均能使肝组织中TLR2,My D88,NF-κB和NALP3表达水平显着下调,对TLR4的蛋白表达无显着影响;病理切片显示短穗兔耳草各剂量组能不同程度改善肝组织的病理形态变化。（2）短穗兔耳草30%、50%、95%乙醇部位及阳性药组能显着降低血清中ALT、AST水平,30%和50%乙醇部位能显着降低血清中TG、IL-1β水平,而对TC水平无明显影响;30%和50%乙醇部位能使肝匀浆中GSH水平显着下降,50%乙醇部位能使肝匀浆中SOD水平显着下降而MDA各组无显着性差异;Western Blot结果显示短穗兔耳草30%乙醇部位能使肝组织中My D88水平下调,30%和50%乙醇部位均能使肝组织中TLR2,NF-κB和NALP3表达水平显着下调;病理切片结果显示30%和50%乙醇部位能改善大鼠肝组织病理变化。（3）尿酸钠造模48h后,短穗兔耳草各剂量组及秋水仙碱组大鼠踝关节肿胀度均显着下降;短穗兔耳草各剂量组能显着降低大鼠血清中TNF-α水平而各组IL-1β水平无显着性差异;Western Blot结果显示短穗兔耳草中、高剂量组能使滑膜组织中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3蛋白表达水平显着下调;病理切片显示短穗兔耳草能不同程度改善大鼠滑膜组织病理变化。（4）尿酸钠造模48h后,秋水仙碱组、30%乙醇部位低剂量组和50%乙醇部位的低、高剂量组大鼠踝关节肿胀率均明显下降;Western Blot结果显示秋水仙碱组及30%乙醇部位低、高剂量组均能使滑膜组织中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3蛋白表达量下调。同时,滑膜病理切片显示30%乙醇部位更能改善大鼠滑膜组织病理变化。（5）网络药理学结果显示:从短穗兔耳草中共筛选出7个有效化合物,涉及5027个靶点;从数据库中搜寻两个疾病相关靶点4212个,取交集共得到化合物与疾病共有靶点253个。253个共有靶点主要通过作用于44条信号通路发挥其―同治‖的药效作用,其中主要涉及脂肪细胞因子信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号传送途径、FcεRI信号通路、PPAR信号通路、T细胞受体信号通路等。结论:短穗兔耳草对慢性酒精性肝损伤及急性痛风性关节炎具有一定的保护作用,其对两种疾病的治疗皆与TLR/My D88/NF-κB和NALP3信号通路有关;其中30%、50%的乙醇部位为短穗兔耳草抗慢性酒精性肝损伤的有效部位,30%的乙醇部位为短穗兔耳草抗痛风性关节炎的有效部位。同时,网络药理学结果也表明短穗兔耳草中化合物发挥药效可能与Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路等相关。
陈茂林[8]（2020）在《枳葛口服液基于AMPK/SREBP-1/Lipin-1通路调控酒精性肝病大鼠糖脂代谢》文中研究表明目的:枳葛口服液是全国名老中医孙同郊教授根据多年临床经验,总结出的纯中药解酒保肝制剂,本实验使用枳葛口服液干预酒精性肝病大鼠模型,从腺苷酸活化蛋白激酶/固醇调节元件结合蛋白-1/脂素-1（AMPK/SREBP-1/Lipin-1）通路探索枳葛口服液对酒精性肝病大鼠糖脂代谢的影响机制。方法:1、实验分组和构建酒精性肝病模型:雄性清洁SD大鼠72只,体重200230g,先适应性喂养1周,然后随机分为6个组:正常组、酒精性肝病模型组（模型组）、枳葛口服液高、中、低剂量组（以下简称高剂量组、中剂量组和低剂量组）以及解酒灵口服液对照组（对照组）,每组各12只。正常组大鼠每天灌胃蒸馏水1.0mL/100g,其余各组大鼠按照同等剂量（1.0mL/100g/d）给予泸州老白干（酒精度为52%）灌胃,酒精灌胃后高、中、低剂量组分别给予1.0mL/100g/d、0.5mL/100g/d和0.25mL/100g/d的枳葛口服液灌胃,而对照组则按照0.5mL/100g/d灌胃解酒灵口服液,连续造模及给药12周。2、取材:各组大鼠根据体重给予10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉满意后腹主动脉取血离心,保存于-80℃冰箱中;取肝脏剪切成两份,然后分别予10%福尔马林和4%甲醛溶液固定。3、指标检测:酶标仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、空腹血糖（FBG）等指标含量,ELISA检测胰岛素浓度（INS）;根据HOMA-IR模式[IR=（FBG*INS）/22.5]计算胰岛素抵抗（IR）,HOMA-IS模式[IS=1/（FBG*INS）]计算胰岛素敏感性（IS）;HE染色和油红O染色检测肝细胞损伤程度和脂肪含量;免疫荧光及免疫组化检测AMPK/SREBP-1/Lipin-1通路相关蛋白表达水平。结果:肝功能指标（ALT、AST）比较:与正常组相比,模型组大鼠ALT、AST水平升高（P<0.01）,各治疗组大鼠ALT、AST均有下降,以高剂量组下降最显着（P<0.01）,与正常组相比差异无统计学意义（P>0.05）;中剂量组与对照组相似。各组大鼠脂代谢相关指标（TC、TG、HE染色、油红O染色）比较:与正常组相比,模型组大鼠TC、TG均有升高（P<0.01）,其余治疗组大鼠血脂水平与模型组相比均有下降,其中仍以高剂量组下降最明显（P<0.01）,其次为中剂量组和对照组;肝组织HE染色示:正常组:肝细胞大小均匀,界限清楚,形态正常,其内未见脂肪空泡;模型组:肝组织结构紊乱,边界不清,细胞核偏移明显,分布不均,整个肝组织可见大量脂肪空泡,部分小空泡融合成大脂肪空泡;高剂量组:细胞结构清晰,和正常组较接近;中剂量组表现与对照组大致一样:脂肪空泡较高剂量组有增加,但较模型组少;低剂量组与模型组比较变化不大;油红O染色示:正常组:肝细胞大小正常,核染色呈蓝色,细胞与细胞间排列规整、有序,细胞内无红色脂滴沉积;模型组:肝细胞肿胀明显,周围可见大片红色脂滴聚集成簇;与模型组相比:枳葛口服液高、中剂量组及对照组肝细胞红色脂滴均有减少,其中高剂量组减少最明显;中剂量组和对照组肝细胞内红色脂滴数相近,低剂量组红色脂肪颗粒沉积虽明显,但较模型组仍有减少。各组大鼠糖代谢指标（FBG、INS、IS、IR）比较:与正常组相比,模型组大鼠FBG、INS含量升高（P<0.01）,肝脏对胰岛素的敏感性（IS）降低（P<0.01）,胰岛素抵抗（IR）显着（P<0.01）,与模型组比较,其余各组大鼠血清FBG及INS均有不同程度的下降,其中高剂量组胰岛素敏感性增加（P<0.05）、胰岛素抵抗改善（P<0.01）,几乎接近正常组,总体而言,各治疗组指标改善程度依次为高剂量组>中剂量组=对照组>低剂量组。肝组织AMPK/SREBP-1/Lipin-1糖脂代谢相关蛋白表达水平比较:与正常组相比,模型组AMPK表达显着抑制,其下游脂质蛋白SREBP-1、Lipin-1、FASN表达水平升高（P<0.01）;与模型组比较,各治疗组中肝脏AMPK蛋白被激活,其下游各脂质蛋白表达受抑制,以高剂量组差异最明显（P<0.01）,其次是中剂量组和对照组（P<0.05）,低剂量组改善不大（P>0.05）;对免疫组化进行光密度分析,可得出相同的结果。结论:1、枳葛口服液可以减轻酒精性肝病大鼠肝损伤,降低血脂水平,减少肝脏脂质沉积和脂肪空泡,并且可以降低酒精性肝病大鼠血糖及血胰岛素浓度,增加肝脏的胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗,从而调节糖脂代谢平衡;2、其作用机制可能与AMPK/SREBP-1/Lipin-1糖脂代谢通路相关,枳葛口服液可通过激活AMPK的表达,下调其下游脂质蛋白FASN、SREBP-1、Lipin-1的合成,改善机体高血脂、高血糖、高胰岛素浓度状态,进而改善酒精性肝病大鼠糖脂代谢异常,防治酒精性肝病发生发展。
单亮[9]（2020）在《ATP-CD39-CD73通路调控肝星状细胞炎症因子和纤维化因子分泌在酒精性肝病中的作用》文中研究表明酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝,进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。其分子机制和病理机制不明,临床上没有确切的药物用于ALD。研究发现嘌呤能信号（Purinergic signalling）参与肝脏疾病的病理生理调节过程。乙醇等外界刺激下,细胞将胞内三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）释放至胞外,提示机体启动免疫防御。当细胞应激或受损时ATP释放至细胞外,立即被胞外酶CD39（ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase,NTPDase1）水解为一磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate,AMP）,而胞外CD73（Ecto-5’-Nucleotidase,NT5E）将AMP水解为腺苷（Adenosine）。腺苷脱氨酶（Adenosine Deaminase,ADA）可水解灭活腺苷。因此,胞外酶CD39-CD73共同调控腺苷浓度。肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）也表达CD39和CD73,但是到目前为止还没有相关文献对其在ALD炎症和纤维化中的作用进行系统的报道。本课题组前期研究发现HSCs的腺苷受体（Adenosine Receptors,ARs）在乙醛（Acetaldehyde,Ace）作用下激活后通过c AMP-PKA（Proteinkinase A）-CREB（c AMP-Response Element Binding Protein）信号通路促进HSCs活化增殖。此外,ARs拮抗剂及Caffeine可减轻酒精性肝纤维化中HSCs活化增殖。进一步证实腺苷信号通路调控ALD纤维化。研究目的:本项研究中,按照课题组前期发表的文献分别复制急性酒精性肝损伤小鼠模型和细胞模型,慢性酒精性肝纤维化小鼠模型和细胞模型,研究ATP-CD39-CD73信号通路调控HSCs炎症因子和纤维化因子分泌在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中的作用。研究方法:（1）参考本课题组以前发表文章中的方法,分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化小鼠模型。提取HSCs,参考本课题组以前发表文章中的方法分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型。（2）计算平均体重和肝比重,全自动生化分析仪检测动物血清生化指标和纤维化指标,取肝组织做病理切片,分别做Hematoxylin-Eosin（HE）染色、Masson三基色染色、Van Gieson（VG）染色和天狼星红（Sirius red）染色,免疫组化法分析肝组织α-Smooth Muscle Actin（α-SMA）蛋白表达,荧光免疫双染检测肝组织CD39和CD73表达,HE染色POM-1高中低三个剂量组的肝组织病理切片。阐明CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物模型中发挥重要作用。（3）Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction（RTq PCR）法检测CD39,CD73,炎症因子和纤维化因子的基因表达。Western blotting法检测CD39、CD73、炎症因子和纤维化因子的蛋白表达,生物发光法检测ATP浓度和高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）法检测腺苷含量。阐明CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥重要作用。（4）分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化HSC模型,检测CD39和CD73的激动剂和拮抗剂对细胞模型炎症因子和纤维化因子蛋白表达的影响,同时检测HSCs培养上清液中ATP和腺苷含量变化。阐明ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中的作用。（5）使用小干扰RNA/沉默RNA（Small interfering RNA/silencing RNA,si RNA）分别沉默CD39基因和CD73基因,检测基因沉默后对急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化HSC模型的影响。阐明CD39和CD73沉默在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥作用。SPSS（Statistical Product and Service Solutions）17.0软件统计数据,Graphpad prism 8.0软件做图。结果:（1）急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物实验中两个模型组的平均体重、肝比重、血清生化指标、血清肝纤四项指标、肝组织病理、免疫组化、荧光免疫双染结果均较对照组有明显变化,HE染色结果显示POM-1大剂量可减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化,荧光免疫双染结果发现急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化模型组小鼠肝组织CD39和CD73表达增加。提示急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物模型建立成功。（2）在体外实验中,模型组胞外酶CD39和CD73、炎性细胞因子和成纤维细胞因子的表达均明显增加,提示CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中发挥调控作用。（3）体外实验中,CD39拮抗剂ARL67156和CD73拮抗剂APCP可以显着降低CD39和CD73蛋白的表达,二者均可以降低炎性细胞因子和成纤维细胞因子的蛋白表达,同时,细胞培养上清液中ATP和腺苷的浓度也发生了相应的变化。提示ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥调控作用。（4）CD39 si RNA和CD73 si RNA可分别降低急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中CD39和CD73的蛋白表达,二者均可降低细胞模型炎症因子和纤维化因子的蛋白表达,细胞培养上清液中ATP和腺苷浓度也有相应的变化。提示ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥调控作用。结论:（1）ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中发挥作用。（2）抑制或沉默CD39可以减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化。（3）抑制或沉默CD73可以减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化。
吴嘉迪[10]（2020）在《基于肠道真菌菌群及其介导的Dectin-1/IL-1β通路探讨丹皮酚预防酒精性肝病炎症损伤的作用机制》文中指出目的:基于肠道真菌群及其代谢产物b-葡聚糖介导的Dectin-1/IL-1b信号通路探讨丹皮酚抗酒精性肝病（alcohol liver disease,ALD）炎症损伤的作用机制。方法:本研究将90只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、ALD模型组、阳性药物组、丹皮酚高、中、低剂量组,采用Lieber-De Carli酒精液体饲料自由饮食的方法建立酒精性肝病小鼠模型。通过血清生化检测TG、TC、ALT、AST、γ-GT,肝脏HE染色、油红O染色验证模型成功。通过ITS高通量测序检测小鼠肠道真菌群,分析肠道真菌种属的变化。通过HE染色观察回肠病理变化,并通过免疫组化、Western blotting、qRT-PCR检测回肠ZO-1、Claudin-1蛋白与基因表达。通过ELISA检测血清b-葡聚糖、caspase-1、IL-1b以及肝组织匀浆NLRP3水平,免疫组化检测肝脏caspase-1、NLRP3蛋白表达,免疫荧光检测肝脏巨噬细胞F4/80、IL-1b表达,Western blotting、qRT-PCR检测肝脏Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1b、IL-1b蛋白与基因表达。另外我们还建立体外b-葡聚糖诱导巨噬细胞炎症模型进一步验证丹皮酚抗ALD炎症损伤的作用机制。MTT检测细胞活性,倒置显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞术检测巨噬细胞表面标记物F4/80的表达,免疫荧光检测巨噬细胞内NLRP3表达,Western blotting、qRT-PCR检测巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白与基因表达,ELISA检测细胞上清IL-1b、IL-18水平。结果:HE染色与油红O染色发现ALD模型组肝脏有大量脂肪滴出现,酒精喂养后血清TG、TC、ALT、AST、γ-GT较正常组显着升高。丹皮酚干预后肝脏脂肪滴减少,血清TG、TC、ALT、AST、γ-GT较ALD模型组显着降低。ITS测序结果表明ALD模型组肠道真菌种类和丰度较正常组明显升高,丹皮酚干预后肠道真菌种类和丰度较ALD模型组组明显减少,尤其在酿酒酵母目（Saccharomycetales）、德巴酵母科（Debaryomycetaceae）、白色念珠菌属（Candida）、真菌种（fungi＿sp）水平上。回肠HE染色发现ALD模型组肠粘膜受损严重,丹皮酚干预后受损肠粘膜得到改善。免疫组化、Western blotting、qRTPCR结果表明ALD模型组回肠ZO-1、Claudin-1蛋白与基因表达较正常组明显降低,丹皮酚干预后较ALD模型组则明显升高。ELISA结果表明ALD模型组血清中b-葡聚糖、caspase-1、IL-1b以及肝组织匀浆中NLRP3水平较正常组明显升高,而丹皮酚干预后较ALD模型组明显减少。免疫组化结果表明ALD模型组肝脏caspase-1、NLRP3蛋白表达较正常组明显增多,丹皮酚干预后较ALD模型组明显减少。免疫荧光结果表明ALD模型组肝脏巨噬细胞F4/80、IL-1b表达较正常组明显增多,丹皮酚干预后肝脏巨噬细胞F4/80、IL-1b表达较ALD模型组明显减少。Western blotting与qRT-PCR结果表明ALD模型组肝脏Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1b、IL-1b表达较正常组均显着增多,丹皮酚干预后均较ALD模型组显着降低。体外细胞实验中,MTT结果表明b-葡聚糖诱导组较空白组细胞活性显着降低,丹皮酚干预组细胞活性较b-葡聚糖诱导组显着升高。形态学结果发现b-葡聚糖诱导组巨噬细胞较空白组出现明显分化现象,丹皮酚干预组细胞分化较少。流式细胞与免疫荧光结果表明b-葡聚糖诱导组巨噬细胞F4/80与NLRP3表达较空白组明显增多,丹皮酚干预后均明显减少。Western blotting与qRT-PCR结果表明b-葡聚糖诱导组巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1表达较空白组均显着增多,丹皮酚干预后均显着降低。ELISA结果表明b-葡聚糖诱导组IL-1b与IL-18水平较空白组明显升高,丹皮酚干预后均显着降低。结论:体内实验表明丹皮酚可以通过减少肠道白色念珠菌的丰度,从而抑制了b-葡聚糖介导的Dectin-1/IL-1b炎症信号通路,并最终发挥抗酒精性肝病炎症损伤的作用。体外实验则进一步验证丹皮酚通过调节肠道真菌菌群相关的Dectin-1/IL-1b信号通路关键蛋白,而发挥抗酒精性肝病炎症损伤的作用。
二、酒精性肝病大鼠模型的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、酒精性肝病大鼠模型的建立（论文提纲范文）
（1）桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1抗急性酒精性肝损伤作用的药效学再评价及作用机制研究（论文提纲范文）
| 本文主要缩写语说明 |
| 主要仪器说明 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 序言 |
| 第一章 文章综述 |
| 1.1 酒精性肝损伤的现状研究 |
| 1.1.1 酒精性肝损伤概述 |
| 1.1.2 酒精性肝损伤的损伤机制 |
| 1.1.3 酒精性肝损伤的治疗现状 |
| 1.2 植物多糖抗酒精性肝损伤活性的研究进展 |
| 1.2.1 酒精性肝损伤模型的建立 |
| 1.2.2 生理生化指标的检测 |
| 1.2.3 植物多糖抗酒精性肝损伤的作用机制 |
| 1.3 桑葚多糖及其衍生物概述 |
| 1.4 脂质组学的研究进展 |
| 1.4.1 脂质组学研究内容 |
| 1.4.2 脂类化合物简介 |
| 1.4.3 脂质组学的研究方法 |
| 1.5 研究背景与意义 |
| 1.6 研究主要内容 |
| 第二章 桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1 抗急性酒精性肝损伤的药效学再评价 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.2 实验主要设备 |
| 2.1.3 实验动物及饲料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂的配制 |
| 2.2.2 急性酒精性肝损伤小鼠模型的建立 |
| 2.2.3 血清的制备及AST、ALT和 TG水平的测定 |
| 2.2.4 肝组织病理切片的制作及观察 |
| 2.3 数据统计与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 五组小鼠的体重及存活率分析 |
| 2.4.2 五组小鼠的肝脏指数分析 |
| 2.4.3 五组小鼠血清的AST、ALT及 TG水平分析 |
| 2.4.4 五组小鼠的肝脏组织病理学检查结果分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于氧化应激靶标的桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1 抗急性酒精性肝损伤作用机制研究 |
| 3.1 实验材料与设备 |
| 3.1.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.2 实验主要设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 试剂的配制 |
| 3.2.2 急性酒精性肝损伤小鼠模型的建立 |
| 3.2.3 肝匀浆的制备及 SOD、GSH-Px及 MDA含量的测定 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 多元统计分析 |
| 3.4.2 五组小鼠的SOD含量分析 |
| 3.4.3 五组小鼠的GSH-Px含量分析 |
| 3.4.4 五组小鼠的MDA含量分析 |
| 3.4.5 氧化应激靶标含量变化的生物学解释 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于脂质组学的桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1 抗急性酒精性肝损伤作用机制研究 |
| 4.1 实验材料与设备 |
| 4.1.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.2 实验主要设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 试剂的配制 |
| 4.2.2 急性酒精性肝损伤小鼠模型的建立 |
| 4.2.3 肝组织病理切片的制作与观察 |
| 4.2.4 肝脏样本预处理方法 |
| 4.2.5 非靶向脂质组学色谱质谱条件 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.3.1 数据预处理方法 |
| 4.3.2 多元统计方法 |
| 4.3.3 差异脂质的筛选 |
| 4.3.4 差异脂质的鉴定方法 |
| 4.3.5 通路分析和生物学解释 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 肝脏组织病理学检查结果分析 |
| 4.4.2 数据质量控制 |
| 4.4.3 多元统计分析 |
| 4.4.4 差异脂质的筛选及结构鉴定 |
| 4.4.5 基于差异脂质的急性酒精性肝损伤机制分析 |
| 4.4.6 基于差异脂质的桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1 抗急性酒精性肝损伤作用机制分析 |
| 4.4.7 差异脂质的生物学解释 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 实验结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 硕士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）健脾活血方修复酒精性肝病小鼠肠粘膜损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 酒精性肝病肠-肝轴机制的研究进展 |
| 1 肠道屏障功能的损伤 |
| 2 肠源性内毒素血症 |
| 3 由肠-肝轴介导的肝损伤 |
| 4 肝损伤加剧肠道屏障功能障碍 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医对酒精性肝病的认识及治疗进展 |
| 1 ALD在中医古籍中的相关记载 |
| 2 中医对ALD病因病机的认识 |
| 3 ALD的中医辨证论治 |
| 4 ALD的中医药科学研究 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 预实验建立ALD小鼠模型及模型评估 |
| 1 材料 |
| 2 造模方法 |
| 3 ALD小鼠模型评价 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 实验二 健脾活血方对ALD模型小鼠肝脏指数、肝功指标及肝脏病理的改善作用 |
| 1 材料 |
| 2 造模方法 |
| 3 模型评估及各项指标检测 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 实验三 健脾活血方对ALD模型小鼠干预作用及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏疾病 |
| 1.2 酒精性肝损伤 |
| 1.2.1 酒精消费的现状 |
| 1.2.2 长期饮酒的危害 |
| 1.2.3 酒精性肝病的临床诊断 |
| 1.2.4 酒精性肝病的流行病学特征 |
| 1.2.5 酒精性肝损伤的危险因素 |
| 1.2.6 酒精性肝损伤的发生机制 |
| 1.2.7 酒精性肝损伤的药物治疗 |
| 1.3 穿心莲内酯 |
| 1.3.1 穿心莲内酯的生物学活性 |
| 1.3.2 穿心莲内酯的临床应用研究 |
| 1.4 选题内容、目的及创新点 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 本论文的研究目标 |
| 1.4.3 本论文的特色及创新之处 |
| 第2章 穿心莲内酯的文献研究及临床应用现状分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 穿心莲内酯相关研究的文献计量分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.3 穿心莲内酯临床应用的病例分析 |
| 2.3.1 对象与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用及其机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 细胞学实验 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.3 动物实验 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 酒精性肝损伤的模型 |
| 3.4.2 酒精性肝损伤的判定指标 |
| 3.4.3 酒精性肝损伤的分子机制 |
| 3.4.4 酒精性肝损伤的保护药物 |
| 3.5 不足与展望 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）药食两用中草药防治酒精性肝病的研究进展（论文提纲范文）
| 1 药食两用中草药防治酒精性肝病 |
| 1.1 葛根 |
| 1.2 菊花 |
| 1.3 栀子 |
| 1.4 枳椇子 |
| 1.5 绿茶 |
| 1.6 广枣 |
| 2 总结与展望 |
（5）基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 慢性肝病的研究进展 |
| 1.1.1 病毒性肝病 |
| 1.1.2 酒精性肝病 |
| 1.1.3 非酒精性脂肪肝 |
| 1.1.4 药物性肝病 |
| 1.1.5 自身免疫性肝病 |
| 1.2 肠道微生态与慢性肝病的研究进展 |
| 1.2.1 肠道菌群的概念 |
| 1.2.2 肠-肝轴学说 |
| 1.2.3 肠道菌群与慢性肝病的研究进展 |
| 1.2.4 FMT在肝病治疗中的应用进展 |
| 1.3 本课题的设计思路 |
| 第2章 慢性肝病患者肠道菌群结构多样性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 研究对象与分组 |
| 2.1.2 粪便样本采集与DNA提取 |
| 2.1.3 16S rRNA V4 区扩增与纯化 |
| 2.1.4 16S rRNA测序和生物信息学分析 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者临床信息统计 |
| 2.2.2 16SrRNA测序深度 |
| 2.2.3 慢性肝病患者肠道菌群物种多样性的差异分析 |
| 2.2.4 慢性肝病患者肠道菌群门和属水平的差异性分析 |
| 2.2.5 肝硬化组、LC-HCC组和NLC-HCC组中肠道菌群物种多样性分析 |
| 2.2.6 肝硬化组、LC-HCC组,NLC-HCC组肠道菌群门和属水平的差异性分析 |
| 2.2.7 肠道菌群紊乱与临床因素之间的关系 |
| 2.2.8 肠道菌群紊乱与HCC病因的关联分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 FMT改善了各组大鼠的生活状态和生存时间 |
| 3.2.2 FMT延缓了各组大鼠的体重下降和腹水形成时间 |
| 3.2.3 FMT减轻肝损伤保护肝功能 |
| 3.2.4 FMT可改善肝硬化大鼠的肝纤维化发展进程 |
| 3.2.5 FMT可降低肝硬化大鼠血清中炎性细胞因子和内毒素含量 |
| 3.2.6 FMT可减少肝硬化大鼠肠道菌群的移位 |
| 3.2.7 FMT可改善肝硬化大鼠肠道粘膜的屏障功能 |
| 3.2.8 FMT抑制了肝硬化大鼠肝组织中TLR4 信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 FMT对肝硬化大鼠的肠道菌群组成与代谢的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 16SrRNA测序深度 |
| 4.2.2 FMT对肝硬化大鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 4.2.3 FMT对肝硬化大鼠肠道菌群门和属水平的影响 |
| 4.2.4 UPLC-Q/TOF-MS的稳定性评估 |
| 4.2.5 FMT对肝硬化大鼠体内代谢组学的影响 |
| 4.2.6 FMT治疗后差异性代谢物鉴别 |
| 4.2.7 FMT对肝硬化大鼠相关代谢通路的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录图 |
| 附录表 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 急性酒精肝损伤发病机制及治疗研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 葛花、枳椇子化学成分和药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 酒精性肝损伤动物模型制备的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏保护作用的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠乙醇浓度及乙醇脱氢酶活性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏抗氧化作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理形态的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏Keap1和Nrf2基因及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验六葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏AQP9基因及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（7）短穗兔耳草基于炎症信号通路对慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎治疗作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 注释表 |
| 引言 |
| 第一章 TLR/MyD88/NF-κB及 NALP3 信号通路参与不同疾病病理机制研究进展 |
| 1 TLR/MyD88/NF-κB信号通路的构成 |
| 1.1 TLR |
| 1.2 MyD88 |
| 1.3 NF-κB |
| 1.4 NALP3 |
| 2 TLR/MyD88/NF-κB信号通路与疾病 |
| 2.1 自身免疫性疾病 |
| 2.1.1 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE) |
| 2.1.2 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS) |
| 2.1.3 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA) |
| 2.2 感染性疾病 |
| 2.2.1 细菌性感染 |
| 2.2.2 真菌性感染 |
| 2.2.3 病毒感染 |
| 3 过敏性疾病 |
| 4 总结与展望 |
| 第二章 炎症信号通路探讨藏药短穗兔耳草提取物抗慢性酒精性肝损伤大鼠的作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组、模型复制及给药 |
| 2.2 指标检测 |
| 2.2.1 血清指标检测 |
| 2.2.2 HE染色法检测肝组织病理学变化 |
| 2.2.3 Western blot法测大鼠肝组织TLR2,MyD88,NF-κB和 NALP3 蛋白表达 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 对慢性酒精性肝损伤大鼠血清中TC,TG,ALT,AST的影响 |
| 3.2 对慢性酒精性肝损伤大鼠血清中 IL-1β 含量的影响 |
| 3.3 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理学的影响 |
| 3.4 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织中 TLR2,TLR4,MyD88,NF-κB和NALP3 蛋白表达的影响 |
| 4、讨论 |
| 第三章 基于炎症信号通路对藏药短穗兔耳草抗慢性酒精性肝损伤大鼠作用有效部位研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组、模型复制及给药 |
| 2.2 指标检测 |
| 2.2.1 血清指标检测 |
| 2.2.2 HE染色法检测肝组织病理学变化 |
| 2.2.3 Western blot法测大鼠肝组织TLR2,MyD88,NF-κB和 NALP3 蛋白表达 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 对慢性酒精性肝损伤大鼠血清中TG,TC,ALT,AST的影响 |
| 3.2 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织中 GSH,SOD,MDA 含量的影响 |
| 3.3 对慢性酒精性肝损伤大鼠血清中 IL-1β 含量的影响 |
| 3.4 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理学的影响 |
| 3.5 对慢性酒精性肝损伤大鼠TLR2/MyD88/NF-κB和 NALP3 信号通路蛋白表达的影响 |
| 4、讨论 |
| 第四章 基于炎症信号通路探讨藏药短穗兔耳草提取物抗急性痛风性关节炎大鼠的作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物造模、分组及给药 |
| 2.2 尿酸钠晶体的制备 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.3.1 踝关节肿胀度检测 |
| 2.3.2 血清指标检测 |
| 2.3.3 滑膜组织病理学检测 |
| 2.3.4 大鼠踝关节滑膜组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和 NALP3 蛋白表达检测 |
| 2.4 统计学方法处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 短穗兔耳草提取物对急性痛风性关节炎大鼠不同时间踝关节肿胀度的影响 |
| 3.2 短穗兔耳草提取物对急性痛风性关节炎大鼠血清中 TNF-α,IL-1β含量的影响 |
| 3.3 短穗兔耳草对急性痛风性关节炎大鼠踝关节滑膜病理学的影响 |
| 3.4 短穗兔耳草提取物对急性痛风性关节炎滑膜组织中 TLR2,TLR4,MyD88,NF-κB 和 NALP3 信号通路蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 第五章 基于炎症信号通路对藏药短穗兔耳草抗急性痛风性关节炎大鼠作用有效部位研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物造模、分组及给药 |
| 2.2 尿酸钠晶体的制备(同第四章2.2) |
| 2.3 指标检测 |
| 2.3.1 踝关节肿胀度检测 |
| 2.3.2 滑膜组织病理学检测 |
| 2.3.3 大鼠踝关节滑膜组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和 NALP3 蛋白表达检测 |
| 2.4 统计学方法处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 短穗兔耳草不同极性部位对急性痛风性关节炎大鼠不同时间踝关节肿胀度的影响 |
| 3.2 短穗兔耳草不同极性部位对急性痛风性关节炎大鼠踝关节滑膜病理学的影响 |
| 3.3 短穗兔耳草不同极性部位对急性痛风性关节炎滑膜组织中 TLR2,TLR4,MyD88,NF-κB 和 NALP3 蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 第六章 藏药短穗兔耳草“异病同治”慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎的网络药理学作用机制研究 |
| 1 方法 |
| 1.1 短穗兔耳草有效化学成分 |
| 1.2 有效化学成分靶点的预测 |
| 1.3 疾病靶点的预测 |
| 1.4 有效成分-疾病-共有靶点网络及共同靶蛋白互作(PPI)的构建 |
| 1.5 共有靶点的GO富集分析与通路注释分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 短穗兔耳草有效化合物的获取 |
| 2.2 作用靶点的预测结果 |
| 2.3 共有靶点的网络分析 |
| 2.4 共有靶点的GO富集分析与通路注释分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结语 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（8）枳葛口服液基于AMPK/SREBP-1/Lipin-1通路调控酒精性肝病大鼠糖脂代谢（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 酒精性肝病发病机制研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）ATP-CD39-CD73通路调控肝星状细胞炎症因子和纤维化因子分泌在酒精性肝病中的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 2.实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 急性酒精性肝损伤小鼠模型建立 |
| 3.2 慢性酒精性肝纤维化小鼠模型建立 |
| 3.3 体内外模型中CD39、CD73基因表达 |
| 3.4 CD39拮抗剂POM-1减轻小鼠急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化 |
| 3.5 CD39/CD73拮抗剂降低急性酒精性肝损伤细胞模型炎症因子蛋白表达 |
| 3.6 CD39/CD73激动剂和拮抗剂调控慢性酒精性肝纤维化细胞模型蛋白表达 |
| 3.7 沉默CD39减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化 |
| 3.8 沉默CD73减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 7.附录 |
| 8.致谢 |
| 9.综述 |
| 参考文献 |
（10）基于肠道真菌菌群及其介导的Dectin-1/IL-1β通路探讨丹皮酚预防酒精性肝病炎症损伤的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 丹皮酚改善ALD肝功能损伤与肝脂肪病变 |
| 1 实验材料及仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 液体饲料配制 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 酒精性肝病(ALD)小鼠模型的建立、分组与给药剂量折算 |
| 2.2 小鼠活动状态观察 |
| 2.3 样本采集与预处理 |
| 2.4 血清中ALT测定 |
| 2.5 血清中AST测定 |
| 2.6 GPO-PAP酶法检测血清中TG水平 |
| 2.7 COD-PAP酶法检测血清中T-CHO水平 |
| 2.8 GPNA底物法检测血清中γ-GT水平 |
| 2.9 肝脏组织HE染色 |
| 2.10 小鼠肝脏油红O染色 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 小鼠的一般生活状态 |
| 3.2 血清中ALT、AST、TG、TC与 γ-GT的含量变化 |
| 3.3 肝组织病理学HE染色 |
| 3.4 肝组织病理学油红O染色 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 丹皮酚改善ALD引起的肠道真菌群紊乱 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样本收集 |
| 2.2 DNA抽提和PCR扩增 |
| 2.3 Illumina Miseq测序 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 物种组成分析 |
| 3.1.1 物种Venn图分析 |
| 3.1.2 群落组成Bar图 |
| 3.2 Beta多样性分析 |
| 3.2.1 样本层级聚类分析图 |
| 3.2.2 距离Heatmap图 |
| 3.2.3 PCA分析与PCo A分析 |
| 3.3 物种差异分析--多物种差异检验柱形图 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 丹皮酚改善ALD引起的肠屏障受损 |
| 1 实验材料及仪器 |
| 1.1 实验动物、药物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HE染色 |
| 2.2 免疫组织化学法检测回肠ZO-1、Claudin-1 表达 |
| 2.3 Western blotting(免疫蛋白印迹法)检测回肠ZO-1、Claudin-1 蛋白表达 |
| 2.4 qRT-PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,定量实时聚合酶链锁反应)与RT-PCR(reverse transcription-PCR,逆转录PCR)检测回肠ZO-1、Claudin-1 基因表达 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肠组织病理学HE染色 |
| 3.2 免疫组化检测ZO-1、Claudin-1 蛋白表达 |
| 3.3 Western blotting检测ZO-1、Claudin-1 蛋白表达 |
| 3.4 qRT-PCR与 RT-PCR检测ZO-1、Claudin-1 基因表达 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 丹皮酚抑制Dectin-1/IL-1b信号通路改善ALD炎症损伤 |
| 1 实验材料及仪器 |
| 1.1 实验动物、药物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 ELISA检测血清b-1,3-D-葡聚糖、caspase-1、IL-1b和组织匀浆中NLRP3水平 |
| 2.1.1 样品收集、处理 |
| 2.1.2 标准品稀释 |
| 2.1.3 加样 |
| 2.1.4 温育 |
| 2.1.5 配液 |
| 2.1.6 洗涤 |
| 2.1.7 加酶 |
| 2.1.8 温育 |
| 2.1.9 洗涤 |
| 2.1.10 显色 |
| 2.1.11 终止 |
| 2.1.12 测定 |
| 2.2 免疫组化检测肝脏caspase-1与NLRP3 表达 |
| 2.3 免疫荧光检测肝脏巨噬细胞F4/80与IL-1b表达 |
| 2.4 Western blotting检测肝脏Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1b和IL-1b蛋白表达 |
| 2.5 q RT-PCR 与 RT-PCR 检测肝脏 Dectin-1、NLRP3、caspase-1、IL-1?基因表达 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ELISA检测b-1,3-D-葡聚糖、caspase-1、NLRP3、IL-1b |
| 3.2 免疫组化检测肝脏caspase-1与NLRP3 表达 |
| 3.3 免疫荧光检测肝巨噬细胞F4/80与IL-1b表达 |
| 3.4 Western blotting检测肝脏Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cle-caspase-1、pro-IL-1b、IL-1b蛋白表达 |
| 3.5 qRT-PCR与 RT-PCR检测肝脏Dectin-1、NLRP3、caspase-1和IL-1b基因表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Dectin-1 识别β-葡聚糖 |
| 4.2 Syk激酶 |
| 4.3 NLRP3炎症小体 |
| 4.4 细胞因子IL-1β |
| 第五部分 丹皮酚改善b-葡聚糖诱导的巨噬细胞炎症损伤 |
| 1 实验材料及仪器 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 药物溶解与主要试剂的配制 |
| 1.4.1 药液溶解及配制 |
| 1.4.2 PBS缓冲液的配制(pH7.2-7.6) |
| 1.4.3 含10%胎牛血清DMEM高糖完全培养基的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞复苏、培养、传代和冻存 |
| 2.2 细胞种板 |
| 2.3 模型浓度筛选与验证 |
| 2.3.1 MTT法筛选b-1,3-D-葡聚糖对RAW264.7 巨噬细胞有效致损伤浓度 |
| 2.3.2 Western blotting检测NLRP3 炎症小体蛋白表达 |
| 2.4 细胞分组 |
| 2.5 药物干预及其浓度筛选 |
| 2.6 倒置显微镜观察丹皮酚对b-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞的影响 |
| 2.7 流式细胞术检测RAW264.7巨噬细胞表面标记F4/80的表达量 |
| 2.8 免疫荧光检测巨噬细胞NLRP3表达 |
| 2.9 Western blotting检测巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表达 |
| 2.10 qRT-PCR检测巨噬细胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 基因表达 |
| 2.11 ELISA法检测RAW264.7 巨噬细胞IL-1b、IL-18 的分泌量 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 细胞种板最佳密度 |
| 3.2 b-1,3-D-葡聚糖诱导炎症模型筛选 |
| 3.3 药物浓度筛选 |
| 3.4 倒置显微镜观察细胞形态学差异 |
| 3.5 流式细胞术检测巨噬细胞表面标记物F4/80 |
| 3.6 免疫荧光检测巨噬细胞NLRP3的表达 |
| 3.7 Westen blotting检测巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表达 |
| 3.8 qRT-PCR与 RT-PCR检测巨噬细胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 基因表达 |
| 3.9 ELISA检测巨噬细胞分泌IL-1b和IL-18 水平 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 丹皮酚药理学作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 攻读硕士学位期间(待)发表的学术论文及奖励 |
| 奖励 |
| 致谢 |
四、酒精性肝病大鼠模型的建立（论文参考文献）
- [1]桑葚多糖组分MFPA1、MFPB1抗急性酒精性肝损伤作用的药效学再评价及作用机制研究[D]. 边亮. 贵州师范大学, 2021(12)
- [2]健脾活血方修复酒精性肝病小鼠肠粘膜损伤的机制研究[D]. 周梅月. 北京中医药大学, 2021(08)
- [3]穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究[D]. 宋远. 吉林大学, 2021(01)
- [4]药食两用中草药防治酒精性肝病的研究进展[J]. 赵先银,刘梦扬,王丹,于海洋,陈倩,王涛. 中南药学, 2021(02)
- [5]基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究[D]. 郑瑞鹏. 吉林大学, 2020(01)
- [6]葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的实验研究[D]. 许皖. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]短穗兔耳草基于炎症信号通路对慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎治疗作用研究[D]. 单佳铃. 江西中医药大学, 2020(05)
- [8]枳葛口服液基于AMPK/SREBP-1/Lipin-1通路调控酒精性肝病大鼠糖脂代谢[D]. 陈茂林. 西南医科大学, 2020(11)
- [9]ATP-CD39-CD73通路调控肝星状细胞炎症因子和纤维化因子分泌在酒精性肝病中的作用[D]. 单亮. 安徽医科大学, 2020(01)
- [10]基于肠道真菌菌群及其介导的Dectin-1/IL-1β通路探讨丹皮酚预防酒精性肝病炎症损伤的作用机制[D]. 吴嘉迪. 安徽中医药大学, 2020(03)