一、多年生黑麦草种子愈伤组织诱导和植株再生（论文文献综述）
孙天晓[1]（2021）在《多年生黑麦草热激转录因子HSFAs和HSFCs亚家族基因的功能研究》文中认为多年生黑麦草（Lolium perenne）是一种品质优良的冷季型草坪草,被广泛应用于园林绿化、运动场地建植和生态治理中。多年生黑麦草对高温的耐受性差,在我国华中和华南地区夏季地上部分枯死,不能安全越夏,成为其推广应用的制约因素。热激转录因子（heat shock transcription factors,HSFs）在植物高温胁迫调控网络中起着重要作用。多年生黑麦草品种胁迫耐受性的自然变异和胁迫耐受机制一直是育种工作者的研究重点。本研究通过解析非生物胁迫下多年生黑麦草的生理和分子调控网络,聚焦HSFs在多年生黑麦草高温应答中的功能和调控机理,为培育抗高温的多年生黑麦草新种质提供理论基础和技术支持,以期部分解决多年生黑麦草的越夏问题。重要研究结果如下:（1）非生物胁迫下多年生黑麦草抗逆筛选和转录调控机制解析:鉴定了非生物胁迫下17个多年生黑麦草品种的抗性,并从生理生化和转录组水平解析多年生黑麦草在高温、干旱和低温胁迫下的调控机理。结果表明,17个多年生黑麦草品种在干旱、高温和低温胁迫下有着极为显着的差异。胁迫处理后,抗性品种的脯氨酸含量及抗氧化酶活性显着高于敏感品种。转录组学研究结果表明,三种胁迫共同诱导表达的基因主要涉及碳水化合物代谢、氧化戊糖磷酸酯、金属处理、激素代谢和脂质代谢途径。而干旱胁迫条件下,异源物降解、氮代谢、碳水化合物代谢和氧化戊糖磷酸酯等途径被显着性富集。高温条件下,四吡咯化合物合成、光合作用、多胺代谢、硫吸收和碳水化合物代谢等途径被显着性富集。而低温条件下,碳水化合物代谢、乙醛酸循环、异源物降解、多胺代谢和糖酵解等途径被显着性富集。基于多年生黑麦草的干旱、高温和低温胁迫后的转录组数据,构建多年生黑麦草非生物胁迫调控网络,并分析发现HSFs在非生物胁迫调控网络中起着重要作用。（2）LpHSFCs提高多年生黑麦草耐热性机制:从多年生黑麦草中克隆到受高温处理诱导表达的LpHSFC1b和LpHSFC2b,序列分析结果表明它们的氨基酸序列都具有DBD、OD和NLS结构域。亚细胞定位实验表明它们都定位在细胞核。在拟南芥中异源表达LpHSFC1b和LpHSFC2b可以显着性提高植物耐热性。高温胁迫下,LpHSFC1b和LpHSFC2b转基因拟南芥的电导率、丙二醛含量和叶片损伤指数显着低于野生型,而且热胁迫响应基因的表达量显着升高。（3）多年生黑麦草热激转录因子家族鉴定和表达分析:利用生物信息学手段从多年生黑麦草基因组和转录组数据中鉴定到17个LpHSFs,其中A、B、C亚家族分别有10、5、2个基因。通过与水稻同源基因氨基酸序列比对,构建系统进化树,对LpHSFs进行分类和命名。基因结构、蛋白保守结构域和启动子上顺式作用元件分析表明LpHSFs具有高度保守的结构域,尤其是在3个亚家族中,并且大多数LpHSFs含有多种激素和胁迫响应元件。互作网络分析表明,LpHSF基因主要与转录因子活性、DNA依赖性转录、信号传导、核苷酸结合、生物或非生物胁迫应答、RNA、植物激素代谢、信号和胁迫等有关。通过RNA-seq和q RT-PCR分析验证了LpHSFs的表达谱,表明LpHSFs可能对非生物胁迫至关重要,特别是热胁迫。这些结果表明LpHSFs基因对植物应对高温胁迫和生长发育至关重要。（4）LpHSFA3激活LpHSFA2增强多年生黑麦草耐热性机制:从多年生黑麦草叶片中克隆到受高温显着性诱导的LpHSFA3和LpHSFA2a。序列分析结果表明它们都具有HSF蛋白典型的保守结构域（DBD、OD、NLS、和AHA）。将LpHSFA3和LpHSFA2a分别转入拟南芥植株和多年生黑麦草的原生质体。高温胁迫下,LpHSFA3和LpHSFA2a转基因拟南芥植株的电导率显着低于对照,成活率显着高于对照,表明LpHSFA3和LpHSFA2a的异源表达可以显着性提高植物耐热性。在LpHSFA3和LpHSFA2a转基因拟南芥植物和多年生黑麦草原生质体中热激响应基因明显被激活。LpHSFA3和LpHSFA2a均定位于细胞核中,并起着转录因子的作用。LpHSFA3与LpHSFA2a启动子中的HSE区结合,并组成性激活LpHSFA2a的表达。这些结果表明,转录因子LpHSFA3通过LpHSFA2a正向调控植物耐热性,其为理解植物热胁迫反应的调控网络提供了新的证据。（5）多年生黑麦草的原生质体转化和遗传转化体系优化:以多年生黑麦草‘流星雨’品种的10-12 d幼苗叶片为材料,建立了一套高效的多年生黑麦草原生质体转化体系,并基于此体系建立了一套可以快速筛选确认高温胁迫候选基因的实验方案。此外,以5个多年生黑麦草品种的种子为材料,进行愈伤诱导率、增殖率、再生率和转化率筛选试验,初步建立了以多年生黑麦草‘流星雨’品种为材料的愈伤组织再生和遗传转化方案。上述结果表明,多年生黑麦草不同品种对非生物胁迫具有不同的耐受性。LpHSFs在非生物胁迫调控网络中起着重要调控作用。LpHSFA3可通过与LpHSFA2a启动子的结合,激活LpHSFA2a和下游热激相关基因的表达从而增强多年生黑麦草的抗热性。LpHSFC1b和LpHSFC2b也作为正调控因子,提高多年生黑麦草对高温的耐受性。相关研究阐述了多年生黑麦草应答高温胁迫的机制,同时对多年生黑麦草转化体系的优化,为通过生物技术培育多年生黑麦草新种质提供了技术支撑。
姜倩倩[2]（2020）在《多年生黑麦草LpCKX1基因CRISPR/Cas9靶向编辑载体的构建及遗传转化体系的建立》文中研究指明多年生黑麦草（Lolium perenne L.）是具有生长快、分蘖多、耐牧、成坪速度快等优点的高价值饲用牧草。但因其籽粒小、饱满度差,严重降低了种子收获指数和种子质量,是全球范围内长期制约规模化种子生产效率的重要因素。CRISPR/Cas9基因编辑技术能够实现对基因的定点编辑,可作为黑麦草通过基因工程手段进行种质创新的有力工具。然而,由于多年生黑麦草遗传转化体系尚不成熟且远远滞后于其他作物,为通过基因编辑对其进行定向改良带来困难。因此,建立高效遗传转化体系并通过CRISPR/Cas9技术对黑麦草种子产量潜力进行遗传改良,对于保证黑麦草种子生产和机械化收获均具有重要意义。本研究建立了新西兰多年生黑麦草品种NUI的愈伤组织诱导及再生体系,克隆了LpCKX1全长基因序列并构建了靶向LpCKX1的CRISPR/Cas9基因编辑载体。为验证编辑载体的效率,对黑麦草原生质体的制备及转化条件进行了优化。主要结果如下:1、多年生黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立采用多年生黑麦草NUI的成熟种子作外植体,建立了多年生黑麦草高效再生体系。其中横切种子处理在添加5 mg/L的2,4-D的诱导培养基上,愈伤组织诱导效果最好,可用作遗传转化的受体,而种子浸泡研磨处理诱导的愈伤组织却极易褐化且难以再生。愈伤组织在添加1 mg/L的6-BA的分化培养基上分化效果最好。2、多年生黑麦草LpCKX1基因序列的克隆提取多年生黑麦草NUI基因组DNA,根据实验室前期获得的LpCKX1基因片段序列设计PCR引物,分段克隆了LpCKX1基因序列,并通过序列拼接获得了LpCKX1基因全长序列。3、靶向LpCKX1基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建根据细胞分裂素氧化酶基因LpCKX1的基因组序列,在外显子区域选择符合载体构建的靶点,构建了5个靶向LpCKX1的CRISPR/Cas9编辑载体。4、多年生黑麦草原生质体制备及瞬时表达体系的建立通过设计正交实验对原生质体制备和转化条件进行优化,建立了原生质体制备及瞬时表达体系。最佳原生质体制备条件为纤维素酶浓度为1%、离析酶浓度为0.3%、甘露醇浓度为0.5 mol/L、酶解时间为4 h,最佳原生质体转化条件为原生质体浓度为2×106个/mL、质粒浓度为0.7μg/μL、转化时间为5 min、PEG4000浓度为40%。5、CRISPR/Cas9编辑载体活性检测将构建好的载体转入原生质体中进行瞬时表达,经T7核酸内切酶酶切验证靶向LpCKX1载体具有活性。Sanger测序结果表明其中一处靶点发生T-G替换突变。本研究结果不仅为深入开展多年生黑麦草的功能基因组学研究奠定了基础,对通过细胞融合和基因工程手段进行黑麦草种质创新方面也具有重要意义。
张睿[3]（2019）在《CRISPR/Cas9介导无外源DNA日本结缕草ZjSGR基因编辑技术研究》文中研究指明CRISPR/Cas9基因编辑技术自2013年问世以来,被广泛应用在多种动植物的基因敲除或敲入研究中,改良的CRISPR/Cas9 RNP（ribonucleoproteins）技术是一种无外源DNA的基因编辑技术,使用该方法获得的编辑植株最终无外源DNA的整合,成功避免了后代分离的复杂步骤,且更利于公众的接受;其还具有较低脱靶率的优势,因此在农作物的遗传改良应用中极具发展潜力。日本结缕草（Zoysia japonica Stued.）是我国极其宝贵的草种资源,拥有众多优良特性,但在北方绿期短的特点成为其大面积推广使用的主要限制因子,该试验拟通过构建CRISPR/Cas9 RNP编辑体系与结缕草遗传转化体系,改良结缕草持绿性状,为创制绿期延长性状的结缕草育种材料做尝试性研究,试验得到以下主要结果:1、进一步优化了结缕草成熟种子愈伤组织诱导方法。6-BA对结缕草种子发芽率及诱导率有抑制作用;α-酮戊二酸显着提高了发芽率与诱导率,且在0-1OOmg/L的范围内随着浓度的增加而升高;正交试验表明试验范围内1号培养基组合是使发芽率与诱导率最高的组合:即在MS培养基种添加1mg/L2,4-D、0.1mg/L6-BA、50mg/L α-酮戊二酸、2mg/LVB1与2.5mg/LCuSO4,使发芽率与诱导率分别达到86.67%与81.33%;且表明对发芽率影响作用的顺序为α-酮戊二酸>2,4-D>VB1>6-BA;对诱导率影响作用的顺序为2,4-D>a-酮戊二酸>VB1>6-BA;通过不同品种的比较试验得出“Compadre”品种的诱导率明显高于“Zenith”与“Chinese Common”,但“Zenith”状态较优。通过继代培养得到了大量的胚性愈伤组织,并可用于下一步试验。2、结缕草再生体系的研究结果表明,分化生芽的过程中会有异常分化情况的发生,具体表现为只有根状物长出而无芽原基形成。结果显示,0.2mg/L的6-BA对愈伤组织分化生根具有明显的促进作用。3、结缕草ZjSGR CRISPR/Cas9 RNP基因编辑体系各元件的构建和制备。以pHUN411gRNA-1、2、3为模板,根据ZjSGR基因设计特异性引物,反转录获得100ng/uL的三个sgRNA体外转录模板,通过T7体外转录并纯化最终获得三个靶位点的sgRNA浓度分别为3.4μg/μL、3.0μg/μL及3.8μg/μL,达到转化目标要求;将Cas9基因构建在原核表达载体pET-28a上,获得重组载体pET28a-cas9-His并通过大肠杆菌菌株BL21表达,纯化后获得Cas9蛋白终浓度为1μg/μL,Cas9蛋白的分子量约为200KDa。高质量sgRNA与Cas9蛋白的获得为成功建立起RNP编辑体系奠定基础。4、将sgRNA与Cas9蛋白在体外于Cas9蛋白反应缓冲液中预混,通过基因枪法将RNP导入结缕草“Chinese Common”品种胚性愈伤组织。由于此体系无选择标记基因可供大量筛选,因此验证ZjSGR基因的编辑效率工作量较大,该结果还需要进一步的研究。
陈林涛[4]（2018）在《紫花苜蓿与黑麦草转基因表达基因重组人血清白蛋白研究》文中研究表明人血清白蛋白（HSA）是人血浆中所含蛋白质的主要成分,除了维持血液渗透压、抗凝血和清除自由基的功能外,在临床上广泛用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综合症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂等。由于HSA治疗剂量大,且血液来源不足,导致产量无法满足市场需求。目前所建立的rHSA表达系统仍没有解决HSA来源短缺的问题,对此,本研究探索基因重组HSA的表达方式,通过对紫花苜蓿（Medicago SativaL.）和黑麦草（Lolium perenne L.）组织培养和植株再生条件的优化,分别建立了其遗传转化体系,通过农杆菌介导法将HSA基因分别导入紫花苜蓿和黑麦草中,经基因组PCR和Western blotting鉴定,获得了可表达rHSA的转基因紫花苜蓿株系和转基因黑麦草株系,为后续rHSA的分离纯化、理化性质分析和药理活性的鉴定奠定基础。取得的主要实验结果如下:1、根据人血清白蛋白基本序列构建植物表达载体,并通过电击法转化农杆菌菌株GV3101,经PCR鉴定获得阳性转基因工程菌GV3101-pCAMBIA1300-HSA。2、以人工选育的紫花苜蓿品种“游客”（Eureka）和“赛迪”（Sardi）的无菌子叶为外植体材料,进行遗传转化体系的建立,实验结果得出:（1）愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导最适培养基为MS基本培养基+ 2 mg/L 2,4-D + 0.2mg/L KT+2g/L 酪蛋白水解物,3%蔗糖,pH5.8;（2）分化诱导最适培养基为MS基本培养基+0.5 mg/L KT+2 g/L酪蛋白水解物,3%蔗糖,pH 5.8;（3）生根培养基为1/2 MS培养基,1.5%蔗糖,pH 5.8。3、以人工选育的黑麦草品种“特高”的种子为外植体,进行遗传转化体系的建立,实验结果得出:（1）愈伤组织诱导最适培养基为MS基本培养基+ 5 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L 6-BA+ 2 g/L酪蛋白水解物,3%蔗糖,pH 5.8;（2）胚性愈伤组织诱导最适培养基为MS基本培养基+ 3 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA +2g/L酪蛋白水解物,3%蔗糖,pH 5.8;（3）分化诱导最适培养基为MS基本培养基+ 2 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA+ 2 g/L酪蛋白水解物,3%蔗糖,pH5.8;（4）生根培养基为1/2 MS培养基+0.1 mg/L IBA,1.5%蔗糖,pH 5.8。4、对农杆菌转化过程中菌体浓度和浸染时间进行梯度实验,结果表明紫花苜蓿转化最佳条件为菌液浓度为OD600 = 0.6,浸染10 min;黑麦草转化最佳条件为菌液浓度为OD600 = 0.6,浸染5 min。5、通过农杆菌介导法分别对紫花苜蓿和黑麦草愈伤组织进行转化,诱导筛选获得阳性转化植株,经基因组PCR和Western blotting检测最终确定HSA基因成功转入相应的紫花苜蓿和黑麦草植株中。经确定,转基因赛迪株系获得96株,转基因游客获得165株,转基因黑麦草（特高）获得119株。
曾庆飞,韦鑫,陈锡,陈光洁,马培杰,吴佳海,王小利[5]（2017）在《多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立》文中认为对在贵州地区广泛种植的多花黑麦草特高（Lolium multiflorum‘Tetragold’）和多年生黑麦草四季（L.perenne‘Four seasons’）的成熟种子进行了愈伤组织诱导及植株再生的研究,建立了两个品种的胚性愈伤组织高频诱导与再生体系。结果表明,剥去成熟种子的颖壳,切除1/3胚乳端,将特高接种于CC+7mg·L-1 2,4-D+0.5mg·L-1 6-BA、四季接种于CC+5mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA的培养基中,在明显降低组培污染率的同时,能分别得到65.52%和63.55%的最高愈伤组织诱导率;将两个品种诱导出的愈伤组织转移在MS+0.5 mg·L-1 2,4-D+0.5mg·L-1 6-BA+1.25mg·L-1 CuSO4+1.0g·L-1 CH的继代培养基上,能促进质量较好的Ⅱ型胚性愈伤组织的形成;根据后续转化试验所选用的植物表达载体pCAMBIA 1300的抗性特点,3040mg·L-1的潮霉素是两个品种愈伤组织最佳的筛选剂和临界浓度;特高的胚性愈伤组织接种在MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA+0.1mg·L-1 TDZ的培养基上,可以产生86.37%的最高分化率,四季的胚性愈伤组织接种在MS+6.0 mg·L-1 6-BA+0.3mg·L-1 NAA+5.0mg·L-1 KT的培养基上,能得到85.40%的最高分化率;生根培养基1/2MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5mg·L-1 IAA能让两个品种分化出的不定芽形成100%的生根率;以腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1的混合材料作为营养土,能保证组培再生苗达到99%以上的成活率。优化建立的高频组培再生体系为下一步的遗传转化奠定了基础。
吴雪莉[6]（2017）在《超表达CdNF-YC和CdSAMDC提高海滨雀稗抗逆性研究》文中进行了进一步梳理海滨雀稗（Paspalums vaginatium O.Swartz）是一种重要的暖季型草坪草,具有优良的草坪性状,在我国长江以南地区的高尔夫球场被广泛应用。海滨雀稗作为盐土植物,能严格调节对钠的摄取量,是目前最耐盐的暖季型草坪草种。海滨雀稗对干旱和低温的耐受能力低于大多数暖季型草坪草,极大限制了它在我国北方干旱和半干旱盐渍土地区的推广种植。因此,亟需开展海滨雀稗的耐旱耐寒育种,培育耐旱耐低温的新种质。本研究以海滨雀稗为研究对象,首次建立了高效的农杆菌介导的遗传转化体系。通过农杆菌介导转化的方法,用含有Hpt标记基因和GUS报告基因的pCAMBIA1305.2载体,浸染海滨雀稗胚性愈伤组织。通过确定潮霉素最佳筛选压以及优化农杆菌转化方法,建立了高效稳定的遗传转化方法:菌液浓度OD600=0.6、添加100 μMAS、0.01%Silwet L-77、超声波处理5 min、真空处理20 min条件下,共培养2d,可以获得高的GUS瞬时转化效率。最高GUS瞬时转化效率可达98.8%,平均GUS瞬时转化效率87.1%。通过PCR、Southern blot检测证明T-DNA成功在海滨雀稗基因组中表达,平均转化效率为8%。我们利用农杆菌介导转化的方法,将狗牙根NF-YC整合到海滨雀稗基因组中,首次成功获得了表达CdNF-YC的转基因海滨雀稗新种质。与此同时,将狗牙根SAMDC基因和具有草铵膦抗性的bar基因同时整合到海滨雀稗基因组中,首次成功获得了具有除草剂抗性的表达CdSAMDC的转基因海滨雀稗新种质。通过PCR、Southern blot检测,证明T-DNA成功在海滨雀稗基因组中表达。通过qRT-PCR分析,转基因海滨雀稗中CdNF-YC的相对表达量显着高于野生型;在干旱、低温、盐处理条件下,转基因海滨雀稗中CdSAMDC的相对表达量显着高于野生型。过表达bar基因的转基因海滨雀稗具有明显的BASTA除草剂抗性。NF-YC核转录因子通过与其他调控因子相互作用,激活或抑制下游基因的表达,参与调控逆境应答。干旱条件下,表达CdNF-YC的转基因海滨雀稗株系具有显着更低的相对电导率,显着更高的叶片相对含水量以及复水后存活率,耐旱性显着提高。过表达CdNF-YC的转基因海滨雀稗对高盐的耐受力也进一步提高。在高盐胁迫条件下,表达CdNF-YC海滨雀稗株系具有显着更低的叶片枯黄率,保持了显着更高的叶片含水量、根系重量、光系统Ⅱ最大光化学效率和叶绿素含量。在高盐条件下,转基因海滨雀稗通过保持体内更低的Na+含量,和更高的K+含量以及K+/Na+比,从而显着提高了耐盐性。在干旱、盐胁迫条件下,转基因海滨雀稗中CdNF-YC基因激活胁迫响 应 基因 PvDREB2A、PvDREB1B、PvLEA3、PvP5CS1、PvABI 的表达,相对表达量均显着高于野生型。ABA处理,显着提高了PvLEA3、PvP5CS1、PvABI基因的相对表达量,且转基因株系显着高于野生型;而PvDREB2A、PvDREB1B的诱导表达量变化较小。SAMDC基因通过调节海滨雀稗体内不同形态、不同种类的多胺合成与代谢,调控对不同逆境的应答反应。干旱胁迫下,表达CdSAMDC转基因海滨雀稗具有更低的相对电导率,更高的相对含水量和复水后存活率,并显着高于野生型,获得了更高的耐旱能力。转基因株系的游离态的腐胺Put、亚精胺Spd含量显着高于野生型;而结合态、束缚态及精胺Spm含量虽升高,但差异不显着。表达CdSAMDC转基因海滨雀稗的低温耐受能力显着提高,具有显着低于野生型的低温半致死温度;低温处理后的存活率显着高于野生型。低温胁迫条件下,转基因株系3种形态的腐胺Put含量均显着高于野生型。游离态亚精胺无显着差异,而结合态、束缚态的亚精胺Spd含量显着低于野生型。游离态精胺Spm显着高于野生型;结合态、束缚态精胺Spm稍高于野生型。与此同时,表达CdSAMDC转基因株系的耐盐性也得到进一步的提高。在高盐胁迫下,转基因海滨雀稗具有显着更高的光合作用能力、K+含量、K+/Na+比。转基因株系中游离态的腐胺Put、精胺Spm含量,显着高于野生型;游离态亚精胺Spd含量显着低于野生型;束缚态多胺差异均不显着。CdSAMDC基因通过调控体内多胺代谢,显着提高了转基因株系体内GABA含量,参与海滨雀稗对干旱、低温、盐的抵御过程。本研究首次建立了海滨雀稗稳定的农杆菌转化体系,同时获得了表达CdNF-YC和CdSAMDC的转基因新种质,显着提高了海滨雀稗的耐旱性、耐寒性、耐盐性,以及除草剂的抗性。
代小梅,孙振元,韩蕾,巨关升[7]（2015）在《多年生黑麦草愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应》文中指出为了优化多年生黑麦草愈伤组织诱导培养条件,以多年生黑麦草成熟种子为材料,研究浸泡、研磨和接种方式等因素对愈伤组织诱导率和出愈时间的影响,以及不同浓度的柠檬酸对其愈伤组织褐化的抑制效果。结果显示,浸泡48h处理有利于种子愈伤组织诱导,随着浸泡时间延长,愈伤组织诱导率逐渐下降,且出愈时间推迟。在浸泡48h处理下,研磨处理的种子愈伤组织诱导率显着高于未研磨处理的种子,随机接种的种子愈伤组织诱导率显着高于机械接种的种子;经研磨处理的种子以随机接种方式接种于愈伤组织诱导培养基上,培养3d后即出现愈伤组织,1421d后愈伤组织发生达到高峰期,2130d后胚性愈伤组织大量形成,愈伤组织诱导率高达90%。此外,研究表明,在愈伤组织的继代培养中,对愈伤组织褐化抑制效果较好的柠檬酸浓度是2mg·L-1,培养2周的褐化率为15%,而随柠檬酸浓度升高,褐化率逐渐增加,而未添加柠檬酸的愈伤褐化率为50%。经试验观察发现2mg·L-1柠檬酸对愈伤组织的增殖和分化再生无明显影响,胚性愈伤组织分化率为70%,生根率100%。本研究建立的多年生黑麦草的高效再生体系,不仅有利于其基因工程改造,也为其愈伤组织再生体系研究奠定了科学基础。
文沛玲,瞿杨,叶光明,杨秉健,杜小姣[8]（2014）在《不同浓度6-BA对黑麦草种子出愈率的影响》文中进行了进一步梳理研究了不同浓度6-BA对多年生黑麦草4个品种夜影、蒙特利Ⅲ、高帽和德比极品的种子愈伤组织诱导率的影响。结果表明,在一定的浓度范围内,6-BA能够提高多年生黑麦草愈伤组织的出愈率,但随着浓度的增加反而会降低黑麦草愈伤组织的出愈率。夜影品种愈伤组织诱导的浓度为0.1、0.3mg/L;诱导德比极品品种愈伤组织的浓度为0.2、0.3mg/L都适宜;诱导蒙特利Ⅲ品种成熟种子愈伤组织的浓度以0.1mg/L为佳;高帽品种成熟种子诱导愈伤组织的浓度为0.1、0.2mg/L。
王宇[9]（2014）在《几种牧草再生体系和遗传转化体系的优化》文中研究说明紫花苜蓿（Medicago sativa）是一种优质的豆科牧草,在我国已有两千多年的栽培历史,由于其具有适口性强、营养丰富、产草量高等优点,素有“牧草之王”的美誉。苜蓿在畜牧业中占有很重要的地位,利用基因工程技术来提高苜蓿的抗逆性及改良其品质,期望获得优良新品系,这对我国畜牧业的发展有着极其重要的现实意义。老芒麦（Elymus sibiricus）和垂穗披碱草（E. nutans）都是禾本科披碱草属多年生草本植物,具有对土壤要求低、抗寒、抗旱和耐盐碱等特性,是具有较高经济价值的栽培牧草。利用基因工程技术来培育能够满足不同生产需求的优质牧草,对推动我国畜牧业的发展具有重要意义。然而目前关于老芒麦和垂穗披碱草组织培养的有关报道较少,其组培再生体系的建立还处于探索阶段。本研究借鉴了多年生黑麦草（Lolium perenne）、高羊茅（Festuca arundinacea）和羊草（Leymus chinensis）等重要牧草组织培养的有关文献资料,以老芒麦和垂穗披碱草幼穗为外植体初步建立了两种牧草的组织培养再生体系。1.紫花苜蓿再生体系的建立及GUS基因转化的研究本研究以紫花苜蓿“中苜1号”作为转化受体,在以子叶为外植体转化苜蓿的过程中,建立了紫花苜蓿组织培养再生体系,为苜蓿转基因研究工作打下了良好的基础。在此基础上,将报告基因GUS通过农杆菌的介导,转化到“中苜1号”中,得到了疑似Kan抗性植株。主要研究内容如下：1)再生体系的研究。分别以子叶和下胚轴作为外植体,通过实验比较发现,两种外植体的愈伤诱导率都比较高,但是子叶的分化能力较好,更适合作为转化受体；选择UM+2.0mg/L2,4-D+0.25mg/L KT为最佳愈伤诱导培养基；UM+2.0mg/L KT作为最佳愈伤分化培养基；1/2MSo作为最佳生根培养基。2)根癌农杆菌介导的GUS基因转化“中苜1号”遗传转化体系的建立。将苜蓿6日龄幼苗子叶外植体预培养3d,将其浸入OD600值为0.5的农杆菌中振荡侵染10min,共培养3d,之后转入含有500mg/L Cef抗生素的培养基上进行除菌培养（每继代一次将Cef浓度降低100mg/L）,待胚性愈伤形成后将其转入含有50mg/L Kan培养基上进行筛选培养,最后在1/2MSo培养基上生根成苗。3)转化再生苜蓿的获得及PCR鉴定。经筛选,得到26株疑似Kan抗性植株,经PCR检测,全部表现为假阳性。2.老芒麦、垂穗披碱草组织培养再生体系的研究在本研究中,以老芒麦和垂穗披碱草的2-3mm幼穗切段为外植体,初步筛选出最佳的老芒麦幼穗的愈伤诱导培养基为MS+2.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,最适于垂穗披碱草幼穗的愈伤诱导培养基为MS+3.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂；最佳诱导二者愈伤分化的培养基为MS+1.0mg/L KT+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂；对于植株非常有效的生根培养基为1/2MS。最终得到老芒麦再生植株10株和垂穗披碱草再生植株2株。
李蔚,张娜,李仁,赵冰,郭仰东[10]（2012）在《多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化》文中提出以多年生黑麦草（Lolium perenne L.）成熟种子作为外植体,建立其高频再生体系,通过农杆菌介导法将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因转入,为多年生黑麦草的抗逆转基因工作奠定基础。结果表明:种子充分灭菌后在附加6.0mg·L-1 2,4-D的培养基中诱导愈伤组织,诱导率可达61.33%。愈伤组织在2,4-D浓度减半的培养基上继代培养长势良好,分化培养基为MS培养基附加1.0mg·L-16-BA,分化率最高达到61.33%,在1/2MS+0.5mg·L-1 NAA培养基中进行生根培养,生根率达100%。以该再生体系为基础,将获得的愈伤组织作为外植体进行遗传转化,经筛选培养后得到再生植株,通过PCR及实时荧光定量（Real-Time）PCR验证表明PEPC基因已成功转入,转化率为8.67%。试验结果将为多年生黑麦草抗性品种的研究奠定基础。
二、多年生黑麦草种子愈伤组织诱导和植株再生（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、多年生黑麦草种子愈伤组织诱导和植株再生（论文提纲范文）
（1）多年生黑麦草热激转录因子HSFAs和HSFCs亚家族基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略名词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 研究问题的由来 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 植物高温胁迫响应机理的研究进展 |
| 2.1.1 植物高温胁迫信号 |
| 2.1.2 植物高温胁迫响应的转录调控网络 |
| 2.1.3 转录后调控在植物高温胁迫响应中的作用 |
| 2.1.4 表观调控在植物高温胁迫响应中的作用 |
| 2.1.5 高温胁迫下植物的生理变化 |
| 2.2 植物热激转录因子在非生物胁迫响应中的研究进展 |
| 2.2.1 植物热激转录因子的结构和分类 |
| 2.2.2 植物热激转录因子调控各种非生物胁迫 |
| 2.2.3 植物HSFs的调控网络 |
| 2.3 多年生黑麦草的研究进展 |
| 2.3.1 多年生黑麦草基因组研究进展 |
| 2.3.2 多年生黑麦草高温胁迫研究进展 |
| 2.3.3 多年生黑麦草其它非生物胁迫研究进展 |
| 2.3.4 多年生黑麦草遗传转化研究进展 |
| 3 技术路线与研究目的和意义 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 研究目的和意义 |
| 第二章 非生物胁迫下多年生黑麦草生理和转录水平的变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 植物材料和生长条件 |
| 2.2 植物非生物胁迫处理和实验设计 |
| 2.2.1 多年生黑麦草非生物胁迫抗性筛选 |
| 2.2.2 生理指标分析 |
| 2.2.3 非生物胁迫的转录组样品处理 |
| 2.3 电导率和丙二醛的测定 |
| 2.4 脯氨酸、可溶性糖和抗氧化酶酶活检测 |
| 2.5 转录组测序和分析 |
| 2.6 聚类和蛋白互作网络分析 |
| 2.7 GO和 MapMAN富集分析 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 多年生黑麦草品种的非生物胁迫抗性筛选 |
| 3.2 非生物胁迫下多年生黑麦草中渗透调节剂的含量变化 |
| 3.3 非生物胁迫下多年生黑麦草中抗氧化酶的活性变化 |
| 3.4 非生物胁迫下多年生黑麦草的转录组分析 |
| 3.5 GO和 MapMAN富集分析 |
| 3.6 非生物胁迫下多年生黑麦草中共同调控和特异调控基因分析 |
| 3.7 非生物胁迫下多年生黑麦草中转录因子分析 |
| 3.8 非生物胁迫下多年生黑麦草中共同调控基因的蛋白互作网络分析 |
| 3.9 非生物胁迫下多年生黑麦草中HSFs和HSPs家族基因分析 |
| 3.10 非生物胁迫下多年生黑麦草中DREB/CBF途径相关基因分析 |
| 3.11 非生物胁迫下多年生黑麦草中ABA信号途径相关基因分析 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 多年生黑麦草LpHSFCs正向调控植物耐热性 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 植物材料和生长条件 |
| 2.2 基因序列比对和进化分析 |
| 2.3 LpHSFC1b和LpHSFC2b亚细胞定位分析 |
| 2.4 LpHSFC1b和LpHSFC2b基因转化拟南芥 |
| 2.5 植物非生物胁迫处理和实验设计 |
| 2.6 电导率和丙二醛的测定 |
| 2.7 叶片坏死程度指数 |
| 2.8 qRT-PCR分析 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 多年生黑麦草LpHSFC1b和LpHSFC2b基因分离以及序列特征和进化树分析 |
| 3.2 LpHSFC1b和LpHSFC2b亚细胞定位 |
| 3.3 LpHSFC1b和LpHSFC2b被高温诱导 |
| 3.4 LpHSFC1b和LpHSFC2b转基因拟南芥增强植物耐热性 |
| 3.5 LpHSFC1b和LpHSFC2b转基因拟南芥中HSRs基因变化 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 多年生黑麦草热激转录因子家族基因鉴定和表达分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 多年生黑麦草中HSF基因的鉴定 |
| 2.2 进化树分析和分类 |
| 2.3 基因结构、保守结构域和顺式作用元件分析 |
| 2.4 互作网络分析 |
| 2.5 非生物胁迫下LpHSFs基因的表达水平分析 |
| 2.6 植物材料、生长条件和高温处理 |
| 2.7 RNA提取和qRT-PCR分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 多年生黑麦草中LpHSFs家族基因的鉴定 |
| 3.2 多年生黑麦草中LpHSFs家族基因进化树分析和分类 |
| 3.3 多年生黑麦草LpHSFs保守结构域、基因结构和启动子中顺式作用元件分析 |
| 3.4 多年生黑麦草LpHSFs基因的调控网络 |
| 3.5 非生物胁迫下多年生黑麦草LpHSFs基因的表达谱 |
| 3.6 高温胁迫下多年生黑麦草LpHSFs基因的表达谱 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 多年生黑麦草LpHSFA3 通过LpHSFA2a正向调控植物耐热性 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 植物材料和生长条件 |
| 2.2 LpHSFA3和LpHSFA2a基因CDS的克隆和分析 |
| 2.3 其它LpHSFAs基因CDS的克隆 |
| 2.4 LpHSFA3和LpHSFA2a的亚细胞定位 |
| 2.5 LpHSFA3 的转录激活实验 |
| 2.6 多年生黑麦草LpHSFA3和LpHSFA2a的高温表达谱 |
| 2.7 拟南芥转化 |
| 2.8 LpHSFA3和LpHSFA2a转基因拟南芥高温处理 |
| 2.9 生理指标测定 |
| 2.10 RNA提取和qRT-PCR分析 |
| 2.11 凝胶电泳迁移实验(EMSA) |
| 2.12 双荧光素酶活实验 |
| 2.13 多年生黑麦草原生质体的分离和转化 |
| 2.13.1 多年生黑麦草原生质体分离和转化所需试剂和配方 |
| 2.13.2 多年生黑麦草原生质体的分离和转化 |
| 2.13.3 多年生黑麦草原生质体高温实验 |
| 2.14 多年生黑麦草愈伤诱导和农杆菌介导的遗传转化 |
| 2.14.1 多年生黑麦草愈伤诱导和转化所需试剂和配方 |
| 2.14.2 多年生黑麦草愈伤诱导和继代 |
| 2.14.3 载体构建和农杆菌准备 |
| 2.14.4 农杆菌介导的多年生黑麦草愈伤转化 |
| 2.14.5 多年生黑麦草转基因阳性苗鉴定 |
| 2.15 多年生黑麦草转基因材料抗性分析 |
| 2.15.1 RNA提取和基因表达分析 |
| 2.15.2 转基因材料抗性分析 |
| 2.16 统计分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 LpHSFA3 序列特征和进化树分析 |
| 3.2 LpHSFA3 亚细胞定位 |
| 3.3 LpHSFA3 是一个转录因子 |
| 3.4 高温诱导LpHSFA3 基因的表达 |
| 3.5 LpHSFA3 转基因拟南芥增强植物耐热性 |
| 3.6 LpHSFA3 转基因拟南芥中HSRs基因变化 |
| 3.7 LpHSFA3 结合LpHSFA2a启动子促进其表达 |
| 3.8 LpHSFA1、LpHSFA2a和 LpHSFA4d激活LpHSFA2a的表达 |
| 3.9 LpHSFA2a转基因拟南芥增强植物耐热性 |
| 3.10 LpHSFA2a转基因拟南芥中HSRs基因变化 |
| 3.11 LpHSFA3和LpHSFA2a增加多年生黑麦草原生质体抗热性 |
| 3.12 多年生黑麦草原生质体分离和转化体系 |
| 3.13 多年生黑麦草的遗传转化体系 |
| 3.14 多年生黑麦草LpHSFA3和LpHSFA2a本源转化和表型 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多年生黑麦草中LpHSFA3 的分离和生物学功能分析 |
| 4.2 LpHSFA3 正向调控植物耐热性 |
| 4.3 LpHSFA2a正向调控植物耐热性 |
| 4.4 LpHSFA3和LpHSFA2a调控靶基因差异 |
| 4.5 其他LpHSFAs调控LpHSFA2a的表达 |
| 4.6 多年生黑麦草中高效的原生质体转化体系 |
| 4.7 多年生黑麦草愈伤诱导和遗传转化体系 |
| 5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 附表 |
| 附录Ⅱ 部分实验的详细操作方法 |
| 附录Ⅲ 作者简介 |
| 致谢 |
（2）多年生黑麦草LpCKX1基因CRISPR/Cas9靶向编辑载体的构建及遗传转化体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 多年生黑麦草育种现状及存在的问题 |
| 1.2 多年生黑麦草再生体系的研究进展 |
| 1.2.1 胚性愈伤组织培养 |
| 1.2.2 悬浮细胞培养 |
| 1.2.3 原生质体培养 |
| 1.2.4 茎尖分生组织培养 |
| 1.2.5 花药培养 |
| 1.3 基因编辑技术在植物育种中的应用 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的原理及基本结构 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在植物中的应用 |
| 1.4 原生质体制备与瞬时转化体系 |
| 1.4.1 原生质体制备的影响因素 |
| 1.4.2 原生质体瞬时表达体系在植物研究中的应用 |
| 1.5 细胞分裂素氧化酶的研究进展 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植株材料 |
| 2.1.2 培养基的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黑麦草种子去颖壳处理 |
| 2.2.2 黑麦草种子的消毒 |
| 2.2.3 黑麦草愈伤组织的诱导与继代 |
| 2.2.4 胚性愈伤组织的继代培养 |
| 2.2.5 黑麦草愈伤组织的再分化 |
| 2.2.6 炼苗和移栽 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同浓度的2,4-D对黑麦草愈伤组织的诱导的影响 |
| 2.3.2 不同外植体处理方法对愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3.3 不同浓度的6-BA对愈伤组织分化的影响 |
| 2.3.4 再生植株的生根和移栽 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 靶向黑麦草LpCKX1 基因CRISPR/Cas9 表达载体的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植株材料 |
| 3.1.2 菌种及载体 |
| 3.1.3 实验试剂及培养基配制 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 黑麦草LpCKX1基因的克隆 |
| 3.2.2 分两段克隆NUI黑麦草LpCKX1 的基因全长序列 |
| 3.2.3 靶向LpCKX1 基因sgRNA载体的构建 |
| 3.2.4 靶向LpCKX1 基因CRISPR/Cas9 植物表达载体的构建 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 黑麦草LpCKX1基因全长序列 |
| 3.3.2 靶向LpCKX1 基因sgRNA载体的构建 |
| 3.3.3 黑麦草LpCKX1 基因的CRISPR/Cas9 靶向编辑载体的构建 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 黑麦草原生质体分离及瞬时表达体系的建立与编辑靶点效率的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植株材料 |
| 4.1.2 菌种及载体 |
| 4.1.3 实验仪器与试剂 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 植株培养 |
| 4.2.2 pAN580-GFP质粒的扩繁与提取 |
| 4.2.3 黑麦草原生质体的制备及条件优化 |
| 4.2.4 黑麦草原生质体计数及活力测定 |
| 4.2.5 黑麦草原生质体的转化及条件优化 |
| 4.2.6 原生质体转化效率的测定 |
| 4.2.7 靶向黑麦草LpCKX1 基因sgRNA载体转化原生质体 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 黑麦草原生质体最佳分离条件的确定 |
| 4.3.2 黑麦草原生质体最佳转化条件的确定 |
| 4.3.3 靶向黑麦草LpCKX1 基因sgRNA载体活性和编辑效率的验证 |
| 4.4 讨论 |
| 结论及主要创新点 |
| 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（3）CRISPR/Cas9介导无外源DNA日本结缕草ZjSGR基因编辑技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 1 引言 |
| 1.1 结缕草简介 |
| 1.2 我国草坪草转基因技术育种进展 |
| 1.3 结缕草属植物育种进展 |
| 1.3.1 结缕草常规育种国内外进展 |
| 1.3.2 延长结缕草绿期研究 |
| 1.3.3 结缕草生物技术育种研究 |
| 1.4 植物滞绿基因SGR与ZjSGR研究 |
| 1.4.1 植物滞绿基因SGR功能及滞绿突变 |
| 1.4.2 ZjSGR对植物持绿性的调控 |
| 1.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术简介 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的来源与发展 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的结构与作用机理 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用 |
| 1.6 转基因育种的潜在局限 |
| 1.7 CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的基因编辑技术 |
| 1.7.1 RNP基因编辑技术 |
| 1.7.2 RNP技术的应用 |
| 1.8 试验研究目的及意义 |
| 2 日本结缕草再生体系构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 植物材料预处理 |
| 2.2.2 试验设计 |
| 2.2.3 培养基的制备 |
| 2.2.4 培养方法 |
| 2.2.5 数据统计与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 添加6-BA对结缕草成熟种子发芽率及愈伤组织诱导率的影响 |
| 2.3.2 添加α-酮戊二酸对结缕草种子发芽率及愈伤组织诱导率的影响 |
| 2.3.3 正交试验结果分析 |
| 2.3.4 不同基因型结缕草种子发芽率与诱导率的差异 |
| 2.3.5 愈伤组织生芽培养 |
| 2.4 讨论 |
| 3 CRISPR/Cas9核糖核蛋白基因编辑体系构建 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 生化试剂 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 敲除靶位点的选择设计 |
| 3.2.2 体外转录模板的获得 |
| 3.2.3 含有ZjSGR靶位点sgRNA的体外转录 |
| 3.2.4 sgRNA纯化 |
| 3.2.5 Cas9蛋白表达 |
| 3.2.6 Cas9蛋白纯化 |
| 3.2.7 Cas9蛋白浓度检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 靶位点的选择设计 |
| 3.3.2 体外转录模板获得 |
| 3.3.3 sgRNA的转录与纯化 |
| 3.3.4 Cas9蛋白的表达与纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 4 基因枪介导的RNP导入 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 RNP复合体体外制备 |
| 4.2.2 基因枪的操作 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 附录D |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（4）紫花苜蓿与黑麦草转基因表达基因重组人血清白蛋白研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 人血清白蛋白的结构与功能 |
| 1.1 人血清白蛋白理化性质 |
| 1.2 人血清白蛋白的功能与应用 |
| 1.3 人血清白蛋白的经济价值 |
| 2 基因重组人血清白蛋白的研究进展 |
| 2.1 rHSA在原核表达系统中的表达 |
| 2.2 rHSA在酵母表达系统中的表达 |
| 2.3 转基因动物表达 |
| 2.4 转基因植物表达 |
| 3 紫花苜蓿遗传转化的研究进展 |
| 4 黑麦草遗传转化的研究进展 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 紫花苜蓿遗传转化体系的构建及转基因植株的获得 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株及质粒 |
| 1.1.3 实验主要试剂 |
| 1.1.4 常用试剂的配置 |
| 1.1.5 培养基 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 载体构建 |
| 1.2.2 转基因工程菌的构建 |
| 1.2.3 紫花苜蓿遗传转化体系的构建 |
| 1.2.4 转化基因重组人血清白蛋白基因的再生植株的获得 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 rHSA植物表达载体的构建 |
| 2.2 转基因工程菌的筛选与鉴定 |
| 2.3 不同激素浓度对紫花苜蓿再生体系建立的影响 |
| 2.3.1 不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3.2 不同浓度的细胞分裂素对愈伤组织分化的影响 |
| 2.4 农杆菌浸染时间和菌液浓度对愈伤转化的影响 |
| 2.5 抗性植株的再生 |
| 2.6 转基因植株的鉴定 |
| 2.6.1 基因组DNA分子检测 |
| 2.6.2 蛋白质水平检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外植体的选择与植物激素对紫花苜蓿组织培养的影响 |
| 3.2 影响基因转化效率的因素 |
| 3.3 影响外源蛋白在紫花苜蓿中表达的因素 |
| 第三章 黑麦草遗传转化体系的构建及转基因植株的获得 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株及质粒 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 黑麦草遗传转化体系的构建 |
| 1.2.2 转化基因重组人血清白蛋白基因的再生植株的获得 |
| 1.2.3 转基因植株的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 植物激素浓度对愈伤组织形成的影响 |
| 2.2 植物激素浓度对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3 植物激素浓度对愈伤组织分化的影响 |
| 2.4 农杆菌浓度与浸染时间对愈伤转化的影响 |
| 2.5 黑麦草遗传转化与植株再生 |
| 2.6 转基因黑麦草的鉴定 |
| 2.6.1 基因组DNA分子检测 |
| 2.6.2 蛋白质水平检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 影响黑麦草再生体系建立的因素 |
| 3.2 影响黑麦草愈伤组织转化的因素 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 外植体的前处理 |
| 1.2.2 外植体的消毒预处理 |
| 1.2.3 培养基 |
| 1.2.4 愈伤组织的诱导及继代培养 |
| 1.2.5 抗生素临界浓度的确定 |
| 1.2.6 愈伤组织分化与植株再生 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同外植体处理方式对愈伤组织诱导的影响 |
| 2.1.1 不同前处理方式对外植体污染率的影响 |
| 2.1.2 不同种子处理方式对愈伤组织诱导频率的影响 |
| 2.2 培养基、激素浓度对愈伤组织诱导频率的影响 |
| 2.2.1 不同基本培养基的愈伤组织诱导率 |
| 2.2.2 2, 4-D与6-BA浓度对愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.3 不同激素浓度组合对愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3 培养基成分对愈伤组织继代培养的影响 |
| 2.4 抗生素临界浓度的确定 |
| 2.5 不同激素和激素组合对愈伤组织分化不定芽的影响 |
| 2.6 再生植株的获得 |
| 3 讨论与结论 |
（6）超表达CdNF-YC和CdSAMDC提高海滨雀稗抗逆性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 海滨雀稗抗逆性研究进展 |
| 1.1 海滨雀稗的耐盐性研究 |
| 1.1.1 海滨雀稗对盐胁迫的形态学反应 |
| 1.1.2 海滨雀稗耐盐性机理研究 |
| 1.1.3 海滨雀稗耐盐性评价 |
| 1.2 海滨雀稗的耐旱性研究 |
| 1.2.1 海滨雀稗对干旱胁迫的形态学响应 |
| 1.2.2 海滨雀稗耐旱性评价 |
| 1.3 海滨雀稗耐寒性 |
| 1.3.1 海滨雀稗对低温胁迫的生理生化反应 |
| 1.3.2 海滨雀稗耐寒性评价 |
| 2 NF-Y转录因子与植物耐逆性 |
| 2.1 植物转录因子概述 |
| 2.2 NF-Y转录因子参与植物逆境响应 |
| 3 多胺与植物抗逆性 |
| 3.1 多胺代谢参与植物逆境响应 |
| 3.2 SAMDC基因与植物抗逆性 |
| 3.3 多胺代谢与GABA的生物学功能 |
| 4 禾本科草的转基因育种研究进展 |
| 4.1 植物转基因研究概况 |
| 4.2 农杆菌介导的禾本科草的转化研究进展 |
| 5 研究的目的和意义 |
| 第二章 海滨雀稗遗传转化体系的建立 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 菌株、质粒、引物 |
| 2.3 工具酶及主要试剂 |
| 2.4 外植体的消毒、接种 |
| 2.5 离体再生培养基 |
| 2.6 诱导并继代胚性愈伤组织 |
| 2.7 不同基因型的愈伤组织对再生率的影响 |
| 2.8 不同培养基对的再生率的影响 |
| 2.9 农杆菌的培养方法 |
| 2.10 农杆菌侵染过程 |
| 2.11 潮霉素筛选压的选择 |
| 2.12 优化农杆菌介导的遗传转化条件 |
| 2.13 抗性愈伤组织筛选与再生 |
| 2.14 GUS基因瞬时、稳定表达染色 |
| 2.15 GUS表达效率和转化效率的统计 |
| 2.16 抗性植株PCR检测 |
| 2.17 Southern blot检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 建立高效的离体再生体系 |
| 3.2 潮霉素筛选压的确定 |
| 3.3 转化条件的优化 |
| 3.4 农杆菌介导的转化体系的建立 |
| 3.5 GUS表达效率与转化效率统计 |
| 3.6 抗性再生植株的分子检测与表型鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 外植体基因型和培养基对愈伤组织诱导、再生的影响 |
| 4.2 潮霉素浓度对遗传转化的影响 |
| 4.3 乙酰丁香酮对遗传转化的影响 |
| 4.4 共培养时间对遗传转化的影响 |
| 4.5 菌液浓度对遗传转化的影响 |
| 4.6 表面活性剂对遗传转化的影响 |
| 4.7 超声波及真空处理对遗传转化的影响 |
| 第三章 表达CdNF-YC和CdSAMDC转基因海滨雀稗的鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 菌株、质粒、引物 |
| 2.3 植物材料养护管理 |
| 2.4 除草剂抗性鉴定 |
| 2.5 质粒提取 |
| 2.6 酶切鉴定 |
| 2.7 PCR产物回收纯化 |
| 2.8 目的片段和目的载体的连接 |
| 2.9 转化大肠杆菌感受态及阳性克隆筛选 |
| 2.10 农杆菌EHA105电激感受态细胞的制备 |
| 2.11 电激转化农杆菌及阳性克隆筛选 |
| 2.12 抗性植株PCR检测 |
| 2.13 Southern blot检测 |
| 2.14 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 获得转基因抗性再生植株 |
| 3.2 PCR鉴定 |
| 3.3 Southern blot鉴定 |
| 3.4 除草剂抗性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 获得表达CdNF-YC转基因海滨雀稗新种质 |
| 4.2 获得表达CdSAMDC转基因海滨雀稗新种质 |
| 4.3 获得抗除草剂转基因海滨雀稗新种质 |
| 第四章 表达CdNF-YC海滨雀稗的耐逆性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料处理 |
| 2.2 实时定量PCR引物 |
| 2.3 植物总RNA提取 |
| 2.4 RNA样品检测 |
| 2.5 第一链cDNA的合成 |
| 2.6 实时定量PCR |
| 2.7 相对电导率 |
| 2.8 叶片相对含水量 |
| 2.9 复水后存活率 |
| 2.10 叶片枯黄率 |
| 2.11 地下部生物量 |
| 2.12 最大光化学效率 |
| 2.13 叶绿素含量 |
| 2.14 离子含量测定 |
| 2.15 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转基因海滨雀稗的基因表达量分析 |
| 3.1.1 转基因海滨雀稗的CdNF-YC和Hpt表达 |
| 3.1.2 CdNF-YC调控海滨雀稗相关胁迫基因的表达 |
| 3.2 转基因海滨雀稗的耐旱性分析 |
| 3.3 转基因海滨雀稗的耐盐性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达CdNF-YC基因调控胁迫相关基因的表达 |
| 4.2 表达CdNF-YC提高海滨雀稗的耐旱性 |
| 4.3 表达CdNF-YC提高海滨雀稗的耐盐性 |
| 第五章 表达CdSAMDC海滨雀稗的耐逆性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料处理 |
| 2.2 实时定量PCR引物 |
| 2.3 植物总RNA提取 |
| 2.4 RNA样品检测 |
| 2.5 第一链cDNA的合成 |
| 2.6 实时定量PCR |
| 2.7 叶片中多胺含量的测定 |
| 2.8 相对电导率 |
| 2.9 叶片相对含水量 |
| 2.10 复水后存活率 |
| 2.11 叶片枯黄率 |
| 2.12 地下部生物量 |
| 2.13 最大光化学效率 |
| 2.14 叶绿素含量 |
| 2.15 离子含量测定 |
| 2.16 半致死温度的测定 |
| 2.17 低温存活率 |
| 2.18 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转基因海滨雀稗的SAMDC表达量分析 |
| 3.2 转基因海滨雀稗内源多胺含量对逆境的响应 |
| 3.3 转基因海滨雀稗内源GABA含量对逆境的响应 |
| 3.4 转基因海滨雀稗的耐旱性分析 |
| 3.5 转基因海滨雀稗的耐寒性分析 |
| 3.6 转基因海滨雀稗的耐盐性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达CdSAMDC提高海滨雀稗的耐旱性 |
| 4.2 表达CdSAMDC提高海滨雀稗的耐寒性 |
| 4.3 表达CdSAMDC提高海滨雀稗的耐盐性 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 主要结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（7）多年生黑麦草愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应（论文提纲范文）
| 1材料和方法 |
| 1.1试验材料 |
| 1.2主要试剂及培养基配方 |
| 1.3种子表面灭菌 |
| 1.4诱导愈伤组织前无菌材料的处理方法 |
| 1.5愈伤组织的诱导 |
| 1.6防褐剂的添加 |
| 1.7愈伤组织的分化和再生 |
| 1.8数据处理 |
| 2结果与分析 |
| 2.1浸泡、研磨处理及接种方式对多年生黑麦草种愈伤组织诱导率的影响 |
| 2.2不同浓度柠檬酸对愈伤组织褐化的抑制效应 |
| 2.3愈伤组织的分化与生根培养 |
| 3讨论 |
| 4结论 |
（8）不同浓度6-BA对黑麦草种子出愈率的影响（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 外植体的消毒与接种 |
| 1.3 培养基的配置 |
| 1.4 愈伤组织诱导 |
| 1.5 试验处理 |
| 1.6 愈伤组织观察及记录 |
| 1.7 数据统计与分析方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度6-BA对多年生黑麦草发芽率的影响 |
| 2.2 6-BA对多年生黑麦草不同品种出愈率的影响 |
| 3 讨论与结论 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 试验结论 |
（9）几种牧草再生体系和遗传转化体系的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 第一部分 紫花苜蓿再生体系的建立及GUS基因转化的研究 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 紫花苜蓿基因工程研究进展 |
| 2.1.1 抗逆性转基因苜蓿 |
| 2.1.2 抗病抗虫转基因苜蓿 |
| 2.1.3 抗除草剂转基因苜蓿 |
| 2.1.4 苜蓿品质的改良 |
| 2.1.5 植物生物反应器 |
| 2.2 紫花苜蓿遗传转化方法的研究进展 |
| 2.2.1 农杆菌介导法 |
| 2.2.2 基因枪法 |
| 2.2.3 电击法 |
| 2.2.4 PEG法 |
| 2.2.5 花粉管通道法 |
| 2.3 紫花苜蓿遗传转化受体系统的研究进展 |
| 2.3.1 外植体转化受体系统 |
| 2.3.2 愈伤组织转化受体系统 |
| 2.3.3 悬浮细胞转化受体系统 |
| 2.3.4 胚状体转化受体系统 |
| 2.3.5 原生质体转化受体系统 |
| 2.4 本实验的研究目的和意义 |
| 第三章 紫花苜蓿高频再生体系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 基本培养基 |
| 3.1.3 植物激素 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 无菌苗的获得 |
| 3.2.2 基本培养基的筛选和不同外植体对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.3 诱导胚状体的分化 |
| 3.2.4 成苗 |
| 3.2.5 炼苗移栽 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 最佳诱导愈伤组织培养基的确定 |
| 3.3.2 最佳诱导胚性愈伤组织分化培养基的确定 |
| 3.3.3 最佳生根培养基的确定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 消毒剂 |
| 3.4.2 无菌苗质量的影响 |
| 3.4.3 不同外植体材料对愈伤形成的影响 |
| 3.4.4 培养基和激素对愈伤组织诱导以及分化的影响 |
| 3.4.5 褐化现象 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 根癌农杆菌介导的GUS基因的转化研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 农杆菌菌株和质粒载体 |
| 4.1.4 生化试剂 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 质粒载体pBI121-GUS转化根癌农杆菌EHA105 |
| 4.2.2 根癌农杆菌的活化方法 |
| 4.2.3 紫花苜蓿遗传转化体系的建立 |
| 4.2.4 GUS组织染色化学分析 |
| 4.2.5 转基因植株基因组DNA的少量提取 |
| 4.2.6 PCR检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 质粒载体pBI121-GUS转化根癌农杆菌EHA105的PCR检测 |
| 4.3.2 选择培养基中抗生素头孢霉素(Cef)浓度的确定 |
| 4.3.3 预培养时间的确定 |
| 4.3.4 侵染液浓度的确定 |
| 4.3.5 最佳侵染时间的确定 |
| 4.3.6 最佳共培养时间的确定 |
| 4.3.7 选择培养基中卡那霉素(Kan)有效工作浓度的确定 |
| 4.3.8 GUS植物组织染色鉴定 |
| 4.3.9 Kan抗性植物的PCR分子鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 农杆菌菌株对转化的影响 |
| 4.4.2 共培养方法对转化效率的影响 |
| 4.4.3 抗生素对愈伤组织诱导的影响 |
| 4.4.4 选择方法和选择时间对转化的影响 |
| 4.4.5 乙酰丁香酮(AS)对转化效率的影响 |
| 4.4.6 关于GUS染色和PCR鉴定 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 第二部分 老芒麦、垂穗披碱草组织培养再生体系的研究 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 老芒麦概述 |
| 2.1.1 植物学特征 |
| 2.1.2 生物学特征 |
| 2.1.3 生态经济价值 |
| 2.2 垂穗披碱草概述 |
| 2.2.1 植物学特征 |
| 2.2.2 生物学特征 |
| 2.2.3 生态经济特征 |
| 2.3 禾本科牧草组织培养研究进展 |
| 2.3.1 器官培养 |
| 2.3.2 胚胎培养 |
| 2.3.3 组织培养 |
| 2.3.4 细胞培养 |
| 2.3.5 原生质体培养 |
| 2.4 影响禾本科牧草再生体系建立的因素 |
| 2.4.1 外植体的影响 |
| 2.4.2 基因型的影响 |
| 2.4.3 基本培养基的影响 |
| 2.4.4 外源激素的影响 |
| 2.4.5 继代培养时间的影响 |
| 2.4.6 其它因素的影响 |
| 2.5 几种禾本科牧草的组织培养 |
| 2.5.1 高羊茅的组织培养 |
| 2.5.2 多年生黑麦草的组织培养 |
| 2.5.3 羊草的组织培养 |
| 2.5.4 老芒麦的组织培养 |
| 2.5.5 披碱草的组织培养 |
| 2.6 本研究的目的与意义 |
| 第三章 老芒麦、垂穗披碱草组织培养再生体系的优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 基本培养基 |
| 3.1.3 植物激素 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 外植体的采集 |
| 3.2.2 外植体的消毒 |
| 3.2.3 愈伤诱导培养基的筛选 |
| 3.2.4 愈伤组织分化培养基的筛选 |
| 3.2.5 成苗 |
| 3.2.6 炼苗移栽 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 2,4-D对老芒麦和垂穗披碱草幼穗诱导愈伤组织的影响 |
| 3.3.2 激素配比对老芒麦和垂穗披碱草幼穗诱导愈伤分化的影响 |
| 3.3.3 1/2 MS培养基对老芒麦和垂穗披碱草生根成苗的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 外植体的选择 |
| 3.4.2 基本培养基的使用 |
| 3.4.3 外源激素的影响 |
| 3.4.4 继代培养时间的影响 |
| 第四章 结论和展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图1 |
| 附图2 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（10）多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 愈伤组织诱导和继代培养 |
| 1.3 愈伤组织分化培养和生根培养 |
| 1.4 农杆菌介导的遗传转化 |
| 1.5 转化植株PCR检测 |
| 1.6 转化植株目的基因表达的Real-Time PCR 检测 |
| 1.7 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 2, 4-D浓度对黑麦草愈伤组织诱导和培养效果的影响 |
| 2.2 6-BA浓度对愈伤组织分化的影响 |
| 2.3 转基因植株的获得及PCR检测 |
| 2.4 转化植株中目的基的 Real-Time PCR检测 |
| 3 讨论与结论 |
| 3.1 影响愈伤组织诱导及分化的因素 |
| 3.2 农杆菌介导的PEPC 基因的转化 |
四、多年生黑麦草种子愈伤组织诱导和植株再生（论文参考文献）
- [1]多年生黑麦草热激转录因子HSFAs和HSFCs亚家族基因的功能研究[D]. 孙天晓. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]多年生黑麦草LpCKX1基因CRISPR/Cas9靶向编辑载体的构建及遗传转化体系的建立[D]. 姜倩倩. 烟台大学, 2020(01)
- [3]CRISPR/Cas9介导无外源DNA日本结缕草ZjSGR基因编辑技术研究[D]. 张睿. 北京林业大学, 2019(04)
- [4]紫花苜蓿与黑麦草转基因表达基因重组人血清白蛋白研究[D]. 陈林涛. 海南大学, 2018(08)
- [5]多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立[J]. 曾庆飞,韦鑫,陈锡,陈光洁,马培杰,吴佳海,王小利. 草业科学, 2017(08)
- [6]超表达CdNF-YC和CdSAMDC提高海滨雀稗抗逆性研究[D]. 吴雪莉. 南京农业大学, 2017(05)
- [7]多年生黑麦草愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应[J]. 代小梅,孙振元,韩蕾,巨关升. 核农学报, 2015(10)
- [8]不同浓度6-BA对黑麦草种子出愈率的影响[J]. 文沛玲,瞿杨,叶光明,杨秉健,杜小姣. 草原与草坪, 2014(03)
- [9]几种牧草再生体系和遗传转化体系的优化[D]. 王宇. 兰州大学, 2014(10)
- [10]多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化[J]. 李蔚,张娜,李仁,赵冰,郭仰东. 草地学报, 2012(04)