一、时间温度梯度凝胶电泳结合基因测序对乳癌体细胞全线粒体DNA扫描及突变检测（论文文献综述）
罗林[1]（2021）在《奶牛乳脂性状候选基因SNP及Indel位点筛选及其与产奶性状关联分析》文中进行了进一步梳理乳脂作为奶牛重要的经济性状,也是遗传育种工作的主要目标性状。SNP及Indel位点是分子标记辅助选择的主要DNA分子遗传标记,将其与现代育种技术结合,是目前分子育种的主要手段。本研究在收集规模化牛场连续三年完整DHI数据的基础上,首先开展DHI数据的乳成分与体细胞评分、胎次和季节之间的相关性分析;进而分别利用PCR-RFLP和TD-PCR法对中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因SNP及Indel位点进行筛选及基因型鉴定;最终将乳脂性状候选基因SNPs及Indels位点与中国荷斯坦奶牛产奶性状进行关联分析,以明确与产奶性状相关分子标记位点,为乳脂性状相关候选基因的分子标记辅助选择奠定基础。研究结果如下:1、通过收集2017年～2019年DHI数据,经统计分析后,发现该牛场乳房炎奶牛患病率较低;SCS、产奶量、乳成分均相关,胎次与SCS、产奶量相关;同时发现SCC处于10～20万个/m L时,便会引起牛奶损失以及经济损失。2、在5个候选基因中筛选获得35个SNP位点;鉴定出SNP位点2个,G490025A群体遗传参数分析结果表明该位点在群体中分布均匀且多态信息含量丰富,且该位点与奶牛日产奶量显着相关;G64695500A群体遗传参数分析结果表明该位点在群体中分布均匀且多态信息含量丰富,并且该位点与乳蛋白率呈现极显着相关性,与SCS和日产奶量呈现显着相关性。3、在选择的13个候选基因筛选鉴定出Indel位点2个;rs381960368位点群体遗传参数结果表明该位点在群体中分布均匀,多态信息含量丰富;该位点与日产奶量、乳蛋白率、SCS具有显着相关性。rs801171594位点群体遗传参数结果表明该位点在群体中分布均匀,多态信息含量丰富;该位点与乳蛋白率呈现显着相关性。4、鉴定获得的SNP位点与Indel位点存在不同程度的连锁不平衡,位于BDNF的rs801171594与位于CYHR1基因中的G64695500A连锁不平衡程度最高,2个SNP位点连锁不平衡程度较高。综上所述,本研究筛选鉴定的G64695500A和G490025A SNPs位点、rs381960368和rs801171594 Indels位点均可作为奶牛产奶性状相关分子标记,可用于奶牛分子标记辅助选择中,促进奶牛遗传育种进程,为我国畜牧业发展贡献力量,为后续实验奠定基础。
刘思琪[2]（2020）在《氧化磷酸化缺陷激活适应性反应维持线粒体膜电位》文中提出氧化磷酸化产生线粒体膜电位,用于合成ATP以及驱动线粒体蛋白、代谢物的转运。氧化磷酸化缺陷导致线粒体膜电位下降,抑制线粒体生成和代谢活动,危及细胞存活。一个关键原因是线粒体合成的铁硫簇是很多看家基因的辅因子,铁硫簇合成系统、铁离子的转运依赖于线粒体膜电位。过去多年的研究表明线粒体膜电位下降激活适应性反应,以调整细胞代谢,清除损伤的线粒体,降解不能转运入线粒体的前体蛋白等。但是,针对线粒体膜电位的保护机制研究较少。我们通过分析酵母细胞和小鼠模型的转录组和线粒体蛋白质组的变化,探究细胞在氧化磷酸化缺陷时是如何维持线粒体膜电位的。我们发现在分别缺失复合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和线粒体DNA的酵母细胞中,线粒体膜电位和细胞的增殖速率逐渐降低。通过详尽的组学分析,我们发现随着线粒体膜电位的降低,适应性反应被依次激活:首先,氧化磷酸化复合物亚基在转录水平发生下调,其中ATP合酶抑制蛋白Inh1的下调至关重要;其次,mRNA结合蛋白Puf3发生高度磷酸化,上调数百条编码线粒体蛋白的mRNA,促进线粒体生成,其中膜间隙蛋白转运受体Mia40的上调最为关键;Snf1/AMPK被激活,上调糖酵解,抑制核糖体生成,优化ATP的产生与消耗;最后,当膜电位进一步降低时,胞质分子伴侣的转录发生上调。这些适应性反应通过释放Fi-ATPase的活性,促进线粒体生成,增加ATP的供应,共同维持线粒体膜电位,从而维持铁硫簇的合成和细胞增殖。对于心脏线粒体DNA缺失的Myh6-cre,TfamloxP/loxP小鼠,我们同样发现了糖酵解基因的上调,氧化磷酸化复合物亚基的下调,以及转录后水平介导的线粒体生成。Inh1的同源基因,ATPIF1受转录后水平的调控发生下调。在线粒体DNA缺失的HeLa细胞中敲除ATPIF1可以升高线粒体膜电位,维持细胞的增殖速率。但在Myh6-cre,TfamloxP/loxP小鼠中敲除ATPIF1不能延长寿命。我们的研究揭示了氧化磷酸化缺陷的细胞会激活适应性反应维持线粒体膜电位,促进线粒体功能的恢复。我们发现的关键基因Inh1、Mia40、Snf1在进化上是保守的,为氧化磷酸化相关疾病的分析提供了线索。
衡双平[3]（2015）在《油菜hau CMS线粒体基因组和不育基因的研究》文中研究指明细胞质雄性不育（CMS）是油菜杂种优势利用的重要途径之一,同时也是研究核质互作的重要实验材料。因此CMS系统深受育种学家和生物学家的广泛关注。目前,在油菜生产中目前应用的CMS系统有:pol CMS、ogu CMS等。同时,在芸薹属中还有很多正在研究的细胞质雄性不育类型,包括nap胞质、Tour CMS、Moricandia arvensis CMS、Nsa CMS、NCa CMS、hau CMS、菘油CMS（inap CMS）等。细胞质雄性不育主要是由于细胞质中的线粒体基因导致的雄性不育,但是目前在油菜中线粒体基因如何导致雄蕊的败育还不十分清楚。油菜hau CMS不育性彻底、稳定,在生产上有很大的应用潜质。本研究利用油菜hau CMS不育系、保持系以及测恢F1可育植株等,通过细胞学、遗传学和基因组学等研究方法,对油菜hau CMS的线粒体基因组序列信息以及导致细胞质雄性不育的原因进行初步解析,本研究的主要结果如下:1.通过细胞学研究发现,hau CMS不育系败育时期发生在孢原细胞分化时期,雄蕊败育彻底,没有花粉囊的出现。hau CMS不育系雄蕊中的线粒体空泡化,细胞肿胀,发育后期细胞被中央大液泡填充,细胞凋亡,最终导致雄蕊败育。2.利用二代测序技术,完成hau CMS不育系和保持系的线粒体基因组测序。通过比较分析发现:同保持系相比,hau CMS不育系的线粒体基因组发生了大量的重组,hau CMS细胞质属于异源胞质。3.通过对hau CMS不育系和保持系的线粒体基因组序列对比,找出不育系和保持系特异的开放阅读框,利用这些未知功能的ORFs,进一步开发出不育系和保持系特异的SCAR标记,用来区分不育系和保持系;通过对hau CMS不育系和保持系的线粒体基因组的研究进一步证明植物线粒体基因组亚计量效应的存在;通过对种子植物中已经测序完成的线粒体基因组进行序列对比,发现芸薹属中黑芥和埃塞俄比亚芥菜的线粒体基因组跟白菜,甘蓝,甘蓝型油菜,芥菜型油菜的线粒体基因组不能够聚到一起。从线粒体基因组的角度进一步证明在禹氏三角中B基因组的遗传距离距A、C基因组远。4.通过对甘蓝型油菜中6种不同胞质的线粒体基因组进行序列对比,总共得到90条不同胞质类型特异的序列（MSSs）。利用这些不同胞质类型特异的线粒体序列,成功开发了12对不同胞质类型特异的SCAR标记,这些标记可以成功的将这6种不同的胞质区分开来;利用本研究开发的MSS标记,我们对全国各个育种单位的570份甘蓝型油菜的胞质类型进行鉴定,最终鉴定出了其中533份甘蓝型油菜的胞质类型。在甘蓝型油菜生产上目前应用的比较广的是nap胞质和pol CMS胞质类型。还有37份甘蓝型油菜的胞质类型没有被鉴定,它们可能是一些未被鉴定的胞质类型,对这些胞质类型的鉴定还有待进一步研究。5.通过Northern blot和q PCR技术对hau CMS不育系中特异的ORF进行研究,发现orf288在不育和恢复材料中转录本发生了很大的改变。另外两个不育胞质特异的ORFs:orf325和orf220的转录本没有发生明显的改变。不育基因orf288对大肠杆菌的生长有抑制作用（毒蛋白）,通过对orf288进行不同长度的截短,发现orf288的毒性区域主要集中在它的三个跨膜结构域。通过构建表达载体,转拟南芥和芥菜型油菜都证明orf288为hau CMS的不育基因,导致不育的核心区段主要在该蛋白的C端,而不在N端的跨膜结构区域,表明育性可能与毒性无关。orf325与hau CMS的育性无关;orf220与hau CMS育性的关系还有待进一步研究。6.通过对芥菜型油菜不育系和保持系花蕾提取RNA进行转录组测序,对差异表达基因进行分析。包括MADS box家族的基因在内的很多参与早期雄蕊发育的基因在hau CMS不育系中都下调表达。参与到氧化还原反应,细胞代谢和蛋白合成等路径的基因在不育系中也有下调表达。
王彬[4]（2015）在《玉米C型胞质不育的机理与穗发育相关miRNA的研究》文中进行了进一步梳理玉米是杂种优势利用最为普遍的一类作物,利用雄性不育系是玉米杂种优势利用中简化制种程序、降低制种成本的一种重要手段。但由于玉米C型胞质雄性不育产生的分子机理极其复杂,其不育机制至今尚未明确。miRNA是小分子非编码RNA,参与调节基因的表达,在调控生长发育和逆境胁迫响应等方面发挥作用。穗发育是影响玉米产量的重要阶段,筛选其相关miRNA及其靶基因并进行功能分析,有助于在整体水平上穗发育的分子调控机制。本研究对玉米C型胞质雄性不育的机理与穗行数发育的miRNA调控机制进行了研究,主要结论有以下几个方面:1.以细胞质雄性不育系Cms-ES 87-1（rf4rf4rf5rf5）和保持系87-1（rf4rf4rf5rf5）以及相应的恢复系Cms-ES 87-1（Rf4Rf4rf5rf5）为材料,克隆了10个在不育系和保持系的胞质线粒体DNA存在差异的ORFs;对10个差异ORFs与pET28a构建原核表达载体并转化大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）,将含有pET28a及pET28a-orf的阳性克隆菌液分别通过0.4 mM的IPTG诱导,获得了4个具有明显的毒害作用的pET28a-orf菌株。对影响生长的4个orf分别构建pCAMBIA1300-35S-orf-GFP,利用农杆菌介导的方法对拟南芥进行了转化,发现orf 415的转基因阳性植株表现败育,通过拟南芥原生质体瞬时表达发现ORF415和GFP融合蛋白定位在细胞膜及细胞质上。跨膜结构预测发现ORF415可能编码一个包含4个跨膜区域的膜蛋白。利用Western杂交发现候选基因的多克隆抗体分别在不育系及恢复系材料的减数分裂前期、四分体时期及单核期蛋白样品中检测到一条大小介于40 kDa和55 kDa之间的特异杂交条带,而在保持系花药减数分裂过程中却无此杂交条带出现,从而证明ORF415可能是玉米C型胞质雄性不育的线粒体候选基因。2.借助于Illumina/Solexa技术对不育系Cms-ES 87-1（rf4rf4rf5rf5）和恢复系Cms-ES87-1（Rf4Rf4rf5rf5）进行了转录组测序,分别获得27,618,604（A4,不育系）和25,828,640（R4,恢复系）次读数;发掘出新基因1,096个,使用BLAST软件将发掘的新基因与NR、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG数据库进行序列比对,有1,006个新基因获得注释信息;使用EBSeq对基因在不同样品中的表达量进行差异表达分析,并对其进行功能注释和富集分析,共获得了2369个差异表达基因（DEGs）。其中,1550个DEGs表达量A4高于R4,819个DEGs表达量R4高于A4,在差异表达基因中,仅在R4中表达的有172个,仅在A4中表达的有203个;GO分析中生物学过程、构成细胞的组分和分子功能分别有1793个、1871个和1668个。其中,在生物学过程中涉及细胞过程的DEG数量最多。在分子功能中参与了结合活性和催化活性的DGEs较多。差异基因参与到细胞和结合活性、催化活性占据多数;在注释的2,352差异基因中,有826个差异基因具有COG分类,并分为25类。归类到一般性预测功能、转录功能、信号转导差异基因较多,而核酸结构类、细胞运动性和细胞外基质结构类没有差异基因。差异表达基因的通路富集分析发现苯丙氨酸代谢途径富集显着性最可靠。苯丙氨酸代谢途径关键酶之一的查尔酮合成酶,调控植物育性等生理生化过程,可能在雄性不育的恢复机制中发挥着重要作用。3.利用新一代测序技术对穗行数存在显着的差异的玉米自交系综3和一个单片段代换系SSSL-10进行了测序。在两个系中,确定了28个miRNA属于11个保守的miRNA家族,它们的表达差异在2倍以上。而且在这些miRNA中属于4个miRNA家族中的14个成员是上调表达,7个miRNA家族中的14个在SSSL-10中是下调表达,并利用全基因组的降解组测序确定了miRNA的靶基因。此外预测了8个家族的29个新miRNA,其中只有一个的表达差异在2倍以上。结合前人研究结果,根据筛选出的表达差异在2倍以上miRNA及其靶基因的工作,构建了玉米穗行数形成过程的miRNA调控网络。
李林海[5]（2015）在《线粒体DNA突变与乳腺癌风险相关性研究》文中研究指明乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,绝大多数系源于乳腺的上皮组织,少数可源自乳房的各种非上皮组织,偶尔可见到混合性的癌肉瘤。据Globocan统计,2008年全球女性乳腺癌新诊断病例达138万例,占全部女性恶性肿瘤发病率的23%,已成为威胁妇女健康的主要病因。目前在中国,每年有超过120万人因癌症而死亡。而乳腺癌则成为了中国女性发病率最高的癌症,在癌症死亡原因中位居第六；中国每年乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2%和9.6%。中国全年检查出的乳腺癌患者数量是欧洲的一半,与美国基本相当。在过去30至40年中,恶性肿瘤死亡率在城市人群中的增长速度远远高于农村。如果保持这一趋势不变,那么到2021年,中国乳腺癌患者将会高达250万,发病率可能将会增加一倍。为此,我国在2012年启动了城市癌症早诊早治项目,拟在全国9个大区的14个省份针对城市高发的五大类癌症（肺癌、结直肠癌、上消化道癌、乳腺癌和肝癌）开展危险因素调查和高危人群评估、癌症筛查和卫生经济学评估工作。乳腺癌是一种全身性的疾病,在疾病的早期就有可能发生肿瘤细胞的全身扩散。乳腺癌治疗失败的原因几乎为复发和转移,其主要转移途径为血行播散,乳腺癌细胞可以通过上述途径到达机体的任一组织和器官,并在一定条件下形成转移灶。一般肿瘤在小于1 cm的情况下,医生并不会认为它是异常。但通过国外发表的文章可知,不要说是1 cm,很多肿瘤在1 mm的情况下就能够在血液里检查到循环肿瘤细胞。因此对于早期诊断来讲,乳腺癌高危因素的预测并通过日常生活中有效的预防,就显得更加有意义。正因为如此,很多研究者都投身于乳腺癌的研究,试图用各种方法找到乳腺癌的发病机制。一些乳腺癌高发病率国家对乳腺癌发病相关危险因素的研究已经取得重大进展。研究者通过对某一地区特定人群的调查与分析,确定了这一区域乳腺癌发病相关危险因素。从而让医生能够对相关信息进行个体化、量化来预测某一女性罹患乳腺癌危险性。这已经成为恶性肿瘤相关检查的重要内容。乳腺是多种内分泌激素的靶器官,如雌激素、孕激素及泌乳素等。雌激素是乳腺细胞增殖最主要的兴奋剂,黄体酮（孕酮）也会一同作用加大乳腺细胞增殖的比率。其中雌酮及雌二醇对乳腺癌的发病有直接关系。20岁前本病少见,20岁以后发病率迅速上升,45-50岁较高,绝经后发病率继续上升,可能与年老者雌酮含量提高相关。月经初潮年龄早、绝经年龄晚、不孕及初次足月产的年龄与乳腺癌发病均有关。一级亲属中有乳腺癌病史者,发病危险性是普通人群的2-3倍。乳腺良性疾病与乳腺癌的关系尚有争论,多数认为乳腺小叶上皮高度增生或不典型增生者可能与乳腺癌发病有关。另外,营养过剩、肥胖、脂肪饮食,可加强或延长雌激素对乳腺上皮细胞的刺激,从而增加发病机会。北美、北欧地区乳腺癌发病率约为亚、非、拉美地区的4倍,而低发地区居民移居至高发地区后,第二、三代移民的乳腺癌发病率逐渐升高,提示环境因素及生活方式与乳腺癌的发病有一定关系。除此之外,随着近年来对基因突变与癌症发生相关研究的不断突破和深入,人们越来越认识到癌症的发生与基因突变紧密相关。研究者纷纷进行了大量的关于癌症发生在基因水平方面的机制研究,取得了丰硕的成果,并且逐渐应用于癌症的诊断、预防当中。尤其是随着人类测序计划和Hap Map计划的顺利完成,各种高通量测序技术、基因芯片技术的广泛应用,研究者可以利用全基因组关联性分析的方法来寻找乳腺癌的易感基因。上世纪80年代,流行病学家克莱尔·金通过分析家族聚集性乳腺癌病例,认为17号染色体的某个基因可能是导致乳腺癌的主要原因。1994年,美国MYRIAD公司在此基础上顺利地找到了BRCA1,同年该公司又利用冰岛的两个乳腺癌高发家族提供的样本,在13号染色体上找到了BRCA2基因。目前为止,已发现的BRCA基因突变已达到数百种之多。但其仅限于有强烈遗传家族史的人群,包括40岁之前的一级亲属患乳腺癌,50岁之前患双侧乳腺癌,任何年龄2个或2个以上一级亲属患乳腺癌。筛查较高频率的突变形式,或对外显子11进行筛查,也有筛查全部外显子和邻近内含子的全序列监测法。但是癌症是多因素疾病,乳腺癌中BRCA只能解释与一部分的癌症之间的关联,且存在漏洞的可能性。因此,在判断结果时必须综合分析。于此同时,还应寻找其他与乳腺癌发生相关的分子机制,并可应用于高发人群的筛查、评估的标准。这对于乳腺癌的早期预测、有效预防十分必要。虽然目前高通量测序的成本已降低了不少,但是全面开展全基因组关联分析这种需要巨大样本量和测序通量的研究需要比较高的成本。因此本课题将研究的目标锁定在线粒体基因组。人线粒体DNA （mitochondrial deoxyribonucleic acid, mtDNA）是含有16.6kb的闭环双链分子,有轻链和重链之分。线粒体DNA是真核细胞中唯一存在的独立于核DNA之外的遗传物质,与细胞的氧化磷酸化功能密切相关。它编码氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）所需的13种氧化磷酸作用酶亚基,包括复合物Ⅰ中的七个亚基（ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6）,复合物Ⅲ中的一个亚基（CytB）,复合物Ⅳ中的三个亚基（COX1,COX2, COX3）以及复合物Ⅴ中的两个亚基（ATPase6,ATPase8）;同时,mtDNA还可以编码合成蛋白和生成ATP必需的22种tRNAs和两种rRNAs。mtDNA无内含子,唯一的非编码区为D-loop区（displacement-region, D-loop region）,该区已被证实为mtDNA复制转录的调控区,含有基因复制起点和负责转录调控的启动子区。虽然mtDNA有自我复制能力,但产能过程中所需要的大多数蛋白仍然是由细胞核基因组（nuclear deoxyribonucleic acid, nDNA）所编码的,因此称线粒体为半自主性复制的细胞器。过去十多年的研究发现mtDNA的突变率很高,比nDNA高出几十倍,突变类型有：大片段缺失、错义突变、移码突变以及小片段的缺失和插入等。这主要是由其自身的结构和功能特点决定的,这也导致它成为了众多致癌物作用的重要靶点。mtDNA的突变可削弱正常的呼吸功能,释放高水平的ROS,进而增加肿瘤发生的危险性,所以mtDNA被认为与肿瘤发生有密切关系。许多学者已经证实检测肿瘤细胞中的mtDNA突变比检测nDNA突变要简便可靠。临床上针对核基因损伤的肿瘤检测结果常达不到预期的效果,这是因为受到了野生型nDNA的干扰,而mtDNA在细胞中的拷贝数比nDNA高得多,比如在肿瘤细胞中突变mtDNA的拷贝数比p53基因的拷贝数高200多倍,因此检测mtDNA突变更可靠。本研究的目的在于对乳腺癌患者人群外周血中的mtDNA突变进行全基因组关联性分析来筛选具有高风险的种系突变。区别于以往研究中采用乳腺癌组织分析的体细胞突变,种系突变对于乳腺癌高风险人群的预测、乳腺癌的预防和早期无创诊断方面有着更大的意义。本研究的实验方法为通过随机采集对照组（进行全面体格检查和影像学检查排除各种肿瘤的体检者）和病例组（首次病理确诊为乳腺癌且从未进行过治疗的患者）外周血样本,获得对照组样本137例,病例组样本118例。提取总DNA后通过两段扩增法富集mtDNA,构建片段长度为200bp的高通量测序文库。通过Agilent 2100和Qubit 2.0对构建好的文库进行浓度、片段大小的测定,对文库质量进行评估,确定用于测序模板制备的文库量。在Ion One Touch 2平台上进行测序模板的制备、富集后,使用Ion 316芯片在Ion torrent PGM测序仪上进行高通量测序。测序数据运用Ion Torrent PGM服务器系统Torrent Suite4.2自带的分析软件FastQC-3.4.1.1、Assembler-3.4.2.0、Alignment2.0,coverageAnalysis 3.0软件进行测序质控和结果分析,对测序数据进行初步分析,去除接头、低质量,多克隆的序列,对原始序列进行组装,获得整体数据量、平均测序深度、测序质量等数据信息,导出测序fastq格式的原始数据和测序报告。运用基于fanse2算法的云平台,与参考Homo sapiens GRCh38基因组（NC012920）序列进行比对,进行变异位点分析及基因注释,获得每个样本的突变列表。对每个突变的样本数进行统计,计算突变频率=有突变样本数/总样本数。运用SPSS19.0统计学分析软件对突变频数进行四格表资料的卡方检验法分析对照组和病例组之间的差异性,同时进行相对风险性评估,计算OR值（Odds Ratio,OR）和95%可信区间（95% confident Internal,95% CI）,结合卡方检验p值,分析SNP与乳腺癌疾病的关联性,筛选高风险评价指标。筛除滤过率低于40%、mapping率低于80%、覆盖深度低于100X或覆盖度不均一的样本数据,最终筛选得到对照组22例和实验组83例有效数据,平均覆盖深度达到300X以上。测序数据分析结果表明,在22例对照组的mtDNA中发现170个突变位点,而在83例乳腺癌患者的mtDNA中发现393个突变位点；我们搜索到的所有突变中有283个是未有报道的,其中实验组含有232个,对照组含有88个。关联性分析结果表明其中32个突变具有显着性差异。这32个突变分布于mtDNA的D-loop区（4/32）、编码区的RNR2（1/32）、COX1 （8/32）、 COX2 （3/32）、ATP6 （1/32）、COX3 （4/32）、ND4 （3/32）、ND5 （4/32）和CYTB（2/32）。对这些突变位点的相对风险性分析发现,27个突变的OR值小于1,即为保护因素,可降低乳腺癌发病的机率。而另外5个,即位于编码区RNR2的2463位上的indelA、位于COX1的6296位上的C>A、6298位上的indelT、位于ATP6的8860位上的A>G和位于ND5的13327位上的indelA,这些位点的OR值大于1,分别为8.050、4.464、4.464、5.254、4.853,即表明这些突变可能提高乳腺癌发病的机率,为高风险因素。MT-RNR2是线粒体编码的16srRNA,隶属于Mt-rRNA家族,参与线粒体独立的核糖体组装。2463A位点的缺失可能使其结构发生变化,影响其与其他蛋白或核酸的结合。作为线粒体独立转录翻译系统中重要的部件,其功能的丧失将直接影响到其他蛋白质的合成,使整个线粒体的功能受到极大的影响。MT-COX1是在线粒体中合成的细胞色素c氧化酶中的1个亚基,是具有催化功能的重要单元。虽然COX1上的C6296T是一个无义突变,但是在研究中我们却发现COX1上的C6296T点突变和6298T位点缺失突变总是同时出现,其中的原因未知,而6298T的缺失突变却可能造成编码区的移码突变,从而改变整条肽链的氨基酸序列。COX1作为细胞色素c氧化酶上重要的催化功能亚基,它的结构改变将直接导致细胞色素c氧化酶催化功能的丧失。MT-ATP6编码“生物分子马达"ATP合成酶的一个亚基。在MT-ATP6编码区的点突变A8860G使原来的极性氨基酸苏氨酸（ACA）突变成非极性的丙氨酸（GCA）,这必然会引起蛋白质三级结构的改变,从而影响ATP合成酶的催化活性。MT-ND5编码NADH脱氢酶（复合物Ⅰ）中的第五个亚基。13237A位点的缺失将使编码区发生移码突变,整条多肽链的氨基酸序列都将发生错义突变,因此蛋白质二级、三级结构发生变化,从而影响NADH脱氢酶复合物的功能。上述5个mtDNA突变均可能影响呼吸链的合成,通过nDNA与mtDNA基因相互调控,也将使核基因突变几率增大以及引起细胞凋亡紊乱,对乳腺癌发生和发展可能起着十分重要的作用。与以往的研究不同,本课题主要针对mtDNA的种系突变与乳腺癌的关系进行研究,分析结果得到的5个突变有可能作为乳腺癌高风险人群评估的指标之一,以达到早期预防的效果。而样本采用外周血,其研究成果在将来也可以直接应用于无创诊断技术当中。由于时间的限制,本研究只采集了255例的样本,而mtDNA的高通量测序在国内尚未见报道,通过本课题已建立起较完善的技术流程,但在摸索过程中,部分样本的测序质量不太理想,为了保证关联性分析结果的科学性和可靠性,将测序数据进行了严格的筛选,最终只得到了22例对照组和83例乳腺癌病例组的mtDNA数据用于关联性分析。今后的研究将进一步扩大范围,采集全国各地的样本用于mtDNA全基因组关联性分析。本研究中筛选得到的5个突变也将在更大规模的研究中进一步验证。
蓝云锋[6]（2014）在《母系遗传高血压线粒体tRNA基因突变及脂联素通路的调控机制研究》文中指出心血管疾病已成为危及人类生命安全的首要原因。其中，原发性高血压（essential hypertension,，EH）是心血管疾病中最常见的危险因素，也是临床最常见的心血管疾病。我国成年人高血压的患病率呈增长趋势。2002年，我国18岁以上的居民高血压患病率为18.8%，2010年中国成年人高血压患病率上升为33.5％，成年男性为35.1%。近年来研究发现，部分EH患者具有母系遗传特征，而母系遗传是线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）传递所特有的遗传模式。Fuents等4报道子代高血压与母亲高血压病有显着的相关性，并进一步指出mtDNA突变与血压升高有关，但其中的机制尚未明确。因此，我们拟以小样本人群作为研究对象，试图揭示线粒体突变导致具有母系遗传特征的原发性高血压发生及发展的机制。我们通过问卷调查及全线粒体基因测序分析，研究了115个家系，根据志愿者及其三代亲属高血压的发病情况，进行分组，分别为母系遗传EH家系（A组，n=17）、非母系遗传EH家系（B组，n=65）、正常对照家系（C组，n=33）。通过比对线粒体tRNA变异及高血压发生情况，我们发现，线粒体tRNA基因的突变与EH的发生有较好相关性，EH患者的线粒体tRNA基因突变明显增多；mtDNAA5823G、mtDNA T4386C及mtDNA C15910T突变与母系遗传EH的发生可能更加密切，推测对于EH的发生可能发挥重要作用；mtDNA5597缺失与EH的发生可能有一定的关系，但与母系遗传高血压无必然联系。为了进一步明确mtDNA C15910T与母系遗传EH的关系，我们对携带该突变的内蒙家系和涿州家系的所有母系成员进行了全线粒体基因测序，并对比血生化指标的变化。结果发现，携带mtDNAC15910T的2系母系成员EH发生率为59.3%，其中男性发生率为90%，明显高于中国普通人群高血压患病率（33.5％）；携带mtDNA C15910T原发性高血压成员的发病年龄与相应性别和年龄的人群比较显着提前；对比软体动物到人类的12种生物发现，mtDNA15910具有高度的生物保守性；mt DNA15910为线粒体tRNAThr基因D-loop臂上的一个碱基，野生型为C，和15897位点G形成D-loop臂上第一个碱基对，mtDNA C15910T突变后可能影响了tRNAThr的稳定性及功能，进而导致线粒体功能异常；携带mtDNA C15910T成员的血清钠和氯化物水平明显增高，合并EH的母系成员血清钠、氯化物水平增加更为显着，提示mtDNA C15910T除本身可能致病外，也可能通过影响血清钠及氯化物水平促发血压升高。为了进一步揭示mtDNA C15910T导致母系遗传EH的发生机制，我们通过体外培养外周静脉血单个核细胞（PBMCs），分别对涿州家系的高血压母系成员（n=6，EH+Mu组）、涿州家系非高血压母系成员（n=6，Mu组）、单纯EH组（n=6，EH组）及正常对照组（n=6，Con.组）进行研究发现，携带mtDNA C15910T成员的细胞活力增加，增殖明显，ATP生成增多导致细胞内ROS增加，线粒体功能障碍而导致脂肪组织分泌APN水平降低；低脂联素进一步促进细胞增殖，产生更多的ROS，形成恶性循环，共同作用促进mtDNA C15910T母系遗传EH的发生；mtDNA C15910T突变成员的血浆APN、细胞AdipoR1及其信号通路的关键分子PGC-1α明显降低，ERRα则明显增高，提示mtDNA C15910T突变可能通过改变APN、AdipoR1、PGC-1α或APN、ERRα导致血压升高，诱发高血压的发生。
侯玲灵[7]（2012）在《鸡线粒体ND1、ND2基因遗传变异及其效应的研究》文中指出NADH脱氢酶亚单位1（NADH dehydrogenase subunit1）基因和NADH脱氢酶亚单位2（NADH dehydrogenase subunit2）基因是线粒体DNA（mtDNA）的两个蛋白编码基因,它们是NADH脱氢酶的两个亚基,而NADH脱氢酶是呼吸链复合体Ⅰ的主要组成,其在呼吸链中直接参与氢与电子传递并通过氧化磷酸化产生ATP,进而参与能量代谢作用。本课题组前期研究发现30%的能量限制组对肉鸡肝脏组织中线粒体ND1基因的表达呈现显着的影响（P<0.05）,属下调表达。目前,线粒体基因的研究主要集中在分子进化与系统发育等方面上,在日本黑毛和牛上发现线粒体基因与肉质性状相关,在奶牛上ntDNA多态性与较高产奶量和较低乳脂率等相关。为了解鸡ND1、ND2基因的遗传变异及其潜在效应,本研究采用直接测序结合酶切的方法对ND1、ND2基因在品种间的遗传变异进行了研究,结果表明：在8个品种鸡中,仅从ND1基因检测到一个变异位点mt.NDl4589A>G,且为同义突变,PCR-RFLP发现该变异存在异质性,其异质性发生的比率为6.3%；采用直接测序法从ND2基因中共检测到17个变异位点,其中6个错义突变,11个同义突变,经软件构建单倍型发现,共有15种单倍型,单倍型多样度（Haplotype diversity, Hd）:0.7692；在ND2基因中选取的2个错义突变mt.ND25703A>T和mt.ND25727T>G,采用CRS-PCR-RFLP方法也存在异质性,其异质性发生的比率分别为6.3%和3.8%。进行三个异质性位点在固始鸡资源群体的变异分布研究,发现mt.ND14589A>G在F0、F1和F2代的异质性发生比率分别为81%、41%和70%,mt.ND25703A>T在F0、F1和F2代的异质性发生比率分别为39%、14%和9%,mt.ND25727T>G在F0、F1和F2代的异质性发生比率分别为16%、9%和40%,呈现了明显的位点间异质性的差异。进行变异及其异质性与固始鸡F2代群体性状的关联分析,结果显示mt.NDl4589A>G除与腹脂、腹脂率和盲肠长度等屠体性状、生长性状及血清生化指标均产生了显着的关联,尤其是腿肌重率仅在考虑异质性时才产生显着关联；mt.ND25703A>T和mt.ND25727T>G与胸肌脂肪含量等脂肪性状显着相关外,还与生长性状、屠体指标、血清生化指标均产生了显着的关联,尤其是肌胃重率、双翅重率仅分别在mt.ND25703A>T、mt.ND25727T>G考虑异质性时才产生显着关联；显示了三个变异广泛的潜在效应。采用RT-PCR（reverse transcription PCR）和定量PCR（quantitative PCR,QPCR）进行ND2的表达特性研究,结果表明不同组织之间存在明显的表达差异,在15个组织中,胰腺的表达量是最低,心的表达量最高,约为胰腺的24倍,其次表达量较高的是肾,约为胰腺的17.5倍。发现30%的能量限制组对肉鸡肝脏组织中线粒体ND2基因的表达无显着的影响（P>0.05）。本研究首次报道鸡线粒体的异质性,并发现异质性变异对生长性状、屠体指标、血清生化等指标均有显着效应,显示相关变异的潜在重要性。
严旭坤[8]（2011）在《两个中国遗传性聋家系的致病基因研究》文中提出第一部分一个母系遗传性聋家系的致病基因研究目的：研究一个五代母系遗传性聋大家系的遗传学病因及发病机制,阐明该家系成员耳聋的机制,为遗传性聋的防治提供理论依据。方法：经耳聋先证者获悉一遗传性聋大家系,经家系调查采集详细的临床及听力学资料,并在签署知情同意书后采集静脉血。由静脉血提取全基因组DNA,对母系成员的线粒体基因组全序列及常见耳聋基因GJB2经聚合酶链反应扩增和测序进行检测。对检测到的线粒体DNA耳聋相关突变应用焦磷酸测序进行异质性定量,分析突变的异质性比例与耳聋程度的相关性。对突变位点行物种间进化保守性分析。在相同遗传背景的200名正常听力对照和806名散发感音神经性聋患者中进行突变筛查。同时建立耳聋患者和正常听力对照的淋巴细胞系,提取细胞的线粒体总RNA,采用Northern blot检测基因突变后tRNA水平的变化,并进行线粒体基因的蛋白合成和细胞耗氧量测量。结果：该家系符合母系遗传规律,耳聋的发生与使用氨基糖甙类抗生素无关,表现为双侧对称、迟发性、进行性感音神经性聋,以高频听力损失为主,逐渐累积全频,常伴高调耳鸣。患者颞骨高分辨率CT无明显异常,未伴随明显的其他系统疾病,属于非综合征型聋。线粒体基因组全序列分析显示母系成员属于同一线粒体单倍型Z,共存在43种碱基改变,其中T12201C为异质性突变,位于tRNA—His基因二级结构的接受臂,使碱基配对由A-U变为A-C,该位点在多物种间高度保守,突变异质性比例与耳聋发病年龄和严重程度存在相关性。其余碱基改变无特殊病理意义。在200名听力正常对照和806名散发感音神经性聋患者中未筛查到该突变。常见耳聋基因GJB2筛查显示部分家系成员包括患者和听力正常者均携带235delC杂合突变。成功构建患者和正常听力对照的淋巴细胞系,Northern blot分析显示突变后tRNA-His水平较正常对照减少75%。线粒体基因的翻译产物较正常对照减少47%,细胞总耗氧率较正常对照减少36%,差异皆有统计学意义。结论：线粒体基因tRNA His T12201C异质性突变为该家系成员耳聋的主要分子基础,突变异质性比例与耳聋发病年龄和严重程度存在一定相关性。T12201C突变造成tRNA代谢异常,tRNA His的水平明显减少,使线粒体蛋白合成和呼吸功能显着降低,ATP合成减少,活性氧族增加,最终导致耳聋。第二部分一个Waardenburg综合征家系的致病基因研究目的：研究一个中国Waardenburg综合征家系的临床表型特征和遗传学致病基因,及其基因型和表型间的关系。方法：经耳聋先证者获悉一个综合征型聋家系,进行家系调查、听力学检测和全身检查,并在签署知情同意书后采集静脉血5ml,提取全基因组DNA。分析整理临床资料,绘制系谱图,判断遗传方式。聚合酶链反应扩增候选基因MITF全部9个外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化测序后与参考序列比对,寻找突变和多态改变。对发现的突变分析氨基酸及编码蛋白质的改变,并进行氨基酸多物种间保守性分析。同时对所有家系成员进行常见耳聋基因GJB2、线粒体DNA 12S rRNA的测序筛查。在100名相同遗传背景的正常听力对照中对发现的突变进行测序筛查。结果：该家系诊断为Waardenburg综合征Ⅱ型,主要临床表现为棕褐色雀斑、早白发、虹膜异色、先天性感音神经性聋。根据系谱图判断为常染色体显性遗传方式,但家系中不同个体的表型存在明显差异。MITF基因外显子全测序在第8外显子发现c.[742-743delAAinsT;746-747delCA]杂合突变,12名家系成员携带该突变,与临床表型共分离。突变导致MITF蛋白第248位氨基酸由赖氨酸转变为终止密码子TAG,正常时419个氨基酸残基的蛋白截短为247个氨基酸,丧失了蛋白重要的功能结构域bHLH,导致单倍剂量不足。该氨基酸位点在多物种间高度保守。同时发现先证者不仅携带MITF基因的杂合突变,而且携带GJB2基因c. [109G>A]+[235delC]复合杂合致病突变。其他家系成员无GJB2基因双致病突变,所有成员线粒体DNA 12S rRNA均未发现致病突变。100名听力正常对照中未发现MITF基因第8外显子任何突变或多态改变,也未发现GJB2基因c.[109G>A]+[235delC]复合杂合致病突变。结论：Waardenburg综合征Ⅱ型临床表型多变,该家系成员的主要遗传学病因为MITF基因c.[742-743delAAinsT; 746-747delCA]杂合突变,这是一个新的WS2复杂突变。先证者同时存在MITF基因突变和GJB2基因双致病突变,两个基因可能在其耳聋的表型中均发挥作用。研究拓展了WS2基因突变谱,其基因型和表型的关系需进一步研究。
陈健美[9]（2011）在《甘蓝型油菜2个细胞质雄性不育系的线粒体基因组研究》文中提出细胞质雄性不育是主要杂种优势利用工具,作为一种天然存在的败育现象,细胞质雄性不育系也是植物遗传学研究的基础材料,因此深受植物学家的重视。大量研究已表明细胞质雄性不育的发生与线粒体基因组的结构变异有关。Pol型细胞质雄性不育是世界上应用最广泛的油菜细胞质雄性不育胞质。本研究对包括Pol细胞质在内的两个细胞质雄性不育系进行线粒体基因组测序；通过线粒体基因组序列相比较,研究了油菜线粒体基因组的结构；进一步,研究了油菜线粒体基因组构成。主要研究结果如下：1. Pol CMS系NH12A的线粒体基因组研究①NH12A线粒体基因组测序与基因鉴定：NH12A是Pol胞质不育系,本研究采用shotgun测序技术,完成了其线粒体基因组测序。从shotgun文库中随机挑选白斑菌落测序,得到了2592条序列,覆盖率超过11倍；进一步,用Phred-Phrap软件拼接,得到5个contig；再用PCR方法,补齐缺口,得到一个完整环状线粒体DNA,全长为223412 bp。为区别于前人所测定的序列,将此序列称为pol型（pol mitotype）,将前人的Nap胞质线粒体基因组序列称为nap型。pol型含34个编码蛋白的基因、3个核糖体RNA基因和18个tRNA基因,编码基因序列总长38742 bp,占整个基因组17.34%。与nap型比较,pol型的已知功能基因中,48个基因与nap型完全相同,但pol型中多1个trnH基因,其余6个基因有差异,分别是：cox1、cox2、atp1、trnC、trnE和orf224。除orf224差异较大外,其他5个基因均仅有1个核苷酸差异,且不影响功能。该序列鉴定得到了44个未知功能的ORF,其中35个ORF与nap型完全相同,其他ORF有差异,其中orf122和orf132为pol型特有序列,而orf117b则为nap型独有序列。②比较基因组分析：pol型与nap型序列基因组的核苷酸序列高度保守,但是序列发生了至少5次重排,与CMS相关的orf224邻近区域（大约5kb）发生了至少2次重排。pol型及nap型均含各自的特异序列,分别占两个序列的4.53%、3.63%。③重复序列分析和SNP分析：pol型基因组序列中,含有大量重复序列,包括1对2427bp的大片段重复序列,和占基因组4.96%的小片段重复序列,以及19组串联重复序列。2.4 kb的大片段重复序列与可逆的重排事件有关,导致线粒体基因组的多环分子构型；大量小片段重复序列与线粒体基因组不可逆重排有关,导致特异ORF的产生。nap型与pol型序列间的SNP分析发现,两序列间有197个SNP,核苷酸置换率计算为8.88 bp/10 kb。除了orf224/orf222区域,在已知基因中仅有6个位点的核苷酸置换发生,说明这两个基因组在编码基因上高度保守。2.甘蓝型油菜线粒体基因组的构成分析①pol型与nap型共存性实验研究：根据pol型与nap型这2个线粒体基因组的差异序列,设计了11对特异性引物。选取包括Pol CMS系、它们的保持系及常规油菜品种,共16份材料,通过特异引物的PCR扩增,发现用所有引物均能从这些材料的高纯度mtDNA中扩增出目的条带,因此证明pol型与nap型共存于甘蓝型油菜的线粒体中。②orf222与orf224拷贝数的定量检测：TaqMan qPCR分析发现,Pol不育系中,orf224的拷贝数明显高于orf222的拷贝数；而保持系及其他可育品种中,orf222拷贝数均多于orf224。表明,Pol胞质中pol型是主基因组,nap型则以亚化学计量水平的mtDNA分子存在；而在Nap胞质中则相反。在同一种胞质材料中这2个基因拷贝数比值相差2到6个数量级,这种巨大差异与不同材料的核基因背景有关。不同年份测定结果表明环境也是影响pol型与nap型含量的因素。推测油菜中存在pol型与nap型的亚化学计量转换,导致不育株的出现,从而可能解释了“相同类型不育株为不同育种家所独立发现”的原因。3.N219A线粒体基因组研究①N219A线粒体基因组测序与基因鉴定：利用solexa测序技术,获得了新型细胞质不育系N219A线粒体主基因组精细图。N219A线粒体主基因组是全长为261671bp的双链环状DNA。该基因组含有33个编码蛋白基因、3个核糖体RNA基因和17个tRNA基因。与nap型的基因相比较,N219A线粒体主基因组的orfB基因由于序列不完整,从而影响了该基因功能。同时还鉴定了48个未知功能的ORF,其中31个ORF与nap型完全相同,其它ORF有差异,其中orf153、orfl95b、orf130、orf101f、orf122和orf127是N219A特有序列。②比较基因组分析：N219A型与nap型两个基因组的序列插入及缺失现象比较普遍。N219A型缺失了nap型中的4.7 kb序列,但插入了39.6 kb的未知来源序列。插入序列中有55.96%的序列与其他植物线粒体基因组具有同源性。N219A型的重复序列占基因组全长的10.6%,多于nap型。N219A线粒体基因组与油菜线粒体基因组的序列差异可能是由于原生质体融合导致线粒体重组造成的。SNP分析结果表明,两个序列间有305个SNPs,核苷酸置换率为13.7 bp/10 kb。本研究通过线粒体基因组比较分析,明确了2个不育系线粒体基因组的差异；同时研究发现多种线粒体亚基因组在油菜中普遍共存,对油菜CMS发现与应用提供了新的知识。
郑秋月[10]（2009）在《热加工食品和水产品中致病菌检测技术体系建立》文中指出热加工食品和水产品中多种致病菌是威胁人类食品安全和身体健康的重要因素。目前国内外对热加工食品和水产品中致病菌的检测方法还多停留在检测效率低、目标单一的水平上。本研究采用DNA聚合酶链反应（PCR）结合变性高效液相色谱（denaturing highperformance liquid chromatography,DHPLC）高通量核酸检测方法,对热加工食品和水产品中多种致病菌的高通量检测、快速分种、毒素编码基因筛选、致病菌突变株检测等高通量检测技术进行了系统研究,搭建相应技术平台,获得了以下试验结果:1、在国内外首次应用多重PCR结合DHPLC在非变性条件下分离DNA片段的原理,通过优化多重PCR和DHPLC分析条件,建立了针对热加工食品中常见的蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌等3种芽胞菌及其毒素编码基因的DHPLC高通量检测技术;在国内外首次建立了PCR-DHPLC非变性条件检测热加工食品中致病菌的特异性基因检测平台。弥补了芽胞菌检测因普通培养鉴定周期长、试剂质量和生化反应不稳定而导致的误检、漏检等问题。2、在国内外首先进行了通用引物PCR-DHPLC非变性条件下,乳酸杆菌属检测方法的研究,解决了热加工食品中常见的乳酸杆菌属PCR-DHPLC法高通量检测技术难题,建立了乳酸杆菌属的PCR-DHPLC快速检测技术。为在食品安全和工业生产检测中对乳酸杆菌属的快速检测提供了科学、高效、快捷的检测手段。3、解决了乳酸杆菌属的各个菌种间凭借DNA序列碱基差异而达到分类鉴别的高通量分种鉴定技术难题。采用DHPLC部分变性条件下分型鉴定方法,在国内外首先建立了乳酸杆菌属9个分类菌种的高通量分种鉴定方法,真正达到了一次增菌、一次检测,即可同时鉴别乳酸杆菌属9个分类菌种的分种鉴定的科学、高效、快捷的鉴定目的。部分变性条件下DHPLC检测乳酸杆菌9个菌种分型鉴定方法具有创新性。4、本研究应用多重PCR结合DHPLC,解决了水产品中多种常见致病菌高通量快速检测技术难题,建立了从多种目标菌一次复合增菌、一次PCR-DHPLC完成检测的快速检测技术。以水产品中常见致病菌,霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、肠出血性大肠埃希氏菌0157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等9种致病菌为研究对象,进行非变性条件下的九重PCR-DHPLC检测技术研究。在国内外首次建立了多重PCR-DHPLC非变性条件下,检测水产品中9种致病菌的高通量检测方法,建立了PCR-DHPLC检测水产品中致病菌的特异性基因检测平台。并进行了霍乱弧菌突变株的筛选检测,在进行水样检测时,分离并鉴定出霍乱弧菌突变株。本研究成果实现了在一次操作过程中同时检测水产品中9种致病菌,使得致病菌的检测时间、检测数量和检测水平发生了很大的飞跃,从而达到对水产品中上述9种致病菌快速、准确、高灵敏检测的目的。综上所述,本课题在国内外首次建立了热加工食品和水产品中多种致病菌的DHPLC精准、高通量检测技术,细菌快速分种鉴定技术,毒素编码基因筛选技术。并使其检测技术标准化,在研究成果基础上,制定了中华人民共和国出入境检验检疫行业标准;而且研究成果已经转化为检测试剂盒,申报了国家发明专利,具有重要的研究意义和应用价值。
二、时间温度梯度凝胶电泳结合基因测序对乳癌体细胞全线粒体DNA扫描及突变检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、时间温度梯度凝胶电泳结合基因测序对乳癌体细胞全线粒体DNA扫描及突变检测（论文提纲范文）
（1）奶牛乳脂性状候选基因SNP及Indel位点筛选及其与产奶性状关联分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 分子标记研究进展 |
| 1.2.1 限制性片段长度多态性 |
| 1.2.2 简单重复序列标记 |
| 1.2.3 扩增片段长度多态性 |
| 1.2.4 单核苷酸多态性 |
| 1.2.5 插入缺失标记 |
| 1.3 乳脂合成主要候选基因研究进展 |
| 1.3.1 二酰基甘油酰基转移酶1 |
| 1.3.2 脂蛋白酶 |
| 1.3.3 催乳素 |
| 1.3.4 生长激素受体 |
| 1.3.5 三磷酸腺昔结合转运蛋白 G 超家族成员 2 |
| 1.3.6 长链脂酰Co A合成酶 |
| 1.4 奶牛生产性能测定 |
| 1.5 研究内容和目的意义 |
| 第二章 基于DHI数据中国荷斯坦奶牛产奶性状间的相关性分析 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 数据来源 |
| 2.1.2 数据处理 |
| 2.1.3 体细胞数、体细胞评分和胎次季节划分 |
| 2.1.4 统计分析方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SCS 分布 |
| 2.2.2 SCS、产奶量、乳脂率和乳蛋白率之间相关性 |
| 2.2.3 胎次对 SCC、产奶量及乳成分的影响 |
| 2.2.4 季节对 SCC、产奶量及乳成分的影响 |
| 2.2.5 SCC 引起的奶损失及经济损失 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 2.3.1 SCC与乳房炎的关系 |
| 2.3.2 SCC、产奶量、乳脂率和乳蛋白率之间相关性 |
| 2.3.3 胎次对SCS、产奶量及乳成分的影响 |
| 2.3.4 季节对SCS、产奶量及乳成分的影响 |
| 2.3.5 SCC造成的奶损失与经济损失 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因SNPs位点筛选及其与产奶性状关联分析 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 血液样品的采集 |
| 3.1.2 血液DNA提取 |
| 3.1.3 引物设计 |
| 3.1.4 PCR扩增体系 |
| 3.1.5 PCR扩增条件 |
| 3.1.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.1.7 测序分析 |
| 3.1.8 PCR-RFLP分析 |
| 3.1.9 统计分析方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因SNPs位点筛选 |
| 3.2.2 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因 SNPs 基因型鉴定 |
| 3.2.3 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因SNPs基因型群体遗传参数分析 |
| 3.2.4 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因SNPs基因型与奶牛产奶性状关联分析 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 3.3.1 CYHR1 基因与中国荷斯坦奶牛产奶性状关联分析 |
| 3.3.2 VPS13B基因与中国荷斯坦奶牛产奶性状关联分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因Indels位点筛选及其与产奶性状关联分析 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 血液样品的采集 |
| 4.1.2 血液DNA提取 |
| 4.1.3 奶牛乳脂性状候选基因的选择及引物设计 |
| 4.1.4 PCR扩增体系 |
| 4.1.5 PCR扩增条件 |
| 4.1.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.1.7 测序分析 |
| 4.1.8 Indel基因型鉴定 |
| 4.1.9 统计分析方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因Indels测序结果及基因型鉴定 |
| 4.2.2 奶牛乳脂性状候选基因Indels位点群体遗传参数分析 |
| 4.2.3 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因Indels与产奶性状关联分析 |
| 4.2.4 中国荷斯坦奶牛乳脂性状候选基因SNPs与 Indels位点连锁不平衡分析 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 4.3.1 SCD5 基因与产奶性状关联分析 |
| 4.3.2 BDNF基因与产奶性状关联分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 |
| 个人简历 |
（2）氧化磷酸化缺陷激活适应性反应维持线粒体膜电位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 研究背景 |
| 2.1 线粒体的重要功能 |
| 2.1.1 氧化磷酸化和线粒体膜电位的维持 |
| 2.1.2 依赖线粒体膜电位的细胞活动 |
| 2.1.3 合成铁硫簇是线粒体唯一不可缺少的功能 |
| 2.1.4 线粒体功能缺陷导致线粒体疾病 |
| 2.2 线粒体压力应激反应的研究进展 |
| 2.2.1 酵母细胞中的线粒体压力应激反应 |
| 2.2.2 线虫中的线粒体压力应激反应 |
| 2.2.3 哺乳动物细胞中的线粒体压力应激反应 |
| 2.2.4 小鼠模型中的线粒体压力应激反应 |
| 第3章 实验材料和实验方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 酵母菌株 |
| 3.1.2 细胞系和小鼠 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.1.5 RT-qPCR引物序列 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 酵母细胞的培养和转化 |
| 3.2.2 细胞培养和基因敲除细胞系的构建 |
| 3.2.3 质粒的构建 |
| 3.2.4 培养基中葡萄糖消耗的测量 |
| 3.2.5 线粒体膜电位的测量 |
| 3.2.6 RNA的提取和RT-qPCR |
| 3.2.7 mRNA-Seq |
| 3.2.8 蛋白提取和Western blot |
| 3.2.9 分离线粒体 |
| 3.2.10 酵母细胞和小鼠心脏线粒体的定量质谱 |
| 3.2.11 Puf3蛋白免疫沉淀,磷酸酶处理,phos-tag胶分析和磷酸化位点的鉴定 |
| 3.2.12 多聚核糖体印记和Ribo-Seq |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 氧化磷酸化缺陷的酵母细胞的应激反应 |
| 4.1.1 不同氧化磷酸化突变体的增殖速率和线粒体膜电位逐渐下降 |
| 4.1.2 氧化磷酸化缺陷的酵母细胞的转录组变化 |
| 4.1.3 氧化磷酸化缺陷的酵母细胞的蛋白质组变化 |
| 4.1.4 INH1的主动下调对于ρ~0细胞是重要的 |
| 4.1.5 Puf3介导的线粒体生成对于ρ~0细胞是重要的 |
| 4.1.6 Puf3在ρ~0细胞中的高磷酸化对于其功能是重要的 |
| 4.1.7 Snf1介导的应激反应对于△V和ρ~0细胞是重要的 |
| 4.1.8 ρ~0细胞上调细胞质中的分子伴侣以维持线粒体膜电位 |
| 4.2 线粒体DNA缺失的小鼠和细胞的应激反应 |
| 4.2.1 线粒体DNA缺失的小鼠的线粒体转录组和蛋白质组的变化 |
| 4.2.2 敲除ATPIF1有利于维持细胞的线粒体膜电位和增殖速率 |
| 4.2.3 敲除ATPIF1不能延长心脏线粒体DNA缺失的小鼠的寿命 |
| 第5章 分析讨论 |
| 第6章 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: Puf3相关线粒体基因 |
| 致谢 |
（3）油菜hau CMS线粒体基因组和不育基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 芸薹属作物的物种分类和亲缘关系 |
| 1.3 植物线粒体基因组的起源和结构特点 |
| 1.4 植物线粒体基因组的组成和转录调控 |
| 1.5 植物线粒体基因组测序 |
| 1.5.1 基因组的测序方法 |
| 1.5.2 高等植物线粒体基因组测序 |
| 1.6 基于植物线粒体基因组分子标记的开发和利用 |
| 1.7 十字花科植物花药结构与发育的研究 |
| 1.8 MADS-box家族的基因在植物花药发育中的作用 |
| 1.8.1 植物MADS-box家族基因的发现 |
| 1.8.2 花发育的ABC模型 |
| 1.8.3 植物MADS-box家族蛋白的结构特征、基因功能和转录调控机制 |
| 1.9 细胞质雄性不育 |
| 1.9.1 细胞质雄性不育的概述 |
| 1.9.2 线粒体与细胞质雄性不育 |
| 1.9.3 油菜细胞质雄性不育 |
| 1.9.4 细胞质雄性不育的分子机理 |
| 1.10 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CTAB法提取油菜叶片总DNA |
| 2.2.2 油菜线粒体的提取 |
| 2.2.3 油菜不同组织RNA提取 |
| 2.2.4 半薄切片 |
| 2.2.5 扫描电镜 |
| 2.2.6 透射电镜 |
| 2.2.7 不同胞质类型线粒体基因组的共线性关系和聚类分析 |
| 2.2.8 6 种不同胞质类型MSS标记的开发 |
| 2.2.9 油菜线粒体中ogu CMS与nap两个亚基因组序列拷贝数的测定 |
| 2.2.10 RNA提取 |
| 2.2.11 亚细胞定位 |
| 2.2.12 基因的表达分析 |
| 2.2.13 原核表达实验 |
| 2.2.14 遗传转化的载体构建 |
| 2.2.15 拟南芥的遗传转化和芥菜型油菜转化 |
| 2.2.16 转录组数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 油菜hau CMS不育系细胞学研究 |
| 3.1.1 油菜hau CMS不育系表型观察 |
| 3.1.2 芥菜型油菜和甘蓝型油菜hau CMS不育系的败育时期 |
| 3.1.3 芥菜型油菜hau CMS不育系花药的透射电镜分析 |
| 3.2 线粒体基因组测序及比较分析 |
| 3.2.1 芥菜型油菜hau CMS不育系和保持系的线粒体基因组测序 |
| 3.2.2 芥菜型油菜hau CMS不育系与保持系线粒体基因组的比较分析 |
| 3.2.3 植物线粒体基因组比较分析 |
| 3.2.4 甘蓝型油菜中不同胞质类型特异标记的开发与利用 |
| 3.3 hau CMS不育相关基因的研究 |
| 3.3.1 hau CMS不育相关基因orf288与hau CMS育性的关系 |
| 3.3.2 不育系特异的开放读码框orf325与hau CMS育性的关系 |
| 3.3.3 不育系特异的开放读码框orf220与hau CMS育性的关系 |
| 3.4 芥菜型油菜hau CMS不育系和保持系花药的转录组数据分析 |
| 3.4.1 芥菜型油菜hau CMS不育系和保持系差异表达基因的鉴定 |
| 3.4.2 芥菜型油菜hau CMS不育系和保持系差异表达基因的功能分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 芥菜型油菜hau CMS不育系花药的败育时期 |
| 4.2 油菜hau CMS不育胞质来源以及芸薹属植物线粒体基因组的关系 |
| 4.3 植物线粒体基因组的亚计量效应 |
| 4.4 不同胞质类型特异标记的开发与利用 |
| 4.5 芥菜型油菜hau CMS的不育基因 |
| 4.6 细胞质雄性不育基因的转基因互补验证 |
| 4.7 芥菜型油菜hau CMS不育基因对早期雄蕊发育基因表达的影响 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 本研究用的的引物列表 |
| 附录2 Northern blotting |
| 附录3 种子植物中68个不同属种的线粒体基因组信息 |
| 附录4 作者简介及研究生阶段发表论文成果 |
（4）玉米C型胞质不育的机理与穗发育相关miRNA的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 玉米C型胞质不育的机理研究 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物细胞质雄性不育 |
| 1.2 雄性不育及育性恢复的重要性 |
| 1.2.1 利用杂种优势的重要遗传资源 |
| 1.2.2 细胞质雄性不育/恢复系统:研究线粒体-核共同进化和相互作用的模型 |
| 1.3 主要作物的细胞质雄性不育和恢复基因研究进展 |
| 1.3.1 CMS基因的测序特征 |
| 1.3.2 恢复基因的鉴定及序列特征 |
| 1.4 细胞质雄性不育的机理 |
| 1.4.1 细胞毒性模型 |
| 1.4.2 能量缺乏模型 |
| 1.4.3 异常的细胞程序性死亡模型 |
| 1.4.4 反向调控模型 |
| 1.5 细胞质雄性不育的育性恢复机制 |
| 1.5.1 细胞质雄性不育在基因组水平的育性恢复 |
| 1.5.2 细胞质雄性不育在转录后水平的育性恢复 |
| 1.5.3 在翻译或翻译后水平的胞质雄性不育的育性恢复 |
| 1.5.4 代谢水平的胞质雄性不育的育性恢复 |
| 1.6 玉米雄性不育 |
| 1.7 转录组 |
| 1.7.1 转录组和转录组学研究方法 |
| 1.7.2 RNA-Seq测序的特点及应用 |
| 1.8 本研究的目的及意义 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 常规菌种 |
| 3.1.3 载体 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 线粒体DNA的提取 |
| 3.2.1.1 黄化苗线粒体的分离 |
| 3.2.1.2 线粒体DNA的提取 |
| 3.2.1.3 线粒体DNA的质量及纯度检测 |
| 3.2.2 差异片段的克隆和测序比较 |
| 3.2.2.1 玉米CMS-C序列差异ORF引物设计 |
| 3.2.2.2 PCR反应体系及反应程序 |
| 3.2.2.3 电泳检测 |
| 3.2.2.4 PCR产物纯化 |
| 3.2.2.5 连接载体pMD19-T |
| 3.2.2.6 测序结果 |
| 3.2.3 差异ORF原核表达载体构建及生长曲线的测定 |
| 3.2.3.1 设计引物 |
| 3.2.3.2 克隆ORF |
| 3.2.3.3 质粒提取 |
| 3.2.3.4 限制性内切酶双酶切 |
| 3.2.3.5 电泳检测及切胶回收 |
| 3.2.3.6 基因片段与载体相连 |
| 3.2.3.7 重组质粒转化大肠杆菌BL21 |
| 3.2.3.8 生长曲线的测定 |
| 3.2.4 植物表达载体构建及遗传转化 |
| 3.2.4.1 植物表达载体构建 |
| 3.2.4.2 转化农杆菌GV3101 |
| 3.2.4.3 拟南芥的种植 |
| 3.2.4.4 花序浸染法转化拟南芥 |
| 3.2.4.5 转基因株系的检测 |
| 3.2.5 PEG介导的原生质体瞬时表达 |
| 3.2.6 Western blot检测 |
| 3.2.6.1 抗体旳制备 |
| 3.2.6.2 蛋白样品的制备 |
| 3.2.6.3 Western杂交步骤 |
| 3.2.7 转录组测序 |
| 3.2.7.1 RNA的提取 |
| 3.2.7.2 转录组测序实验步骤 |
| 3.2.7.3 信息分析流程图 |
| 3.2.8 实时荧光定量PCR(real-time PCR) |
| 3.2.8.1 RT-PCR引物 |
| 3.2.8.2 实时荧光定量PCR(real-time PCR)分析 |
| 3.2.9 序列分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 不育系ORFs与保持系的同源序列的对比分析 |
| 4.2 ORFs的原核表达分析 |
| 4.2.1 原核表达载体的构建 |
| 4.2.2 IPTG诱导表达 |
| 4.3 拟南芥的遗传转化 |
| 4.4 ORF415的瞬时表达 |
| 4.5 不育胞质orf415编码蛋白产物的分析 |
| 4.6 orf415 编码蛋白产物的western杂交检测 |
| 4.7 转录组分析 |
| 4.7.1 RNA提取及质量检测 |
| 4.7.2 转录组文库质量评估 |
| 4.7.2.1 转录组数据与参考基因组的序列比对 |
| 4.7.2.2 基因覆盖度统计 |
| 4.7.3 转录组文库质量评估 |
| 4.7.3.1 mRNA片段化随机性检验 |
| 4.7.3.2 插入片段长度检验 |
| 4.7.3.3 转录组测序数据饱和度检验 |
| 4.7.4 基因结构分析 |
| 4.7.4.1 SNP分析 |
| 4.7.4.2 新可变剪接事件预测 |
| 4.7.5 新基因分析 |
| 4.7.6 差异表达分析 |
| 4.7.6.1 差异表达筛选 |
| 4.7.6.2 差异表达基因聚类分析 |
| 4.7.7 差异表达基因功能注释和富集分析 |
| 4.7.7.1 差异表达基因GO分类 |
| 4.7.7.2 差异表达基因COG分类 |
| 4.7.7.3 差异表达基因KEGG注释 |
| 4.7.7.4 差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 4.7.8 DEG表达量分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 细胞质雄性不育的育性相关ORF筛选 |
| 5.2 转录组差异分析 |
| 第二章 玉米穗发育miRNA和靶基因的确认 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 microRNA的生物学特性与作用机制 |
| 1.2 植物microRNA的特征与功能 |
| 1.3 植物microRNA的获得途径 |
| 1.4 植物microRNA的检测 |
| 1.4.1 基于分子杂交的植物microRNA检测 |
| 1.4.2 基于PCR技术的植物microRNA检测 |
| 1.5 植物microRNA靶基因预测及功能验证 |
| 2 引言 |
| 3 材料和方法 |
| 3.1 植物材料 |
| 3.2 miRNA深度测序 |
| 3.3 miRNA数据分析 |
| 3.4 miRNA靶基因预测 |
| 3.5 全基因组的降解组测序 |
| 3.6 深度测序的验证 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 miRNA文库质控 |
| 4.2 玉米穗发育miRNA和靶基因的确认 |
| 4.3 新的miRNA的确定 |
| 4.4 全基因组降解组测序对miRNA靶基因的确认 |
| 4.5 玉米穗不同发育阶段miRNA和其靶基因的表达 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 缩写词 Abbreviations |
（5）线粒体DNA突变与乳腺癌风险相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.1 乳腺癌研究的国内外现状 |
| 1.2 乳腺癌的诊断现状 |
| 1.3 乳腺癌病理学特性 |
| 1.4 线粒体DNA突变与癌症发生发展的关系 |
| 1.5 全基因组关联研究方法在癌症病因学中的应用 |
| 1.6 全基因组关联研究对乳腺癌高风险人群预测的意义 |
| 1.7 mtDNA种系突变与乳腺癌关联性研究的意义 |
| 材料 |
| 2.1 样品来源和信息 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器与耗材 |
| 2.4 引物设计 |
| 方法 |
| 3.1 线粒体DNA捕获 |
| 3.2 线粒体DNA文库构建(参见图2) |
| 3.3 模版制备测序 |
| 3.4 关联性分析 |
| 结果 |
| 4.1 线粒体抽提纯化及扩增 |
| 4.2 文库质控 |
| 4.3 Ion Torrent测序初步结果 |
| 4.4 数据组装及比对 |
| 4.5 突变位点搜索 |
| 4.6 mtSNP与乳腺癌疾病的关联性分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 缩写词简表 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（6）母系遗传高血压线粒体tRNA基因突变及脂联素通路的调控机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 母系遗传原发性高血压与线粒体 tRNA 基因突变关系的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 线粒体 tRNAThr基因突变母系遗传原发性高血压家系临床特点与线粒体基因突变情况分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 脂联素在线粒体 tRNAThr基因突变母系遗传原发性高血压中的调控作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）鸡线粒体ND1、ND2基因遗传变异及其效应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1、文献综述 |
| 1.1 mtDNA |
| 1.1.1 mtDNA概述 |
| 1.1.2 鸟类mtDNA基因组结构 |
| 1.1.3 mtDNA的遗传特性 |
| 1.2 线粒体ND1和ND2基因的研究现状 |
| 1.2.1 人mtND1和ND2的研究现状 |
| 1.2.2 动物mtND1和ND2的研究现状 |
| 1.2.3 鸡mtND1和ND2与其他物种间的同源性分析 |
| 1.3 线粒体DNA异质性的研究 |
| 1.3.1 异质性发生的广泛性和特异性 |
| 1.3.2 异质性的发生机理 |
| 1.3.3 线粒体假基因与异质性 |
| 1.3.4 鸟类线粒体异质性的研究现状 |
| 1.4 线粒体DNA遗传变异的研究方法 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2、试验材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 工具酶及试剂盒 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 试验主要试剂与溶液配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 多态性检测与性状关联所用的试验方法 |
| 2.2.2 鸡线粒体ND2基因的表达特性分析的试验方法 |
| 3、结果与分析 |
| 3.1 鸡线粒体ND1、ND2基因品种间的遗传变异及ND2基因单倍型的构建 |
| 3.1.1 鸡mtND2基因变异位点研究 |
| 3.1.2 鸡mtND1和mtND2基因点突变异质性的发现及验证 |
| 3.2 鸡线粒体ND1、ND2基因多态性与固始鸡资源群体相关性状的关联的分析 |
| 3.2.1 PCR产物的检测 |
| 3.2.2 变异位点酶切结果 |
| 3.2.3 三个变异位点的基因型及其频率在固始鸡资源群体F0、F1和F2代的分布 |
| 3.2.4 三个变异位点与固始鸡资源群相关性状的关联分析 |
| 3.3 鸡线粒体ND2基因的表达特性的分析 |
| 3.3.1 各组织总RNA的提取 |
| 3.3.2 用持家基因18S引物进行RT-PCR检测各组织cDNA的质量 |
| 3.3.3 利用半定量PCR构建鸡线粒体ND2基因的组织表达谱 |
| 3.3.4 鸡线粒体ND2基因在不同组织的表达差异 |
| 3.3.5 鸡线粒体ND2基因在能量限制组和自由采食组肝脏组织中的表达差异 |
| 4、讨论 |
| 4.1 鸡线粒体ND1和ND2基因变异在品种间的分布 |
| 4.2 鸡线粒体ND1和ND2基因三个变异位点异质性的研究 |
| 4.3 鸡线粒体ND1和ND2基因多态性对表型性状的影响 |
| 4.4 鸡线粒体ND1基因多态性对血清生化指标的影响 |
| 4.5 荧光定量RT-PCR对持家基因的选择以及样本的要求 |
| 4.6 鸡线粒体ND2基因在地方鸡种不同组织间的表达差异 |
| 4.7 鸡线粒体ND2基因在能量限制组和自由采食组的表达差异 |
| 5、结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）两个中国遗传性聋家系的致病基因研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 一个母系遗传性聋家系的致病基因研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 一个中国Waardenburg综合征家系的致病基因研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（9）甘蓝型油菜2个细胞质雄性不育系的线粒体基因组研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 高等植物线粒体基因组 |
| 1.1 线粒体基因组的起源 |
| 1.2 线粒体基因组的结构特点 |
| 1.3 线粒体基因组的基因组成 |
| 1.4 线粒体基因的转录及编辑 |
| 1.5 线粒体基因组构成 |
| 1.6 芸薹属植物线粒体基因组研究 |
| 2 线粒体与细胞质雄性不育 |
| 2.1 植物细胞质雄性不育的产生途径 |
| 2.2 油菜细胞质雄性不育 |
| 2.3 线粒体基因组与细胞质雄性不育的关系 |
| 3 线粒体基因组测序 |
| 3.1 线粒体DNA的提取方法 |
| 3.2 线粒体基因组测序方法 |
| 4 本研究目的和意义 |
| 第二章 细胞质雄性不育系NH12A线粒体基因组测序及比较研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 油菜线粒体DNA的提取 |
| 1.2.1 仪器及试剂 |
| 1.2.2 油菜线粒体的提取 |
| 1.2.3 线粒体DNA的萃取及纯化 |
| 1.2.4 线粒体DNA质量及纯度的鉴定 |
| 1.3 线粒体基因组的测序 |
| 1.4 线粒体基因组序列分析 |
| 1.5 油菜线粒体亚基因组共存性实验 |
| 1.5.1 线粒体特异序列引物的设计 |
| 1.5.2 特异序列的克隆测序 |
| 1.6 油菜线粒体中pol与nap两个亚基因组序列含量的测定 |
| 1.6.1 荧光定量PCR引物及TaqMan探针的设计 |
| 1.6.2 TaqMan定量方法的建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 线粒体的提取及检测 |
| 2.1.1 线粒体的提取 |
| 2.1.2 线粒体DNA检测 |
| 2.2 NH12A系线粒体基因组 |
| 2.2.1 线粒体基因组shotgun测序 |
| 2.2.2 NH12A线粒体基因组的基因及ORF |
| 2.2.3 重复序列分析 |
| 2.2.4 NH12A线粒体基因组结构 |
| 2.2.5 油菜线粒体基因组SNP分析 |
| 2.3 油菜线粒体中pol型与nap型线粒体亚基因组共存 |
| 2.4 orf222与orf224拷贝数的定量测定 |
| 2.4.1 TaqMan qPCR体系的建立 |
| 2.4.2 orf222与orf224拷贝数比值 |
| 2.5 油菜线粒体基因组的多环结构 |
| 2.6 油菜线粒体基因组的进化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 高等植物线粒体中mitotype的共存 |
| 3.2 mitotype间的亚化学计量转化 |
| 3.3 油菜中PolCMS的发现 |
| 3.4 短片段重复序列与线粒体基因组序列重排 |
| 3.5 线粒体基因组的特异ORF |
| 3.6 高纯度mtDNA是线粒体研究的基础 |
| 第三章 细胞质雄性不育系N219A线粒体基因组测序 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 油菜线粒体DNA的提取 |
| 1.3 线粒体基因组的solexa高通量测序及拼接 |
| 1.4 线粒体基因组序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 N219A线粒体基因组结构 |
| 2.2 N219A线粒体基因组的基因及ORF |
| 2.3 N219A线粒体基因组SNP及重复序列 |
| 3 讨论 |
| 第四章 全文小结 |
| 1 全文结论 |
| 2 创新之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表或待发表研究论文 |
（10）热加工食品和水产品中致病菌检测技术体系建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 变性高效液相色谱技术在分子生物学领域的应用 |
| 1.1 仪器原理与分析模式 |
| 1.1.1 仪器原理 |
| 1.1.2 分析模式 |
| 1.2 DHPLC在分子生物学领域的主要应用 |
| 1.2.1 DNA片段长度分析 |
| 1.2.2 突变和遗传变异分析 |
| 1.2.3 DHPLC技术在微生物检测领域的应用 |
| 1.2.4 寡核苷酸的纯化 |
| 1.2.5 DHPLC主要技术特点及注意事项 |
| 1.3 结论 |
| 第二章 热加工食品中芽胞菌DHPLC法高通量检测技术研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试材 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 三种芽胞菌目的基因及引物序列 |
| 2.2.2 单个菌PCR-DHPLC检测方法的建立 |
| 2.2.3 三种芽胞菌多重PCR-DHPLC试验结果 |
| 2.2.4 多重PCR-DHPLC检测方法实际应用结果 |
| 2.2.5 产气荚膜梭菌分型及毒素基因检测结果 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 乳酸杆菌属及分种鉴定DHPLC法高通量检测技术研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 乳酸杆菌增菌与核酸高效提取技术建立 |
| 3.2.2 靶标基因与特异性检测引物序列 |
| 3.2.3 通用引物PCR—DHPLC检测乳酸杆菌方法的建立 |
| 3.2.4 部分变性条件下乳酸杆菌属高通量分种鉴定结果 |
| 3.2.5 应用验证 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 水产品中常见致病菌DHPLC法高通量检测技术研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试材 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 靶标基因与特异性检测引物序列 |
| 4.2.2 单个菌PCR-DHPLC检测方法建立 |
| 4.2.3 水产品中9种微生物复合增菌方法的建立 |
| 4.2.4 多重PCR-DHPLC检验方法的研究结果 |
| 4.2.5 多重PCR-DHPLC特异性试验 |
| 4.2.6 多重PCR-DHPLC灵敏度试验 |
| 4.2.7 多重PCR-DHPLC精密度试验结果 |
| 4.2.8 模拟污染样品检测结果 |
| 4.2.9 方法应用结果 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表文章、制定标准及申请专利 |
| 附件 |
四、时间温度梯度凝胶电泳结合基因测序对乳癌体细胞全线粒体DNA扫描及突变检测（论文参考文献）
- [1]奶牛乳脂性状候选基因SNP及Indel位点筛选及其与产奶性状关联分析[D]. 罗林. 黑龙江八一农垦大学, 2021(10)
- [2]氧化磷酸化缺陷激活适应性反应维持线粒体膜电位[D]. 刘思琪. 北京协和医学院, 2020(05)
- [3]油菜hau CMS线粒体基因组和不育基因的研究[D]. 衡双平. 华中农业大学, 2015(02)
- [4]玉米C型胞质不育的机理与穗发育相关miRNA的研究[D]. 王彬. 河南农业大学, 2015(01)
- [5]线粒体DNA突变与乳腺癌风险相关性研究[D]. 李林海. 南方医科大学, 2015(03)
- [6]母系遗传高血压线粒体tRNA基因突变及脂联素通路的调控机制研究[D]. 蓝云锋. 中国人民解放军医学院, 2014(03)
- [7]鸡线粒体ND1、ND2基因遗传变异及其效应的研究[D]. 侯玲灵. 四川农业大学, 2012(06)
- [8]两个中国遗传性聋家系的致病基因研究[D]. 严旭坤. 复旦大学, 2011(08)
- [9]甘蓝型油菜2个细胞质雄性不育系的线粒体基因组研究[D]. 陈健美. 南京农业大学, 2011(06)
- [10]热加工食品和水产品中致病菌检测技术体系建立[D]. 郑秋月. 沈阳农业大学, 2009(12)