一、HER2/neu肽诱导BALB/c小鼠产生特异性CTL及其抑瘤作用的研究（论文文献综述）
尹良伟[1]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中指出自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
蓝肇煜[2]（2020）在《表达RGD、TAT和Gel基因重组减毒沙门菌的构建及其对乳腺癌的抑瘤作用研究》文中提出由雌性动物的乳腺上皮组织产生癌变,而最终出现的恶性肿瘤是乳腺癌（Breast cancer）。这种恶性疾病在雄性动物身上发生概率不到1%,99%病发于雌性动物。乳腺癌细胞与正常细胞存在较大差别,具体表现在其细胞间结构疏松、连接不牢固,最终形成易脱落的特点。也正因为该特性,使脱落后的乳腺癌细胞可以更加轻易进入血管或淋巴管,最终扩散到全身,形成大范围转移现象,最终危及生命。罹患癌症的雌性动物中,最常见肿瘤即是乳腺癌。其中最难治愈的为三阴性乳腺癌,三阴指细胞表皮生长因子受体为阴性,阴性的雌激素受体以及机体的孕激素受体呈阴性,其有别于普通乳腺癌细胞的是没有抗HER2靶点,所以目前此病的治疗成为临床乳腺癌治疗中的棘手问题。现阶段分子生物学、基因学等相关学科已成为肿瘤治疗的热门,其中基因治疗尤为突出。实体瘤中因存在肿瘤微环境形成的免疫逃避,导致化疗药物无法对肿瘤发挥作用,但由于肿瘤微环境的特殊厌氧环境,为一系列厌氧菌及兼性厌氧菌提供了有利的生长条件,这一发现预示细菌可能成为肿瘤治疗的载体。但其安全性尚未可知,需要对治疗菌进行减毒改造,因此寻找合适的靶向性载体和治疗基因是肿瘤基因治疗的核心,同时也是本课题的研究目的及科学意义所在。肿瘤靶向肽（RGD）是一种可识别肿瘤血管整合素αvβ3的短肽,常被用作肿瘤靶向标记物。细胞穿膜肽（TAT）是由30个左右氨基酸残基组成的肽,其可将远大于自身的大分子蛋白或药物穿过细胞膜,进入细胞内部发挥作用。白树毒素（GEL）是一种Ⅰ型核糖体失活蛋白,其可通过抑制核糖体转录进而杀死细胞,但不可穿过细胞膜。为探索融合表达肿瘤靶向肽（RGD）、细胞穿膜肽（TAT）和白树毒素（GEL）基因重组减毒沙门菌对人乳腺癌的抑瘤作用,本试验构建了重组沙门菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL,培养MDA-MB-231细胞（人乳腺癌）并使其被重组菌侵染,高水平翻译转录目标基因。经CCK-8、Western Blotting及流式细胞术等方法,检测MDA-MB-231细胞中重组减毒沙门菌的凋亡和抑制作用。CCK-8检测后,结果表明LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL对MDA-MB-231细胞体外制率较高,且不具有剂量和时间依赖性,其IC50值（2.822×107 cfu/?l）远低于对HEK293细胞的IC50值（3.106×108 cfu/?l）;Western Blotting检测结果显示,重组减毒沙门菌在体外成功表达,并诱导MDA-MB-231细胞表达凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9和Bax的量显着增多（P<0.05）,表达抑制凋亡的蛋白Bcl-2显着减少（P<0.05）;流式细胞术检测结果显示,重组减毒沙门菌对MDA-MB-231细胞24h的抑制率为8.02±2.7%。细胞划痕实验、Transwells法检测在MDA-MB-231细胞中经重组减毒沙门菌作用后的迁移和趋化能力。结果显示,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL可以抑制MDA-MB-231细胞的迁移,并可显着抑制FBS介导的细胞趋化能力（P<0.05）。体外试验中成功建立了荷人乳腺瘤小鼠动物模型,瘤内注射LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL（首次注射量1×106 cfu/只;二次注射量1×107 cfu/只）后,对荷瘤小鼠的体重和瘤体积进行间期性测量,通过生物成像检测重组减毒沙门菌在各器官中的表达与分布状况。结果表明,肿瘤处荧光表达量高于其他组织。当肿瘤大小超过体重的5%时,处死小鼠,取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾等组织,分别进行HE染色、免疫组化实验,并制作病理切片及冰冻切片。结果发现,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL治疗组可以有效抑制小鼠肿瘤体积的增大,体重下降显着低于其他对照组（P<0.05）。通过对各组小鼠肿瘤组织观察和重量测定结果显示,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL的抑瘤效果最好,显着低于LH430/pEGFP-TAT-GEL组、顺铂组和PBS组;与LH430/pEGFP-RGD-GEL组、LH430/pEGFP-GEL组之间虽没有差异显着性,但其肿瘤重量低于LH430/pEGFP-RGD-GEL组和LH430/pEGFP-GEL组。经生物成像检测,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL靶向性较好;冰冻切片结果显示,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL治疗组小鼠肿瘤组织中外源荧光蛋白得到表达;组织HE染色结果发现,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL治疗组小鼠肝脏、肾脏和肺等组织器官无明显的病变和肿瘤转移现象;经免疫组织化学检测结果显示,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL治疗组肿瘤组织中Caspase-3、P53、EGFP表达量显着增高。本试验成功构建了携带RGD-TAT-GEL基因的减毒沙门菌LH430,可稳定传代,能够在体外有效传递和表达目的基因及蛋白。经体外试验验证,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL可提高乳腺癌细胞死亡率,并有效减少其生长能力,转移作用和趋化现象。经荷瘤小鼠模型体内试验验证,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL瘤内注射后,可在体内部高效稳定表达,对肿瘤的靶向性较好,对机体其他组织器官伤害较小。试验证明了重组减毒沙门菌在肿瘤动物模型内对乳腺癌的治疗作用,为比较医学和人类肿瘤基因治疗提供新的研究思路和方法。
李春浦[3]（2019）在《左金丸联合新型EGFR靶向多肽MM2对大肠癌的抑制作用》文中研究表明目的:近年来,随着EGFR功能的发现和酪氨酸激酶抑制剂的更新换代,针对EGFR抗肿瘤的靶向药物药效明确,已在临床获得广泛应用。但是由于肿瘤细胞在病情发生进展时,EGFR基因的突变情况也会随之改变,限制了药物的使用和功能发挥。本课题旨在通过多肽合成的方法,筛选能够竞争性拮抗EGF同时靶向EGFR的新型多肽MM2,并研究其抗肿瘤作用。课题组前期研究发现左金丸能够抑制EGFR信号通路下游PI3k的激活,增强化疗药物的疗效。本课题旨在研究左金丸与MM2联用,对大肠癌抑制作用及作用机制。方法:1.利用One Bead–One Compound Cyclic-Peptide方法以Tenta Gel树脂为基础,在常温下用分割法合成新型多肽。2.通过免疫荧光法筛选出能与EGFR结合的多肽。3.通过荧光偏振技术检测多肽与EGFR蛋白之间的的亲和力。4.通过皮下注射HCT-8细胞的方法构建小鼠皮下移植瘤模型,定期测量瘤体体积裸鼠体重,观察多肽药物MM2及MM2联合左金丸对小鼠生活质量以及瘤体生长情况的影响。5.运用westernblot方法检测肿瘤细胞和中合成多肽MM2对EGFR磷酸化的调控作用以及MM2对EGFR下游基因Ak T、ERK磷酸化的影响。6.利用CCK-8细胞活性检测技术及肿瘤细胞单克隆技术研究MM2及MM2联合左金丸对大肠癌细胞增殖的影响。7.通过Transwell和细胞划痕实验检测MM2及MM2联和左金丸对大肠癌细胞侵袭和迁移的影响。结果:通过固相合成法获得新型多肽MM2,其可与EGFR特异性结合并抑制EGFR及其下游基因AKT和ERK的磷酸化;MM2可以抑制KRAS野生型大肠癌细胞的增殖;MM2可抑制大肠癌细胞的侵袭和转移能力。肿瘤大小统计数据显示,MM2明显抑制了大肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤的增长,在联用左金丸之后,其抑瘤作用进一步增强,提高了MM2对大肠癌的抑制作用。左金丸联合MM2能够降低EGFR相关下游基因AKT和ERK的磷酸化。结论:One-Bead–One Compound Cyclic-Peptide是一种稳定高效的化学合成多肽的方法,筛选到了能与EGFR特异性结合的新型多肽MM2。MM2通过抑制EGFR的磷酸化,阻止其下游PI3K-AKT和MAPK/ERK信号通路的传导,抑制了大肠癌的增殖以及侵袭转移。同时发现左金丸和MM2联合使用之后,增强了MM2的抗肿瘤效应。
刘晶[4]（2019）在《基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究》文中进行了进一步梳理猪流感（Swine influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,其特征为突发咳嗽、呼吸困难、发热及迅速转归。SIV是一种球状结构的单股负链RNA分节段的病毒。其中血凝素（Hemagglutinin,HA）是SIV重要的膜蛋白,可以刺激机体产生中和抗体。目前,流感疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗、基因工程活疫苗等,以乳酸菌作为粘膜疫苗递送载体也有研究,但递送抗原效率有待加强。本研究以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,L.plantarum）NC8株作为宿主菌,构建两种侵入型L.plantarum表达载体:一种是表达金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的侵袭素,即纤连蛋白结合蛋白A（Fibronectin binding protein A,FnBPA）;另一种是表达针对CD11c的单链抗体（single-chain variable fragment against CD11c,scFv-CD11c,简称aCD11c）。使用两种新型侵入型乳酸菌递送载体,以SIV的HA作为保护性抗原,探索其分子免疫机制。首先,我们构建了一株表面展示FnBPA的侵入型L.plantarum NC8-pSIP409-FnBPA。使用该菌株感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）后,发现其对细胞的粘附与侵袭率分别为1.41%和0.15%,大约是空载体组的2倍和5倍。同时,将上述菌株与小鼠骨髓源树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）共培养,使用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测菌株对BMDCs活化并以荧光定量PCR检测相应mRNA的表达情况。结果表明菌株NC8-pSIP409-FnBPA显着增强了BMDCs表面CD40和CD80表达水平（P<0.001）,同时基因IL-6和MyD88 mRNA的表达水平也显着提高（P<0.001）。同样,使用上述菌株免疫BALB/c小鼠,评价其免疫调节特性。结果显示NC8-pSIP409-FnBPA显着刺激派尔氏淋巴集结（Payer’s patches,PPs）中DCs的活化（P<0.001）以及提高脾脏CD4+T细胞中IL-4+（1.72%,P=0.0037）和IL-17A+（2.07%,P=0.0079）细胞百分比;ELISA结果表明血清中IL-4（P=0.0012）和IL-17A（P<0.001）的含量也显着增加。同时与空载体相比,NC8-pSIP409-FnBPA显着增加了小鼠肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes,MLN）（P<0.001）和PP结（P<0.001）中B220+B细胞数量并提高了FnBPA特异性IgG（1.72倍）和分泌型IgA（sIgA）（2.41倍）抗体滴度。其次,我们又构建一株表面展示表达aCD11c的靶向DCs的L.plantarum（NC8-pSIP409-aCD11c）。使用该菌株刺激BMDCs,发现该菌株对BMDCs的粘附与侵袭率分别为36.17%和2.23%,为空载体组的1.56倍和2.42倍。进而将携带真核质粒pValac-GFP的NC8-pSIP409-aCD11c菌株与BMDCs共培养36h后,使用FCM检测BMDCs中GFP表达以确定菌株对pValac-GFP的递送效率,结果表明:该菌株能显着增强BMDCs中GFP表达（P=0.0110）。将上述携带pValac-GFP的菌株口服免疫小鼠,免疫后PP结和MLN中GFP的表达在不同时间点均有所升高。此外,NC8-pSIP409-aCD11c菌株也能有效促进MLN中DCs的分化、成熟以及增加CD4+T细胞中IL-4+和IL-17A+细胞的百分比,同时提高PP结中B220+IgA+B细胞的含量。再次,我们使用上述两种侵入型载体表达了SIV的HA抗原,构建了三株乳酸菌分别为NC8-pSIP409-pgsA’-HA（HA）、NC8-pSIP409-FnBPA-pgsA’-HA（FnBPA-HA）和NC8-pSIP409-aCD11c-pgsA’-HA（aCD11c-HA）。将上述菌株免疫BALB/c小鼠,结果发现,与空载体组相比,HA组、FnBPA-HA组和aCD11c-HA组均能促进脾脏中DCs的活化和成熟,脾脏和MLN CD8+T细胞中IFN-γ+和穿孔素的表达以及PP结中B220+IgA+B细胞的产生;同时ELISA结果表明:与空载体组相比,表达HA的三株菌株免疫后均能显着提高小鼠血清中特异性IgG（2.28倍）及粪便（2.37倍）和气管冲洗液中sIgA（2.39倍）的抗体滴度,且均能产生中和抗体;将BALB/c小鼠感染10×LD50的流感病毒A/PuertoRico/8/1934（H1N1）,在感染后第7天,与HA组和FnBPA-HA组相比,aCD11c-HA组显着提高MLN中CD8+T细胞中IFN-γ+（P<0.001）和穿孔素（P<0.001）的表达,具有一定的抗病毒作用;FnBPA-HA组和aCD11c-HA组对IV的保护率为60%,HA组为40%。最后,探讨了aCD11c-HA乳酸菌在抗H1N1亚型IV中的分子免疫机制。以aCD11c-HA乳酸菌刺激BMDCs 12 h后,使用FCM检测菌株对BMDCs分化的影响,结果表明aCD11c-HA菌株显着促进BMDCs的活化。ELISA检测上述细胞上清中细胞因子的表达,发现aCD11c-HA菌株促进IL-12P70、抑制IL-6的分泌;分选未免疫小鼠脾脏的CD4+和CD8+T细胞,与上述激活的BMDCs共培养48 h后,使用FCM和ELISA分别检测细胞内IFN-γ+和穿孔素的表达及细胞分泌上清中IFN-γ的含量,发现aCD11c-HA菌株增强了分选CD4+T细胞中IFN-γ+（4.33%）以及CD8+T细胞中IFN-γ+（7.68%）和穿孔素（17.50%）的表达,同时促进细胞因子IFN-γ的分泌。与上一致,体内检测了脾脏和MLN中HA特异性CD8+T细胞中IFN-γ+（P<0.001）和穿孔素（P<0.001）的表达,aCD11c-HA组显着升高;并且aCD11c-HA组能显着促进脾脏T细胞的增殖（P<0.001）。使用磁珠分选免疫后各组小鼠的脾脏CD8+T细胞尾静脉回输NOD/Lt-SCID小鼠,24 h后感染5×LD50的IV,结果显示aCD11c-HA组的CD8+T细胞与HA组相比能延长NOD/Lt-SCID小鼠寿命2天,具有一定的保护作用。本研究构建了基于FnBPA蛋白及scFv-CD11c的两种侵入型植物乳杆菌,分别共表达了SIV的HA蛋白,与单表达HA的菌株相比,上述菌株免疫BALB/c小鼠后能显着增加对IV的攻毒保护率,尤其以scFv-CD11c共表达组在增强机体免疫反应方面更佳。进而通过FCM、流式分选、过继回输NOD/Lt-SCID小鼠等手段证实了aCD11c-HA菌株可增强病毒特异性CD8+IFN-γ+T细胞及穿孔素表达,初步揭示了靶向DCs的侵入型乳酸菌载体疫苗引起机体免疫反应的分子机制,为开发新型乳酸菌载体疫苗奠定了基础。
杨国华[5]（2015）在《重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERT-E1a对结肠癌抑制作用的实验研究》文中认为结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,据国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer）资料显示,全球结直肠癌新发病例在男性中发病率位居恶性肿瘤第3位,女性患者仅次于乳腺癌而位居第2位。我国结肠癌发病率位于肺癌、胃癌、肝癌和乳腺癌之后,居第5位。尽管在肿瘤防治以及手术、放疗、化疗等治疗策略上都有进步,这些仅限于在初期肿瘤的治疗中有较满意的疗效,而在晚期多无法获得根治。目前临床迫切需求新型的更有效的治疗手段进入临床应用。在肿瘤研究领域,基因治疗是一项有潜力的逆转常规放化疗抵抗的研究热点之一。然而,基因治疗的有效性及其特异性仍存在诸多挑战。溶瘤病毒能够特异性识别肿瘤细胞并具备复制能力,通过直接溶瘤而杀伤肿瘤细胞。此外,溶瘤病毒还可以通过基因修饰等分子工程的操作,携带各种肿瘤特异治疗元件产生抗肿瘤免疫等多种作用发挥抗癌效应。这种将肿瘤的病毒治疗与基因治疗结合起来的方法,利用溶瘤病毒选择性在肿瘤细胞内的增殖与复制,增加溶瘤病毒携带的抗癌基因的拷贝数量,提高其表达水平,从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,溶瘤病毒为强效且特异选择性杀伤的极具潜力的抗肿瘤方法之一。基于腺病毒的载体是基因转移最广泛应用的平台之一。然而,非复制潜能的腺病毒极少可以有效地清除肿瘤细胞。因此,需要极大的浓度或剂量以达到较有效的抗肿瘤反应;但是往往诱导宿主抗病毒免疫反应,导致病毒载体在随后的组织免疫与毒性反应过程中被中和,而失去治疗作用。为克服这些局限,条件性复制潜能的腺病毒被开发而广泛检测评估,这一系列的病毒可特异性地在肿瘤细胞内复制,随后溶解肿瘤细胞并释放子代病毒,继续感染并杀伤邻近的肿瘤细胞。近年来的研究证实,可与有复制潜能的腺病毒中和的抗体实际上对这些腺病毒作用有限,因此可以推测,肿瘤特异选择性复制潜能的腺病毒在肿瘤基因治疗中极为有效。在本研究中,已应用肿瘤特异启动子人端粒酶逆转录酶（h TERT）以及肿瘤细胞选择性凋亡诱导基因凋亡素（Apoptin）构建了重组溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a,并已经在一系列的不同类型肿瘤细胞中如胃癌、前列腺癌中呈现出强效的抗肿瘤生长与抑制肿瘤转移的疗效。端粒酶活性在大约90%以上的肿瘤组织内过表达,而在正常组织内无法测出,因其肿瘤特异性强而作为肿瘤标志物被广为应用。在端粒酶亚型中,h TERT决定永生化细胞以及85%以上人类肿瘤细胞的端粒酶活性。因此,h TERT启动子已通过转基因操作而达到肿瘤特异表达的效应。另一方面,Apoptin是鸡贫血病毒的VP3基因表达的产物,对一系列转化或人源性恶性肿瘤包括肝癌,淋巴瘤,胆管癌,黑色素瘤以及乳腺、肺与结肠癌中呈现出特异性与有效性,而对非转化细胞包括成纤维细胞、角质细胞或平滑肌细胞则无促凋亡作用,因此认为,Apoptin是一较特异的肿瘤促凋亡蛋白。目前尚无Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌抑制作用效果的研究,本研究通过系列的体外及体内实验,以检测Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP等重组腺病毒对肿瘤组织的靶向作用,探讨AdApoptin-h TERT-E1a抑制肿瘤生长并促进其凋亡的疗效。实验目的本实验拟研究Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌细胞特异性杀伤作用,并探讨Ad-Apoptin-h TERT-E1a的抑瘤率、对结肠癌细胞的抑制作用方式及其作用机制。实验方法体外实验中,以正常胃粘膜细胞系GES为对照组,重组腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP分别感染人结肠癌细胞SW1116,通过MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式细胞术明确重组腺病毒的靶向作用及抑制作用方式。同时,以Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP不同重组腺病毒为对照组,通过MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式细胞术明确Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌细胞的抑制作用效果。此后,通过Western blot检测及流式细胞仪检测Caspase酶、活性氧（ROS）和线粒体膜电位（MMP）水平,进一步检测抑制效应的相关机制,从分子水平对重组腺病毒的抑瘤途径进行研究。在体内实验中,利用鼠结肠癌CT26细胞分别构建BALB/c小鼠实体荷瘤模型及肺转移荷瘤模型,经皮下注射及尾静脉注射两种方式接种重组腺病毒,通过观察肿瘤生长趋势、不同时间的抑瘤率、生存期探讨Ad-Apoptin-h TERT-E1a的体内抑瘤作用效果。实验结果通过MTT染色、光镜检测、AO/EB染色以及Annexin V染色等检测,结果显示重组腺病毒可不同程度诱导细胞凋亡,其中,Ad-Apoptin-h TERT-E1a对人结肠癌细胞SW1116的诱导凋亡作用最强,而各重组腺病毒均对正常细胞系GES未见明显抑制作用。MTT染色还表明,相对定量分析,Ad-Apoptin-h TERT-E1a对体外培养的SW1116的抑瘤作用呈现出一定的剂量依赖效应以及时间依赖效应。Western blot检测及流式细胞仪检测caspase 3,caspase 6及caspase 7等凋亡执行蛋白的表达水平变化,同时检测此过程中线粒体膜电位、活性氧以及细胞色素酶C的变化。结果表明,在Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116细胞中,Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7凋亡执行蛋白的活性明显增强,并伴有ROS、MMP及Cyto C的变化。结果提示,Ad-Apoptin-h TERT-E1a诱导人结肠癌细胞凋亡的作用机制之一为通过影响线粒体膜电位而启动内源性激活凋亡信号通路,而对正常的胃粘膜细胞GES并产生影响。对两种荷瘤模型的体内治疗实验结果显示,接种Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin等重组腺病毒瘤内注射或血管用药,均可以明显的抑制小鼠体内接种的肿瘤的增殖,并显着地延长小鼠模型的生存期,且未见明显的毒副作用,其中Ad-Apoptin-h TERT-E1a T作用最强。进一步验证了重组溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。结论h TERT启动子调控的表达Apoptin基因的溶瘤腺病毒,即Ad-Apoptin-h TERT-E1a可使大多数SW1116肿瘤细胞表现为凋亡形态,这种诱导凋亡的作用呈现出典型的剂量依赖的特征以及时间依赖特征。Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116细胞中,Caspase-3/6/7凋亡相关蛋白的活性明显增强,线粒体膜电位水平下调,而活性氧水平及Cyto C水平上调,提示Ad-Apoptin-h TERT-E1a可能通过线粒体途径诱导人结直肠癌细胞凋亡、抑制其增殖。Ad-Apoptin-h TERT-E1a的这种诱导肿瘤细胞凋亡的抑瘤作用具有特异的肿瘤细胞靶向性,对正常细胞无诱导凋亡作用。Ad-Apoptin-h TERT-E1a显着地抑制了小鼠体内接种肿瘤的增殖,同时可延长CT26荷瘤小鼠模型的生存时间,而未见明显的毒副反应。综上所述,Ad-Apoptin-h TERT-E1a呈现出应用于抗肿瘤治疗的潜力,可同时应用于原发性与转移性结肠癌的治疗。
崔澂,王雅卓,郝淑维[6]（2014）在《卵巢癌免疫生物学治疗策略研究进展》文中指出卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,患者确诊时多已至晚期,预后极差[1]。目前常规采用手术切除辅以放化疗,但5年生存率不足30%,达临床完全缓解者仍有55%75%复发[2]。肿瘤免疫生物学治疗作为新型辅助疗法和第四种治疗模式,针对不同靶位点、靶途径的各种新策略（参见图1）极大地推动了卵巢癌治疗的理论及实践研究。1特异性主动免疫疗法1.1细胞疫苗1.1.1肿瘤细胞疫苗卵巢癌全细胞肿瘤疫苗含
费丹[7]（2014）在《特异性抗体介导的蜂毒肽对骨肉瘤的抑制作用》文中进行了进一步梳理表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）对于多种细胞具有促进增殖和营养作用。EGFR在多种肿瘤细胞内高表达，说明其与这些肿瘤的发生、发展等变化有关。另外，大量研究表明EGFR信号系统与肿瘤的发生和肿瘤耐药性关系密切，并且EGFR的异常变化也是骨肉瘤的显着特点。蜂毒（Beevenom, BV）做为免疫相关疾病治疗制剂已广泛应用，特别是在肿瘤治疗领域其作用十分显着。研究发现，肾癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌以及白血病细胞均可成为BV主要成分蜂毒肽（Melittin）的靶标。Melittin激活PLA2从而发挥细胞毒作用已被公认为BV抗肿瘤的主要作用机制。Melittin通过激活Caspase酶和基质金属蛋白酶，诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，从而实现其抗肿瘤作用。现已证明，将Melittin与激素受体、特异性抗体等多种具有导向作用的物质融合表达，可以有效治疗多种肿瘤。本研究将Melittin通过柔性肽与抗EGFRscFv连接，并由大肠杆菌进行表达，制备了融合蛋白antiEGFR/MEL。对表达条件进行了优化，并进行了复性和初步纯化。利用表达的融合蛋白，针对人骨肉瘤细胞进行了体内、外抑瘤实验研究。研究结果表明，含有EGFR单链抗体的重组蛋白antiEGFR/MEL可与OS732细胞有效结合，并定位于OS732细胞膜表面。antiEGFR/MEL能够有效抑制OS732细胞的生长，但对正常细胞L02无明显作用。另外，antiEGFR/MEL抑制OS732细胞生长的现象，呈现明显的时间效应和剂量效应趋势。本研究还利用BALB/c小鼠结合小鼠骨肉瘤细胞S180，建立了实体肉瘤细胞模型，并开展了体内抑瘤实验研究。研究结果表明，antiEGFR/MEL可以抑制S180实体肿瘤生长、延长动物模型生存期、延长动物模型肿瘤倍增时间和肿瘤生长延迟时间。以上结果说明，antiEGFR/MEL具有应用于骨肉瘤生物治疗研究的潜质。
王荣华[8]（2014）在《中药刺蒺藜及刺蒺藜苷抗乳腺癌作用机制研究》文中认为背景乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升,全世界每年约有110万的新发病例,约41万人的死亡率,严重危害妇女的身心健康。乳腺癌的内科治疗主要包括化疗和内分泌治疗,但多药耐药及其毒副作用,成为乳腺癌治疗的难点。中药具有多靶点、多效应、不易产生耐药性、不良反应小、安全有效等优点,因此,中医药应用在乳腺癌综合治疗方面备受关注。目的1体外实验:研究中药刺蒺藜及其主要有效成分刺蒺藜苷在多种肿瘤细胞系及其相应正常细胞系中细胞增殖的影响,评价其抗肿瘤的作用及其安全性;从中药刺蒺藜对乳腺癌细胞DNA甲基化的影响、刺蒺藜苷在乳腺癌细胞中与雌激素拮抗作用、刺蒺藜苷对乳腺癌细胞HDAC活性影响的研究,初步探讨其抗乳腺癌的作用机制。2体内实验:建立雌激素依赖乳腺癌的动物移植瘤模型,然后以刺蒺藜及刺蒺藜苷为干预药物,研究中药刺蒺藜及其有效成分刺蒺藜苷对裸鼠移植瘤的抑制作用。从抑瘤率、脏器指数等方面初步探讨其抑瘤作用及其安全性。方法1体外实验采用MTS法,研究中药刺蒺藜及其主要有效成分刺蒺藜苷在多种肿瘤细胞系及其相应正常细胞系中细胞增殖的影响,比较其在肿瘤细胞系及相应正常细胞系的细胞增殖抑制率,计算其在不同肿瘤细胞系的IC50值;采用MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）试剂盒检测刺漠藜对肿瘤细胞甲基化的影响;采用E-Screen法研究刺蒺藜苷在乳腺癌细胞与雌激素的拮抗作用;使用HDAC Activity Colorimetric试剂盒（美国Bio Vision公司）检测刺蒺藜苷对MCF-7细胞HDAC活性影响的研究。2体内实验采用雌激素依赖的人乳腺癌细胞系MCF-7,于造模前3天小鼠皮下放置雌激素片,以5×107/ml的密度与Matrigel等体积混匀,将0.2ml的混合液接种于BALB/c裸鼠皮下,构建移植瘤模型。接种后第7天,将15只裸小鼠随机分成模型对照组、刺蒺藜组、刺蒺藜苷组。每2天测量肿瘤体积,绘制生长曲线。实验结束后,测量瘤重,肝脏、脾脏的脏器指数,计算抑瘤率。结果1体外实验①刺蒺藜粗提物各浓度对 MCF-7、MDA-MB-231、HeLa、U-87、A-172 和 FARAGE肿瘤细胞均有明显的抑制作用,随着作用时间及浓度的增加,抑制率增加。对正常乳腺细胞MCF-10A无抑制作用,对正常宫颈细胞END1/E6E7的和人正常星形胶质细胞NHA细胞抑制作用较小,相应肿瘤细胞系,在IC50的浓度范围内,与相应正常细胞系的抑制率相比有统计学差异（P<0.01）。对正常淋巴细胞RPMI-1788的抑制作用较强,与淋巴瘤细胞FARAGE的抑制率相比,无统计学差异（P>0.05）。②刺蒺藜苷对雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞MCF-7增殖具有明显的抑制作用,有统计学差异（P<0.05）;对雌激素受体阴性的MDA-MB-231细胞没有抑制作用;对MCF-10A细胞增殖抑制作用相对较小,明显弱于其对MCF-7的抑制率,两者比较有统计学差异（P<0.05）。③刺蒺藜提高了肿瘤细胞MCF-7及FARAGE甲基化的水平,与对照组相比,均有统计学意义（P<0.05）。④刺蒺藜苷对MCF-7细胞的抑制作用受17β-雌二醇（E2）的影响,同时加入刺蒺藜苷及E2,及先用E2处理两个小时,再加入刺蒺藜苷,其肿瘤增殖的抑制率均明显低于刺蒺藜苷组,且有统计学意义（P<0.05）。⑤刺蒺藜苷不同浓度（40μM、80μM）作用于MCF-7细胞48小时,对HDAC活性的抑制率分别是15.26%、45.93%,结果表明刺蒺藜苷能够抑制组蛋白去乙酰化酶HDAC的活性,且呈剂量依赖性。2体内实验模型对照组肿瘤生长较快,与各治疗组相比,有明显差异（P<0.05）;刺蒺藜苷组的肿瘤抑制率略高于刺蒺藜组,两者无统计学差异（P>0.05）。实验各组的肝脏、脾脏指数与模型对照组无明显差异（P>0.05）。结论1中药刺蒺藜及其有效成分刺蒺藜苷对多种肿瘤细胞均有明显抑制作用,且对相应正常细胞抑制作用较小,体现了良好、安全的抗肿瘤作用。2刺蒺藜抗肿瘤作用机制可能与其调高肿瘤基因甲基化有关。3刺蒺藜苷对MCF-7细胞的抑制作用受17β-雌二醇（E2）的影响,其抗乳腺癌细胞增殖作用机制可能与E2竞争细胞内雌激素受体有关。4刺蒺藜苷可以抑制MCF-7细胞HDAC活性,可能是潜在的HDAC抑制剂。5刺蒺藜与刺蒺藜苷能够抑制乳腺癌移植瘤的生长,表现出体内抗乳腺癌作用的安全性及有效性
贾晓娟[9]（2014）在《猪Gp96N增强PRRSV合成肽疫苗、亚单位疫苗及PCV2灭活疫苗免疫效应的分析》文中提出Gp96是热休克蛋白HSP90家族一员,具有多种免疫学效应,包括提高抗原呈递、刺激抗原呈递细胞（APCs）产生细胞因子、激发机体特异性免疫应答及细胞毒性T细胞（CTL）反应,以及免疫佐剂效应。本论文主要研究猪Gp96N对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的B、T细胞表位合成肽疫苗、B细胞表位串联亚单位疫苗以及猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）灭活疫苗的免疫佐剂效应。首先建立了表达猪Gp96N的大肠杆菌和毕赤酵母p.pastoris-X33表达系统,利用纯化的猪Gp96N作为免疫佐剂,在小鼠和猪上,从细胞免疫、体液免疫和天然免疫角度,分析了猪Gp96N对上述三种疫苗的免疫增强效应。研究结果为猪Gp96N作为免疫佐剂在疫苗中的应用提供了科学依据。从猪肾脏中提取RNA,采用RT-PCR扩增得到猪Gp96N基因cDNA片段,分别插入载体pET-32a和pPICZαA中,构建出原核表达载体pET-32a/Gp96N和真核表达载体pPICZaA/Gp96N,分别转入大肠杆菌BL21和毕赤酵母p.pastoris-X33中,经抗性筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET-32a/Gp96N和重组毕赤酵母p.pastoris-X33/pPICZaA/Gp96N。对表达产物进行纯化,获得猪Gp96N蛋白。根据文献报道,筛选出PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白的高度保守B细胞和T细胞抗原表位,经化学合成表位多肽,与猪Gp96N联合免疫小鼠和猪。结果发现,猪Gp96N能够增强表位肽诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答；猪Gp96N能显着上调IL-12和TNF-a,下调IL-4和IL-10的表达水平；用PRRSV高致病性毒株JXwn06对免疫猪的攻毒试验结果表明,表位多肽+猪Gp96N （BT-Gp组）免疫猪在攻毒后第7天全部死亡,表位多肽免疫（BT组）猪在第5天全部死亡,而对照组（PBS组和猪Gp96N组）的猪在攻毒后第3天全部死亡。虽然BT-Gp组和BT组的免疫猪均不能抵抗JXwn06的攻击,但比较攻毒后猪体温、临床症状、血清中病毒滴度等发现,在PRRSV攻毒后7天内,猪Gp96N与表位多肽联合使用能在一定程度上缓解猪的临床症状,降低猪血清中的病毒载量。将一些PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白Nsp2的高度保守B细胞抗原表位通过柔性linker连接,利用重叠PCR技术获得融合基因,并将其重组到原核表达质粒中,经过大量表达和纯化后得到串连多B细胞表位亚单位疫苗（Cpl、Cp2）。以猪Gp96N为免疫佐剂,与Cpl、CP2联合免疫小鼠和猪。经过三次免疫后,采用ELISA检测小鼠和猪血清中的抗体。结果表明,免疫小鼠和猪血清中均可检测到PRRSV特异性抗体,且猪Gp96N能提高抗体滴度3-4倍；从免疫小鼠血清中可检测到中和抗体,但在猪血清中未检测到中和抗体；ELISPOT及淋巴细胞增殖试验结果表明,猪Gp96N能显着提高疫苗诱导的细胞免疫。此外,定量ELISA检测发现,猪Gp96N能显着上调猪血清中IFN-γ, IL-12等Th1型细胞因子以及TNF-α的表达水平,同时能够下调IL-4和IL-10的表达水平。用不同剂量的猪Gp96N与PCV2灭活疫苗联合免疫猪,采用ELISA检测免疫前后各组血清中PCV2特异性抗体IgG以及IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子含量。结果发现,与单独免疫PCV2灭活苗及商业化的亚单位疫苗相比,猪Gp96N能够提高特异性抗体IgG水平,且随着Gp96N剂量增加,IgG水平呈递增趋势,表明猪Gp96N能够增强PCV2灭活疫苗的体液免疫。此外,与单独免疫疫苗相比,猪Gp96N+PCV2灭活疫苗联合免疫,能提高免疫猪的IFN-γ、TNF-α水平,但对1L-1β、IL-6没有影响。综上研究结果表明,猪Gp96N在一定程度上能够增强PRRSV亚单位疫苗的体液和细胞免疫应答,提升PCV2灭活疫苗的体液免疫效果,具有潜在的免疫佐剂效应。
王田恩[10]（2014）在《新型喹唑啉衍生物WYK431的抗肿瘤作用及机制研究》文中研究指明胃癌（GC）是严重危害人类健康的常见肿瘤之一,在全球癌症死亡率仅次于肺癌居第二位,胃癌发病率存在明显的地域差异,在部分亚洲国家、欧洲中部、美国中部和南非发病率较高,尤其是日本、韩国和中国东亚三国为高发地区,其发病总数约占全球总数的2/3。在中国胃癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位。在我国每年有近30万人死于胃癌,另有约40万新发病例。传统治疗例如手术治疗、放疗、化疗在胃癌的早期阶段发挥重要作用,晚期胃癌病人主要采用联合治疗的方式,但是晚期胃癌病人总的生存期仍不尽如人意。更好了解胃癌发生机制,采用新的治疗手段对晚期胃癌来说是非常必要的。目前研究表明,胃癌组织和细胞很多基因发生了突变,例如：HER-2过表达、EGFR过表达、PIK3CA突变和PTEN缺失。HER-2在10%-38%胃癌样本中高表达；EGFR在27%-44%胃癌样本中高表达。这两个受体被激活以后形成同源或异源二聚体,然后激活PI3K-Akt-mTOR信号通路和Ras-Raf-MEK-ERK信号通路。PI3K-Akt-mTOR信号通路在胃癌中经常被激活,PIK3CA在4%-36%的胃癌病例中发生了激活突变,PTEN在20%-36%胃癌病例中发生了缺失。由于上游受体的过表达、PIK3CA激活突变和PTEN缺失,导致29%-86%胃癌病人持续激活p-Akt和47%-64%胃癌病人持续激活p-mTOR。Ras-Raf-MEK-ERK信号通路是HER家族下游的一条重要的信号通路。在胃癌中K-RAS在2%-20%胃癌病例中发生了突变,B-RAF在0%-2.7%胃癌病例中发生了突变。这两个信号通路在细胞的增殖和存活中发挥重要作用。关于晚期胃癌的靶向治疗也主要集中在HER信号通路、PI3K-Akt-mTOR信号通路和Ras-Raf-MEK-ERK信号通路。曲妥珠单抗己被批准用于HER-2+晚期胃癌的一线治疗。西妥昔单抗、帕尼单抗、拉帕替尼和依维莫司处于临床Ⅲ期阶段。WYK431是新型喹唑啉衍生物,前期研究表明,其对多种肿瘤细胞株均有较好的生长抑制作用。其中对人胃癌BGC823细胞最敏感,48h IC50为2.16μM,但机制不明。本研究,我们评价了WYK431对人胃癌BGC823细胞体内抗肿瘤活性,并对其作用机制进一步研究。皮下异体移植胃癌BGC823细胞的BALB/c裸鼠分别给予5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg WYK431治疗。结果显示5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg WYK431治疗组与对照组相比抑瘤率分别为28.4%、41.9%和63.6%（p<0.05）。WYK431治疗组耐受性良好,体重只有轻微的降低。血液学分析结果显示,WYK431没有显着降低白细胞数量。周期分析结果表明,WYK431能够将BGC823细胞阻滞于G2/M期。DAPI染色结果显示,WYK431可以明显诱导人胃癌BGC823细胞呈现明显的凋亡形态学特征：细胞容积变小,染色质固缩,并产生核碎片和凋亡小体。AnnexinV-FITC/PI双染进一步表明,WYK431诱导BGC823细胞凋亡并呈剂量依赖性增多。TUNEL分析结果显示,与对照组相比,WYK431治疗组TUNEL阳性细胞数量明显增加。这一结果提示WYK431诱导了肿瘤组织内细胞凋亡。为了进一步探讨WYK431引起胃癌BGC823细胞凋亡的机制,我们采用Western blotting法对细胞中凋亡相关蛋白caspase-3, caspase-8和caspase-9进行了检测。结果表明,WYK431可以激活caspase3和caspase9,这一实验结果显示WYK431通过线粒体途径诱导胃癌BGC823细胞凋亡。线粒体膜电位遭受破坏后,细胞色素C从线粒体释放到细胞质是线粒体凋亡途径重要一步。结果显示,WYK431可以通过改变线粒体的膜电位,细胞色素c从线粒体释放到细胞质。线粒体膜电位受Bcl-2家族蛋白调控,Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（Bax）和抑凋亡蛋白（Bcl-2）。Western blot结果显示：WYK431上调促凋亡蛋白Bax的表达,对Bcl-2表达没有影响。综上所述,WYK431通过线粒体途径诱导胃癌BGC823细胞凋亡。PI3K/Akt和MAPK信号通路在细胞的增殖、存活中发挥重要作用。这两条信号通路在胃癌中处于异常活化状态,所以这两条信号通路也是胃癌治疗的重要靶点。实验结果显示,WYK431可以显着降低磷酸化Akt和Erk的表达,而对Akt和Erk的表达没有影响。EGFR在细胞增殖、分化、发育和肿瘤发生过程中发挥重要作用。已有研究报道,作为PI3K/Akt和MAPK信号通路上游,EGFR在胃癌中处于失调状态并且在胃癌的发生和发展过程中发挥作用。我们的研究结果显示,WYK431剂量依赖性降低磷酸化EGFR的表达,对EGFR表达没有影响。综上所述,WYK431是一个新型喹唑啉类小分子化合物,体外可以诱导胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞和线粒体途径凋亡,体内可以抑制荷胃癌BGC823细胞裸鼠异体移植瘤的生长。其抑瘤的作用机制可能与WYK431阻断了PI3K/Akt和p42/44MAPK信号通路有关。WYK431作为一个潜在的有效的抗肿瘤药物值得进一步研究。黑色素瘤是最具有侵袭力的皮肤肿瘤,其发病率的增长速度超过了其它肿瘤。全世界大约每年有46,000人死于转移黑色素瘤。对黑色素瘤的治疗依赖于病理分期。早期病人主要采取手术切除,对于有高复发风险的病人,除采用手术治疗外,联合IFN-a作为辅助治疗。截止到2011年,美国FDA批准用于黑色素瘤晚期治疗的药物只有达卡巴嗪（dacarbazine）和高剂量的IL-2（HD IL-2）。但是达卡巴嗪在临床的反应率只有10-15%,生存期只有8个月。HD IL-2临床反应率也很低,并且伴随多器官毒性,只有一小部分精心选择的病人可以表现出长期的无病反应状态。最近研究结果显示,开发新型的抑制黑色素瘤发生中关键突变分子为靶点的靶向药物可以提高反应率。B-RAFV600E是黑色素瘤中最常见的一种突变形式,在黑色素瘤患者中大约占50%。维罗非尼（Vemurafenib）B-RAF抑制剂主要抑制由于B-RAF V600E突变引起的MAPK信号通路的活性。临床试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期结果显示,维罗非尼显着改善了病人总生存期（OS）和无恶化生存期（PFS）。易普利姆玛（Ipilimumab）靶向细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）,对转移性黑色素瘤患者有显着的生存期延长优势。易普利姆玛和维罗非尼是转移性黑色素瘤标准化护理治疗的一次革命。然而现在最大的挑战是,解决维罗非尼获得性临床耐药,提高易普利姆玛反应率。临床样本显示,B-RAF抑制剂的获得性耐药可分为MAPK信号通路依赖的和非MAPK信号通路依赖的耐药。MAPK信号通路依赖的耐药机制包括N-RAS基因二次突变、B-RAF基因截短和COT激酶活性增加、C-RAF的活化和MEK1获得性突变。非MAPK信号通路依赖的耐药机制包括PDGFRβ, IGF1R, AXL, ERBB4酪氨酸激酶的上调、PI3K/AKT/mTOR和STAT3信号通路的活化。B-RAF和MEK抑制剂的联合治疗对B-RAF治疗过病人或没有治疗过的病人有良好的疗效。易普利姆玛联合辅助治疗提高易普利姆玛反应率正在临床评价中。第一部分研究发现,WYK431对人胃癌BGC823细胞有较好的抗肿瘤活性但靶点不明。本研究,对WYK431进行激酶谱检测,结果显示WYK431在10μM对PI3Kinase（p110δ/p85α）抑制率为80.5%。MTT结果显示,WYK431对很多人源肿瘤细胞株具有良好的抗肿瘤活性,其中人黑色素瘤A375细胞是最敏感的。皮下接种黑色素瘤A375细胞异体移植瘤的BALB/c裸鼠分别给予5mg/kg,10mg/kg和20mg/kg WYK431（i.p.）治疗。结果显示5mg/kg,10mg/kg和20mg/kg WYK431治疗组与对照组相比抑瘤率分别为18.92%,51.18%,76.60%（p<0.05）。WYK431治疗组耐受性良好,体重只有轻微的降低。免疫组化Ki67染色结果显示,WYK431治疗组与对照组相比Ki67阳性细胞数明显降低,提示WYK431可抑制肿瘤组织中细胞的增殖。并对其作用机制进一步研究。周期分析结果表明,WYK431能够将人黑色素瘤A375阻滞于S期。AnnexinV-FITC/PI双染结果显示,WYK431诱导人黑色素瘤A375凋亡并呈剂量依赖性增多。TUNEL分析结果可见,与对照组相比,WYK431治疗组TUNEL阳性细胞数量明显增加,提示WYK431诱导了肿瘤组织内细胞凋亡。免疫组化CD31染色结果也表明,WYK431治疗组肿瘤内微血管密度明显降低,提示WYK431具抑制肿瘤内血管生成。进一步探讨WYK431引起人黑色素瘤A375凋亡的机制结果显示,WYK431可以激活caspase3和caspase9o线粒体膜电位检测结果显示,WYK431可以降低线粒体的膜电位。WYK431上调促凋亡蛋白BAX的表达,对Bcl-2表达没有影响。综上所述,WYK431通过线粒体途径诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡。PI3K/Akt和MAPK信号通路在黑色素瘤中处于异常活化状态,是黑色素瘤治疗的重要靶点。实验结果显示,WYK431可以显着降低磷酸化Akt和Erk的表达,对Akt和Erk的表达没有影响。据文献报道,Stat3在大多数黑色素瘤细胞株和黑色素瘤临床样本中处于持续激活状态,Stat3信号通路激活与vemurafenib获得性耐药有关。我们的研究发现,WYK431剂量依赖性降低磷酸化Stat3的表达,对Stat3表达没有影响。综上所述,WYK431是一个新型的小分子化合物,体外可以诱导黑色素瘤A375细胞S期阻滞和线粒体途径凋亡。体内可以抑制黑色素瘤A375细胞皮下裸鼠异体移植瘤的生长。WYK431作为一个潜在的有效的抗黑色素瘤药物值得进一步研究。
二、HER2/neu肽诱导BALB/c小鼠产生特异性CTL及其抑瘤作用的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HER2/neu肽诱导BALB/c小鼠产生特异性CTL及其抑瘤作用的研究（论文提纲范文）
（1）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（2）表达RGD、TAT和Gel基因重组减毒沙门菌的构建及其对乳腺癌的抑瘤作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 细菌在肿瘤基因治疗中的研究进展 |
| 1.1.1 减毒沙门菌在肿瘤治疗中的研究背景 |
| 1.1.2 细菌在肿瘤治疗中的安全性 |
| 1.1.3 沙门菌在肿瘤治疗中的研究现状 |
| 1.2 肿瘤靶向肽的作用机制和研究进展 |
| 1.2.1 肿瘤靶向肽RGD的作用机制 |
| 1.2.2 肿瘤靶向肽RGD的研究进展 |
| 1.3 细胞穿膜肽的作用机制和研究进展 |
| 1.3.1 细胞穿膜肽TAT的作用机制 |
| 1.3.2 细胞穿膜肽TAT的研究进展 |
| 1.4 白树毒蛋白的作用机制和研究进展 |
| 1.4.1 白树毒素GEL的作用机制 |
| 1.4.2 白树毒素GEL的研究进展 |
| 1.5 研究方案 |
| 第二章 表达RGD、TAT和GEL基因重组减毒沙门菌的制备及检测 |
| 第一节 表达RGD、TAT和GEL基因真核表达质粒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 重组质粒pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-RGD -GEL、pMD- TAT-GEL和pMD- GEL的提取 |
| 2.2.4 pEGFP-N1和pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-RGD -GEL、pMD- TAT-GEL和pMD- GEL的双酶切 |
| 2.2.5 产物回收 |
| 2.2.6 pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-RGD -GEL、pMD- TAT-GEL和pMD- GEL质粒的制备与鉴定 |
| 2.2.6.1 胶回产物连接 |
| 2.2.6.2 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD -GEL、pEGFP- TAT-GEL和pEGFP -GEL转化DH5α 感受态细胞 |
| 2.2.6.3 重组质粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD -GEL、pEGFP- TAT-GEL和pEGFP -GEL的鉴定 |
| 2.2.7 重组质粒图谱 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RGD-TAT-GEL、RGD-GEL、TAT-GEL及GEL基因扩增 |
| 2.3.2 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL和pEGFP-GEL重组表达质粒的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第二节 重组减毒沙门菌的制备及检测 |
| 2.6 材料 |
| 2.6.1 菌株、细胞系和载体 |
| 2.6.2 主要试剂 |
| 2.6.3 主要仪器 |
| 2.7 方法 |
| 2.7.1 重组减毒沙门菌LH430感受态细胞的制备 |
| 2.7.2 重组减毒沙门菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL和LH430/pEGFP-GEL的构建与鉴定 |
| 2.7.2.1 LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL和LH430/pEGFP-GEL的构建 |
| 2.7.2.2 重组LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL和LH430/pEGFP-GEL的鉴定 |
| 2.7.3 MDA-MB-231 细胞的培养 |
| 2.7.4 重组减毒沙门菌侵染MDA-MB-231 细胞 |
| 2.7.5 重组减毒沙门菌侵染MDA-MB-231 细胞总RNA的提取 |
| 2.7.6 RT-PCR检测目的基因RGD-TAT-GEL、RGD-GEL、TAT-GEL和GEL的表达 |
| 2.7.7 Western blotting检测 |
| 2.7.7.1 细胞总蛋白的提取 |
| 2.7.7.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.7.7.3 SDS-PAGE分离蛋白质 |
| 2.7.7.4 转膜 |
| 2.7.7.5 封闭 |
| 2.7.7.6 抗体孵育及显色 |
| 2.8 结果与分析 |
| 2.8.1 LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL和LH430/pEGFP-GEL的制备与鉴定 |
| 2.8.2 重组沙门菌侵染MDA-MB-231 细胞检测结果 |
| 2.8.3 RT-PCR检测目的基因表达 |
| 2.8.4 Western Blotting检测蛋白表达结果 |
| 2.9 讨论 |
| 2.10 小结 |
| 第三章 重组减毒沙门菌的体外抑瘤作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 重组减毒沙门菌侵染MDA-MB-231 细胞 |
| 3.2.3 CCK-8 法检测LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL对细胞增殖作用的影响 |
| 3.2.4 Western blotting检测MDA-MB-231 细胞中凋亡蛋白 |
| 3.2.5 流式细胞术检测MDA-MB-231 细胞凋亡情况 |
| 3.2.6 细胞划痕实验检测MDA-MB-231 细胞迁移能力 |
| 3.2.7 细胞趋化实验检测FBS介导MDA-MB-231 细胞的迁移能力 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组减毒沙门菌抑制肿瘤细胞及正常细胞增殖作用的测定 |
| 3.3.2 重组减毒沙门菌对肿瘤细胞及正常细胞的IC50值 |
| 3.3.3 重组减毒沙门菌侵染MDA-MB-231 细胞中凋亡蛋白的表达 |
| 3.3.4 重组减毒沙门菌对MDA-MB-231 细胞的凋亡作用 |
| 3.3.5 重组减毒沙门菌抑制MDA-MB-231 细胞迁移情况 |
| 3.3.6 重组减毒沙门菌可抑制FBS介导的MDA-MB-231 细胞迁移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组减毒沙门菌的体内抑瘤作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞系和实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 MDA-MB-231 实体瘤模型的建立与荷瘤小鼠的治疗 |
| 4.2.2 荷瘤小鼠活体成像 |
| 4.2.3 冰冻切片的制备 |
| 4.2.4 病理切片的制备及HE染色 |
| 4.2.5 免疫组织化学染色 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 荷瘤小鼠体重变化曲线 |
| 4.3.2 重组减毒沙门菌对荷瘤小鼠内脏器官及肿瘤重量的影响 |
| 4.3.3 小鼠活体成像结果 |
| 4.3.4 肿瘤组织冰冻切片结果 |
| 4.3.5 各组织HE染色结果 |
| 4.3.6 各肿瘤组织免疫组织化学染色结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 基因测序结果 |
| 1 RGD+TAT+GEL |
| 2 RGD+GEL |
| 3 TAT+GEL |
| 4 GEL |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）左金丸联合新型EGFR靶向多肽MM2对大肠癌的抑制作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 大肠癌的流行病学 |
| 2 EGFR与大肠癌发生发展的关系 |
| 3 多肽药物的特点 |
| 4 多肽固相合成简介 |
| 5 中药左金丸在大肠癌治疗中的应用 |
| 第一部分 EGFR靶向多肽的合成与药效 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要化学合成仪器 |
| 1.2 主要化学合成试剂 |
| 1.3 生物实验仪器 |
| 1.4 生物学实验试剂 |
| 1.5 细胞培养生化试剂 |
| 1.6 Western blot生化试剂 |
| 1.7 细胞株 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 多肽库的合成 |
| 2.2 多肽库的荧光筛选 |
| 2.3 Hits的解析与合成 |
| 2.4 固相合成 |
| 2.5 HCT-8细胞培养 |
| 2.6 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.7 荧光偏振法 |
| 2.8 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.0 固相合成多肽 |
| 3.1 荧光偏振法测定两种模拟多肽对EGFR的亲和力 |
| 3.2 两种多肽模拟物对EGFR磷酸化的抑制作用 |
| 4 讨论与小结 |
| 第二部分 EGFR靶向药物MM2 在大肠癌细胞体内外的作用疗效及机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MM2对大肠癌细胞增殖的影响 |
| 2.2 MM2对大肠癌细胞迁移能力的影响 |
| 2.3 MM2对大肠癌细胞侵袭能力的影响 |
| 2.4 MM2对EGFR磷酸化的抑制作用 |
| 2.5 MM2对EHGR下游信号通路的抑制作用 |
| 2.6 MM2对小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用 |
| 3 讨论与小结 |
| 第三部分 EGFR靶向药物联合左金丸对大肠癌细胞体外抑制作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 细胞培养 |
| 1.5 细胞单克隆形成 |
| 1.6 划痕实验法检测MM2联合左金丸对大肠癌细胞迁移能力的影响 |
| 1.7 Transwell法检测MM2 对大肠癌细胞侵袭能力的影响 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MM2对大肠癌细胞增殖的影响 |
| 2.2 M2联合左金丸对大肠癌细胞迁移能力的影响 |
| 2.3 MM2联合左金丸对大肠癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3 讨论与小结 |
| 第四部分 左金丸联合EGFR靶向药物对大肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 免疫组化相关仪器 |
| 1.5 裸鼠皮下移植瘤模型 |
| 1.6 免疫组化 |
| 1.7 WESTERN BLOT检测 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MM2联合左金丸对小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用 |
| 2.2 免疫组化测定小鼠移植瘤中EGFR、AKT、ERK 磷酸化表达情况 |
| 3 分析与讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述1 结肠癌分子靶向治疗中EGFR的耐药机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述2 WSB-1与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文 |
（4）基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪流感的研究进展 |
| 1.1 猪流感的流行现状 |
| 1.2 猪流感病毒的结构特点 |
| 1.3 猪流感病毒疫苗的研究进展 |
| 第二章 侵入型乳酸菌载体的研究进展 |
| 2.1 乳酸菌作为口服递送载体的研究进展 |
| 2.2 基于Fn BPA的侵入型乳酸菌的研究进展 |
| 2.3 DCs靶向型疫苗的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 基于FnBPA的侵入型乳酸菌的构建及免疫调节作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 表达CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌的构建及免疫调节作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 两类侵入型乳酸菌递送SIV HA蛋白的免疫保护效果评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 表达CD11c单链抗体侵入型乳酸菌的分子免疫机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERT-E1a对结肠癌抑制作用的实验研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 转移性结直肠癌临床治疗进展 |
| 2.1.1 转移性结直肠癌靶向治疗进展 |
| 2.1.2 CRC腹膜种植转移研究进展 |
| 2.1.3 转移性CRC的治疗指南系统回顾 |
| 2.2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.2.1 临床应用进展 |
| 2.2.2 最小化肝脾对溶瘤病毒的隔离作用 |
| 2.2.3 逃避血清因子的中和作用 |
| 2.2.4 选择性地增强肿瘤血管通透性 |
| 2.2.5 靶向于肿瘤血管内皮的病毒 |
| 2.2.6 增强溶瘤病毒在肿瘤内的扩散 |
| 2.2.7 通过基因重组修饰技术或者化学增敏剂的作用促进病毒增殖 |
| 2.2.8 增强病毒在肿瘤内的扩散: |
| 2.2.9 肿瘤特异选择溶瘤病毒的结构 |
| 2.2.10 控制适应性免疫反应同时清除溶瘤病毒: |
| 2.2.11 增强抗肿瘤免疫力 |
| 2.2.12 溶瘤病毒适应征 |
| 2.2.13 溶瘤病毒介导免疫治疗的机制 |
| 2.2.14 腺病毒的临床应用前景与挑战 |
| 2.2.15 病毒临床试验的相关因素 |
| 2.2.16 其它相关因素 |
| 第3章 研究内容 |
| 3.1 重组腺病毒的制备及对结肠癌细胞SW1116的抑制作用 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 重组腺病毒对结肠癌细胞SW1116的抑制方式 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 重组腺病毒对结肠癌细胞SW1116的抑制途径 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.3.3 讨论 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 重组腺病毒的体内抑瘤作用研究 |
| 3.4.1 材料与方法 |
| 3.4.2 结果 |
| 3.4.3 讨论 |
| 3.4.4 小结 |
| 第4章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）卵巢癌免疫生物学治疗策略研究进展（论文提纲范文）
| 1 特异性主动免疫疗法 |
| 1.1 细胞疫苗 |
| 1.1.1 肿瘤细胞疫苗 |
| 1.1.2 树突状细胞疫苗 |
| 1.1.2. 1 肿瘤相关抗原肽负载DC疫苗 |
| 1.1.2. 2 肿瘤细胞提取物负载DC疫苗 |
| 1.1.2. 3 免疫活性分子修饰DC疫苗 |
| 1.1.3 融合细胞疫苗 |
| 1.1.3. 1 肿瘤细胞融合DC疫苗 |
| 1.1.3. 2 抗独特型抗体融合DC疫苗 |
| 1.1.3. 3 Exosome融合DC疫苗 |
| 1.1.3. 4 肿瘤相关抗原联合细胞因子融合DC疫苗 |
| 1.2 分子疫苗 |
| 1.2.1 蛋白及多肽疫苗 |
| 1.2.2 抗独特型肿瘤疫苗 |
| 2 被动型免疫疗法 |
| 2.1 单克隆抗体拮抗疗法 |
| 2.2 细胞过继免疫疗法 |
| 2.2.1 LAK |
| 2.2.2 CIK细胞 |
| 2.2.3 DC-CIK细胞 |
| 2.2.4 NK细胞 |
| 2.2.5 其他 |
| 2.3 细胞因子疗法 |
| 3 单克隆抗体免疫导向疗法 |
| 4 基因疗法 |
| 4.1 自杀基因靶向疗法 |
| 4.2 癌基因表达封闭疗法 |
| 4.3 抑癌基因恢复疗法 |
| 4.4 肿瘤多药耐药基因拮抗疗法 |
| 4.5 免疫学基因疫苗疗法 |
| 5 肿瘤血管生成拮抗疗法 |
| 6 抗肿瘤免疫抑制疗法 |
| 6.1 靶向于Treg的免疫抑制阻断疗法 |
| 6.2 靶向于免疫抑制分子的免疫抑制阻断疗法 |
| 7 卵巢癌免疫生物学治疗面临的困难 |
| 7.1 如何早期诊断早期干预 |
| 7.2 如何打破肿瘤免疫抑制 |
| 7.3 如何应对复发耐药 |
| 7.4 如何提高基因治疗可行性 |
| 7.5 如何把控治疗的安全稳定性 |
| 7.6 如何制订并有效实施个体化综合治疗方案 |
| 8 展望 |
（7）特异性抗体介导的蜂毒肽对骨肉瘤的抑制作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 骨肉瘤的现行治疗策略与最新疗法 |
| 1.1 现行治疗策略 |
| 1.2 新兴疗法及新的治疗靶点 |
| 1.3 未来展望 |
| 第2章 通过临床前试验项目对骨肉瘤靶向治疗的回顾 |
| 2.1 在骨肉瘤试验组中具有抗肿瘤活性的药物 |
| 2.2 靶向治疗骨肉瘤的渐进式探索 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组蛋白表达载体的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组融合蛋白表达及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 重组抗体对人骨肉瘤细胞 OS732 的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 重组抗体对骨肉瘤模型的治疗作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）中药刺蒺藜及刺蒺藜苷抗乳腺癌作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 中药刺蒺藜及其有效成分抗肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 乳腺癌与雌激素作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 第一部分 体外研究 |
| 实验一 中药刺蒺藜抗肿瘤作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 刺蒺藜苷抗肿瘤作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 中药刺蒺藜对肿瘤细胞DNA甲基化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 刺蒺藜苷在MCF-7中与雌激素拮抗作用的初步研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 刺蒺藜苷对肿瘤细胞HDAC活性作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体内研究 |
| 实验一 中药刺蒺藜及主要成分刺蒺藜苷体内抗肿瘤研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 后续研究计划 |
| 结语 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）猪Gp96N增强PRRSV合成肽疫苗、亚单位疫苗及PCV2灭活疫苗免疫效应的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1 免疫佐剂的研究进展 |
| 1.1 免疫佐剂概述 |
| 1.2 免疫佐剂的作用机理 |
| 1.3 常见疫苗免疫佐剂 |
| 1.4 免疫佐剂应用展望 |
| 2 Gp96研究进展 |
| 2.1 Gp96概述 |
| 2.2 Gp96的结构特点及免疫学特性 |
| 2.3 Gp96佐剂效应的分子机制 |
| 2.4 Gp96在抗感染和抗肿瘤中的应用研究 |
| 2.5 Gp96的应用展望 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第二章 猪Gp96N的表达与纯化 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 菌株及质粒 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞总RNA的提取 |
| 2.2 RT-PCR扩增总cDNA |
| 2.3 PCR扩增猪Gp96N基因 |
| 2.4 重组质粒pET-32a/Gp96N的构建 |
| 2.5 大肠杆菌的转化 |
| 2.6 大肠杆菌表达猪Gp96N及蛋白检测 |
| 2.7 阴离子交换层析纯化猪Gp96N蛋白 |
| 2.8 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.9 猪Gp96N的基因扩增及重组质粒pPICZaA/Gp96N的构建 |
| 2.10 毕赤酵母的电转化 |
| 2.11 阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.12 重组酵母诱导表达猪Gp96N蛋白及检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大肠杆菌表达猪Gp96N及目的蛋白的纯化及检测 |
| 3.2 酵母菌表达猪Gp96N及目的蛋白的纯化与检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 Gp96N对PRRSV合成肽免疫效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 病毒和细胞 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PRRSV的B细胞表位和T细胞表位多肽的合成 |
| 2.2 蛋白佐剂猪Gp96N的获得 |
| 2.3 病毒粒子纯化 |
| 2.4 实验动物分组及免疫 |
| 2.5 攻毒实验 |
| 2.6 间接免疫荧光染色(IFA) |
| 2.7 ELISA检测抗体水平 |
| 2.8 病毒-血清中和实验 |
| 2.9 小鼠脾细胞的分离 |
| 2.10 病毒滴度(TCID_(50))检测 |
| 2.11 猪PBMC的分离 |
| 2.12 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 2.13 小鼠IFN-γ/EIISPOT实验 |
| 2.14 ELISA检测猪细胞因子 |
| 2.15 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRRSV的B细胞表位和T细胞表位的序列分析 |
| 3.2 PRRSV的B细胞表位合成肽能激活小鼠体液免疫 |
| 3.3 猪Gp96N能够增强B细胞表位肽对小鼠的体液免疫效应 |
| 3.4 PRRSV的B细胞表位肽能激发猪的体液免疫 |
| 3.5 猪Gp96N能够增强B细胞表位肽对猪的体液免疫效应 |
| 3.6 猪Gp96N与PRRSV的T细胞表位肽联合免疫能够激活小鼠的细胞免疫 |
| 3.7 猪Gp96N与PRRSV合成肽联合免疫能够激活猪的细胞免疫 |
| 3.8 猪Gp96N对PRRSV合成肽免疫效应的增强具有Thl型偏好性 |
| 3.9 猪Gp96N对PRRSV合成肽免疫保护力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 猪Gp96N对PRRSV亚单位疫苗免疫效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PRRSV的B细胞表位亚单位疫苗重组质粒的构建 |
| 2.2 重组蛋白Cpl、Cp2的表达与检测 |
| 2.3 猪Gp96N蛋白的获得 |
| 2.4 实验动物分组及免疫 |
| 2.5 IFA检测PRRSV特异性抗体 |
| 2.6 体液免疫水平检测 |
| 2.7 细胞免疫水平检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 筛选出9个抗原性较高的PRRSV的B细胞表位 |
| 3.2 重组蛋白Cpl、Cp2的表达纯化及检测 |
| 3.3 Cpl、Cp2能够激发小鼠产生PRRSV特异性抗体 |
| 3.4 猪Gp96N能够增强Cp对小鼠的体液免疫效应 |
| 3.5 猪Gp96N能够增强Cp对小鼠的细胞免疫效应 |
| 3.6 猪Gp96N能够增强Cp对猪的体液免疫效应 |
| 3.7 猪Gp96N能够增强Cp对猪的细胞免疫效应 |
| 3.8 猪Gp96N增强PRRSV亚单位疫苗Cp的免疫效应具有Th1型偏好性 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 猪Gp96N对PCV2灭活疫苗免疫效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 病毒和细胞 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫佐剂猪Gp96N蛋白的制备 |
| 2.2 不同剂量猪Gp96N与疫苗联合免疫的制备方法 |
| 2.3 实验动物分组及免疫方案 |
| 2.4 PCV2特异性抗体IgG的检测 |
| 2.5 血清细胞因子检测 |
| 3 结论与分析 |
| 3.1 猪Gp96N能够增强PCV2灭活疫苗对猪的体液免疫 |
| 3.2 细胞因子检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）新型喹唑啉衍生物WYK431的抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 第一部分 WYK431对胃癌BGC823抗肿瘤作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. WYK 431及其衍生物对细胞增殖活性的影响 |
| 2. WYK 431在体外对胃癌BGC823细胞增殖活性的影响 |
| 3. WYK 431在体内对BGC823裸鼠异体移植瘤生长的影响 |
| 4. WYK 431对荷瘤鼠外周血细胞数量的影响 |
| 5. WYK 431阻滞BGC 823细胞阻滞于G_(2)/M期 |
| 6. WYK 431对BGC 823细胞G_(2)/M相关蛋白表达的影响 |
| 7. WYK 431诱导BGC 823细胞凋亡 |
| 8. TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况 |
| 9. WYK 431通过线粒体途径诱导BGC 823细胞凋亡 |
| 9.1 WYK 431对BGC 823细胞caspase-3,caspase-8和caspase-9的表达的影响 |
| 9.2 WYK431诱导细胞色素C释放 |
| 9.3 WYK 431对胃癌BGC823细胞线粒体膜电位的影响 |
| 9.4 WYK 431对胃癌BGC823细胞Bcl-2和Bax表达的影响 |
| 10. WYK 431对胃癌BGC823细胞PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 11. WYK 431对胃癌BGC823细胞基因PIK3CA转录活性的影响 |
| 12. WYK 431对胃癌BGC823细胞ERK表达的影响 |
| 13. WYK 431对胃癌BGC823细胞EGFR表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 WYK431对黑色素瘤A375抗肿瘤作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. WYK 431对不同来源的人肿瘤细胞增殖活性的影响 |
| 2. WYK 431对黑色素瘤A375细胞增殖活性的影响 |
| 3. 体内药效学研究 |
| 3.1 WYK 431腹腔注射体内药效学评价 |
| 3.2 WYK 431口服体内药效学评价 |
| 4. WYK 431对激酶活性的影响 |
| 5. WYK 431阻滞黑色素瘤A375细胞于S期 |
| 6. WYK 431对黑色素瘤A375细胞S相关蛋白的影响 |
| 7. WYK 431诱导黑色素瘤A375细胞细胞凋亡 |
| 8. TUNEL法分析肿瘤组织中细胞凋亡 |
| 9. WYK 431通过线粒体途径诱导黑色素瘤A375细胞凋亡 |
| 9.1 WYK 431对黑色素瘤A375细胞PARP,caspase-3,caspase-8和caspase-9的表达的影响 |
| 9.2 WYK 431对黑色素瘤A375细胞线粒体膜电位的影响 |
| 9.3 WYK 431对黑色素瘤A375细胞Bcl-2和Bax表达的影响 |
| 10. WYK 431对黑色素瘤A375细胞ERK表达的影响 |
| 11. WYK 431对黑色素瘤A375细胞STAT 3表达的影响 |
| 12. WYK 431对黑色素瘤A375细胞Akt表达的影响 |
| 13. 免疫组化检测Ki67和CD31 |
| 14. 大鼠口服化合物WYK-431后血浆药代动力学研究 |
| 15. WYK-431在脑组织和肿瘤组织中的含量测定 |
| 16. WYK 431在大鼠肝微粒体中的稳定性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、HER2/neu肽诱导BALB/c小鼠产生特异性CTL及其抑瘤作用的研究（论文参考文献）
- [1]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [2]表达RGD、TAT和Gel基因重组减毒沙门菌的构建及其对乳腺癌的抑瘤作用研究[D]. 蓝肇煜. 天津农学院, 2020
- [3]左金丸联合新型EGFR靶向多肽MM2对大肠癌的抑制作用[D]. 李春浦. 上海中医药大学, 2019(03)
- [4]基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究[D]. 刘晶. 吉林农业大学, 2019
- [5]重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERT-E1a对结肠癌抑制作用的实验研究[D]. 杨国华. 吉林大学, 2015(06)
- [6]卵巢癌免疫生物学治疗策略研究进展[J]. 崔澂,王雅卓,郝淑维. 中国免疫学杂志, 2014(09)
- [7]特异性抗体介导的蜂毒肽对骨肉瘤的抑制作用[D]. 费丹. 吉林大学, 2014(09)
- [8]中药刺蒺藜及刺蒺藜苷抗乳腺癌作用机制研究[D]. 王荣华. 北京中医药大学, 2014(04)
- [9]猪Gp96N增强PRRSV合成肽疫苗、亚单位疫苗及PCV2灭活疫苗免疫效应的分析[D]. 贾晓娟. 中国农业大学, 2014(11)
- [10]新型喹唑啉衍生物WYK431的抗肿瘤作用及机制研究[D]. 王田恩. 北京协和医学院, 2014(01)