冠心病患者血红素加氧酶1的表达

一、血红素氧合酶-1在冠心病患者中的表达（论文文献综述）

沈杰^[1]（2021）在《血红素氧合酶-1促AMPK/mTORC1的磷酸化上调自噬是铅暴露肾损伤减轻的重要机制》文中认为随着工业的发展,重金属对环境的污染日趋严重,重金属相关肾病的发病率也逐年升高。铅（Lead,Pb）是目前最常见的重金属环境污染源,因其较长的半衰期在环境中广泛存在。除了职业性接触,日常生活中还有各种含铅物品,如含铅涂料、玩具、香烟、化妆品、染发剂、食品添加剂、汽车尾气等已成为目前铅中毒的主要来源。肾脏是铅中毒的主要受累器官之一,许多临床研究均显示铅与慢性肾功能不全的发生密切相关并且加速慢性肾脏病的进展。铅暴露导致慢性肾脏病发病率增高,但目前临床上对于铅暴露引起的肾功能不全还没有安全有效的治疗方法,因此深入研究铅暴露诱导肾损伤的发病机制、寻找有效的肾保护剂有着重要意义。血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase 1,HO-1）是存在于体内的一种应激蛋白,具有抑制凋亡、抗炎、抗氧化等作用。急性单一剂量醋酸铅腹腔注射诱导大鼠肾脏HO-1表达增加,脂质过氧化物产生增多,而抑制HO-1明显促进肾组织脂质过氧化物的产生;大鼠连续腹腔注射铅3个月肾组织HO-1表达下降,肾脏氧化应激、凋亡、炎症因子分泌增加,在给予保护剂上调HO-1后肾损伤明显改善。故血红素氧合酶-1是铅暴露引起肾损伤的一个重要靶点,但HO-1在铅暴露引起的肾损伤中的作用机制仍不明确。自噬（autophagy）是高等动物细胞中的一种普遍生命现象,是真核细胞在溶酶体介导下,对自身细胞内损伤或衰老的细胞器及蛋白质进行降解的代谢过程。这是维持细胞内稳态的关键过程。在正常生理情况下,基础水平的自噬对于维持肾脏功能具有重要作用。Song等发现使用铅处理后,肾小管细胞的自噬过程被阻断,而后导致自噬体与溶酶体融合后无法进一步降解,最终导致了细胞的凋亡。近年来一些研究发现HO-1能上调心肌细胞的自噬水平,降低缺血再灌注引起的细胞凋亡;抑制HO-1降低肝脏缺血再灌注诱导的自噬表达,导致肝组织损伤进一步加重。在顺铂诱导的小鼠肾损伤模型中,敲除HO-1基因后自噬标志性蛋白未见升高,而肾组织凋亡明显加重;上述结果提示HO-1的保护作用可能与上调自噬有关。目前关于铅暴露肾损伤中HO-1对自噬的调控作用报道较少,因此,我们拟通过体外醋酸铅处理诱导肾小管细胞损伤模型,通过干预HO-1、自噬及AMPK,探讨铅暴露肾损伤中HO-1的保护机制。第一部分:HO-1通过上调自噬减轻铅暴露肾小管细胞损伤目的:利用醋酸铅（Lead acetate,Pb Ac）诱导的肾小管细胞损伤模型,观察HO-1的变化及其对自噬的调控,明确铅暴露肾损伤中HO-1的保护作用。方法:1.利用醋酸铅诱导的肾小管细胞损伤模型,观察HO-1及自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的改变。2.利用醋酸铅诱导的肾小管细胞损伤模型,通过转染高表达HO-1质粒,观察上调HO-1后肾小管细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin 1及细胞凋亡蛋白cleaved-caspase 3的改变。3.利用醋酸铅诱导的肾小管细胞损伤模型,通过自噬抑制剂3-MA预处理,观察肾小管细胞凋亡蛋白cleaved-caspase 3改变。结果:1.不同浓度醋酸铅处理0,24,48,72h后,肾小管细胞活性呈浓度依赖性及时间依赖性下降;50umol/L醋酸铅处理肾小管细胞0、24、48、72h,随着时间延长HO-1蛋白表达逐渐下降,另外自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1水平也呈逐渐下降趋势。2.在醋酸铅处理后HO-1质粒转染组（h HO-1）与空白质粒转染组（EV）相比,肾小管细胞自噬蛋白LC3-II、Beclin1明显升高,电镜结果也显示细胞自噬体数量显着增加,而细胞凋亡蛋白cleaved-caspase 3表达显着下降。3.3-MA预处理进一步加重醋酸铅导致的自噬蛋白LC3-II、Beclin1下降,使醋酸铅诱导的肾小管细胞凋亡蛋白cleaved-caspase 3也显着增加,另外3-MA预处理使HO-1降低凋亡蛋白cleaved-caspase 3的作用也明显减弱。结论:1.醋酸铅导致肾小管细胞活性下降可能与HO-1及细胞自噬能力下降有关;2.HO-1可以通过上调肾小管细胞自噬能力从而减少醋酸铅诱导的细胞凋亡;3.在铅暴露的肾损伤细胞中,抑制自噬可以使得HO-1的肾保护作用减弱;第二部分:HO-1可以通过激活AMPK/m TORC1通路上调自噬,从而减轻铅暴露肾小管细胞损伤目的:利用醋酸铅诱导的肾小管细胞损伤模型,观察AMPK/m TORC1通路的磷酸化改变及HO-1对该通路的调节,明确铅暴露肾损伤中HO-1的保护机制。方法:1.利用醋酸铅诱导的肾小管细胞损伤模型,通过转染高表达HO-1质粒,观察AMPK、m TOR（Ser 2448）磷酸化改变。2.利用醋酸铅诱导的肾小管细胞损伤模型,通过给予AMPK激活剂（AICAR）或者抑制剂（Compound C）,观察细胞自噬和凋亡蛋白的改变。结果:1.与Vehicle处理相比,醋酸铅处理后空白质粒转染组肾小管细胞AMPK磷酸化水平下降、m TOR磷酸化增多,而转染HO-1质粒可以上调AMPK磷酸化、减少m TOR磷酸化。2.AICAR处理可以激活AMPK磷酸化、抑制m TOR磷酸化,使肾小管细胞自噬蛋白LC3-II、Beclin1表达较单纯醋酸铅处理组明显升高,凋亡蛋白cleaved-caspase3显着下降;Compound C预处理抑制肾小管细胞AMPK磷酸化、使m TOR磷酸化水平升高,降低HO-1上调自噬及减少细胞凋亡的能力。结论:1.在铅暴露肾损伤中,HO-1可以激活肾小管细胞的AMPK磷酸化、抑制m TOR磷酸化,使AMPK/m TORC1通路活化;2.激活AMPK/m TORC1通路致使铅暴露肾小管细胞自噬能力增强,参与HO-1的肾保护作用;

周学锋^[2]（2021）在《糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究》文中认为背景糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）的一种严重的微血管并发症,是导致终末期肾脏疾病（end stage renal disease,ESRD）的主要原因之一。2019年,全球糖尿病患病率约为9.3%（4.63亿人）,这一数字预计将在2045年上升到10.9%（7亿人）,大约40%左右的糖尿病患者会变成DKD患者。DKD已经成为危害人类健康的严重疾病。肾脏纤维化是DKD发展过程中的一个重要的病理进程,目前针对DKD肾脏纤维化缺乏行之有效的治疗方案。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGFβ1）在肾脏纤维化的发生发展中具有重要的作用。相关研究证明,TGFβ1/Smad3通路能够通过调节长链非编码RNA（long non-coding RNAs,LncRNA）调节肾脏纤维化。相关研究发现,LncRNA MEG3（GENEID:55384）的过表达加重了细胞增殖,并诱导了细胞凋亡。LncRNA MEG3可以通过调节miR-181a/Egr-1/TLR4轴调节DKD大鼠的肾脏纤维化和炎症反应。氧化应激在DKD的发生和发展中也起着至关重要的作用。活性氧的过量产生可引起DKD患者早期系膜细胞肥大、系膜扩张、细胞外基质蛋白积聚、肾小球硬化、内皮细胞损伤、足细胞凋亡、蛋白尿、肾脏功能障碍。Keap1/Nrf2是非常重要的内源性抗氧化途径。DKD属于中医学“水肿”、“肾消”、“消渴”、“关格”等病证范畴。DKD肾脏纤维化属于典型的“久病入络”、“肾络瘀阻”。DKD之气阴两虚、肾络亏虚,产生痰浊、瘀血等产物阻滞肾络,痰瘀互结日久则络脉淤塞成积,治疗应该益气养阴,通络祛邪。糖肾方是本课题组负责人李平教授研制的治疗DKD的中药复方,由黄芪、生地黄、山茱萸、卫矛、三七、熟大黄、枳壳共七味药组成,具有益气养阴、活血通络的功效。前期多中心、随机、双盲和安慰剂对照试验证实糖肾方能够显着降低DKD患者的蛋白尿水平,并且改善肾小球滤过率（estimated Glomerularfiltrationrate,eGFR）。但是糖肾方治疗DKD肾脏纤维化以及氧化应激损伤的潜在机制仍未被深入探索。因此本课题利用网络药理学方法结合体内外实验验证糖肾方治疗DKD肾脏纤维化、氧化应激损伤的分子机制。目的1.基于网络药理学方法探索糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的潜在机制;2.基于单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型,明确不同剂量糖肾方的治疗作用。3.基于单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞损伤模型,探索糖肾方对DKD肾脏纤维化和氧化应激损伤的作用机制。方法1.利用网络药理学生物信息学方法探索糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的主要活性化合物、作用靶点、参与活动以及作用通路。利用Cytoscape软件绘制可视化网络结构图、PPI图,并进行数据分析。2.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型,观察糖肾方低剂量、糖肾方中剂量、糖肾方高剂量的疗效。8周龄Wistar大鼠,适应性喂养3天,测量基础数据:体重、血糖、尿量、尿蛋白定量。然后根据血糖和体重随机分组,Sham组和DKD组,DKD组进行单侧肾切除以及STZ注射造模手术;造模成功后,随机分为以下5组:DKD组、DKD+糖肾方低剂量组（1.2 g/kg/d）、DKD+糖肾方中剂量组（2.4g/kg/d）、DKD+糖肾方高剂量组（4.8g/kg/d）、福辛普利钠组（1.33mg/kg/d）。实验动物10周龄开始灌胃给药,实验期间每周测体重,每4周测血糖,连续灌胃给药20周后结束实验。取材,收集大鼠血清、肾脏、肝脏等标本,并进行血、尿生化检测,Elisa测定尿蛋白等。病理组织切片PAS、MASSON染色等评估肾脏损伤情况。3.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞损伤纤维化模型研究糖肾方治疗DKD肾脏纤维化机制。基于药效学实验结果,选择糖肾方低剂量组完成本章节机制研究。利用免疫组化、Western Blotting、免疫荧光、Real-time PCR 等实验技术评估糖肾方对 DKD 大鼠的肾脏皮质中 Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin,TGFβ1,Smad 3,p-Smad 3,p-Smad 2/3,LncRNA MEG3 表达水平的影响。糖肾方给药干预高糖诱导的HK2细胞之后,观察HK2细胞中Collagen Ⅰ,Fibronectin,p-Smad 2/3,LncRNA MEG3mRNA 的变化情况。4.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞氧化应激损伤模型研究糖肾方治疗DKD氧化应激损伤的机制。实验分组与方法3相同,利用免疫组化、Western Blotting、免疫荧光、Real-time PCR等实验技术评估糖肾方对DKD大鼠的肾脏皮质中Keap1,Nrf2,HO1,3-NT的影响。利用DHE染色法检测DKD大鼠的肾脏皮质中ROS的含量。糖肾方给药干预高糖诱导的HK2细胞之后,观察HK2细胞中Keap1,Nrf2,HO1的变化情况。结果1.网络药理学研究发现糖肾方的主要活性成分是:槲皮素,beta-谷甾醇,山奈酚,DiincarviloneA,阿魏酸甲酯,地黄苦苷元,羟基-3-甲氧基肉桂醛,豆甾醇,4-羟基肉桂酸甲酯,7-O-methylisomucronulatol;糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的核心靶点有:血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGFA）,表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor,EGFR）,纤连蛋白 1（fibronectin 1,FN1）,TGFβ1,SMAD3,SMAD2等。GO富集分析发现糖肾方参与了抗氧化的生物过程,据此,我们挖掘了与糖肾方有关的氧化应激相关靶点,超氧化物歧物酶1（Superoxidedismutase,SOD1）,HO1,Keap1,Nrf2。糖肾方治疗DKD肾脏纤维化可能是通过调整TGFβ/Smad通路以及Keap1/Nrf2抗氧化应激来实现的。2.药效学结果证明糖肾方能够改善DKD大鼠的肾脏损伤。DKD组大鼠从实验开始时,体重和状态较Sham组较差,随着实验的进行,体重差异持续增加。药物干预第20周时,与DKD组相比较,各给药组的大鼠状态均有改善。糖肾方低剂量、中剂量组大鼠体重从药物干预第14周时体重高于DKD组,并持续到实验结束。DKD组大鼠血糖水平从实验开始时即明显高于Sham组,直到实验结束。糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠组的血糖水平从实验药物干预第16周开始下降,持续到实验第20周时,显着低于DKD组血糖水平。DKD大鼠的脏器指数、24h尿量、尿蛋白/肌酐比值、血清肌酐、血清尿素氮、丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸氨基转移酶、血脂水平等均显着高于Sham组,糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠治疗DKD大鼠20周之后,均能够显着降低24h尿量,减少尿蛋白排泄量,改善肾脏功能、肝脏功能,纠正血脂紊乱;PAS和Masson’s Trichrome染色显示,DKD组大鼠肾脏出现了显着的肾小球系膜基质增生和肾小管损伤,肾间质纤维化,糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠干预治疗后,能够改善DKD大鼠肾脏的病理损伤.3.糖肾方能够通过调节TGFβ1/Smad 3通路以及LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化。与Sham组相比较,DKD大鼠肾脏皮质中Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin的蛋白和基因表达水平均显着升高。DKD大鼠肾脏皮质中的TGFβ1,p-Smad 2/3,Smad3,p-Smad3蛋白表达水平明显高于Sham组。DKD大鼠肾脏皮质中LncRNA MEG3的基因表达水平明显高于Sham组。给予糖肾方干预治疗20周后,可以显着降低DKD大鼠的Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin,TGFβ1,p-Smad2/3,Smad3,p-Smad3,LncRNA MEG3的表达。糖肾方可以改善高糖诱导的HK2细胞中Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白的沉积以及Smad 2/3蛋白的磷酸化。下调TGFβ1 mRNA以及Lnc RNA MEG3 mRNA的表达水平。4.糖肾方能够通过调控Keap1/Nrf2信号通路改善DKD氧化应激损伤。DKD大鼠中MDA含量明显高于Sham组,SOD含量明显低于Sham组。DKD大鼠肾脏皮质中的3-NT、Keap1蛋白和基因表达水平显着升高,Nrf2、HO1蛋白表达水平显着降低;免疫荧光结果显示,DKD大鼠肾脏皮质中的ROS含量增加;给予糖肾方干预治疗20周后,能够显着降低DKD大鼠3-NT、Keap1蛋白和基因的表达水平,上调DKD大鼠肾脏皮质中Nrf2、HO1的蛋白表达水平。此外,糖肾方可以降低NOX4基因表达水平,提高TXNRD1和GCLC基因表达水平。糖肾方可以减少高糖诱导的HK2细胞中ROS的含量,提高Nrf2蛋白以及基因表达水平,降低Keap1蛋白以及基因表达水平。结论本研究利用网络药理学预测糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的潜在靶点,并在DKD动物模型以及HG诱导的HK2细胞中进行验证,明确了糖肾方通过调节TGFβ1/Smad3通路以及LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化;通过调控Keap1/Nrf 2信号通路改善DKD氧化应激损伤。

彭定天,崔伟,韦艳花,曾莉梅,廖韦静,潘雪英,班毓徽,蒙喜斯^[3]（2021）在《急性脑梗死患者血清血红素氧合酶1水平及其与颈动脉粥样硬化斑块的关系》文中指出目的探讨急性脑梗死患者血清血红素氧合酶1（HO-1）水平及其与颈动脉粥样硬化斑块的关系。方法选取100例急性脑梗死患者作为观察组,另选取100例健康者作为对照组,比较两组血清HO-1水平。根据颈动脉彩超结果将急性脑梗死患者分为稳定斑块亚组（38例）、不稳定斑块亚组（25例）及无斑块亚组（37例）,比较3组血清HO-1水平及其他生化指标水平。分析急性脑梗死患者血清HO-1水平与一般临床指标和其他血清指标的相关性。采用受试者工作特征曲线评估血清HO-1水平诊断急性脑梗死患者存在颈动脉粥样硬化斑块的效能。结果观察组血清HO-1水平高于对照组（P<0.05）。急性脑梗死患者中,无斑块亚组、稳定斑块亚组、不稳定斑块亚组血清HO-1水平依次升高（均P<0.05）,不稳定斑块亚组血清LDL-C水平高于其他两个亚组（均P<0.05）;血清HO-1水平与三酰甘油、LDL-C水平呈正相关（均P<0.05）;血清HO-1水平诊断颈动脉粥样硬化的曲线下面积为0.789（P<0.05）,敏感度、特异度、约登指数分别为76.29%、81.46%、0.571。结论急性脑梗死患者血清HO-1水平升高,其可能参与颈动脉粥样硬化斑块的形成及发展过程,且对颈动脉粥样硬化斑块有一定的诊断价值。

曹小虎^[4]（2020）在《中性粒细胞淋巴细胞比值及血清总胆红素与药物洗脱支架内再狭窄的相关性研究》文中研究说明研究背景:近年来,冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CHD）发病率日趋升高,严重危害着人类生命健康。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous Coronary Intervention,PCI）已成为冠心病的主要治疗手段,但术后支架内再狭窄（In-sten Restenosis,ISR）是制约心脏介入治疗技术发展的一大难题,尽管药物洗脱支架（Drug eluting stent,DES）的应用使得ISR的发生率大大下降,但ISR严重影响了手术疗效及病人的生命健康。许多研究表明,炎症和氧化应激与冠心病及支架内再狭窄的发生发展有着密不可分的联系。目的:1、分析中性粒细胞淋巴细胞比值（Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio,NLR）及血清总胆红素水平（Serum Total Bilirubin Level,TBIL）与支架内再狭窄的关系;2、探讨NLR、TBIL及二者联合对支架内再狭窄的预测价值及临床价值。研究对象及方法:采集既往有药物洗脱支架植入史,并于2016年6月至2019年12月在江苏省苏北人民医院心内科复查冠状动脉造影（Coronary angiography,CAG）的患者266例。根据CAG结果将患者分为ISR组126例和非ISR组140例,分别比较两组间的NLR、TBIL差异,并分析患者的一般临床资料信息、首次PCI手术数据（病变血管、植入支架具体冠脉以及植入支架单枚最长长度、直径、串联与否）、复查CAG手术数据（间隔时间、支架内再狭窄与否、发生再狭窄具体冠脉、及再狭窄支架长度、直径、串联与否）及复查CAG术前相关检查指标（包括中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、血红蛋白水平、血小板计数、血清总胆红素水平、空腹血糖、糖化血红蛋白水平、尿酸、血肌酐、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、肌钙蛋白I、BNP、LVEF）的差异,并应用统计学方法,分析各因素与再狭窄的关系,得出相关结论。结果:1、本次研究共筛选纳入病例266例,发生再狭窄的病例126例,未发生再狭窄的病例140例,两组间比较,性别、年龄、高血压、高脂血症、酗酒史、冠心病家族史、服药情况（他汀类、ACEI/ARB、β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂）差异均无统计学意义（P>0.05）。两组间比较,BMI、糖尿病、吸烟史、服用抗血小板药物差异均有统计学意义（P<0.05）。2、两组间比较,病变血管、支架植入靶血管、支架是否串联、单枚支架最长长度、复查间隔时间差异均无统计学意义（P>0.05）。两组间比较,支架最小直径差异具有显着统计学意义（P<0.01）。3、两组间比较,血红蛋白水平、血小板计数、单核细胞计数、TC、TG、HDL-C、LDL-C、血肌酐、肌钙蛋白I、BNP、LVEF差异均无统计学意义（P>0.05）。两组间比较,两组间中性粒细胞计数、淋巴细胞计数差异具有统计学意义（P<0.05）,而NLR、TBIL、HbA1C、FPG差异具有显着统计学意义（P<0.01）。4、选择P<0.1的因素,在筛选完共线性因素后（如糖尿病、FPG、HbA1C,仅保留HbA1C）,将其纳入多因素二元Logistic回归分析,采用前进法将P值无意义（P>0.05）的因素剔除,两组间比较,NLR、HbA1C、吸烟、尿酸、BMI、TBIL、支架最小直径差异具有统计学意义（P<0.05）。NLR、HbA1C、吸烟、尿酸、BMI与ISR呈正相关,均是ISR的危险因素,而血清TBIL、支架直径则与ISR呈负相关。5、通过ROC曲线的绘制,得知NLR和血清TBIL对ISR均有预测价值。当NLR取最佳截断值2.79时,AUC为0.613,灵敏度为67.5%,特异度为50.7%;当TBIL取最佳截断值13.05时,AUC为0.655,灵敏度为75.7%,特异度为53.2%;当联合检测NLR和TBIL对ISR的预测价值时,AUC为0.676,平行试验具有更高的灵敏度,系列实验具有更高的特异性。结论:1、中性粒细胞淋巴细胞比值与冠脉支架内再狭窄呈正相关,是发生支架内再狭窄的危险因素。2、血清总胆红素与支架内再狭窄呈负相关。3、中性粒细胞淋巴细胞比值、血清总胆红素可预测支架内再狭窄,二者联合预测价值更高。4、肥胖、吸烟、植入小直径支架、高尿酸、糖尿病血糖控制欠佳的患者更易发生支架内再狭窄。

阿吉古丽·外斯丁^[5]（2020）在《胆红素对STEMI合并代谢综合征患者临床预后的预测价值》文中指出目的:评估胆红素水平对急性ST段抬高型心肌梗死（ST-Segment Elevation Myocardial Infarction,STEMI）合并代谢综合征（Metabolic Syndrome,MS）患者短期预后的预测价值。方法:本研究纳入了2015年10月至2017年10月在新疆医科大学第一附属医院因胸痛入院并临床诊断为STEMI患者共537例,根据有无合并MS分为合并MS的高危组（n=335）和不合并MS的低危组（n=202）,比较高危和低危组的一般资料及院内死亡情况,对可能影响STEMI预后的指标及胆红素进行多因素Logistic回归分析进一步观察血清总胆红素水平与STEMI合并MS患者院内死亡的相关性。结果:（1）在STEMI合并MS组中血清总胆红素水平较不合并MS组更低（P=0.037）;（2）STEMI合并MS组狭窄血管数量大于不合并MS组;（3）单因素分析中总胆红素水平与STEMI患者院内死亡无明显相关性,但进一步进行多因素logistic回归分析发现合并MS组中年龄、总胆红素、白细胞水平是高危STEMI患者急诊经皮冠状动脉介入（primary percutaneous coronary intervention,PPCI）术后发生全因死亡的危险因素（分别为P<0.001、P=0.048、P<0.001）,血清总胆红素是合并MS的STEMI患者院内死亡的独立预测因素（OR=1.087;95%CI 1.0011.180;P=0.048）,而不合并MS组中总胆红素与全因死亡无明显相关（OR=1.056;95%CI 0.9651.156;P=0.236）。对STEMI合并MS组平随访1065（4181618）天,根据胆红素浓度的中位数分为高胆红素组（n=155）和低胆红素组（n=158）,生存曲线分析显示高胆红素组与低胆红素组院外总MACE发生率无统计学差异（P=0.063）。结论:血清总胆红素水平是合并MS的STEMI患者PPCI术后院内全因死亡的独立危险因素,但与STEMI合并MS患者长期预后无关,胆红素能够预测STEMI合并MS患者PPCI术后短期预后。

潘燕^[6]（2019）在《一氧化碳释放分子-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用及其机制的研究》文中研究表明背景和目的牙周炎是由牙周致病菌引起的牙周组织慢性感染性疾病,是口腔常见病、多发病,发病率高达80%以上。牙周炎会导致牙周组织结构破坏,牙周附着丧失,继而形成牙周袋甚至牙齿松动、脱落,是导致成年人失牙的主要原因[1]。临床上牙周炎的治疗方法包括牙周基础治疗,同时配合全身或局部应用抗生素治疗,以及手术、修复治疗和支持治疗[2]。成骨细胞导致的骨形成和破骨细胞引起的骨吸收之间维持着相互耦联的动态平衡,骨的形态因之能保持稳定。当各种骨吸收刺激因子诱导大量的破骨细胞活化,导致牙槽骨发生显着破坏吸收时,仅仅依靠简单的物理和化学治疗很难逆转牙槽骨出现的破坏趋势。因此,如果能够在牙周炎症的初期抑制破骨细胞分化成熟、减少牙槽骨的吸收,这对治疗牙周炎、维持患牙功能甚至保留患牙尤为重要。本课题以小鼠RAW264.7细胞为体外研究模型,研究CORM-3对RAW264.7这一小鼠源性破骨前体细胞向破骨细胞分化的抑制作用,并探讨其作用机制;并以C57小鼠为体内实验模型,检测CORM-3对实验性牙周炎小鼠牙槽骨吸收的抑制作用,以期为牙周炎的临床治疗提供新的思路。RAW264.7细胞是小鼠源性破骨前体细胞,该细胞株最初来源于Abelson小鼠白血病病毒所致的肿瘤。通过RANKL诱导RAW264.7细胞获得成熟破骨细胞是一种较好的获取破骨细胞的方法。曾有多种破骨前体细胞系（如FDCP、HL-60细胞、C7细胞和FLG29.1等）用于破骨细胞的研究[5],但目前公认的唯一成系的破骨细胞前体细胞是RAW264.7[6],该细胞可表达破骨细胞表型标志基因,与破骨细胞的基因表达谱极其相似,且能形成骨吸收陷窝[7]。RANKL刺激RAW264.7细胞后,与骨吸收有关的基因如ca-thepsin K等表达显着上调,进一步表明RAW264.7细胞是一种较好的破骨前体细胞模型。在破骨细胞前体细胞至成熟破骨细胞的分化过程中有一系列标志性基因产生,可作为破骨细胞及其分化阶段的标识。RANKL/RANK/OPG是调节破骨细胞分化成熟和骨吸收功能的关键系统[8],当多种刺激骨吸收因子作用于成骨/基质细胞后,成骨/基质细胞在其表面表达RANKL特异性的识别破骨细胞前体,并与其膜上的功能性受体RANK结合,刺激破骨细胞前体发育成成熟的破骨细胞。同时RANKL还能通过RANK途径,使成熟的破骨细胞内迅速形成肌动蛋白环,激活成熟的破骨细胞发挥骨吸收功能。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是在破骨细胞中高度表达的关键酶,并参与破骨细胞介导的骨转换过程。组织蛋白酶K（Cathepsin K）是表达于破骨细胞上并以溶胶原形式存在的半胱氨酸蛋白酶。Cts-K与TRAP均为鉴定破骨细胞的重要基因[9]。基质金属蛋白酶（MMP）属于锌结合肽链内切酶家族。为包括骨组织在内的多种组织细胞外基质降解所必须。MMP,尤其是MMP-9在破骨细胞中高表达,是降解细胞外基质、参与骨重建的重要蛋白酶,在破骨细胞活性增强的骨吸收中起重要作用[10]。CORM是近年来新合成的一种CO复合物,经适当溶剂溶解后能够在生理环境下可控制地释放CO,可作为外源性CO供源。已有研究证实,CORM能抑制关节炎小鼠病变区内多种炎症分子的表达,有效改善其临床表征[11]CORM通过其抗氧化、抗炎及抗细胞凋亡作用,可以减轻脂多糖诱导下的大鼠多器官功能损伤[12]。本课题组在前期研究中已发现CORM作为外源性CO供源,能够抑制炎症因子诱导的人牙龈成纤维细胞黏附分子的表达,降低免疫活性细胞的浸润和黏附[13];同时还发现CORM能有效抑制实验性牙周炎大鼠血清中TNF-α和IL-1β的升高,抑制牙槽骨的吸收及病变区域炎症细胞的浸润,证实CORM能有效抑制大鼠实验性牙周炎的病理进程。血红素氧合酶-1（HO-1）是血红素降解的限速酶。HO系统是广泛存在于人和哺乳动物体内的微粒体酶系统。在正常状态下,HO-1呈低水平表达,易受多种因素诱导表达,如血红素、细胞因子、CO[14]等。已有研究表明HO-1在骨改建过程中可起到直接的调节作用[15,16]。本课题通过培养小鼠RAW264.7细胞并对该细胞进行破骨分化诱导,建立体外破骨细胞分化体系,然后在该体系中加入CORM-3,证实CORM-3通过HO-1途径在一定程度上抑制破骨细胞的分化与成熟。同时通过建立实验性牙周炎小鼠模型,经腹腔注射CORM-3,发现CORM-3能够抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞的形成和牙槽骨的吸收。以往对牙周炎治疗的研究多数针对控制牙周炎症方面或聚焦研究成骨方面,本实验以抑制骨吸收为目标,从延缓牙周炎牙槽骨吸收进程入手,为牙周炎的临床治疗提供了新的思路以及实验基础和理论依据。方法1.小鼠RAW264.7细胞破骨分化模型的建立将小鼠RAW264.7细胞以5×104的密度接种于6孔板,细胞分为两组:对照组和破骨诱导组（100μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF）,每组设3个复孔。培养5天后,用TRAP染色法检测不同组细胞破骨分化的情况。2.不同浓度CORM-3对小鼠RAW264.7细胞活性的影响RAW264.7细胞于0、100、200、400及800μM的CORM-3培养液分别培养24h和48h后,以CCK-8法检测不同浓度CORM-3对RAW264.7细胞活性的影响。3.CORM-3抑制RAW264.7细胞破骨分化将小鼠RAW264.7细胞以5×104的密度接种于6孔板,细胞分为三组:对照组、破骨诱导组（100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）和CORM-3组（200 μM CORM-3+100μg/LRANKL+50μg/LM-CSF）,每组设3个复孔。培养5天后,用TRAP染色法检测不同组细胞破骨分化的情况。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子（RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K）mRNA和蛋白表达将小鼠RAW264.7细胞以5×104细胞密度接种于6孔板,细胞分为四组:对照组、破骨诱导组（100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）、失活 CORM-3 组（200μM失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）和 CORM-3 组（200 μM CORM-3+100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF）,每组设 3 个复孔。细胞培养 5、7、9天后,用RT-PCR和Western Blot方法分别检测细胞中RANK,TRAP,MMP-9和Cts-K四种破骨相关因子的mRNA及蛋白表达。上述实验均重复至少三次。5.HO-1基因沉默慢病毒转染实验将小鼠RAW264.7细胞以5×105细胞密度接种于12孔板,细胞分为五组:空白组、NC对照组、SH-1病毒组、SH-2病毒组和SH-3病毒组,每组均分为三个MOI值（MOI=40、50、60）,感染5天后在荧光显微镜下观察选出最佳感染MOI值;用最佳MOI值组别的细胞进行PT-PCR和Westen Blot方法检测,筛选出感染效率最高的慢病毒进行后续正式感染实验。6.HO-1基因沉默后CORM-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子（RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K）mRNA和蛋白表达的影响HO-1基因沉默后的小鼠RAW264.7细胞以5×104细胞密度接种于6孔板。细胞分为4组:对照组、破骨诱导组（100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF）、失活 CORM-3 组（200 μM 失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）和CORM-3 组（200 μM CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）,每组设三个复孔。细胞培养5、7、9天后,分别用实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测细胞中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达。上述实验均重复至少三次。7.CORM-3抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞分化成熟及牙槽骨吸收选择雄性8周龄C57小鼠36只（23g-25g）。将C57小鼠随机分为三组（每组12只）,即正常组、慢性牙周炎组（CP组）及CORM-3干预牙周炎组（CORM-3组）。其中,CP组和CORM-3组采用丝线结扎上颌第二磨牙同时局部注射内毒素法建立牙周炎模型。CORM-3组和CP组自结扎当天起分别腹腔注射一氧化碳释放分子-3溶液（CORM-3,10 mg/kg/d）和等体积无菌生理盐水。分别于牙周结扎的第7天和第14天,各组分别处死6只小鼠,并制作双侧上颂骨标本。一侧上颌骨标本去除附着的牙周软组织用甲苯胺蓝染色后,在体视显微镜下观察每组牙槽骨吸收情况;另一侧上颌骨标本经固定、脱钙、透明、包埋后制作常规石蜡切片,TRAP染色后显微镜下观察每组牙槽骨内破骨细胞分化成熟的情况。结果1.小鼠RAW264.7细胞破骨分化模型的建立RAW264.7细胞加入破骨诱导液诱导5天后,TRAP染色显示有明显破骨细胞形成,且破骨细胞数量显着高于对照组（P<0.05）。2.不同浓度CORM-3对小鼠RAW264.7细胞活性的影响24h和48hCCK-8检测结果均显示:1 00μM和200μM的CORM-3均不影响RAW264.7细胞的活性,且200μM的CORM-3对RAW264.7细胞增殖有显着的促进作用,而800μM的CORM-3显着抑制了RAW264.7细胞的增殖,（P<0.05）。因此选择浓度为200μM的CORM-3作为后续实验操作浓度。3.CORM-3抑制RAW264.7细胞破骨分化RAW264.7细胞破骨诱导的同时加入CORM-3,5天后TRAP染色显示CORM-3干预组仅有少量破骨细胞形成,且破骨细胞数量显着低于破骨诱导组（P<0.05）。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子（RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K）mRNA和蛋白表达RAW264.7细胞进行破骨诱导后,用实时荧光定量PCR技术检测第5、7、9天4种破骨相关基因RANK,TRAP,MMP-9,Cathepsin K的mRNA表达,结果显示,第5、7、9天破骨诱导组中细胞四种因子mRNA的表达均显着高于对照组（P<0.05）。CORM-3组中四种因子mRNA的表达较之破骨诱导组有显着降低（P<0.05）。失活 CORM-3 组中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA表达比CORM-3组有显着增强（P<0.05）,但与破骨诱导组相比无显着差异（P＞0.05）。Western Blot检测结果显示第5、7、9天破骨诱导组中细胞RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表达均显着高于对照组（P<0.05）。而CORM-3组中四种因子的蛋白表达较之破骨诱导组有显着降低（P<0.05）。失活CORM-3组中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的蛋白表达显着高于 CORM-3 组（P<0.05）,但与破骨诱导组相比无显着差异（P>0.05）。5.HO-1基因沉默慢病毒转染实验实验结果显示:SH-3病毒在MOI值为60时对小鼠RAW264.7细胞HO-1基因的沉默效率最高。6.HO-1基因沉默后CORM-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子（RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K）mRNA和蛋白表达的影响小鼠RAW264.7细胞中的HO-1基因沉默后,再进行破骨诱导,用荧光实时定量 PCR 技术检测第 5、7、9 天 RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA 表达。结果显示,破骨诱导组、失活CORM-3组及CORM-3组四种因子的mRNA表达均比对照组有显着增强（P<0.05）。三组间比较,四种因子的mRNA表达无显着性差别（P＞0.05）。Western Blot检测结果显示第5、7、9天破骨诱导组、失活CORM-3组及CORM-3组中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表达较对照组显着增加（P<0.05）,而CORM-3组与破骨诱导组相比,四种因子的表达无显着性差异（P<0.05）。7.CORM-3抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞分化成熟及牙槽骨吸收实验性牙周炎小鼠经腹腔注射CORM-3 7天、14天后,小鼠上颌骨甲苯胺蓝染色结果显示,CP组牙槽骨高度显着低于CORM-3组（P<0.05）。上颌骨TRAP染色结果显示,CORM-3组牙槽骨内成熟破骨细胞数量较CP组显着减少（P<0.05）。结论1.CORM-3能够抑制RANKL+M-CSF诱导的小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化。2.CORM-3能够显着降低破骨相关因子RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达。这一抑制作用是通过CORM-3释放的CO实现的。3.将RAW264.7细胞中HO-1基因沉默后,CORM-3对破骨诱导过程中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达的调控作用丧失,表明CORM-3对RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用是通过HO-1通路进行的。4.CORM-3能够抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞的分化成熟,抑制牙周炎小鼠牙槽骨的吸收。

安伟帅^[7]（2019）在《IL-19在小鼠心梗发生过程中的作用和机制研究》文中研究表明一、背景和目的心肌梗死是导致死亡和失去健康生命调整年的主要原因之一。当前心肌梗死治疗的主要方式是通过溶栓和血管成形术迅速恢复梗死心脏的血液供应,这些均显着减少了心肌损伤及后续病人的死亡率。心肌梗死是由于冠状动脉血流中断引起的心肌细胞损伤和坏死的缺血性心脏疾病。在心梗发生后数小时内,细胞凋亡作为早期细胞死亡的主要方式开始启动,并向心室重构进展。同时,由于细胞坏死引起局部炎症反应,加剧了心脏功能恶化。如果不能及时进行血运重建,缺血区的心肌细胞就会被纤维组织替代,引起心室重构,并最终发展为心力衰竭。尽管急诊PCI技术再血管化及时挽救了部分心肌细胞,但是依然造成不同程度的心肌细胞坏死。目前每年仍然分别有10%和20%的死亡率和心梗后心力衰竭发生率。因此,寻找创新性的治疗方法来挽救更多的心肌细胞,抑制缺血区的炎症,促进缺血区的血管新生,阻止心室重构,改善心梗后病人的生存率是心肌梗死治疗的重要研究方向。细胞因子IL-19于2000年通过克隆测序被发现,证实其为IL-10同源物。IL-19与IL-10具有20%的氨基酸相似性,但在功能上与这些亚家族成员不同。IL-19通过IL-20Rα和IL-20Rβ组成的异二聚体受体发出信号,同时其受体也被IL-20和IL-24使用。与IL-10作用一样,IL-19作为抗炎细胞因子时通过Th2实现其效应而不是Th1。多项研究表明,在局部炎症或缺血的刺激作用下,多种细胞可表达IL-19并发挥其多种生物学效应。在外周血管,IL-19治疗可以增加结扎小鼠后肢的血流灌注。在脑血管,IL-19明显减轻瞬时大脑中动脉闭塞诱导的局灶性脑缺血的损伤。在心血管系统,IL-19可以通过调节巨噬细胞炎症和胆固醇稳态来阻止已形成的动脉粥样硬化斑块的进展。但IL-19对于急性心肌梗死的作用尚未有报道。本实验创新性建立无呼吸机辅助小鼠心梗模型,观察经腹腔注射IL-19对急性期缺血性损伤和心肌细胞凋亡的影响。观察连续腹腔注射IL-19对早期心脏功能、心肌炎症和血管新生的影响,探讨IL-19的治疗作用,并探索其潜在机制。二、实验方法1.小鼠心梗模型的制备采取无辅助呼吸的方法建立小鼠急性心肌梗死模型。过程如下:小鼠吸入异氟烷麻醉后,分离胸壁肌肉挤出心脏,结扎冠状动脉左前降支,建立心梗模型。心电图ST段抬高及心脏颜色变苍白,证实造模成功。假手术小鼠只开胸挤出心脏,不结扎冠状动脉。2.小鼠实验分组我们共进行过3批小鼠实验。具体如下:第一批小鼠用于检测IL-19在小鼠急性心梗后的表达研究,其中假手术组和冠状动脉左前降支结扎组各8只,于术后24小时,异氟烷麻醉后,眼眶取血,用于血液中IL-19的测定。开胸后剪取小鼠心脏左前壁梗死区,并分为两份,其中一部分进行蛋白免疫印迹检测,另一部分多聚甲醛固定行免疫组化分析。第二批小鼠用于IL-19在急性心梗的保护功能研究,于结扎即刻,腹腔注射PBS和IL-19（10 ng/g）,每组小鼠各15只,于术后24小时处死小鼠,用于后续功能分析。第三批小鼠用于IL-19在早期的心梗保护的功能研究,MI模型制作成功后,进行实验分组,其中假手术组、心梗+PBS注射组和心梗+IL-19注射组各20只。注射组小鼠在靶血管结扎即刻,经腹腔注射PBS或IL-19,并连续注射3天或7天后,处死小鼠,进行后续功能分析。3.Western Blot测心肌中的IL-19及其受体IL-20Rα与IL-20Rβ的表达第一批假手术小鼠和心梗小鼠各8只,在术后24小时,异氟烷麻醉,开胸剪取左心室前壁梗死心肌约0.2 g,液氮研磨,裂解于RIPA裂解液,4°C,15000g,离心3 min去除沉淀。蛋白上清经BCA法定量后,加入适量SDS蛋白上样缓冲液,混匀并置于沸水浴中变性10 min。变性蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后,电转到PVDF膜,TBST漂洗后,用5%脱脂奶粉中封闭1小时,适当稀释过的一抗,置于4℃孵育过夜,次日用TBST洗膜3次,每次10 min,随后加入稀释后的辣根过氧化物标记的二抗,室温孵育1小时,孵育结束后用TBST洗膜3次,每次10 min。洗膜结束后,将膜平放在水平塑料板上,将已配好的ECL化学发光液均匀的滴加在膜上,放入成像仪中,扫描成像。Western Blot图像通过Image J软件测量各条带的灰度值,获得计量资料结果,并进行统计分析。4.ELISA测定IL-19等的表达将抗体稀释至为1-10μg/ml,取0.1 ml加入聚苯乙烯板的反应孔中,4℃过夜。次日,弃溶液,用缓冲液洗涤3次,每次3 min。加稀释的待检样品0.1 ml于包被孔中,置37℃孵育60 min,洗涤,在各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体0.1 ml,37℃孵育40 min,洗涤后,于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1 ml,37℃20 min,反应孔中加入2 M 0.05ml H2SO4终止反应。在ELISA检测仪上,以ABTS于410 nm处显色,以空白对照孔调零后测各孔OD值,依据倍数大小判定结果。5.免疫组化和TUNEL染色小鼠按时间点,用麻醉加KCl注射法处死后,剪下心脏,于PBS缓冲液中反复冲洗后,固定于4%多聚甲醛,并进行石蜡包埋和切片,切片厚度为5μm。石蜡切片用二甲苯脱蜡后,梯度乙醇入处理,并用蛋白酶K消化修复抗原,0.01 M PBS缓冲液冲洗后,4℃下0.1%枸橼酸钠溶,进行微波修复,持续时间4 min。3%H2O2处理5 min,0.01 M PBS冲洗3次,每次5 min,室温下滴加50μl一抗或TUNEL反应液,孵育30 min;0.01 M PBS冲洗3次,每次5 min。50μl Converter POD,7度孵育30 min,0.01 M PBS清洗3次,每次3 min。DAB显色,室温孵育15 min,冲洗后,苏木精复染,烤干,封片,摄像。6.EVANS Blue/TTC双染测定心肌梗死面积小鼠气管插管后,连接呼吸机,诱导麻醉。沿心梗模型制备时的位置剪开胸腔,暴露心脏。通过1 ml注射器,经右心房-右心室途径穿刺缓慢注入2%伊文思蓝（Evans Blue）0.8 ml左右,观察2 min,待小鼠四肢及巩膜蓝染后迅速取下心脏,以预冷的PBS缓冲液反复冲洗残留血液至清洗溶液不再染色。置于-20°冰箱中冷冻30 min。取出后沿左心室长轴方向横切5片,单片厚约1 mm。按先后顺序将切片置于2%TTC溶液中,浸泡于避光的37℃恒温箱中,轻摇动使溶液与切片充分接触20 min后,立即冲洗掉多余的染料。使用扫描仪行正反两面扫描,并通过Image J软件测量各部分的面积,进行统计分析。7.原代心肌细胞分离培养及缺氧模型构建新生1天C57BL/6J乳鼠经75%酒精消毒后,剪开胸腔,暴露并剪取心脏,置于Hank’s溶液中,弃去心房、主动脉、肺动脉以及下腔静脉脂肪等多余组织,将心室组织剪成大小1立方毫米左右的组织块,并经多次漂洗。加入已配置好的胶原酶消化液（终浓度为1 mg/ml）,置于37°C恒温水浴中振荡消化1小时。加入等量的含10%胎牛血清的M-199培养基,中和消化液,用100目滤网过滤消化液,1000g离心10 min,弃去上清液,细胞沉淀用含5%胎牛血清的M-199培养基重悬。重悬后的细胞种植于培养瓶中,进行40 min非心肌细胞贴壁,收集未贴壁的心肌细胞,按1×106个/ml,铺于培养板中,培养2天,可观察到心肌细胞的自发搏动。待心肌细胞状态稳定后,换不含血清的DMEM培养基,再加入外源性药物处理;处理完后将乳鼠心肌细胞培养基,换成不含葡萄糖以及血清的DMEM培养基,并转移到含有95%氮气以及5%二氧化碳的无氧培养箱中培养8小时,随后检测细胞相关生物学指标的改变。8.MTT法检测心肌细胞的活性使用碧云天MTT试剂盒检测心肌细胞及IL-19处理后心肌细胞的活性。将25毫克3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）粉末配成浓度为5 mg/ml的MTT工作液。将心肌细胞按2×103-5×103的密度铺于96孔细胞培养板中,置于培养箱中培养。待细胞贴壁后,换100μl培养基,再进行低氧培养及IL-19处理前,加入10μl MTT溶液,在570 nm波长下测定吸光度,读取处理0小时吸光度,随后在培养箱中继续培养4小时,再每孔加入100μl甲瓒溶解液,待4小时甲瓒完全溶解后在570 nm波长下测定吸光度,收集读取吸光度,并作统计分析。9.流式细胞术检测心肌细胞凋亡心肌细胞经低氧及IL-19处理8小时后,收集培养上清至15 ml离心管中,备用;用PBS洗涤已吸净培养基的心肌细胞,加入胰酶消化液消化贴壁的心肌细胞,待细胞变圆透亮时,弃去胰酶,加入适量的完全培养基,并用吸管缓慢轻柔的吹打细胞,将吹打下来的细胞转移至上述收集上清的15 ml离心管中,1000g离心5 min,弃去上清液,再加入适量PBS重悬离心沉淀的细胞,并计数。将约5-10×104个细胞转移至细胞流式细胞管中,1000 g离心5 min,弃去上清液,再加入195μl的Annexin V-FITC的结合液,并用移液枪吹打混匀细胞;细胞混匀后按以下方法加入5μl Annexin V-FITC及10μl碘化丙啶染色液（PI）,轻轻吹打混匀细胞,在室温下避光孵育10-20 min,孵育结束后使用流式细胞仪检测。10.RNA抽提及实时荧光定量PCR左心室梗死区组织放入1.5 ml无RNA酶离心管中,并加入1 ml Trizol,用匀浆器匀浆组织,离心取上清,加入200μl氯仿,上下颠倒混匀30 s,室温放置10 min。将混合液体4℃、12000g离心20 min,小心的将上层液体转移到新的离心管中,并加入等体积的异丙醇,颠倒混匀并静置10 min。将液体4℃、12000 g离心20 min,弃去上清,加入800μl 75%乙醇,轻轻的振荡洗涤沉淀,4℃、10000 g离心5 min。弃去上清,晾干残余水分,加入20μl DEPC水溶解RNA,测量RNA浓度。使用TAKARA的PrimeScript?RT Master Mix的试剂盒将RNA合成cDNA。将已反转录得到的cDNA稀释10倍后,用做荧光定量PCR反应的模版,采用SYBR法进行PCR荧光定量,反应结束后,收集数据,根据Ct值,以GAPDH为内参,用2-ΔΔCt计算各个基因的相对表达。11.超声心动图测定小鼠心功能小鼠连接异氟烷麻醉系统,以2%异氟烷诱导麻醉。脱毛膏脱去前胸左侧毛发。以口鼻接入麻醉面罩,以VISUAL SONICS 2000小动物超声系统于胸骨左旁检查左室射血分数（LVEF）及左室短轴缩短率（FS）,单只小鼠同一体位检测3次,取平均值。12.统计学分析实验中的计量资料以平均值±标准差计算。实验中两组独立样本,进行t检验;多组样本间,先行单因素方差分析（one-way ANOVA）,再行两两比较。以P<0.05作为显着性差异标准。使用Kaplan-Meier生存曲线计算存活率,各组之间的差异采用log-rank（Mantel-Cox）评估。统计学分析使用GraphPad Prism 5.0版本进行。三、实验结果1.IL-19及其受体IL-20Rα与IL-20Rβ在急性梗死心肌中的表达通过冠状动脉左前降支结扎构建小鼠心梗模型。心电图显示ST段抬高,左心室前壁及心尖部变白,表明小鼠急性心梗模型建立成功。术后24小时,心梗组及假手术组各有8只小鼠存活。眼眶取血后,ELISA测定小鼠血清中IL-19的水平,结果显示心梗小鼠血清中IL-19显着降低约50%（P<0.05,n=8）。小鼠开胸后,剪取心肌梗死区,一部分用于免疫组化,另一部分用于蛋白提取。Western Blot结果显示,假手术组小鼠的心肌中仅见少量IL-19表达,但在心梗组,IL-19在梗死心肌的表达水平显着增加,同样IL-19的受体IL-20Rα和IL-20Rβ蛋白在梗死心肌中的表达水平,也明显高于假手术小鼠（P<0.05,n=3）。心脏切片行免疫组织化学分析,显示IL-19在心梗组明显高于假手术组,且IL-19表达主要集中在血管周围和炎症细胞浸润部位（P<0.05,n=3）。2.IL-19在急性心肌梗死中对心肌细胞的保护作用（1）IL-19治疗明显降低缺氧诱发心肌梗死面积,减轻心肌缺氧诱发的心肌细胞凋亡,减轻梗死区心肌细胞的氧化损伤。在心梗模型制作成功后,30只随机分为PBS注射组和IL-19注射组,每组各15只。其中7只小鼠,于PBS或IL-19注射24小时后,进行处死,并行Evans Blue/TTC双染,评价心肌梗死面积。Evans Blue着色蓝色区域为正常区,TTC染色为红色的部分是缺血心肌组织,苍白色部位为梗死区。通过EPSON1610扫描仪正反两面拍照后,用Image J软件测量各区域面积,并计算梗死区/缺血区的比率。结果显示,与PBS对照相比,IL-19治疗组明显减轻了梗死面积（P<0.05,n=7）。每组小鼠各7只取梗死区心肌,固定在多聚甲醛,通过TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡情况。每只小鼠随机观察5个视野,计算凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比,取平均值作为该小鼠的凋亡指标。结果显示IL-19治疗减少了小鼠心肌细胞的凋亡（P<0.05,n=7）。取小鼠心梗区,抽提蛋白,定量后,检测小鼠心肌中血红素加氧酶-1（HO-1）和丙二醛（MDA）水平,结果显示IL-19治疗进一步增强了HO-1活性,并降低了小鼠梗死心肌中的MDA水平（P<0.05,n=7）。（2）IL-19预处理剂量依赖性增加原代乳鼠心肌细胞的活力,减轻缺氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡培养新生小鼠心肌细胞,用IL-19（0,1,10,100ng/ml）预处理2小时,然后将其中一部分细胞暴露于缺氧环境中刺激8小时后。通过MTT检测各组心肌细胞的活力,结果显示在正常培养的心肌细胞中IL-19没有提高心肌细胞的活力,但在缺氧刺激的心肌细胞中,IL-19预处理能够抑制缺氧损伤导致的心肌细胞活力下降,并且具有剂量依赖效应。通过Anexin V/PI染色,并通过流式细胞术检测心肌细胞的凋亡,结果显示IL-19预处理呈剂量依赖性抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡（P<0.05,n=5）。检测乳酸脱氢酶（LDH）和丙二醛（MDA）释放,检测HO-1的表达和活性。结果显示IL-19呈剂量依赖性减少乳酸脱氢酶和丙二醛在缺氧条件下的释放（P<0.05,n=5）。定量PCR显示,IL-19呈剂量依赖性增加HO-1的表达和活性（P<0.05,n=5）。3.长时程IL-19干预在心肌梗死早期中的功能研究（1）长时程IL-19干预改善心梗小鼠的心脏功能在心梗模型制作成功后,我们将心梗小鼠随机分为PBS注射组和IL-19注射组,每组小鼠各7只,并进行相应试剂腹腔注射。7天后,我们通过超声心动图,评估小鼠的心脏功能,结果显示:LAD结扎7天后,IL-19治疗组心梗小鼠的左室射血分数和短轴缩短率明显高于PBS注射组（P<0.05,n=7）。（2）长时程IL-19干预减轻心肌梗死区域的炎症反应在心梗模型制作成功后,我们将心梗小鼠随机分为PBS注射组和IL-19注射组,每组小鼠各7只,相应试剂连续注射3天后,处死小鼠,免疫荧光测定心肌中CD68阳性细胞数。结果显示,与假手术组相比,梗死心肌中CD68阳性细胞数目明显增加,而IL-19腹腔注射能够明显减少心肌梗死区域CD68阳性细胞数目（P<0.05,n=3）。通过检测中性粒细胞的功能标志和激活标志（髓过氧化物酶）,表明IL-19处理能够明显降低髓过氧化物酶的活性（P<0.05,n=7）。通过ELISA检测外周血中炎症因子的水平,结果显示TNF-α水平,IL-1β和IL-6水平在心梗组明显高于对照组,而IL-19处理能明显抑制TNF-α水平,IL-1β和IL-6在心梗鼠的升高（P<0.05,n=7）。（3）IL-19促进巨噬细胞由M1向M2转化为测试心肌梗死心脏中的巨噬细胞亚群分布特点,我们在心梗后3天,通过酶消化法将心肌组织制成单细胞悬液,并通过流式细胞术分析心脏细胞成分,结果显示心梗后心脏中鉴定出两个巨噬细胞亚群:通过F4/80和CD86的双重染色标志M1巨噬细胞,以F4/80和CD206的双重染色标志M2巨噬细胞。IL-19处理使M1巨噬细胞的百分比降低了约9.1%（P<0.05,n=7）,并使M2巨噬细胞的百分比增加了约9.5%（P<0.05,n=7）。通过定量PCR检测显示,心肌梗死能够明显增加CD68、TNF-α、IL-1β和IL-6在心肌中的表达水平,而IL-19处理能够明显抑制梗死诱发的CD68、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达增加（P<0.05,n=7）。相反,通过定量PCR检测,显示IL-19处理能够明显增强了CD206,Arg1和Ym1的mRNA表达,并下调了IFN-γ的mRNA表达（P<0.05,n=7）。（4）IL-19促进梗死区域VEGF的表达和血管新生连续腹腔注射7天后,取梗死心肌,通过CD31免疫组化染色观察心肌血管生成。结果显示,在所检测的7只小鼠的切片中,用IL-19干预能够明显心肌梗死区域微血管密度（P<0.05,n=7）。通过ELISA检测心肌的血管内皮生长因子（VEGF）蛋白水平,显示心梗后7天心肌中IL-19处理的心梗小鼠心脏中的VEGF的蛋白水平明显高于MI组（P<0.05,n=7）。（5）IL-19提高心梗小鼠的存活率我们进一步评估了IL-19连续腹腔注射7天对心梗后小鼠存活的影响。结果显示,与心梗小鼠相比,IL-19干预组的心梗小鼠的存活率明显提高（P<0.05,n=9）。四、结论1.IL-19在急性心梗组织中的表达明显升高,主要富集在血管周围和炎症区域。2.IL-19腹腔注射能够减轻了心梗诱发的急性心肌损伤,能够明显抑制缺血诱发的心肌细胞凋亡。3.IL-19持续注射能够改善心梗早期的心功能,能够减轻心肌的炎症反应,能够促进巨噬细胞的由M1向M2转化,能够促进VEGF在心肌中的表达及其介导的血管新生;能够提高小鼠的存活率。4.我们的结果提出IL-19可能是一种有潜力的抗缺血性心脏病的治疗选择。

刘海潮,刘少朋,白明辉,苏宝威^[8]（2019）在《血红素氧合酶1在胰腺癌组织中的表达及临床意义》文中研究表明目的:探讨血红素氧合酶1（HO-1）在胰腺癌组织中的表达及临床意义。方法:分别用免疫组化法与Western blot法检测80例胰腺癌患者癌组织及癌旁组中HO-1的表达,通过统计学方法分析HO-1表达与胰腺癌患者临床病理特征及预后间的关系。结果:免疫组化与Western blot结果显示,胰腺癌组织HO-1蛋白的阳性表达率与相对表达量均明显高于癌旁胰腺组织（P<0.05）;HO-1在胰腺癌组织的表达与TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移明显有关（均P<0.05）,而与性别、年龄无明显关系（均P>0.05）;Log-rank检验显示,胰腺癌组织中HO-1阳性表达患者中位生存期明显低于其阴性表达患者（25.1个月vs. 36.7个月,P<0.05）。结论:HO-1在胰腺癌组织呈高表达,且与胰腺癌的恶性临床特征及不良预后密切相关,可能成为胰腺癌治疗与研究的新靶点。

张菊红,陈伟,蔡镇西,林娜娜,王佳龙,何明^[9]（2019）在《血红素氧合酶1在慢性鼻炎-鼻窦炎伴鼻息肉患者中的表达与作用机制研究》文中研究说明目的探讨血红素氧合酶1在慢性鼻炎-鼻窦炎伴鼻息肉患者中的表达与作用机制。方法 100例慢性鼻炎-鼻窦炎伴鼻息肉患者作为观察组,另选取同期于医院治疗的60例单纯鼻中隔偏曲患钩突黏膜组织作为研究对照组。分别检测两组受检对象血红素氧合酶1表达情况。另选取受检者钩突黏膜组织进行体外培养,并检测IL-17A、TGF-β1、地塞米松刺激受检对象鼻黏膜组织中血红素氧合酶1mRNA的调节。结果观察组患者血红素氧合酶1mRNA表达水平、血红素氧合酶1阳性细胞数,明显高于对照组,P<0.05;观察组患者血红素氧合酶1蛋白表达水平,明显高于对照组,P<0.05。经体外培养发现,IL-17A可提高血红素氧合酶1mRNA的表达,TGF-β1、地塞米松则降低血红素氧合酶1mRNA的表达。IL-17A刺激血红素氧合酶1mRNA表达量明显高于地塞米松联合IL-17A、地塞米松联合IL-17A,P<0.05。结论慢性鼻炎-鼻窦炎伴息肉患者鼻息肉组织中血红素氧合酶1氧化应激过程可被反馈性诱导上调,然地塞米松可抑制其表达。

刘璐^[10]（2019）在《上调环氧二十碳三烯酸拮抗肥胖及其对心脏损伤的新机制》文中指出目的:环氧二十碳三烯酸（Epoxyeicosatrienoic acids,EETs）可减少人类间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）和小鼠前脂肪细胞（3T-3L1）的脂肪形成。我们旨在探讨通过抑制环氧化物水解酶（Soluble epoxide hydrolase,sEH）上调EET水平,能否影响白色和褐色脂肪的形成及上调线粒体和产热基因的表达,从而达到改善脂肪细胞功能的目的。同时,因血红素氧合酶1（Heme-oxygenase,HO-1）可抑制氧化应激对EET的降解,从而进一步加强EET的作用,故而我们旨在通过本研究验证EETs和HO-1是否可以协同作用,进一步促进白色脂肪的褐变过程,最终达到拮抗肥胖的效果。方法:细胞实验中,我们取人类骨髓间充质干细胞（Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell,hMSC）分化成熟的脂肪细胞,分别给予细胞11,12-EET和14,15-EET（1μM）以及sEH抑制剂（AUDA）（1μM）处理以上调细胞内EET水平,观察其脂肪细胞大小和脂滴面积;另外,我们给予脂肪细胞携带sEH的siRNA基因的左旋病毒转染细胞以敲除（knock out,KO）sEH基因,上调细胞内EET水平,观察其脂肪细胞大小和脂滴面积。动物实验中,选取12周龄雄性sEH基因敲除小鼠16只,小鼠均正常饮食自由饮水,饲以高脂饮食。将所有小鼠分成3组（n=8）:1)对照组;2)sEH-KO雄性小鼠;3)sEH-KO+CoPP雄性小鼠。给予小鼠钴原卟啉IX（CoPP）腹腔注射（3mg/kg,每周一次）,共计8周,收集脂肪组织行检测。使用RT-PCR测量细胞和组织中的HO-1、NOV、TNF-α、Mfn1、Mfn2、COX-1、Fis1 和 UCP1 基因表达,应用蛋白免疫法测定HO-1水平,使用液相色谱串联质谱法测量EET和DHET水平,液体闪烁计数器以测定脂肪组织O2-含量。结果:体外研究中,抑制hMSC衍生的脂肪细胞内sEH以提高EET的水平,无论是外源性抑制sEH水平还是内源性敲除sEH基因的脂肪细胞,其小而健康的褐色脂肪细胞数量均明显增加,细胞体积明显缩小,细胞内脂滴含量显着降低（p<0.05）。在体研究显示,与对照组相比,敲除sEH上调EET的水平可减轻肥胖小鼠体重（29.37±2.46 vs.35.73±3.17,p<0.05）,其脂肪细胞体积减小,炎性脂肪因子NOV（1.51±0.22vs.1.14±0.21,p<0.05）、TNFα（1.53±0.21 vs.1.12±0.19,p<0.05）降低。敲除sEH基因后小鼠体内的线粒体因子Mfn1（1.54±0.23 vs.0.79±0.17,p<0.05）、COX1（20.07±7.31 vs.3.82±0.79,p<0.05）上调,且产热基因 UCP1（1.63±0.12 vs.0,81±0.13,p<0.05）和脂联素（2.48±0.37vs.1.42±0.21,p<0.05）水平均明显增高（p<0.05）,显示其线粒体功能的改善效果。敲除sEH的小鼠体内EETs异构体5,6,7,9,11,12和14,15-EET以及EET/DHETES比率明显增加（p<0.05）。进一步给予CoPP上调HO的基因表达后,小鼠体内超氧化物的含量成倍降低（86.42±13.38 vs.174.43±54.71,p<0.05）,而其小鼠体内EETs水平成倍增加（p<0.05）,表明抗氧化剂HO-1可保护EETs免受氧化应激因子（Ractive Oxygen species,ROS）的降解,与EET协同作用以拮抗肥胖的发生和发展。结论:敲除sEH可增加EET水平,并提高线粒体和产热基因表达,从而促进白色脂肪的褐变。HO-1的上调可抑制氧化应激反应对EET的降解,进一步提高EET的水平。因此,上调EET和HO-1可以有效拮抗肥胖。

二、血红素氧合酶-1在冠心病患者中的表达（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、血红素氧合酶-1在冠心病患者中的表达（论文提纲范文）

（1）血红素氧合酶-1促AMPK/mTORC1的磷酸化上调自噬是铅暴露肾损伤减轻的重要机制（论文提纲范文）

（2）糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究（论文提纲范文）

（3）急性脑梗死患者血清血红素氧合酶1水平及其与颈动脉粥样硬化斑块的关系（论文提纲范文）

（4）中性粒细胞淋巴细胞比值及血清总胆红素与药物洗脱支架内再狭窄的相关性研究（论文提纲范文）

（5）胆红素对STEMI合并代谢综合征患者临床预后的预测价值（论文提纲范文）

（6）一氧化碳释放分子-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用及其机制的研究（论文提纲范文）

（7）IL-19在小鼠心梗发生过程中的作用和机制研究（论文提纲范文）

（8）血红素氧合酶1在胰腺癌组织中的表达及临床意义（论文提纲范文）

（10）上调环氧二十碳三烯酸拮抗肥胖及其对心脏损伤的新机制（论文提纲范文）

四、血红素氧合酶-1在冠心病患者中的表达（论文参考文献）

• [1]血红素氧合酶-1促AMPK/mTORC1的磷酸化上调自噬是铅暴露肾损伤减轻的重要机制[D]. 沈杰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
• [2]糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究[D]. 周学锋. 北京中医药大学, 2021(01)
• [3]急性脑梗死患者血清血红素氧合酶1水平及其与颈动脉粥样硬化斑块的关系[J]. 彭定天,崔伟,韦艳花,曾莉梅,廖韦静,潘雪英,班毓徽,蒙喜斯. 广西医学, 2021(05)
• [4]中性粒细胞淋巴细胞比值及血清总胆红素与药物洗脱支架内再狭窄的相关性研究[D]. 曹小虎. 扬州大学, 2020(04)
• [5]胆红素对STEMI合并代谢综合征患者临床预后的预测价值[D]. 阿吉古丽·外斯丁. 新疆医科大学, 2020(07)
• [6]一氧化碳释放分子-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用及其机制的研究[D]. 潘燕. 山东大学, 2019(02)
• [7]IL-19在小鼠心梗发生过程中的作用和机制研究[D]. 安伟帅. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(03)
• [8]血红素氧合酶1在胰腺癌组织中的表达及临床意义[J]. 刘海潮,刘少朋,白明辉,苏宝威. 中国普通外科杂志, 2019(09)
• [9]血红素氧合酶1在慢性鼻炎-鼻窦炎伴鼻息肉患者中的表达与作用机制研究[J]. 张菊红,陈伟,蔡镇西,林娜娜,王佳龙,何明. 中国实验诊断学, 2019(07)
• [10]上调环氧二十碳三烯酸拮抗肥胖及其对心脏损伤的新机制[D]. 刘璐. 中国人民解放军医学院, 2019(02)

标签：心肌细胞论文;  细胞分化论文;  血清蛋白论文;  健康论文;  养生论文;