一、乙型肝炎病毒S基因变异研究进展（论文文献综述）
李任,余艳芬,李春林,黎运,邱晓颖,李湖[1]（2021）在《乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭患者的病毒S基因准种变异特征分析》文中进行了进一步梳理目的了解HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）患者的病毒S基因准种变异特征,探讨HBV-ACLF可能的发生机制。方法将2016年1月至2018年10月高州市人民医院收治的HBV-ACLF患者和慢性乙型肝炎（CHB）患者纳入研究,收集患者基本资料以及治疗前血清样本。提取HBV DNA,巢式PCR法扩增HBV S基因,参照相应基因型标准序列,分析两组患者的HBV S基因的准种异质性差异,包括信息熵（Sn）、平均遗传距离（d*）、同义替换率（dS）、非同义替换率（dN）指标。结果成功扩增HBV S基因的患者共99例,其中HBV-ACLF患者56例,CHB患者43例。HBV S基因准种异质性分析显示,HBV-ACLF组的Sn（核苷酸、氨基酸）、dS、dN分别为（0.716±0.181） nt、（0.598±0.218） AA、8.259±2.607和7.103±3.081,均高于CHB组,差异均有统计学意义（t=2.579、2.546、8.232和5.297,P均<0.05）。S基因MHR区准种变异性分析结果显示,HBV-ACLF组的Sn（核苷酸、氨基酸）、d*（核苷酸、氨基酸）、dS、dN分别为（0.756±0.184） nt、（0.613±0.229） AA、（7.137±3.074） nt、（8.280±3.194） AA、9.091±2.720和7.429±2.860,明显高于CHB组,差异均有统计学意义（t=5.332,、5.020、3.599、5.772、4.093和3.857,P均<0.01）。结论 HBV-ACLF患者更易发生S基因变异,尤其是MHR区变异,可能与HBV-ACLF产生相关。
刘贺[2]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中研究表明目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
王童[3]（2020）在《乙肝低水平HBsAg无症状携带者Pre-S/S基因序列分析及相关性研究》文中指出目的:探讨低水平HBsAg感染的乙肝无症状携带者（ASCs）HBV Pre-S/S基因序列特征及氨基酸变异情况,进一步积累和完善低水平HBsAg感染的ASCs分子流行病学资料,为预防HBV传播以及低水平HBsAg有效清除提供理论依据。方法:1.采用化学发光免疫分析法（CMIA）筛选18岁以上成人健康体检23130例（男性10543例,女性12587例）中HBsAg阳性的ASCs病例,回顾性的收集病历资料,对符合入组标准的患者进行乙肝血清标志物（HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe、anti-HBc）及生化指标测定,采用实时荧光定量PCR测定乙肝DNA水平。以HBsAg 10IU/mL进行高、低水平HBsAg分组,分析低水平HBsAg组的分子流行病学特征。2.276例低水平HBsAg组和100例高水平HBsAg组（以年龄匹配原则随机抽取）,采用巢式PCR分段扩增HBV Pre-S/S区基因并进行Sanger法测序。测序完成后利用DNAstar软件Seqman程序进行序列拼接,使用Blast进行序列比对。3.利用MEAG6.0软件构建系统发育进化树并进行HBV基因分型,分析两组样本的血清学、病毒学、HBV基因型特征之间的相关性。4.通过所得高水平HBsAg组HBV Pre-S/S基因序列构建ASCs Pre-S/S基因参考序列,并与NCBI推荐基因型的参考序列进行同源性分析和验证。最后利用MEAG6.0软件进行序列比对,分析ASCs Pre-S/S区氨基酸的表达情况。结果:1.低水平HBsAg组血清学结果:年龄（55.09±16.45）岁、HBV DNA浓度（1.32±1.60）log10IU/mL、HBV DNA阳性率为45.65%（126/276）,以B基因型（104例,82.54%）,adw血清型（106例,84.13%）,M2（HBsAg/anti-HBe/anti-HBc,97.1%）血清学模式为主。年龄均值高于高水平HBsAg组（P<0.05）,HBV DNA水平及HBV DNA阳性率则低于高水平HBsAg组（P<0.05）,两组间性别构成比、ALT无统计学差异（P>0.05）,年龄、HBV血清学标志物构成比、HBV基因型构成比、HBV血清型构成比在两组之间有统计学差异（P<0.05）。2.低水平HBsAg组HBV Pre-S/S区基因成功测序126例,随机抽取的100例高水平HBsAg组成功测序94例。以高水平组测序结果为基础构建的中国东部地区ASCs的B、C基因型Pre-S/S参考序列与中国大多数地区报道的ASCs的B、C基因型Pre-S/S序列具有较高的同源性。3.低水平HBsAg组Pre-S基因区发现未报告的突变位点包括:30个单位点突变、16个双位点联合突变、5个三位点联合突变、5个Pre-S2缺失突变;以及7个有意义的单位点突变,17个热点突变,且Pre-S（Pre-S1、Pre-S2）基因氨基酸突变位点数目高于高水平HBsAg组（P<0.05）,Pre-S1基因发生特征性氨基酸突变（发生未报告突变及有意义突变）的百分率（B:55.77%,C:72.72%）高于Pre-S2基因（B:38.46%,C:45.45%）（P<0.05）。此外,Pre-S区一些热点突变T76A、P15L、Y21T、V32A;缺失突变Pre-S2Δ2-5、Pre-S2Δ12-14、Pre-S2Δ5-22、Pre-S2Δ9-22、Pre-S2Δ12-22分别位于与病毒复制相关的结构位点和T、B细胞识别表位上。4.低水平HBsAg组S基因区中发现5个单位点突变、40个二位点联合突变、13个三位点联合突变及1个四位点联合突变均为未报告的突变位点;另有19个有意义的单位点突变、6个有意义的二位点联合突变（P<0.05）、25个热点突变,这些特征性氨基酸单位点及多位点联合突变在低水平HBsAg组中所占比例较高（B基因型:82.7%,86/104;C基因型:63.6%,14/22）,且突变热点主要集中分布在MHR的两侧,分别为氨基酸位点40-49和198-220。结论:低水平HBsAg感染的ASCs HBV Pre-S/S基因存在多点未报告突变（含联合突变）、有意义突变以及缺失突变并且突变频率较高,这些特征性的突变可能与低水平HBsAg持续表达密切相关。
董哲[4]（2020）在《云南省少数民族乙肝流行特征及分子流行病学研究》文中指出[目的]通过对云南省少数民族乙肝流行特征及分子流行病学研究,掌握云南省少数民族乙肝流行趋势及三间分布、探讨云南省少数民族乙肝病毒分子流行病学特征,为制定云南省少数民族乙肝防控策略和措施提供科学依据,也为我省少数民族乙肝的有效控制奠定一定的理论基础。[方法]1.采用描述流行病学方法,对2009-2018年来源于国家法定传染病信息报告系统乙肝报告病例发病数据进行描述分析;采用SOM聚类方法,通过R软件的som、tidyverse和rm等函数包,对云南省主要少数民族的乙肝发病数据进行自组织特征的相似性时间轨迹聚类,分析研究具有相似性发病规律的民族。2.采用Excel 2007软件对数据进行整理和图表制作,用SPSS 17.0软件进行统计分析,率的比较用卡方检验。3.采用实验室检测技术,包括ELISA检测、核酸提取、HBV DNA S区巢式PCR扩增、电泳和基因测序等方法,对2018-2019年云南省少数民族HBVDNA阳性标本进行分子生物学特征研究,用Sequencher软件将获得的序列进行整理;从Genbank中下载参考株序列;用MEGA软件构建系统进化发生树,从而确定每个样本的HBV基因型和基因亚型。[结果]1云南省少数民族2009-2018年乙肝病例流行病学特征1.1流行概况2009-2018年间,白族、傣族、佤族等18种主要少数民族共报告95132例乙肝病例,年均发病率为41.27/10万低于全国、全省平均发病水平。各民族均有病例发生,发病率位于前三位的民族为:佤族（95.26/10万）,回族（59.04/10万）,独龙族和怒族（54.17/10万）,发病率最低的是景颇族（22.51/10万）,瑶族（28.59/10万）,拉祜族（30.32/10 万）。1.2聚类分析结果按发病率时间轨迹,通过SOM聚类方法,将少数民族乙肝发病率时间轨迹聚为4类,第一类包括:云南省、哈尼族、少数民族合计、彝族、拉祜族、瑶族和藏族;第二类类中心序列总体上明显高于其他三类,包括中国、佤族、壮族和苗族;第三类包含的民族有:傈僳族、傣族、布朗族、普米族、景颇族和白族;第四类包含的民族有:回族、怒族、独龙族和纳西族,同为一类的民族具有相似的发病率时间轨迹。1.3流行特征1.3.1时间分布2009-2018年,云南省18个主要少数民族每年均有乙肝病例报告,发病率从2009年上升,到2012年最高（51.21/10万）,随后逐年下降,2016年最低（30.44/10万）,近年有上升趋势。少数民族总体发病率与云南省总体情况有类似的变化趋势,与全国情况差异较大。1.3.2地区分布乙肝病例的分布与各民族聚居地基本一致,佤族发病率最高（95.26/10万）,主要分布在西盟县、沧源县;其次为回族（59.04/10万）,主要分布在寻甸县、巍山县;第三位的是独龙族和怒族（54.17/10万）,主要聚集在贡山县。发病率最低的三个民族分别为:景颇族（22.51/10万）,主要分布在德宏州;瑶族（28.59/10万）,主要分布在河口县、金平县;拉祜族（30.32/10万）,主要分布在镇沅县、双江县和澜沧县。1.3.3人群分布2009-2018年云南省少数民族乙肝发病率均呈现男性高于女性,男性63404例,发病率为51.77/10万;女性31 728例,发病率为29.00/10万,发病率男女性别比为1.78:1（P<0.001）。各年龄组均有病例报告,病例数所占比重最高的是40-49岁组（23%）,其次为30-39岁组（20%）;最低的是0-9岁组和80岁及以上组（1%）。2云南省少数民族乙型肝炎病毒分子流行病学调查研究2.1基本情况云南省2017-2018年765例少数民族的HBV阳性标本中,HBV DNA扩增成功的标本672份,成功率为87.84%;649例完成S基因测序,测序成功率为97%。649株HBV可被分为四种基因型,其中138（21.3%）株属于B基因型,C基因型497株（76.6%）,D基因型12株（1.8%）,Ⅰ基因型2株（0.3%）。B基因型可分为不同亚基因型,有1株B1,1 18株B2,9株B3,7株B4,2株B7,1株B8;C基因型中有394株C1,60株C2,17株C5,24株C8,1株CI10,1株C17;D基因型中有1株D3,11株C/D重组基因型;Ⅰ基因型中2株均为I1。2.2云南省少数民族HBV分子流行病学特征云南省HBV基因型和基因亚型的分布都存在民族差异,优势基因均为C型,除独龙族以C2亚型为主,其他主要为C1亚型;其次是B型,主要为B2亚型;D型中主要为C/D重组基因型。四种基因型的性别和年龄分布均无统计学差异,男女比例均约为1:1,均以C型为主;649例S基因测序成功的标本中,最大年龄为87岁,最小年龄为1岁,所有年龄组均以C基因型为主。地区分布有差异,C基因型在各州市均有分布,B基因型主要分布在文山,两例Ⅰ基因型病例均在文山发现;D基因型病例主要分布在迪庆。四种基因型在两年间的分布没有统计学差异。2.3不同基因型临床特征分析165例急性乙肝病例中,不同基因型出现乏力、食欲减退、恶心、纳差症状和黄疸体征均无统计学差异,所有病例均未出现肝肿大、脾肿大、肝掌和蜘蛛痣等体征;有158例（95.8%）出现ALT值异常,不同基因型的ALT值无统计学差异。[结论]1云南省少数民族2009-2018年乙型病毒性肝炎流行趋势及流行病学特征1.1 2009-2018年云南少数民族乙肝年均发病率为41.27/10万,低于全国、全省平均发病水平。各民族均有病例发生,佤族最高（95.26/10万）,主要分布在西盟县、沧源县;景颇族最低（22.51/10万）,主要分布在德宏州。不同民族的年平均发病率存在统计学差异,青壮年男性为少数民族乙肝发病的重点人群。1.2通过SOM聚类分析得到的同一类包含的民族发病率时间轨迹具有很强的相似性。其中第二类包含的:全国、佤族、壮族和苗族总体上明显高于其他三类,应给予足够的乙肝防治重视和卫生资源配置。2云南省少数民族乙型肝炎病毒分子流行病学调查研究2.1本次研究发现了B、C、D和I四种基因型,不同的基因型又分为不同的基因亚型。阿昌族、白族、布朗族等18个少数民族均以C型为主,主要为C1亚型;B基因型主要分布在彝族中;D基因型主要分布在藏族病例中,且为C/D重组基因型,两例Ⅰ型病例均为壮族,HBV基因型和基因亚型的分布都存在民族差异,不同民族的生物易感性可能在HBV流行的差异中起作用。性别和年龄分布均无差异。2.2少数民族急性乙肝病例,不同基因型出现乏力、食欲减退、恶心、纳差、黄疸及ALT值等主要症状及体征均无统计学差异。3防控建议3.1青壮年男性是少数民族乙肝发病的重点人群,在防控工作中,针对青壮年男性的特点,开展健康宣传教育,提高对传染病危害的认知和自我保护意识,通过减少危险行为,降低乙肝感染风险。3.2对发病率较高的佤族、回族、独龙族、怒族开展高发因素调查分析,制定有针对性的防控措施和策略。3.3继续巩固和落实乙肝疫苗基础免疫,提高儿童乙肝疫苗全程接种率和及时接种率。3.4云南省少数民族HBV感染以C型为主,提示我们大多数病例存在向肝硬化和肝癌进展的高风险,应加强三级预防的宣传和政策推广。
刘莹[5]（2020）在《云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）属嗜肝DNA病毒科,是一种带有包膜的小型环状部分双链（ds）DNA病毒。HBV感染是导致慢性乙型肝炎（CHB）、肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要致病因素,对人类的健康造成很大威胁。由于不同基因型和亚型对乙肝患者存在致病性和治疗效果的差异,云南具有独特的地理位置和多民族聚集的地域特征,针对云南少数民族人群开展HBV的分子流行病学研究为乙型肝炎的治疗和控制具有重要意义。此外,近期研究发现HBV Pg RNA是HBV ccc DNA的直接转录产物,能够通过反映HBV ccc DNA的转录活动状态进而反映慢性乙型肝炎病情进展,从而指导临床治疗和判断预后。然而,目前针对HBV pg RNA的检测方法研究较少且该方法还未推广应用到临床。基于此本论文针对云南地区八个少数民族的普通人群进行了HBV流行病学调查并建立了HBV pg RNA的检测方法以及该方法的评价。首先,针对普通人群我们采集了云南地区五个少数民族（佤族、布朗族、哈尼族、纳西族、普米族）共计2696例血浆样本,利用Elisa方法检测发现,HBs Ag总体阳性率为7.6%（204/2696）,其中普米族感染率最高为15.4%（58/376）、哈尼族7.6%（37/487）、佤族7.4%（66/896）、布朗族5.4%（25/464）、纳西族4.9%（23/473）。针对204例HBs Ag阳性样本,我们利用HBV S基因进行基因型和亚型分析,结果显示该人群中HBV亚型分布为B2（48.6%）、C1（34.2%）、B4（13.9%）、C2（0.7%）、C5（0.7%）、和4.9%（10例）未确定基因亚型。为了进一步比较不同少数民族中HBV亚型分布差异,我们还收集了206例包括三个民族（傣族、彝族和汉族）乙肝肝病血液样本,经基因亚型分析显示,该人群中HBV亚型分布为B2（29.6%）、C1（29.1%）、C2（23.3%）、B1（0.5%）、B4（0.5%）以及35个未分型样本。经统计分析发现,哈尼族以B2（75%）为主,普米族以B2（38.6%）和C1（43.9%）亚型为主,纳西族以C1（47.1%）亚型为主,彝族以基因型B2（32.69%）和基因型C1占（38.46%）亚型为主,傣族以基因型C1（67.35%）为主,汉族以基因型B2（30.48%）和C2（36.19%）为主。其次,为了进一步分析上述45例未分型样本的基因特征,我们进行了HBV全基因组序列的扩增,其中我们成功获得了39例HBV全基因序列,经序列分析发现8例属于B/C重组,1例B/I重组。7例属于潜在B新亚型,6例属于C型新亚型,其余16例属于不同亚型。为了进一步命名这些新的HBV亚型,基于HBV全基因组序列我们分别进行了HBV遗传距离分析、同源关系进化树分析、基因重组分析、以及特异性氨基酸突变分析,分析发现这些样本符合HBV基因亚型的命名规则,因此我们将它们命名为B10和C17亚型。最后,我们针对HBV Pg RNA5’和3’端序列的特征,分别建立了两种HBV Pg RNA荧光定量PCR检测方法,经特异性、灵敏性、重复性分析发现针对HBV5’端序列建立的Pg RNA的检测方法特异性更好、灵敏度更高。此外,我们选择了40例临床HBV样本就我们建立的HBV Pg RNA检测方法进行评价,结果显示,慢乙肝样本中HBV Pg RNA含量明显高于乙肝肝癌样本,该结果与临床表现相符与相关文献报道一致,该结果表明我们建立的HBV Pg RNA的方法具有潜在的临床应用价值。综上所述,本研究阐明了HBV在云南地区八个民族中基因型和亚型的分布情况并比较了不同民族之间基因型的差异,揭示了云南地区不同民族HBV基因型的复杂性和多样性。同时我们还建立和评价了两种HBV pg RNA荧光定量的检测方法,为今后HBV的研究提供了重要的理论依据,同时也为临床样本的诊断提供了一种更加方便、灵敏的检测方法。
刘忠萍[6]（2020）在《全球乙型肝炎病毒基因型和基因亚型分布的Meta分析》文中研究说明研究背景乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一个全球公共卫生问题,可引起严重的肝脏疾病。随着对HBV了解的不断深入,关于HBV基因型、基因亚型的研究越来越受到人们的重视。HBV基因型、基因亚型的分布具有明显的地理差异,这可能与HBV感染率、人群以及生活习惯等有关。本文旨在探究全球HBV基因型、基因亚型的分布特点,各个基因型、基因亚型的系统发育特征,以及HBV不同基因型与相关肝脏疾病临床表现、疾病进展风险、抗病毒治疗效果之间的关系,为评估未来HBV感染肝脏相关疾病的发病风险、抗病毒药物的治疗效果、耐药变异及其预后提供有用的辅助信息。方法在Pub Med数据库检索2017年08月以前所有有关HBV感染者基因型和/或基因亚型分布的文献,在Gen Bank数据库中收集HBV全基因组序列和S基因序列,根据纳入排除标准进行纳入排除,然后再按照国家、来源等的不同将不同基因型归类,最终应用Meta分析的方法来研究全球各个国家基因型、基因亚型的分布情况。同时根据HBV核苷酸突变率来估计每个基因型的相对进化时间。结果在PUBMED数据库中检索出205篇有关HBV基因型的原始文献,从Gen Bank数据库中收集了80个国家的全基因组序列和85个国家的S基因序列,经纳入排除标准后有188篇文献、58个国家的全基因组序列和63个国家的S基因序列数据被采用,然后对来自75个国家的274个数据集进行了Meta分析。最终,本研究得到了全球111个国家的详细HBV基因型比例数据和61个国家常见基因型的亚型比例数据,虽然大体基因型分布与前人报道的相似,但是本研究更具体而且更详细。当然也存在一些显着差异:非洲东南部、北非和西非的主要基因型分别为A型、D型和E型。基因型G和H主要分布在墨西哥。基因型F主要分布在中美洲和南美洲,而基因型A和D在巴西、古巴和海地也很常见。海地和南非的A1亚型基因差异较小,在进化树中相邻;而距海地不远的古巴,其A基因型以A2亚型为主,在系统发育上与欧洲的A2亚型关系密切。结论本研究通过对188篇有关HBV基因型分布的文献数据、58个国家的全基因组序列数据和63个国家的S基因序列数据进行整理,再通过Meta分析的方法研究后得到一个较为准确的HBV基因型和基因亚型的分布。不同国家HBV基因型、基因亚型分布不同,与人类迁移民族融合等有关。
马维娟[7]（2019）在《青岛地区无偿献血者HBV感染的人群特征及病毒特征分析》文中进行了进一步梳理目的了解青岛地区无偿献血者的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）流行情况及阳性人群特征,探讨检测手段对HBV阳性率的影响,追踪献血者隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection,OBI）情况,分析献血者HBV基因型,以期为无偿献血宣传招募及归队提供数据支持,为青岛地区献血者HBV的认知和防控提供地域性的指导意见。方法20132018年青岛市中心血站无偿献血者643771例血液标本通过常规HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）血清学试验和核酸扩增技术（nucleic acid amplification test,NAT）检测,确立HBV阳性献血者;统计学分析HBV阳性献血者与年度、年龄、性别、学历和献血次数（初次献血和重复献血）之间的关系;对部分HBsAg阳性样本通过中和实验进行确认;对部分HBsAg-/HBV DNA+和HBsAg+/HBV DNA+标本进行高精度病毒载量检测和补充乙肝五项（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb）检测,并追踪随访,重复检测其病毒载量和乙肝五项;采用PCR直接测序法获得样本中HBsAg编码基因即S基因序列,通过与GenBank中HBV标准序列及共有序列比对,绘制系统进化树,分析病毒基因型别及HBsAg氨基酸变异情况。结果（1）共筛查出HBV阳性标本1624例（0.252%）,其中HBsAg+/HBV DNA-892例（0.139%）,HBsAg-/HBV DNA+316例（0.049%）,HBsAg+/HBV DNA+416例（0.065%）。（2）HBV总阳性率、HBsAg+/HBV DNA-和HBsAg+/HBV DNA+在2015年的阳性率较高（P<0.05）;HBV总阳性率和HBsAg+/HBV DNA+阳性率在18-55岁间随年龄增长上升（P<0.05）,HBsAg-/HBVDNA+阳性率在18-60岁间随年龄增高呈上升趋势（P<0.05）,而HBsAg+/HBV DNA-在<45岁献血者阳性率高,26-35岁最高（P<0.05）;HBV总阳性率在性别间差异无统计学意义,但HBsAg+/HBV DNA-阳性率男性低于女性（P<0.05）,HBsAg-/HBV DNA+和HBsAg+/HBV DNA+检出率男性高于女性（P<0.05）;HBsAg+/HBV DNA-、HBsAg-/HBV DNA+和HBsAg+/HBV DNA+的阳性率均随着学历升高而逐渐降低（P<0.05）;初次献血者的HBV总阳性率、HBsAg+/HBV DNA-和HBsAg+/HBV DNA+的阳性率明显高于重复献血者（P<0.05）。（3）HBsAg双试剂阳性样本的确证率明显高于单试剂阳性样本（P<0.05）。（4）62例HBsAg-/HBV DNA+标本HBV病毒载量25例定量阴性,47例定量阳性,其中27例HBV DNA<20 IU/ml,20例>20 IU/mL;12例HBsAg+/HBV DNA+样本均定量阳性,2例HBV DNA<20 IU/ml,10例>20 IU/ml;62例HBsAg-/HBV DNA+标本乙肝五项结果HBcAb+53例（85.48%）,其中单独HBcAb+26例（41.94%）,HBsAb+/HBcAb+13例（20.97%）;32例HBsAg-/HBV DNA+献血者追踪随访发现1例标本两次的结果均为HBsAg+、HBeAb+、HBcAb+,1例为HBsAg血清转换前窗口期,1例为一过性的HBV感染,其余22例为OBI,7例需进一步确定HBV DNA是否阳性。（5）5例OBI和13例HBsAg+献血者样本成功测序,4例OBI和5例HBsAg+标本为B基因型,1例OBI和8例HBsAg+标本为C基因型。2例OBI样本在HBsAg主要亲水区发生与免疫逃逸和OBI相关位点突变,3例HBsAg+样本在MHR区域也发生突变。结论（1）年龄、学历、是否重复献血、检测手段均影响献血者HBV检出率,应合理招募献血者,加大重复献血者队伍的组建力度,更新检测手段,减低输血风险并避免不必要的献血者流失。（2）HBsAg-/HBV DNA+献血者HBcAb检出率高,病毒载量低,以OBI比率最多;核酸检测与ELISA结合在很大程度上降低窗口期和OBI传播HBV的风险,提升血液安全。（3）青岛地区献血者携带的HBV主要为B型和C型,HBsAg氨基酸突变可能与OBI形成有关。
潘明洁,徐陈瑜,刘兰华,刘景丽,戴毅敏,胡娅莉,周乙华[8]（2019）在《母亲乙型肝炎表面抗原基因变异与新生儿免疫预防失败无关》文中研究说明目的探讨乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染母亲HBV S基因变异与新生儿免疫预防失败的关系。方法纳入乙型肝炎（乙肝）表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）阳性、经PCR扩增HBV S基因并测序成功的660例产妇以及其随访的子女673例。根据母亲HBV S基因a决定簇和主要亲水区（major hydrophilic region,MHR）有无变异,将母亲分为变异组和未变异组,比较两组新生儿免疫预防失败率。同时比较新生儿免疫预防成功组和预防失败组母亲的HBV S基因变异率。结果 673例子女中,14例（2.1%）发生慢性感染,均为乙肝e抗原（hepatitis B e antigen, HBeAg）阳性母亲的子女（14/273,5.1%）,400例HBeAg阴性母亲的子女感染率为0（P<0.001）。660例母亲中,S基因a决定簇氨基酸发生变异166例,不包含a决定簇（124～147位氨基酸）的MHR氨基酸发生变异141例。HBeAg阴性母亲a决定簇变异率（31.8%）高于HBeAg阳性母亲（15.6%）（P<0.001）。a决定簇和MHR变异率在HBV感染预防成功组（分别为25.3%和21.5%）和预防失败组（分别为16.7%和16.7%）母亲差异无统计学意义（P值分别为0.728和0.964）。在270例HBeAg阳性母亲中,HBV感染预防成功组和预防失败组的a决定簇（15.5%和16.7%,P=1.000）以及MHR变异率（10.1%和16.7%,P=0.804）差异无统计学意义。在所有母亲中,a决定簇变异和未变异的母亲,其子女感染率分别为1.2%和2.4%（P=0.535）,MHR变异和未变异的母亲其子女感染率分别为1.4%和2.3%（P=0.715）。在HBeAg阳性母亲中,a决定簇变异与未变异的母亲其子女感染率分别为4.8%和5.2%（P=1.000）,MHR变异和未变异的母亲其子女感染率分别为7.1%和4.9%（P=0.954）。结论本研究结果表明,新生儿免疫预防失败与母亲HBV S基因变异无明显关系,而是与HBeAg阳性母亲的高病毒载量有关。
聂源[9]（2019）在《HIV/HBV合并感染治疗队列HBV变异特征及其对长期HBV病毒学应答和炎性反应的影响》文中研究说明研究背景:HIV、HBV有相似传播途径,HIV/HBV合并感染常见。总体上,HIV感染者中有5%20%可同时感染HBV。HIV/HBV合并感染可相互促进疾病进程,与HBV单一感染相比,合并感染终末性肝病进程明显加快;与HIV单一感染相比,合并感染免疫重建延缓。高效抗逆转录病毒疗法（HAART）可同时抑制合并感染者体内HIV和HBV复制,但不能彻底清除HIV储存库和HBV储存库（肝细胞内的HBV cccDNA）,终末性肝病成为目前HIV感染者死亡的首要原因。我国HBV传播方式主要为母婴传播,基因型以B型、C型为主。鉴于我国HBV与西方不一样的流行特点和更差的预后转归,HIV/HBV合并感染者治疗过程中应考虑我国HBV感染的独特性。HBV基因组序列变异含有多种形式,包括PreS区缺失。PreS/S区编码翻译的多肽包含HBV多个重要的抗原表位,表位的免疫原性改变,可使病毒逃避宿主的免疫监视而致持续的免疫反应。HBV在宿主体内复制过程中因序列变异可产生大量的错配的但不构成基因型差异的种群,其中具有逃避宿主免疫攻击的准种逐渐发展为优势准种是HBV持续感染和慢性化的重要原因。HIV/HBV合并感染治疗前PreS区准种变异特征及是否影响合并感染纵向队列治疗过程中的HBV病毒学应答及炎性反应,尚缺乏全面的研究报道。我们课题组前期的研究发现,治疗前HBV PreS准种缺失与HIV/HBV合并感染者治疗后免疫重建（CD4+T淋巴细胞数及CD4/CD8比值的回升）相关,提示治疗前合并感染者的HBV基因组序列变异可能对治疗效果甚至预后产生影响。已有研究发现:与HCC相关的PreS、A1762T/G1764A等HBV基因组变异在HIV/HBV合并感染中更常见,HBV基因组特定序列变异（主要包括点突变和PreS区缺失）,与HBV单一感染肝硬化、HCC等终末性肝病发病率增加显着相关。那么HIV/HBV合并感染队列中的HBV序列变异是否与疾病进程加快相关?可能通过什么机制导致疾病进程加快?回答这个问题需要依托HIV/HBV合并感染的纵向治疗队列,研究分析HIV/HBV合并感染队列治疗前HBV序列变异特征及其对治疗过程中的HBV病毒学应答和炎性反应的影响。本课题目的是研究HIV/HBV合并感染队列HBV变异特征及其对长期HBV病毒学应答和宿主炎性反应的影响,以探讨HIV/HBV合并感染的疾病进程加快的可能机制。研究分为三部分:第一部分基于横断面的HBV全基因序列,分析HIV/HBV合并感染抗病毒治疗前出现的已知肝病进展相关的HBV变异的特征,从全基因组角度深度分析合并感染HBV变异及与宿主免疫相关性;第二部分研究是在第一部分全基因组分析的基础上,分析HIV/HBV合并感染队列治疗前HBV PreS准种变异特征和异质性;第三部分是在第二部分研究的基础上,基于随访6年的HIV/HBV合并感染纵向治疗队列,从长期治疗过程中HBV病毒学应答（采用相关指标:HBV DNA、HBsAg、HBV PgRNA）和炎性反应活化（采用相关指标:sCD14、sCD163、IP-10、IL-18）角度出发,研究分析治疗前HBV PreS准种缺失对长期治疗过程中HBV病毒学应答、宿主炎性反应的影响。第一部分HIV/HBV合并感染者治疗前HBV全基因组变异特征研究目的深度分析HIV/HBV合并感染治疗前HBV全基因组序列变异特征,为进一步研究治疗前HBV序列变异对HIV/HBV合并感染纵向治疗队列的可能影响提供依据。研究方法以HIV/HBV合并感染者、HBV单一感染者为研究对象。采集患者抗病毒前外周静脉血,提取血浆中DNA,以DNA为模板进行HBV全基因组PCR扩增（nest-PCR）,PCR产物经Sanger测序后,序列经Contig Express软件拼接,Bio Edit7.0软件将拼接序列与相应基因型的HBV野生株序列进行比对,比较两组HBV序列中肝病进展相关变异（A1762T、G1764A、G1896A、G1613A、C1653T、T1753V、A1846T、G1899A、Pre S1缺失、Pre S2缺失）和HBV Pre S/S表位变异发生率;以HIV/HBV合并感染CD4+T淋巴细胞数100个/ul为临界值分组,比较两组肝病进展相关变异发生率;以HIV/HBV合并感染有无Pre S缺失分组,比较两组同时发生点突变的比例。系统进化树分析使用MEGA6.0软件。统计学分析采用Office2010和SPSS19.0软件,P<0.05表示差异有统计学意义,采用单因素和多因素的Logistic回归分析多变量模型中的相关因素。研究结果1.成功扩增全长基因组序列的HIV/HBV合并感染者82例、HBV单一感染者50例,性别组成、年龄、HBe Ag状态、基因型、ALT、AST、HBV DNA比较均无统计学意义。2.除G1613A变异外,其他肝病进展相关的HBV变异发生率在HIV/HBV合并感染都较高,其中T1753V变异比较具有统计学意义。3.HIV/HBV合并感染有Pre S缺失组与无Pre S缺失组的肝病进展相关的点突变比例比较发现,除C1653T外,其余位点在Pre S缺失组均有较高的变异比例,其中A1762T、G1764A、G1613A、T1753V变异率比较具有统计学意义。4.单因素和多因素Logistic回归分析发现,合并HIV感染是T1753V变异发生的相关因素;HBV基因C型是A1762T、G1764A变异发生的相关因素;HBV基因B型是G1896A变异发生的相关因素;HBe Ag阴性是G1896A、A1846T、G1899A变异发生的相关因素。5.除C1653T、G1899A位点外,HIV/HBV合并感染CD4+T淋巴细胞数≤100个/ul组比CD4+T淋巴细胞数≤100个/ul组其余位点变异率较高。6.遗传进化分析发现有Pre S缺失的患者进化关系较远。HIV/HBV合并感染较HBV单一感染所有的细胞毒性T细胞（CTL）表位变异发生率均偏高,Pre S2aa1-15表位比较具有统计学意义,Pre S2 aa1-15表位缺失率也明显偏高。除Pre S2aa1-26外所有的B细胞表位和所有的Th细胞表位变异发生率比较无统计学意义。研究结论HIV/HBV合并感染者治疗前HBV肝病进展相关变异及Pre S区表位变异均高于HBV单一感染者,且免疫功能低下的HIV/HBV合并感染者有着更多的肝病进展相关变异,提示HBV的变异与宿主免疫状态相关,HIV/HBV合并感染者有着更高的肝病进展风险。第二部分HIV/HBV合并感染者治疗前HBV Pre S准种变异特征研究目的从准种角度出发,分析HIV/HBV合并感染者Pre S区准种变异特征、异质性及其与宿主免疫状态的相关性。研究方法以HIV/HBV合并感染者、HBV单一感染者为研究对象。采集患者抗病毒前外周静脉血,提取血浆中DNA,以DNA为模板进行HBV Pre S区PCR扩增（nest-PCR）,选取HBV Pre S扩增阳性产物进行T-A克隆,单克隆PCR后选取阳性克隆菌液送公司菌液测序,采用Chromas2.4软件、Bio Edit7.0软件与相应基因型的HBV野生株序列进行比对,比较两组发生Pre S缺失患者数比例;Pre S准种缺失频率、异质性。异质性采用Golang语言程序包、MEGA6.0软件计算。统计学分析采用Office2010和SPSS19.0软件,P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.PCR成功扩增HBV Pre S区样本分别来自HIV/HBV合并感染组（71例）和HBV单一感染组（76例）,两组患者性别组成、年龄、HBe Ag状态、基因型、ALT、AST、HBV DNA比较均无统计学意义。2.HIV/HBV合并感染组与HBV单一感染组Pre S缺失患者数比例比较发现（准种序列中出现一条HBV Pre S缺失归为有Pre S缺失的患者）,HBV单一感染组中发生Pre S缺失患者数比例高于HIV/HBV合并感染组,比较无统计学意义。3.HIV/HBV合并感染发生Pre S缺失患者的Pre S缺失准种频率高于HBV单一感染组;发生Pre S1缺失的Pre S1准种频率在HIV/HBV合并感染中显着较高,具有统计学意义;发生Pre S2缺失的准种频率,HIV/HBV合并感染较高;HIV/HBV合并感染HBV Pre S区功能区域准种缺失频率较HBV单一感染较高,其中S蛋白启动子区、热休克蛋白70结合位点比较具有统计学意义。4.HIV/HBV合并感染组（55例）较HBV单一感染组（32例）的HBV准种异质性较低,准种进化宽度较窄。研究结论HIV/HBV合并感染者更常发生高频率HBV Pre S1、Pre S2准种缺失,且Pre S1缺失为主;功能区域准种缺失频率普遍较高,S蛋白启动子区与热休克蛋白70结合位点准种缺失频率为着;HBV准种异质性较低,准种进化宽度较窄,提示合并HIV感染对HBV Pre S区准种变异存在明显影响。第三部分HIV/HBV合并感染者治疗前HBV Pre S准种缺失对治疗后HBV病毒学应答和炎性反应的影响研究目的根据第二部分研究结果,以HIV/HBV合并感染随访6年纵向治疗队列为基础,分析治疗前HBV Pre S准种缺失对HIV/HBV合并感染者长期抗病毒治疗过程中HBV病毒学应答、炎性反应的影响。从病毒学、免疫学角度,研究HIV/HBV合并感染中HBV Pre S缺失可能引发致病的机制。研究方法获取纵向队列治疗前血浆（0年）及治疗后随访2年、4年、6年共4个时间点血浆,ELISA方法定量检测s CD14、s CD163、IP-10、IL-18,电化学发光方法定量检测HBs Ag、PCR-荧光探针法定量检测HBV DNA、HBV Pg RNA。依据治疗前有无HBV Pre S、HBV Pre S1、HBV Pre S2准种缺失,将HIV/HBV合并感染队列分组,分析治疗前有HBV Pre S、HBV Pre S1、HBV Pre S2准种缺失组与相应无缺失组HBV病毒学应答指标（HBV DNA、HBs Ag、HBV Pg RNA）、炎性因子（s CD14、s CD163、IP-10、IL-18）纵向变化差异。统计学分析采用Office2010和SPSS19.0软件,绘图采用Graph Pad Prism 6.0软件。P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.HIV/HBV合并感染有Pre S准种缺失组（42例）与无Pre S准种缺失组（29例）比较发现:（1）所有时间点的血浆HBV DNA检测值比较均无统计学意义。（2）有Pre S缺失组血浆HBs Ag检测值在治疗前（0年）明显低于无Pre S缺失组,具有统计学意义,且治疗2年、4年、6年时间点持续趋低于无Pre S缺失组。（3）有Pre S缺失组血浆HBV Pg RNA检测值在治疗前（0年）、治疗2年与无Pre S缺失组明显偏高,具有统计学意义,在治疗4年、6年时间点,比较无统计学意义。2.HIV/HBV合并感染有Pre S1准种缺失组（34例）较无Pre S1准种缺失组（37例）比较发现:（1）所有时间点的血浆HBV DNA、HBs Ag检测值比较均无统计学意义。（2）有Pre S1缺失组血浆HBV Pg RNA检测值在治疗前（0年）、2年明显偏高,具有统计学意义,治疗4年、6年比较无统计学意义。3.HIV/HBV合并感染有Pre S2准种缺失组（22例）较无Pre S2准种缺失组（49例）比较发现:（1）所有时间点的血浆HBV DNA、HBV Pg RNA检测值比较均无统计学意义。（2）有Pre S2缺失组血浆HBs Ag检测值在治疗前（0年）明显低于无Pre S2缺失组,具有统计学意义,且治疗2年、4年、6年时间点持续趋低于无Pre S2缺失组。4.HIV/HBV合并感染队列中纵向检测系列血浆炎性因子（s CD14、s CD163、IP-10、IL-18）者共59例,（1）相对无Pre S准种缺失组（27例）,有Pre S准种缺失组（32例）比较发现:血浆s CD14、s CD163、IL-18检测值在治疗前（0年）明显偏高,具有统计学意义;治疗2年、4年、6年时间点比较无统计学意义;所有时间点的血浆IP-10检测值比较均无统计学意义。（2）相对无Pre S1准种缺失组（33例）,有Pre S1准种缺失组（26例）比较发现:血浆s CD14、s CD163、IL-18检测值在治疗前（0年）偏高,其中s CD14、s CD163比较具有统计学意义,且s CD163检测值在治疗2年、4年、6年有偏高趋势;治疗2年、4年、6年s CD14、IL-18检测值无统计学意义;所有时间点的血浆IP-10检测值比较均无统计学意义。（3）相对无Pre S2准种缺失组（41例）,有Pre S2准种缺失组（18例）比较发现:血浆s CD14、s CD163检测值在治疗前（0年）偏高,具有统计学意义;治疗2年、4年、6年比较无统计学意义;在所有时间节点IL-18检测值均偏高,治疗4年、6年比较具有统计学意义;所有时间点的血浆IP-10检测值比较均无统计学意义。研究结论HIV/HBV合并感染队列治疗前HBV Pre S准种缺失影响治疗过程中HBV病毒学应答和宿主炎性反应,尤其是Pre S2缺失,与长期HAART血浆中低水平HBs Ag及高水平IL-18相关,提示HBV Pre S缺失可能通过HBs Ag分泌异常导致炎性反应异常活化,从而加快HIV/HBV合并感染者疾病进展。
蔡林[10]（2019）在《藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究》文中进行了进一步梳理研究背景:HBV在乙肝患者体内以准种的形式存在,早已经被学者证实。HBV病毒变异的多样性,既与病毒自身复制时多聚酶缺乏校正功能,容易产生随机突变有关,还与宿主免疫状态、抗病毒治疗的干预有关。不同的人群、不同的疾病阶段都会有不同的HBV准种变异特点。HBV准种变异与乙肝的诊断、治疗、疾病转归息息相关。目前研究较多的变异是HBV BCP区、preC/C区、preS/S区、RT区,例如BCP区的A1762T/G1764A双突变、preC区G1896A突变都会导致C基因转录的异常,会造成HBeAg合成障碍,且都与肝硬化、肝癌的发生有关。西藏地区地处高原地带,地理上、人文上都与外界相对隔离,在西藏藏族人群中,乙肝感染率高达12%以上,远高于国内平均感染率（6.1%）。目前对于藏族人乙肝病毒的研究发现,藏族人HBV流行株以C/D重组型为主,而汉族人以B、C型为主,目前对藏族C/D型HBV准种的研究较少,尚不清楚其是否具有独特的准种特点。HBV在人体内会受到宿主免疫压力的选择,病毒抗原经HLAⅠ类和Ⅱ类分子呈递表位肽,刺激CD8和CD4+T细胞应答,表位肽的变异会造成T细胞不能识别而出现免疫逃逸。因此不同HLA分子能驱动不同的HBV变异,对HBV变异存在限制性。目前研究较多的是HLAⅠ类分子限制的表位肽,例如HBV核心蛋白HBcAg 17-28aa是HLA-A2限制的抗原肽;对于藏族HBV感染者的HLA限制性目前则尚无相关研究。研究目的:本研究以西藏藏族乙肝感染者为研究对象,试图探讨藏族人HBV病毒准种特点,以及藏汉不同民族HLA遗传背景下对HBV的限制性,旨在加深HBV病毒准种变异及其HLA分子限制性的认识。方法:以1例C基因型HBV样本（pAAV-HBV质粒）为参考序列进行三代测序用于HBV全长准种分析的方法学探索,先对pAAV-HBV质粒进行HBV全长PCR扩增,在三个独立的测序单元（cell）中加入相同量的质粒扩增产物,通过BioEdit7.0、MEGA 7.0等生物信息工具对测序序列的分析,得出三代测序的错误率,以及用于准种分析的遗传距离、突变率的合理阈值。以2016-2017年在西藏藏南地区进行流行病学调查时采集到24例HBsAg阳性患者为研究对象,同时于2017年在西南医院感染科门诊匹配收集24例汉族乙肝感染者血液样本作为对照组。从100ul血清中提取HBV DNA,通过PCR扩增HBV全基因组,进而利用第三代DNA测序平台PacBio RS II对HBV进行全长测序;同时从血细胞样本中提取人gDNA,利用SBT（Sequence-Based Typing）分型方法对HLA-A、B、C、DRB1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1八个位点进行四位数字的高分辨率分型。利用PacBio SMRT Tools进行测序数据的拆分及CCS（Circular consensus sequences）序列的生成;序列编辑用BioEdit7.0完成;序列比对用Clustal W 2.1、Muscle 3.8、T-Coffee11.0来完成。核酸替换模型的测试用Modeltest3.7完成。系统进化分析采用MEGA 7.0进行,进化树的构建采用邻接法（Neighbor-Joining）,进化树可靠性分析采用自助抽样法（Bootstrip Method）,Bootstrip重复次数选择500次以上。进化树的分析处理采用FigTree v1.4.3完成。重组分析采用Stuart C.Ray开发的SimPlot 3.5进行。病毒准种特点用两种方法描述:香农熵（Shannon entropy,Sn）和平均遗传距离（mean genetic distance,d）,前者计算公式为:Sn=-Σi（piInpi）/InN,pi为第i个种群序列出现的频率,N为总的种群数量。遗传距离用MEGA 7.0计算,核酸替换模型选择TN+G（Tamura-Nei model+Gamma distribution）,同时用校正的Nei-Gojobori method（Jukes-Cantor）+G模型计算同义突变率（Synonymous mutation,dS）及非同义突变率（Nonsynonymous mutation,dN）。借助人工神经网络在线工具NetMHC 4.0 Server和NetMHCⅡ2.3 Server分别预测HLAⅠ、Ⅱ类分子与HBV肽段的亲合力（网址:https://www.cbs.dtu.dk/services/）。结果:1.第三代测序平台PacBio RS II用于HBV全长测序方法具有可行性,平均读长可达到3.4kb,其测序总错误率为2.13%,插入错误为主,其次为缺失和错配,分别为1.45%、0.62%、0.06%。测序读长越长,测序错误率就越低。运用生物信息学方法删除插入错误后总错误率降低到0.69%下。HBV准种分析中将遗传距离阈值设定为0.01,突变筛查阈值设定为3.5%。2.藏族人HBV以C/D重组型为主,且有两种重组类型:C2/D4型与C2/D3型,前者是D4型的1-750nt片段与C2型重组,后者是D3型的1-1500nt片段与C2型发生重组。C2/D4为主要的优势毒株（77.8%）。3.C/D重组型HBV比对照组在preC/C区有更高的复杂度（P=0.006）和非同义突变率（P=0.006）。C/D型HBV准种变异主要集中在EnhⅡ区（1636-1744nt）、BCP区（1742-1849nt）和preS区（2848-152nt）,包括C1653T突变（44.4%）、T1753V/A1762T/G1764A三联突变（44.4%）、preS的缺失突变（33.3%）等。汉族对照样本变异集中在preC、S基因、X基因,包括G1896A变异（35.0%）、sS143T变异（70.0%）,及xV5L变异（75.0%）等。4.藏族人HLAⅡ类分子基因型HLA-DRB1*12:01:01G（55.6%vs 5.6%,P=0.008）、DQA1*05-DQB1*03:01（77.8%vs 16.7%,P=0.004）要多于汉族人,而HLAⅠ类分子中HLA-B*40:01比汉族对照少（0%vs 50.0%,P=0.012）。提示藏族人HLA的遗传背景不同与汉族人。5.HBV X基因36aa（1479nt）位点变异在HLA-DRB1*12:01:01G样本中更多见（66.7%vs 14.3%,P=0.024）,P基因268aa（3108nt）位点变异在HLA-DQA1*05-DQB1*0301样本中更多见（50.0%vs 5.9%,P=0.015）,前者可能位于DRB1*12:01:01G限制的表位区,后者可能位于DQA1*0501-DQB1*0301限制的表位区。提示在藏族人与汉族人在自身不同的HLA遗传背景下,会驱动不同的HBV准种变异。总结:我们探索了第三代测序技术用于HBV全长准种分析的具体方法,确立了HBV准种遗传距离及突变的阈值。发现了C2/D4重组型HBV是藏族人中的优势毒株,同时在HBV全基因组水平探讨了藏族、汉族不同的乙肝病毒准种变异特点。结合HLAⅠ类、Ⅱ类分子的高分辨率分型,初步认识了藏族、汉族人HLA分子的差异,及其对HBV准种变异的限制性。
二、乙型肝炎病毒S基因变异研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒S基因变异研究进展（论文提纲范文）
（2）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）乙肝低水平HBsAg无症状携带者Pre-S/S基因序列分析及相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 主要英文缩写词对照表 |
| 附录B 个人简历 |
| 附录C 综述 |
| 参考文献 |
（4）云南省少数民族乙肝流行特征及分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 云南省少数民族2009-2018年乙型病毒性肝炎流行特征研究 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 云南省少数民族乙型肝炎病毒分子流行病学调查研究 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 建议 |
| 创新性 |
| 局限性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 不同种族/民族乙型肝炎分子流行病学研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙型肝炎 |
| 1.2 HBV传播方式 |
| 1.3 HBV的基因组和生命周期 |
| 1.3.1 HBV的复制与转录 |
| 1.4 HBV基因分型与重组变异 |
| 1.5 HBV基因型地理分布情况 |
| 1.5.1 HBV基因型在世界的流行 |
| 1.5.2 HBV基因型在中国的流行 |
| 1.5.3 HBV基因型在云南的流行 |
| 1.6 国内外不同种族/民族基因型流行现状 |
| 1.6.1 全球不同种族乙型肝炎流行现状 |
| 1.6.2 中国不同民族乙型肝炎流行现状 |
| 1.6.3 HBV在云南各少数民族的流行 |
| 1.7 乙型病毒性肝炎的治疗 |
| 1.7.1 乙型肝炎的治疗现状 |
| 1.7.2 乙肝治疗的新型血清标志物HBV PgRNA |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 1.9 研究的技术路线 |
| 第二章 云南地区HBV在少数民族中的流行 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要的仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 乙肝表面抗原(HBs Ag)ELISA检测 |
| 2.3.2 病毒DNA核酸提取 |
| 2.3.3 引物设计与样本巢式PCR扩增 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 2.3.6 送测序 |
| 2.3.7 双峰样品TA克隆 |
| 2.3.8 菌落PCR |
| 2.3.9 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 云南省HBV的流行病学 |
| 2.4.2 部分受试样本乙型肝炎表面抗原检测阳性结果 |
| 2.4.3 受试者临床生化分析 |
| 2.4.4 HBV部分基因组序列扩增结果及测序分析 |
| 2.4.5 HBV部分基因组序列的系统发育分析 |
| 2.4.6 云南省HBV基因型在少数民族中的流行分布情况 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 HBV基因分型 |
| 2.5.2 HBV在云南地区少数民族中的分布 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 HBV基因组全长扩增 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验对象 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 巢式PCR扩增 |
| 3.3.3 测序 |
| 3.3.4 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HBV基因组序列全长扩增结果及测序分析 |
| 3.4.2 基于全长HBV基因组序列的重组分析 |
| 3.4.3 毒株YNKM91 的全长HBV基因组序列的系统发育和重组分析 |
| 3.4.4 HBV B/I重组毒株(YNKM91)的子区域进化树 |
| 3.4.5 HBV基因型重组序列的重组片段和断点位置分析 |
| 3.4.6 新型HBV亚型C17的全长基因组序列分析 |
| 3.4.7 新型HBV亚型C17的全长基因组耐药突变分析 |
| 3.4.8 HBV新亚型B10全长基因组序列分析 |
| 3.4.9 新型HBV亚型B10的全长基因组耐药突变分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 HBV新亚型的鉴定与命名 |
| 3.5.2 HBV重组分析 |
| 3.5.3 HBV耐药突变分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 HBV PgRNA定量检测方法的建立及应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验对象 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.2.4 主要的数据分析方法 |
| 4.3 引物设计 |
| 4.3.1 普通PCR引物设计 |
| 4.3.2 荧光定量PCR引物和探针的设计 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 样品准备 |
| 4.4.2 样品RNA提取 |
| 4.4.3 PCR扩增HBV PgRNA目的片段 |
| 4.4.4 PCR电泳检测 |
| 4.4.5 目的片段和质粒载体片段双酶切 |
| 4.4.6 PCR产物及质粒载体的纯化 |
| 4.4.7 送测序 |
| 4.4.8 PET32a-PgRNA质粒的构建 |
| 4.5 阳性重组质粒的提取 |
| 4.6 质粒酶切验证和测序验证 |
| 4.6.1 重组阳性质粒双酶切验证 |
| 4.7 HBV PGRNA产物体外转录及纯化 |
| 4.7.1 HBV PgRNA产物体外转录 |
| 4.7.2 HBV PgRNA体外转录产物的纯化 |
| 4.8 荧光定量PCR反应条件的建立 |
| 4.9 荧光定量PCR的反应体系和反应条件 |
| 4.10 结果 |
| 4.10.1 阳性质控品的构建 |
| 4.10.2 Taq_Man的灵敏性实验 |
| 4.10.3 Taq_Man的重复性实验 |
| 4.10.4 Taq_Man的特异性实验 |
| 4.10.5 两种HBV pgRNA检测方法的评价 |
| 4.10.6 临床样本的检测 |
| 4.11 讨论 |
| 4.11.1 Taq Man探针法的灵敏性、特异性和重复性的评价 |
| 4.11.2 临床样本的检测结果评价 |
| 4.12 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（6）全球乙型肝炎病毒基因型和基因亚型分布的Meta分析（论文提纲范文）
| 中英文缩略词汇对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 资料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 乙型肝炎病毒基因型和基因亚型的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）青岛地区无偿献血者HBV感染的人群特征及病毒特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 2 研究对象 |
| 2.1 研究对象来源 |
| 2.2 血液标本采集 |
| 2.3 研究对象检测标本留取 |
| 3 血液常规筛查 |
| 3.1 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBsAg(以SORIN为例) |
| 3.2 罗氏Cobas S201 核酸检测系统检测HBV DNA |
| 3.3 Procleix Tigris核酸检测系统检测HBV DNA |
| 4 HBsAg确认试验(中和试验) |
| 4.1 试验原理 |
| 4.2 试验步骤 |
| 4.3 结果计算 |
| 4.4 结果解释 |
| 5 HBsAg-/HBV DNA+标本的进一步检测 |
| 5.1 高精度病毒载量检测 |
| 5.2 乙肝五项检测 |
| 5.3 追踪试验 |
| 6 HBV S基因序列检测 |
| 6.1 HBV病毒DNA提取 |
| 6.2 引物设计 |
| 6.3 PCR扩增 |
| 6.4 测序分析 |
| 6.5 序列比对 |
| 6.6 系统进化树分析及基因分型 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 青岛地区无偿献血者HBV阳性标本的检出情况 |
| 1.1 无偿献血者HBV感染情况的年度变化 |
| 1.2 青岛地区不同年龄无偿献血者HBV的阳性检出情况 |
| 1.3 青岛地区不同性别无偿献血者HBV的阳性检出情况 |
| 1.4 青岛地区不同学历无偿献血者HBV的阳性检出情况 |
| 1.5 青岛地区初次献血者和重复献血者HBV的阳性检出情况 |
| 2 HBsAg确认检测结果 |
| 3 HBsAg-/HBV DNA+样本病毒载量及乙肝五项检测结果 |
| 3.1 HBV DNA高精度定量检测结果 |
| 3.2 乙肝五项化学发光检测结果 |
| 3.3 追踪随访结果分析 |
| 4 HBV S基因序列分析结果 |
| 4.1 系统进化树及基因分型结果 |
| 4.2 S蛋白功能区基因变异情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（8）母亲乙型肝炎表面抗原基因变异与新生儿免疫预防失败无关（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 资料 |
| 1.2 血清 HBV标志物检测 |
| 1.3 HBV基因分型及S基因变异检测 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 一般情况及病毒学特征 |
| 2.2 母亲HBV S基因变异率与变异氨基酸 |
| 2.3 母子S基因序列同源性比较 |
| 2.4 母亲HBV S基因变异与新生儿免疫预防失败 |
| 3 讨 论 |
（9）HIV/HBV合并感染治疗队列HBV变异特征及其对长期HBV病毒学应答和炎性反应的影响（论文提纲范文）
| 中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 HIV/HBV合并感染者治疗前HBV全基因组变异特征 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HIV/HBV合并感染者治疗前HBV PRES准种变异特征 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HIV/HBV合并感染队列HBV PRES准种缺失对长期HBV病毒学应答和炎性反应的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间的成果 |
| 致谢 |
（10）藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 第三代测序用于HBV准种分析的方法学研究 |
| 2.1 研究对象及材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 藏族人群HBV准种变异特征研究 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 藏族人群HBV准种HLA限制性研究 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV准种变异及其HLA限制性研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、乙型肝炎病毒S基因变异研究进展（论文参考文献）
- [1]乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭患者的病毒S基因准种变异特征分析[J]. 李任,余艳芬,李春林,黎运,邱晓颖,李湖. 国际流行病学传染病学杂志, 2021(01)
- [2]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究[D]. 刘贺. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [3]乙肝低水平HBsAg无症状携带者Pre-S/S基因序列分析及相关性研究[D]. 王童. 蚌埠医学院, 2020(01)
- [4]云南省少数民族乙肝流行特征及分子流行病学研究[D]. 董哲. 昆明医科大学, 2020(02)
- [5]云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价[D]. 刘莹. 昆明理工大学, 2020(05)
- [6]全球乙型肝炎病毒基因型和基因亚型分布的Meta分析[D]. 刘忠萍. 安徽医科大学, 2020(04)
- [7]青岛地区无偿献血者HBV感染的人群特征及病毒特征分析[D]. 马维娟. 青岛大学, 2019(03)
- [8]母亲乙型肝炎表面抗原基因变异与新生儿免疫预防失败无关[J]. 潘明洁,徐陈瑜,刘兰华,刘景丽,戴毅敏,胡娅莉,周乙华. 中国病毒病杂志, 2019(03)
- [9]HIV/HBV合并感染治疗队列HBV变异特征及其对长期HBV病毒学应答和炎性反应的影响[D]. 聂源. 广州医科大学, 2019
- [10]藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究[D]. 蔡林. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)