一、HIGN LEVEL EXPRESSION OF HEPATITIS C VIRUS CORE GENE IN E.COLI（论文文献综述）
刘艳秀[1]（2019）在《双靶向病毒样颗粒递送系统的构建及其抗脑胶质瘤的研究》文中指出血-脑屏障（BBB）与血-脑肿瘤屏障（BBTB）的存在以及许多药物穿透屏障的能力差,限制了化疗对多形性胶质母细胞瘤（GBM）的治疗。在这里,我们设计了一种基于乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒（HBc VLPs）的双靶向递送系统,使该系统具有靶向脑部以及脑胶质瘤的功能。在这个靶向载体中,我们在VLP的表面插入了一段12个氨基酸的肽（简称TGN）作为一级靶向配体,以将药物靶向递送至脑部并穿过BBB。在另一个VLP表面我们同样以基因工程修饰的方式插入RGD肽,将其作为二级靶向配体,以靶向脑部肿瘤。两种靶向VLPs在解聚与重组的过程中进行杂聚,从而实现在同一个VLP上同时具有TGN靶向和RGD靶向（TGN/RGD-VLP）。此外,VLPs能通过疏水作用力及静电吸附作用将紫杉醇（PTX）和基因药物（YAP-siRNA）封装在颗粒内。在电镜下,可观察到VLPs形貌完整,大小均一,分散性好。在体外细胞摄取和MTT实验中,证明了该靶向递送系统能促进细胞对药物的摄取并杀死肿瘤细胞。通过Western blot验证发现VLPs具有较高的转染效率,能有效降低YAP蛋白的表达。最后,对裸鼠原位脑胶质瘤模型进行药物治疗,结果显示该递送系统可以显着抑制肿瘤的增殖并具有良好的生物相容性。以上结果表明双靶向VLPs具有作为靶向肿瘤治疗递送平台的潜力。
霍春玲[2]（2017）在《肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究》文中提出手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）是一种严重危害婴幼儿健康的重要传染病,主要由肠道病毒感染引起。流行病学研究证实,引起婴幼儿手足口的肠道病毒主要包括肠道病毒71（enterovirus 71,EV71）和柯萨奇病毒A16（coxsackievirus A16,CA16）两种亚型。两种亚型毒株同时感染可能诱发严重的并发症甚至死亡。EV71和CA16共存在或共感染时可导致重组毒株出现,引起爆发流行,是严重的公共卫生问题之一。因此,研制抗EV71和CA16疫苗对于有效防控HFMD疫情的暴发流行至关重要。近年来,病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）疫苗因其展示抗原和安全性高等优点成为新型疫苗的发展方向之一,人乳头瘤病毒和乙肝病毒等的病毒样颗粒疫苗已成功上市。嵌合多抗原表位的VLPs疫苗研发正在取得积极进展。本论文基于乙型肝炎病毒核心（HBc）的自组装能力,制备了以HBc为载体蛋白展示了 EV71和CA16的多个保守抗原表位的嵌合病毒样颗粒（VLPs）。以小鼠为模型,对VLPs的免疫原性、抗EV71或CA16感染的保护进行评价;基于EV71 P1和3CD在杆状病毒表达系统中共表达可自主切割包装成病毒样颗粒,设计了一种新型重组嵌合肠病毒VLPs,分别将CA16的单个或多个主要抗原表位替换EV71对应区域,研究了EV71和CA16抗原表位的嵌合表达及对VLPs自组装特性的影响,后续将评价嵌合VLPs诱导的抗EV71和CA16感染的免疫保护。主要研究结果包括:1.以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白（tHBc）为载体蛋白,将EV71的保守抗原表位SP70和CA16 VP1蛋白保守中和表位PEP91融合片段插入HBc肽段的Asn75与Ser81残基之间,获得了融合片段tHBc/SP;然后将EV71编码VP2蛋白的CD4+ T细胞优势抗原表位A3融合在tHBc/SP的C端,获得了融合片段tHBc/SPA;以未插入外源基因的tHBc作为对照,将tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc三种基因片段分别克隆到大肠杆菌表达载体pET28中,构建重组表达质粒ptHBc/SP、ptHBc/SPA和ptHBc。转化大肠杆菌,筛选用于病毒样颗粒疫苗生产的工程菌株;经优化条件,高效表达了融合蛋白tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc。通过分离变性包涵体、亲和层析纯化融合蛋白和体外复性等实验,制备了高纯度的VLPs。2.以BALB/c小鼠为动物模型,对两种嵌合病毒样颗粒tHBc/SPA和tHBc/SP诱导的免疫应答和抗病毒感染免疫效力进行评估。结果显示,tHBc/SPA和tHBc/SP两种VLPs免疫小鼠均可诱导针对EV71和CA16的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。与灭活EV71相比,嵌合VLPs诱导Th1细胞因子显着升高,Th2细胞因子降低。用嵌合VLPs免疫母鼠诱导针对子代新生小鼠抗EV71致死感染的完全免疫保护效应和抗CA16致死感染的部分保护。共表达CD4+ T细胞表位没能提高嵌合VLPs在小鼠中的抗病毒效力。3.对杆状病毒表达系统进行优化改造,将巨细胞病毒（CMV）的启动子替换转移质粒pFBDM中的p10启动子驱动3CD基因、降低3CD的表达,减少p10控制3CD表达时与pH启动子驱动的P1表达存在的竞争以提高VLPs产量,获得重组转移质粒pFBDM P1-C3CD。将CA16 SP70单独替换EV71对应片段,构建重组转移pFBDM P1/SP70-C3CD;通过将CA16-SP70、VP2136-150、VP3176-190和VP448-62 同时替换EV71 相应片段,构建重组转移质粒pFBDM P1/4M-C3CD。转化宿主大肠杆菌DH1OMultiBac使四种重组转移质粒发生转座,提取同源重组产生的杆状病毒基因组Bacmid,分别转染昆虫细胞Sf9拯救重组杆状病毒 BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD 和 BacP1/4M-C3CD。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组嵌合目的均高效表达;利用昆虫细胞大量培养和重组病毒接种,表达目的蛋白,经过超速离心、凝胶过滤层析和超滤纯化浓缩,制备了高纯度组分。经电镜观察三种重组杆状病毒感染Sf9细胞均生产VLPs。后续将进行嵌合VLPs疫苗的抗EV71和CA16致死感染的免疫效力评价。我们的研究成果为研制抗EV71和CA16感染的VLPs的新型疫苗奠定了重要基础。
于德彬[3]（2016）在《新型干扰素λ嵌合体的设计和活性研究》文中研究表明Ⅲ型干扰素是近年来发现的由被感染的细胞和某些免疫细胞如浆细胞样树突细胞（p DCs）产生的具有与Ⅰ型干扰素相似功能的细胞因子。目前已经发现四个成员,分别命名为IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28A）、IFN-λ3（IL-28B）和IFN-λ4。它们与由IL-28R1和IL-10R2亚基组成的受体复合物结合,通过JAK-STAT信号通路发挥抗病毒等生物学作用。人Ⅲ型干扰素基因位于19号染色体长臂上,即19q13.13。IFN-λ1和IFN-λ2基因位于正链,IFN-λ3和IFN-λ4基因位于负链。IFN-λ1由5个外显子组成,IFN-λ2和IFN-λ3由6个外显子组成。IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的启动子区域包含干扰素调节因子3（IRF3）和IRF7的结合位点和至少一个有功能的NFκB结合位点。IFN-λ1的N端为19个氨基酸的信号肽,IFN-λ2和IFN-λ3的N端为25个氨基酸的信号肽。当信号肽被切下后形成成熟的181个氨基酸的IFN-λ1或者175个氨基酸的IFN-λ2和IFN-λ3。IFN-λ4由IFNL4-delta G等位基因表达而来。其等位基因IFNL4-TT编码IFN-λ4假基因,不表达有功能的蛋白质。尽管IFN-λ4与其它3个Ⅲ型干扰素家族成员的同源性很低,但其结构与其它3个成员相似,并且同样与IL-28R1/IL-10R2受体结合,通过JAK-STAT信号通路,发挥功能。最近的研究发现IFN-λ3基因上游的单核苷酸多态性（SNP）与PEG-IFN-α联合利巴韦林治疗丙型肝炎的应答相关。该SNP也与机体自发清除丙型肝炎病毒的能力相关。此外,IFN-λ4基因的单核苷酸多态性也与PEG-IFN-α联合利巴韦林治疗丙型肝炎的应答及机体自发清除丙型肝炎病毒相关。人Ⅲ型干扰素受体的IL-28R1亚基的基因il28ra位于1号染色体1p36.11处,包含7个外显子,所转录的m RNA存在3种剪接方式,可以产生3种不同的m RNA。IL-28R1全长520个氨基酸,其N端为20个氨基酸的信号肽。IL-28R1亚基由208个氨基酸的细胞外结构域、23个氨基酸的跨膜区及271个氨基酸的细胞内结构域组成。IL-28R1细胞外结构域有4个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点,细胞内结构域有3个酪氨酸残基位点。其中Tyr343和Tyr517为STAT2和STAT5激活所必须。人Ⅲ型干扰素受体的IL-10R2亚基的基因il10r2位于21q22.11处,包含7个外显子,编码一条325个氨基酸的多肽,该多肽N端为19个氨基酸的信号肽。IL-10R2的细胞外结构域有4个N-糖基化位点和4个O-糖基化位点。IL-10R2细胞内结构域由79个氨基酸组成。IL-28R1是Ⅲ型干扰素专有的受体亚基,主要在粘膜上皮细胞和肝细胞中表达。IL-28R1表达的细胞特异性决定了Ⅲ型干扰素的靶细胞特异性。而IL-10R2则是IL-10、IL-22、IL-26和Ⅲ型干扰素的共用受体亚基,其表达不具有细胞特异性。Ⅲ型干扰素与IL-28R1亚基结合,使之IL-10R2亚基结合形成受体复合物,进而启动信号转导。Ⅲ型干扰素除了具有直接抗病毒的活性以外,还可以通过上调MHCⅠ分子调节免疫应答,发挥抗病毒作用。大量研究表明,Ⅲ型干扰素是抵抗病毒感染粘膜上皮细胞的最重要免疫因子。但不同于Ⅰ型干扰素的严重而广泛的副作用,Ⅲ型干扰素因其受体表达的特异性而限制了其作用的靶细胞范围,降低了其副作用。因此,Ⅲ型干扰素在防治呼吸道和胃肠道病毒感染中极具应用前景。Ⅲ型干扰素可以抑制多种肿瘤细胞的增殖。Ⅲ型干扰素通过上调细胞周期调节因子p21的表达和促进Rb的去磷酸化,诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖;同时,通过诱导凋亡蛋白TRAIL等的表达,诱导癌细胞凋亡。Ⅲ型干扰素通过特定的靶细胞在抗病毒感染、肿瘤固有免疫防御方面发挥重要作用。但是,尽管Ⅲ型干扰素在预防和肿瘤发生、病毒感染和自身免疫性疾病中发挥重要作用,目前只有PEG-IFN-λ1治疗丙型肝炎病毒感染的方案进行了临床试验。PEG-IFN-λ1治疗丙型肝炎的Ⅱ期临床试验结果显示PEG-IFN-λ1与PEG-IFN-α疗效相似。与PEG-IFN-α相比,在12周前PEG-IFN-λ1可以更快的抑制病毒复制。在第24周时,PEG-IFN-λ1的病毒抑制率则与PEG-IFN-α基本相同。但是PEG-IFN-λ1治疗的副作用很小。在接受PEG-IFN-λ1治疗的患者中,很少发生嗜中性白细胞减少症和血小板减少症。尽管Ⅲ型干扰素具特异的抗病毒活性,且副作用很小,但是与Ⅰ型干扰素相比,其抗病毒活性要低很多。因此提高Ⅲ型干扰素的抗病毒生物活性具有重要意义。此外,在III型干扰素所有成员中,IFN-λ3的抗病毒活性最高,但只有IFN-λ1可以在原核表达系统里高效表达,导致目前在临床开发中的III型干扰素是IFN-λ1,而不是活性最高的IFN-λ3。近数十年对?干扰素的研究表明,将干扰素蛋白分子的序列稍做改变,有时可以使其在某一方面的活性（抗病毒或抑制细胞增殖）大大提高,如IFN-con和经DNA shuffling产生的超级干扰素等。因此,结合IFN-λ1易于在原核表达系统中表达和IFN-λ3高抗病毒活性的特点,本文通过用IFN-λ1的序列置换IFN-λ3相对应序列的方法设计了9个Ⅲ型干扰素嵌合体。为了避免产生免疫原性,我们选择在IFN-λ1和IFN-λ3的序列完全相同的区域进行置换,因此所设计的Ⅲ型干扰素嵌合体分子全都不带任何非天然氨基酸序列。本文第一次系统地研究了IFN-λ1/3嵌合体的表达和纯化,并且进行了PEG修饰。随后我们细致地研究了IFN-λ1/3嵌合体的活性和稳定性。发现PEG-analog-6诱导ISRE-luciferase报告基因表达的效率高于Ⅰ型干扰素PEG-IFN-α2a。PEG-analog-6和PEG-analog-7可以有效抑制丙型肝炎病毒和A型流感病毒的复制。并且PEG-analog-6和PEG-analog-7抑制流感病毒H3N2的效率高于Ⅰ型干扰素PEG-IFN-α2a。PEG-analog-6还可以抑制肺癌细胞株HCC827的增殖,诱导HCC827细胞STAT1磷酸化。此外还发现PEG-analog-6可以诱导HCC827细胞表达APOBEC3G。本文采用同家族基因序列置换的方法设计嵌合体蛋白质,并且证明了所设计的嵌合体蛋白质生物活性获得显着提高。此蛋白质设计方法避免了引入非天然蛋白质序列所引起的免疫源性问题,可用于设计和筛选安全有效的蛋白质工程药物。本文的实验结果如下:1.通过将Ⅲ型干扰素不同亚型之间的序列进行置换的方法设计干扰素嵌合体,并进行表达纯化。发现以IFN-λ1序列为N端的嵌合体可以在大肠杆菌里高效表达和纯化,而以IFN-λ3序列为N端的嵌合体则不能在大肠杆菌里表达。开发了一整套嵌合体干扰素的表达纯化和修饰的工艺。2.通过检测经嵌合体干扰素处理的Hep G2细胞Mx A和OAS的表达,证实4种嵌合体干扰素具有诱导干扰素应答基因表达的活性。其活性与浓度呈正相关,并且具有时间效应。3.通过检测干扰素信号通路关键蛋白STAT1的磷酸化与否,证实嵌合体干扰素可以诱导STAT1发生磷酸化,从而诱导干扰素应答基因的表达。4.通过ISRE-luciferase报告基因细胞系定量研究嵌合体干扰素的活性,证实analog-6和analog-7的活性高于IFN-λ1,PEG-analog-6的活性比PEG-IFN-α2a高5倍,PEG-analog-7的活性与PEG-IFN-α2a接近。5.通过免疫荧光染色和实时定量PCR的方法证明了PEG-analog-6和PEG-analog-7嵌合体干扰素能够抑制丙型肝炎病毒复制,其活性与PEG-IFN-α2a接近。6.通过ELISA的方法证实PEG-analog-6和PEG-analog-7嵌合体干扰素能够抑制流感病毒的复制,并且PEG-analog-6的活性高于PEG-IFN-α2a。7.通过检测放置于40℃的不同批次的嵌合体干扰素PEG-analog-6的浓度和纯度变化的方法,证明PEG-analog-6蛋白具有高度的稳定性。8.通过测定嵌合体干扰素对不同肿瘤细胞增殖的作用,发现嵌合体干扰素PEG-analog-6可以抑制肺癌细胞HCC827的增殖,诱导HCC827细胞凋亡,表达APBOEC3G。因此证实了嵌合体干扰素PEG-analog-6具有抑制肿瘤细胞增殖的活性,其活性高于PEG-IFN-λ1。本文研究结果表明嵌合体干扰素PEG-analog-6具有易于在大肠杆菌中表达和纯化,稳定性好,能够诱导干扰素应答基因的表达,具有很高的抗病毒和抑制肿瘤细胞增殖的活性,为将其开发成蛋白质药物奠定了基础。
刘亚妮[4]（2016）在《用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究》文中认为在全球范围内丙型病毒性肝炎是可致死的十大感染性疾病之一,在我国也是一种常见的传染病。丙型病毒性肝炎由丙型肝炎病毒引发,简称为丙肝,主要传播途径是经体液及血液传播。HCV感染人群中慢性丙型肝炎约占70%～85%,其中60%～70%的慢性感染患者将发展为慢性肝病,包括肝硬化、肝癌等,在肝硬化患者中,每年有1%～4%发展为肝癌。HCV感染会引发肝硬化的产生,同时也是诱发肝癌的最重要原因。丙肝危害极大的另一主要原因是由于目前尚无切实有效的可用于预防丙型肝炎病毒感染的疫苗。在发展中国家,因为诊断技术不成熟以及治疗方法存在缺陷而导致的HCV感染者死亡率在逐渐升高。由于HCV疫苗的研发在短期内很难获得突破性的进展,所以,控制该疫情的发展只能从切断传染源和阻遏传播途径上入手。而HCV感染初期具有极强的感染性,因此对HCV感染者进行及早而准确的诊断是控制丙型肝炎传播的最为有效的手段。因而建立一种具有高灵敏度、特异性和稳定性的针对HCV的筛查方法具有重要的意义。目前常用的HCV检测方法主要包括:①血清中HCV抗体检测;②血清中HCV核心抗原检测;③血液中HCVRNA检测。这三种检测方法在确诊HCV感染、选择患者治疗方案以及评价治疗效果等方面相辅相成,起到了关键性的作用。但由于目前使用的抗HCV检测试剂盒中抗原均为人工合成的具免疫原性的基因工程抗原配比合成肽抗原,其在特异性方面存在不足,可能会出现假阳性结果。此外,由于“窗口期”的存在,在HCV感染初期,感染者体内尚无抗体的产生,因此,在HCV感染早期诊断还需要其他检测策略来弥补其不足。丙肝病毒核心蛋白由氨基酸序列非常保守的大约190个氨基酸编码而成。病人血液中HCV核心抗原的出现是反映HCV感染的重要标志,因此目前可应用于HCV感染“窗口期”的筛查,HCV抗原的检测可将HCV感染的窗口期缩减50天左右。HCV核心抗原检测中较常用的方法是双抗体夹心法。双抗体夹心法可检测血清样品中总的核心抗原或游离的核心抗原,在明显缩短窗口期的同时,不会受到被检样品中所含有的抗-HCV抗体的影响,检测结果可靠,具有方法简单、用时短、对环境要求低、假阳性率低等特点。在暴露于HCV环境中7～21天内,即可在患者外周血中检测到HCV RNA的存在,其含量在血清阳转之前可达到一个峰值,滴度在1×105至1×108拷贝/mL之间。为了实现HCV感染的早期检测,降低感染率,许多国家采用了灵敏度较高的核酸检测法,但技术该技术对设备、试剂及操作方法等要求均较高,而且检测过程易交叉污染,因此很难在发展中国家推行开来。综上所述,联合检测抗HCV抗体及HCV核心抗原将成为检测HCV感染的有效手段之一。本课题利用检测抗原及抗体相结合的方法,可同时检出样本中HCV抗原和抗体,提高了阳性检出率,并可有效缩短HCV检测窗口期,有利于HCV感染早期诊断。通过比较前三代抗-HCV诊断试剂盒中抗原的组份,我们选择了 core及NS3-5重组型抗原检测病人血液中的抗体,同时应用HCV核心抗原保守区两端小肽分别制备HCV抗核心单克隆抗体,利用双抗体夹心法原理检测病人血液中的抗原。本课题的具体研究内容如下:（1）ELISA试剂盒中用于检测抗体的丙肝病毒抗原的表达与纯化:通过PCR获得HCV core-NS3-5基因片段,将其克隆至实验室构建保存的原核表达载体pRSET-BL,然后通过酶切鉴定及测序获得pRSET-BL/HCV core-NS3-5原核表达载体,将该质粒电转化至E.coliBL21（DE3）菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白6His-HCV core-NS3-5融合蛋白。该融合蛋白作为ELISA试剂盒中抗原的组份。（2）携带丙型肝炎病毒核心抗原C8-160片段,核心抗原小肽C8-22及C101-115融合蛋白的原核表达载体的构建及其表达纯化:通过公司合成HCV C8-160基因片段、HCV C8-22小肽以及HCV C101-115小肽的Linker。将HCV C8-160基因克隆至实验室构建保存的PGEX-4T-3载体,获得原核表达载体PGEX-4T-3/HCVC8-160。将 HCVC8-22 小肽和 HCVC101-115 小肽分别克隆至实验室保存的pET-28a/HBc-LacZ BS载体和pRSET-B/Grn E BS载体中,获得pET-28a/HBc-HCV C8-22、pET-28a/HBc-HCV C101-115、pRSET-B/Grn E-HCV C8-22和pRSET-B/Grn E-HCV C101-115四种可以表达不同表位小肽的融合蛋白的原核表达载体。将上述五种原核表达载体分别电转化至E.coli BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白,用于制备针对HCV核心不同抗原表位的单克隆抗体。（3）分别携带核心抗原小肽C8-22和C101-115的真核表达载体的构建:将质粒pAd5/E1-CMV-H1H2-Grn E-Flag用BamHI和SfuI分步双酶切后,分别连入HCV C8-22小肽和HCV C101-115小肽,转染HEK 293细胞72 h后收集上清和全细胞裂解液,用于单克隆抗体的Western Blot检测。（4）针对人IgGFc段的单克隆抗体的制备:用购买自Sigma的人IgG蛋白作为免疫原,第一次免疫时将免疫原和Freund完全佐剂等体积混合,研磨后对小鼠进行皮下多点注射,每只小鼠注射的免疫原总量为40 μg;3周后进行第二次免疫,将免疫原与Freund不完全佐剂等体积混合,每只注射剂量和注射方法均同第一次;2周后进行第三次免疫,此次不加佐剂,采用腹腔注射,注射剂量同前两次。2周后,进行断尾取血,用ELISA检测小鼠血清抗体效价,选择抗体效价达到1:64000以上的2只小鼠,于1周后用该蛋白进行腹腔加强免疫。加强免疫后第2天,将饲养细胞接种于96孔板中,第3天将免疫小鼠的脾细胞按照10:1或5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞通过PEG4000进行融合,以HAT/HT选择培养液筛选杂交瘤细胞,融合7天至10天后,采用ELISA法筛选阳性孔,经过3～4次的亚克隆,阳性率达到100%时,即得到分泌小鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞,随后将杂交瘤细胞转移到24孔板中进行扩大培养并冻存。选择8周龄的BALB/c小鼠制备腹水。收集腹水后获得所需的小鼠抗人IgG单克隆抗体。（5）针对HCV核心不同抗原表位的单克隆抗体的制备:为了制备针对HCV C8-22单克隆抗体的制备,将上述获得的GST-6His-HCV C8-160融合蛋白作为初次免疫原,HBc-HCV C8-22融合蛋白作为加强免疫原,Grn E-HCV C8-22融合蛋白用于杂交瘤的筛选检测,筛选获得阳性杂交瘤细胞,扩大培养及制备腹水后由Western Blot和免疫荧光染色进行鉴定,制备得到针对HCV C8-22的单克隆抗体。针对HCV C101-115单克隆抗体的制备,同上述实验策略,初次免疫原同上,HBc-HCV C101-115融合蛋白作为加强免疫原,Gm E-HCV C101-115融合蛋白用.于筛选,制备获得针对HCVC101-115的单克隆抗体。（6）HCV抗原抗体联合检测体系的建立及其应用:应用针对HCV核心抗原不同抗原表位的单克隆抗体Anti-HCV C8-22和Anti-HCV C101-.115及HCV core-NS3-5重组抗原同时包被酶联板。如果是检测样本中的抗体,使用HRP标记的鼠抗人IgG单抗;如果是检测样本中的抗原,使用与固相包被物有不同抗原决定簇的辣根过氧化物酶标记的抗-HCV核心单克隆抗体,显色后进行定性或定量检测。由此可以检测样品中的HCV抗原或其抗体。通过以上研究获得以下研究成果:（1）成功构建了 pRSET-BL/HCV core-NS3-5原核表达载体,纯化获得6His-HCV core-NS3-5 融合蛋白,浓度为 1.0 mg/mL;（2）成功构建了 PGEX-4T-3/HCV C8-160原核表达载体,纯化获得GST-6His-HCV C8-160 融合蛋白,浓度为 1.0 mg/mL;（3）成功构建了 pET-28a/HBc-HCV C8-22 和 pRSET-B/Grn E-HCV C8-22 原核表达载体,纯化获得携带HCV C8-22小肽的融合蛋白HBc-HCV C8-22浓度为0.1 mg/mL,Gm E-HCV C8-22 浓度为 0.25 mg/mL;（4）成功构建了 pET-28a/HBc-HCV C101-115 和 pRSET-B/Grn E-HCV C101-115原核表达载体,纯化获得携带HCVC101-115小肽的融合蛋白HBc-HCV C101-115 浓度为 0.1 mg/mL,Grn E-HCV C101-115 浓度为 1.2 mg/mL;（5）成功构建了 pAd5/E1-CMV-H1H2-Grn E-HCV C8-22-Flag 和 pAd5/E1-CMV-H1H2-Gm E-HCV C101-115-Flag 真核表达载体;（6）通过杂交瘤技术制备获得3株针对人IgG Fc段的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,它们分别为33E5、30E1和28D11。经Western Blot鉴定,3株单克隆抗体均特异性针对人IgGFc段。均为IgG1亚类。经ProteinGPlus/ProteinA-Agarose亲和层析法纯化后浓度分别为2.28 mg/mL、1.07 mg/mL和1.61 mg/mL。（7）采用联合免疫的方法,通过杂交瘤技术制备获得3株针对HCV C101-115抗体,它们分别为39A6、43C6和73B6。经Western Blot和免疫荧光染色鉴定,3株单克隆抗体均特异性针对HCV C101-115抗原。均为IgG1亚类。经Protein G Plus/Protein A-Agarose 亲和层析法纯化后浓度分别为 3.41 mg/mL、5.15 mg/mL 和 1.09 mg/mL。上述研究成果为HCV诊断提供了特异性抗体及抗原,为进一步研究HCV的防治途径奠定了重要基础;同时也为小肽的单抗制备提供了一种更有效的免疫方案。
余晓杰[5]（2013）在《HCV-F蛋白的原核表达以及对Th1/Th2型细胞因子的影响》文中研究指明为了研究丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）F蛋白（alternate readingframeshifting protein, ARFP）在HCV慢性感染以及HCV相关肝癌发生过程中的作用及意义，本实验以HCV慢性患者（chronic hepatitis patient, CHP）和HCV相关肝细胞癌患者（hepatocellular carcinoma patient, HCCP）外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）为研究对象，了解HCV1b-F蛋白体外刺激CHP和HCCP PBMC后IFN-γ和IL-5的表达情况，分析了F蛋白在体外对宿主细胞Th1/Th2细胞因子表达的影响，以期发现F蛋白在HCV慢性化进程和HCV相关肝癌发生中可能扮演的角色；我们还检测了不同年龄和病程HCV患者血清中F抗体（F antibody, F-Ab）水平，以期进一步探讨F蛋白在HCV生命活动中起到的作用。方法：（1）提取带有F基因片段的pEGFPC3-F重组质粒，用BamH I和EcoR I双酶切，电泳回收后与用上述双酶切割并电泳回收的pColdⅡ质粒连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，筛选阳性转化子后提取质粒，进行酶切鉴定并测序。（2）将HCV1b-F::pcold Ⅱ/BL21重组菌大量培养后加IPTG诱导表达，菌体沉淀用Binding buffer溶解，冰上超声破碎，离心后取上清，上镍柱，Elution buffer洗脱，收集洗脱下来的蛋白溶液，透析复性，将复性后的F蛋白进行蛋白浓度测定、SDS-PAGE电泳以及氨基酸测序鉴定。（3）将纯化后的重组表达蛋白HCV1b-F蛋白作为抗原包被酶联反应板，以待测HCV患者血清标本为一抗，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体为二抗，以F蛋白孔作为本底对照，ELISA分别检测40份慢性HCV患者和20份HCV相关肝癌患者血清，依据所测F抗体的阴性或阳性结果，并将HCV患者分成四组，即F-Ab（+）CHP、F-Ab（-）CHP、F-Ab（+）HCCP和F-Ab（-） HCCP组。（4）分离培养健康者和HCV患者PBMC，加入去除内毒素的F蛋白处理细胞，72h后收集细胞上清，ELISA检测IL-5和IFN-γ的浓度。结果：（1）酶切鉴定结果显示与目的基因片段大小一致，提取重组质粒进行DNA序列测定与比对分析，结果证实DNA插入序列正确；（2）将洗脱下来的蛋白溶液透析复性后，收集透析膜内的蛋白溶液，进行SDS-PAGE鉴定，结果显示：重组菌特异性表达产物的分子量约为18kD，符合预期；经紫外分光光度计测定，复性后的蛋白浓度为0.94mg/ml；通过测定蛋白的氨基酸序列，进一步证实该蛋白即为HCV1b-F蛋白。（3）用F蛋白检测HCV患者血清标本，发现22份慢性HCV患者血清F抗体检测呈阳性（阳性率为55%），12份HCV肝癌患者血清F抗体检测呈阳性（阳性率60%）。（4）ELISA检测结果经SPSS软件分析后显示，F-Ab（+） CHP组IL-5的水平高于F-Ab（-） CHP组（P<0.05），其IFN-γ的水平低于F-Ab（-）CHP组（P<0.05）；F-Ab（+）HCCP组IL-5水平高于F-Ab（-） HCCP组（P<0.05），其IFN-γ的水平低于F-Ab（-）HCCP组（P<0.05）。结论：HCV1b-F蛋白体外刺激HCV患者PBMC，ELISA结果显示该F蛋白可能上调IL-5水平而下调IFN-γ水平，可能与HCV慢性化和肝癌发生机制有关。
汪明珊,颜学兵,周林福,李杨霞[6]（2012）在《7株不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白的差异研究》文中提出目的通过比较不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白（CORE）的差异,筛选出能高效表达CORE的原核质粒。方法用PCR扩增并获得CORE基因,扩增产物分别构建到7种不同原核表达质粒中,重组质粒用IPTG诱导表达,聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）初步鉴定表达产物,并经Western blot验证。结果 PCR及双酶切验证表明CORE基因成功构建到7种原核质粒中,SDS-PAGE验证各融合质粒表达目的蛋白存在差异,其中pTrc-CKS-CORE及Pmbp-C-CORE可见相应的融合蛋白表达,以pTrc-CKS-CORE表达量高,表达产物经Western blot验证表达成功。结论成功构建7株不同CORE原核表达质粒,各融合质粒表达CORE存在较大差异,筛选出高表达CORE质粒,为下一步研究奠定基础。
刘秀财,王克霞,成军,洪源,王琦,杜佳菊,季生吉[7]（2008）在《丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠埃希菌中的表达及其纯化》文中进行了进一步梳理目的建立稳定表达丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白。方法以HCV株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得核心蛋白基因,构建原核表达载体pET-32a（+）-HCV-Core。转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒,验证正确后,再次转化大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Westernblot验证融合蛋白的表达。超声破碎表达菌,Ni+-亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。结果成功构建了原核表达载体pET-32a（+）-HCV-Core,并表达了预期分子量大小的目的蛋白。结论成功表达、纯化HCV核心融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。
李越,王琦,林原,成军,李康,李华[8]（2008）在《HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备》文中进行了进一步梳理目的:构建丙型肝炎病毒核心抗原结合蛋白12（HCVCore binding protein,HCBP12）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化HCBP12融合蛋白并制备兔抗HCBP12多克隆抗体。方法:应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HCBP12基因片段,插入至原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达载体pET-32a（+）-HCBP12,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,获得HCBP12融合蛋白的可诱导性表达,并通过SDS-PAGE电泳、Western Blot免疫印迹分析和证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果:HCBP12融合蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>1512000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论:成功表达、纯化HCBP12融合蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗HCBP12多克隆抗体,为研究HCBP12蛋白的生物学功能及丙肝的临床治疗提供了重要的实验工具。
李越[9]（2007）在《人类丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白12（HCBP12）的克隆表达与功能研究》文中提出研究背景与目的丙型肝炎病毒（HCV）感染所致丙型肝炎是慢性肝病及肝细胞癌（HCC）的原因之一;但迄今尚无疫苗和特异有效的治疗方式.深入研究丙型肝炎病毒的感染与致病机制具有重大的现实意义。在筛选了肝细胞内能与HCV Core相互结合的蛋白,并将其中一个在HCC中作用不清的新基因命名为HCV Core结合蛋白12（HCBP12）的基础上,本研究拟通过亚细胞定位、原核表达、抗体制备和肝细胞内结合蛋白的筛选等几个方面初步阐释该基因在HCC发病过程中的生物学功能。方法1.构建重组绿色荧光表达载体pEGFP-C1-HCBP12,转染HepG2细胞,24hr后在荧光倒置显微镜下观察荧光情况。2.构建原核表达载体pET-32a（+）-HCBP12,转化BL21宿主菌后经IPTG诱导,获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达,并用SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白的特异性进行分析和验证。然后利用Ni+亲和柱纯化表达蛋白并免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。3.构建酵母细胞表达载体pGBKT7-HCBP12,转化AH109酵母菌株并获得表达,利用Western blot对表达蛋白进行验证。与含有肝细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,进行酵母双杂交,筛选与HCBP12具有相互作用的蛋白。结果1.细胞浆出现明显的绿色荧光信号,提示HCBP12主要定位于胞浆内。2.HCBP12融合蛋白在原核表达系统成功表达。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>1:512,000, Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。3.HCBP12融合蛋白经Western blot验证在酵母菌株表达成功。利用酵母双杂交技术筛选出12个与HCBP12相互作用的蛋白,其中包括人类载脂蛋白C-I/B、人类线粒体蛋白、人类金属硫蛋白2A、人类β-2微球蛋白、人类羧酸脂酶4和人类丝氨酸肽酶抑制剂等已知功能蛋白及1个未知功能蛋白。将新基因提交GenBank数据库,并命名为HCBP12BPA。结论本研究证实了HCBP12定位于肝细胞浆内,可与肝细胞的载脂蛋白、金属硫蛋白2A、β-2微球蛋白、羧酸脂酶等多种蛋白结合,在肝细胞的增殖、凋亡,细胞内物质代谢等过程具有不可忽视的作用。本研究成功利用大肠杆菌原核表达系统对其进行了诱导表达,表达蛋白通过亲和层析技术进行了纯化,并应用纯化蛋白成功制备了具备高效价、高特异性的兔抗HCBP12多克隆抗体。这些都为日后应用其他包括免疫组化、哺乳动物双杂交、细胞增殖、细胞信号转导等方法深入研究HCBP12在HCC发生发展过程中的意义奠定了物质基础。
张敏睿[10]（2006）在《丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达》文中研究说明丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要原因之一。目前尚无有效的疫苗及治疗药物,对HCV感染的早期诊断是控制HCV传播的重要手段。 HCV感染的临床诊断途径有:检测血清HCV RNA、HCV抗体及HCV抗原。目前PCR检测HCV RNA是HCV诊断最灵敏、特异的方法,但其操作复杂,易造成污染,且价格昂贵,不适于大规模的筛查应用。HCV患者血清中HCV抗原水平很低,常规免疫学方法难以获得阳性结果。故HCV诊断最常用的方法是利用HCV特异性蛋白质抗原来筛查血清中HCV抗体。 HCV核心蛋白（Core蛋白）高度保守且有很强的免疫原性,可诱发高水平的特异性体液免疫及细胞免疫,是HCV诊断试剂中必不可少的组分之一。近年来Core蛋白先后在大肠杆菌中获得了表达,但是大肠杆菌不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力,表达的蛋白往往形成的包涵体,需要经过变性、复性等处理才能应用。与大肠杆菌相比,毕赤酵母是单细胞真核生物,既具有生长快的特点,又能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足,表达外源蛋白可分泌到胞外,便于产品的分离纯化。因此本研究在大肠杆菌系统中表达Core蛋白并构建其毕赤酵母表达系统,初步对两个系统表达的Core蛋白进行对比。 将克隆有Core基因的原核表达载体pBVIL1-Core转化大肠杆菌HB101,温度诱导表达Core蛋白,进行SDS-PAGE及Western-Blot分析;同时通过PCR方法扩增Core基因,克隆入表达载体pPICZaA,筛选阳性克隆pPICZaA-Core。将经过酶切鉴定和测序正确的阳性克隆电转入毕赤酵母GS115中,挑取酵母转化单菌落,接种于BMGY培养基,30℃、250r/min培养至OD600=2.0时室温1,500r/min离心5min,用BMMY培养基重悬菌体使OD600=1.0,重新放入摇床进行诱导。每24h补加甲醇至终浓度为1.0%,连续诱导72h,诱导后上清进行Western-Blot分析。 结果显示pBVIL1-Core的表达产物经SDS-PAGE分析出现一条约31KD的带,与预期融合蛋白的分子量相符,表达蛋白存在于包涵体中且表达量占菌体总蛋白的20%,Western-blot显示诱导后菌体在相应位置出现特异性杂交带,表明
二、HIGN LEVEL EXPRESSION OF HEPATITIS C VIRUS CORE GENE IN E.COLI（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HIGN LEVEL EXPRESSION OF HEPATITIS C VIRUS CORE GENE IN E.COLI（论文提纲范文）
（1）双靶向病毒样颗粒递送系统的构建及其抗脑胶质瘤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 脑胶质瘤与血脑屏障概述 |
| 1.3 靶向纳米递送系统的概述 |
| 1.4 病毒样颗粒在纳米递送系统中的应用 |
| 1.5 乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒(HBc VLPs) |
| 1.6 课题研究思路及拟解决的问题 |
| 第二章 乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的表达与纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 双靶向病毒样颗粒递送系统的制备与表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 双靶向递送系统的体外抗肿瘤研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 双靶向递送系统的体内抗肿瘤研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 基因组结构及其编码蛋白质 |
| 1.4 肠道病毒感染与免疫 |
| 1.5 手足口病疫苗研究现状 |
| 1.5.1 减毒活疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 表位疫苗 |
| 1.5.4 亚单位疫苗 |
| 1.5.5 DNA疫苗 |
| 1.5.6 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.6 乙肝病毒core蛋白(HBc)与病毒样颗粒(VLPs) |
| 1.7 手足口病疫苗效力评价的相关动物模型 |
| 1.8 杆状病毒表达系统与重组疫苗的研究 |
| 1.9 本研究目的与意义 |
| 第二章 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备及其免疫原性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂及实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆方法 |
| 2.2.2 重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 2.2.3 细胞实验细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.2.4 动物实验 |
| 2.2.5 免疫检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备 |
| 2.3.2 嵌合病毒样颗粒诱导特异性体液免疫应答 |
| 2.3.3 嵌合病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫应答 |
| 2.3.4 EV71小鼠适应株(Mouse adapted virus,MAV) EV71的制备 |
| 2.3.5 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的主动免疫保护 |
| 2.3.6 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的被动免疫保护 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 研究总结 |
| 第三章 基于杆状病毒表达EV71和CA16重组抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备与鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 相关仪器 |
| 3.1.2 细胞细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂 |
| 3.1.3 培养基及溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 重组转移质粒的构建 |
| 3.2.3 重组转移质粒在DH10MultiBac中的同源重组 |
| 3.2.4 重组Bacmid的提取 |
| 3.2.5 重组Bacmid的转染和重组杆状病毒的拯救 |
| 3.2.6 重组杆状病毒的免疫荧光检测 |
| 3.2.7 重组杆状病毒基因组DNA的提取 |
| 3.2.8 重组杆状病毒的增殖 |
| 3.2.9 杆状病毒的滴度测定 |
| 3.2.10 重组嵌合蛋白蛋白表达与鉴定 |
| 3.2.11 重组嵌合蛋白纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组转移质粒pFBDM P1-C3CD、pFBDM P1/SP70-C3CD、pFBDMP1/4M-C3CD的构建与鉴定 |
| 3.3.2 杆状病毒BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD、BacP1/4M-C3CD的拯救与鉴定 |
| 3.3.3 VLPs P1-C3CD VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的表达与鉴定 |
| 3.3.4 VLPs P1-C3CD、 VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的纯化与电镜观察 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 研究总结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）新型干扰素λ嵌合体的设计和活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 干扰素的分类 |
| 1.2 Ⅲ型干扰素细胞因子家族特点 |
| 1.3 Ⅲ型干扰素的基因和蛋白质结构 |
| 1.4 Ⅲ型干扰素的细胞内来源 |
| 1.5 Ⅲ型干扰素受体 |
| 1.6 Ⅲ型干扰素的靶细胞 |
| 1.7 Ⅲ型干扰素的信号转导 |
| 1.8 Ⅲ型干扰素的生物学效应 |
| 1.9 Ⅲ型干扰素的应用前景 |
| 1.10 本论文的思路及方法 |
| 1.11 本文的创新点 |
| 第二章 Ⅲ型干扰素嵌合体的表达、纯化与修饰 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 主要试剂配方： |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原核达载体构建 |
| 2.2.2 表达和纯化IFN-λ 嵌合体 |
| 2.2.3 PEG修饰和纯化 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 设计和筛选IFN-λ 嵌合体 |
| 2.3.2 纯化和分析嵌合体蛋白质 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Ⅲ型干扰素嵌合体的抗病毒活性研究 |
| 3.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR实验 |
| 3.2.2.1 总RNA提取 |
| 3.2.2.2 c DNA合成实验操作步骤 |
| 3.2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 3.2.3 表达荧光素酶报告基因细胞系的建立 |
| 3.2.3.1 实验原理 |
| 3.2.3.2 转染p GL4.45[luc2P/ISRE/Hygro]质粒 |
| 3.2.4 蛋白免疫印迹（Western blot）实验 |
| 3.2.4.1 细胞总蛋白提取 |
| 3.2.4.2 Western blot实验方法 |
| 3.2.5 免疫荧光 |
| 3.2.5.1 实验方法 |
| 3.2.5.2 丙肝病毒的制备 |
| 3.2.6 A型流感病毒（A/H3N2）的扩增 |
| 3.2.7 嵌合体干扰素抑制A型流感病毒（A/H3N2）的测定 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 嵌合体干扰素诱导Mx A和OAS的表达 |
| 3.3.2 PEG修饰的嵌合体干扰素诱导Mx A和OAS的表达 |
| 3.3.3 STAT1磷酸化的测定 |
| 3.3.4 荧光素酶报告基因测定干扰素活性 |
| 3.3.5 干扰素抗丙型肝炎病毒活性的测定 |
| 3.3.6 嵌合体抑制A型流感病毒的测定 |
| 3.3.7 PEG-analog-6 稳定性测试 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Ⅲ型干扰素嵌合体的抗肿瘤活性研究 |
| 4.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 嵌合体干扰素抑制细胞增殖的检测 |
| 4.2.1.1 实验原理 |
| 4.2.1.2 实验步骤 |
| 4.2.2 检测STAT1的活化 |
| 4.2.2.1 Western blot实验 |
| 4.2.3 荧光定量PCR实验 |
| 4.2.4 DAPI染色观察细胞凋亡情况 |
| 4.2.4.1 实验原理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 RT-PCR检测肿瘤细胞Ⅲ型干扰素受体的表达 |
| 4.3.2 嵌合体干扰素对肿瘤细胞增殖的抑制作用 |
| 4.3.3 嵌合体干扰素诱导HCC827细胞STAT1磷酸化 |
| 4.3.4 嵌合体干扰素诱导HCC827细胞凋亡 |
| 4.3.5 嵌合体干扰素诱导HCC827表达APOBEC3G |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 HCV的基因组结构与生物学特性 |
| 1.3 丙型肝炎的诊断方法 |
| 1.3.1 血清HCV抗体检测 |
| 1.3.2 血清HCV核心抗原检测 |
| 1.3.3 HCV RNA检测 |
| 1.3.4 其他检测方法 |
| 1.4 HCV传播途径 |
| 1.4.1 血液、血制品传播 |
| 1.4.2 经性传播 |
| 1.4.3 母婴传播 |
| 1.5 丙型肝炎病毒抗原抗体一体化检测试剂盒的国内外研究现状 |
| 1.6 丙型肝炎病毒抗原抗体一体化检测试剂盒的研究意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 1.7.1 用于检测针对丙型肝炎病毒抗体的融合蛋白抗原的表达及纯化 |
| 1.7.2 携带丙型肝炎病毒核心不同抗原表位蛋白的表达及纯化 |
| 1.7.3 针对人IgG Fc段单克隆抗体的制备 |
| 1.7.4 针对丙型肝炎病毒核心HCV C101-115抗原表位小肽单克隆抗体的制备 |
| 第2章 用于检测针对丙型肝炎病毒抗体的融合蛋白抗原的表达及纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒载体 |
| 2.1.2 材料及试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCV core-NS3-5基因的克隆 |
| 2.2.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞 |
| 2.2.4 pGEMT/HCV core-NS3-5阳性克隆质粒的获得和鉴定 |
| 2.2.5 携带6His-HCV core-NS3-5融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 2.2.6 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.2.7 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的Western Blot检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HCV core-NS3-5基因的克隆 |
| 2.3.2 携带6His-HCV core-NS3-5融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 2.3.3 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.3.4 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的Western Blot检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 携带丙型肝炎病毒核心抗原表位HCV C8-22及HCV C101-115的融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及质粒载体 |
| 3.1.2 材料及试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HCV C8-22小肽的获得 |
| 3.2.2 HBc-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.3 HBc-HCV C8-22融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.4 Grn E-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.5 Grn E-HCV C8-22融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.6 Western Blot检测原核表达的HCV C8-22融合蛋白 |
| 3.2.7 携带HCV C8-22小肽真核表达载体的构建 |
| 3.2.8 HCV C101-115小肽的获得 |
| 3.2.9 HBc-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.10 HBc-HCV C101-115融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.11 Grn E-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.12 Gm E-HCV C101-115融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.13 Western Blot检测原核表达的HCV C101-115融合蛋白 |
| 3.2.14 携带HCV C101-115小肽真核表达载体的构建 |
| 3.2.15 HCV C8-160基因的克隆 |
| 3.2.16 GST-HCV C8-160融合蛋白原核表达载体的构建及其表达纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HBc-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 HBc-HCV C8-22融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.3 Gm E-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.4 Gm E-HCV C8-22融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.5 Western Blot检测原核表达的HCV C8-22融合蛋白 |
| 3.3.6 携带HCV C8-22小肽真核表达载体的构建及表达 |
| 3.3.7 HBc-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.8 HBc-HCV C101-115融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.9 Gm E-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.10 Gm E-HCV C101-115融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.11 Western Blot检测原核表达的HCV C101-115融合蛋白 |
| 3.3.12 携带HCV C101-115小肽真核表达载体的构建及表达 |
| 3.3.13 HCV C8-160基因的克隆 |
| 3.3.14 GST-HCV C8-160融合蛋白原核表达载体的构建及其表达纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 针对人IgG Fc段以及丙型肝炎病毒核心抗原不同表位单克隆抗体的制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 材料及试剂 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 抗人IgG单克隆抗体的制备 |
| 4.2.2 抗人IgG单克隆抗体可特异性结合Fc段的鉴定 |
| 4.2.3 抗人IgG单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.2.4 抗HCV C101-115单克隆抗体的制备 |
| 4.2.5 抗HCV C101-115单克隆抗体的鉴定 |
| 4.2.6 抗HCV C101-115单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 制备抗人IgG单克隆抗体免疫鼠血清效价测定 |
| 4.3.2 抗人IgG单克隆抗体可特异性结合Fc段的鉴定 |
| 4.3.3 抗人IgG单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.3.4 制备抗HCV C101-115单克隆抗体免疫鼠血清效价测定 |
| 4.3.5 抗HCV C101-115单克隆抗体特异性的鉴定 |
| 4.3.6 抗HCV C101-115单克隆抗体亚类测定和纯化 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间获奖情况 |
（5）HCV-F蛋白的原核表达以及对Th1/Th2型细胞因子的影响（论文提纲范文）
| 主要英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：HCV 1b-F 蛋白原核表达系统的构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：HCV1b-F 蛋白的纯化与鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分：HCV1b-F 蛋白作为抗原检测丙型病毒性肝炎患者血清抗体 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分：HCV1b-F 蛋白对 Th1/Th2 细胞因子的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠埃希菌中的表达及其纯化（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 一、主要实验仪器、材料和试剂 |
| 二、方法 |
| 1.HCV核心蛋白基因的扩增: |
| 2.HCV核心蛋白重组表达载体的构建: |
| 3.HCV核心融合蛋白的诱导表达: |
| 4.HCV核心融合蛋白的Western blot检测: |
| 5.HCV核心融合蛋白的大量获得: |
| 6.HCV核心融合蛋白的柱上复性和纯化: |
| 结 果 |
| 一、pET-32a (+) -HCV-Core基因的PCR扩增及质粒酶切鉴定结果 |
| 二、HCV-核心基因重组蛋白表达的SDS-PAGE分析 |
| 三、HCV核心基因重组蛋白表达的Western blot分析 |
| 四、HCV核心融合蛋白的柱上复性和纯化 |
| 讨 论 |
（8）HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要实验仪器、材料和试剂 |
| 1.2 HCBP12基因的扩增 |
| 1.3 HCBP12重组表达载体的构建 |
| 1.4 HCBP12融合蛋白的诱导表达 |
| 1.5 HCBP12融合蛋白的Western blot检测 |
| 1.6 HCBP12融合蛋白的大量制备 |
| 1.7 融合蛋白的柱上复性和纯化 |
| 1.8 兔抗HCBP12多克隆抗体的制备 |
| 1.9 多克隆抗体效价ELISA法分析 |
| 1.10 多克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 HCBP12基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 HCBP12重组表达载体的构建 |
| 2.3 HCBP12融合蛋白的检测 |
| 2.4 HCBP12融合蛋白的大量获得 |
| 2.5 HCBP12融合蛋白的柱上复性和纯化 |
| 2.6 多克隆抗体效价的ELISA法分析 |
| 2.7 多克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 3 讨论 |
（9）人类丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白12（HCBP12）的克隆表达与功能研究（论文提纲范文）
| 一、正文 |
| （一） 中文摘要 |
| （二） 英文摘要 |
| （三） 前言 |
| （四） 第一部分 HCBP12的克隆化与亚细胞定位 |
| （五） 第二部分 HCBP12重组蛋白的表达及多克隆抗体的制备 |
| （六） 第三部分 HCBP12相互作用蛋白的筛选 |
| （七） 结论 |
| （八） 参考文献 |
| 二、文献综述 |
| （一） 综述 |
| （二） 参考文献 |
| 三、致谢 |
（10）丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 文献回顾 |
| 1.HCV研究进展 |
| 2.HCV Core蛋白的研究进展 |
| 3.Core蛋白在诊断试剂中的应用 |
| 第二部分 实验部分 |
| (一) HCV Core蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定 |
| 1.材料与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 HB101感受态细胞的制备及冻存 |
| 2.2 表达载体pBVIL1-Core向HB101中转化 |
| 2.3 表达载体pBVIL1-Core在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.4 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.5 表达产物的可溶性分析 |
| 2.6 最适诱导时间筛选 |
| 2.7 表达产物的Western-blot鉴定 |
| 3.结果与讨论 |
| (二) HCV Core基因的克隆及在毕赤酵母中的表达 |
| 1.材料与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 PCR引物的设计 |
| 2.2 Core基因的扩增 |
| 2.3 毕赤酵母表达质粒pPICZaA-Core的构建 |
| 2.4 重组质粒的酶切鉴定及测序分析 |
| 2.5 pPICZaA-Core向毕赤酵母中转化 |
| 2.6 pPICZaA-Core在毕赤酵母中的诱导表达 |
| 2.7 pPICZaA-Core表达产物的Western-Blot分析 |
| 3.结果与讨论 |
| (三) 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、HIGN LEVEL EXPRESSION OF HEPATITIS C VIRUS CORE GENE IN E.COLI（论文参考文献）
- [1]双靶向病毒样颗粒递送系统的构建及其抗脑胶质瘤的研究[D]. 刘艳秀. 厦门大学, 2019(09)
- [2]肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究[D]. 霍春玲. 武汉大学, 2017(02)
- [3]新型干扰素λ嵌合体的设计和活性研究[D]. 于德彬. 吉林大学, 2016(08)
- [4]用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究[D]. 刘亚妮. 陕西师范大学, 2016(04)
- [5]HCV-F蛋白的原核表达以及对Th1/Th2型细胞因子的影响[D]. 余晓杰. 南京医科大学, 2013(12)
- [6]7株不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白的差异研究[J]. 汪明珊,颜学兵,周林福,李杨霞. 中国现代医生, 2012(33)
- [7]丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠埃希菌中的表达及其纯化[J]. 刘秀财,王克霞,成军,洪源,王琦,杜佳菊,季生吉. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2008(02)
- [8]HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备[J]. 李越,王琦,林原,成军,李康,李华. 中国临床药理学与治疗学, 2008(04)
- [9]人类丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白12（HCBP12）的克隆表达与功能研究[D]. 李越. 大连医科大学, 2007(02)
- [10]丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达[D]. 张敏睿. 西北大学, 2006(09)