一、泛蛋白连接酶Ubc9参与氧还蛋白Ref 1的降解（论文文献综述）
颜家龙[1]（2021）在《线粒体IDO1源性单线态氧诱导核自噬介导apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附》文中研究表明目的:课题组前期报道活性氧（ROS）-自噬途径介导APJ受体的内源性配体apelin-13促单核细胞（MCs）-人脐静脉内皮细胞（HUVECs）粘附。文献报道核自噬标志蛋白Lamin B1下调诱导血管老化并促进动脉粥样硬化（AS）发生发展。单线态氧可氧化核DNA引发核损伤,且线粒体单线态氧能诱发自噬,而ECs中的吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）可产生单线态氧。据此提出线粒体IDO1源性单线态氧诱导核自噬介导apelin-13促MCs-ECs粘附的科学假说。本课题拟采用Western Blot、免疫荧光等技术阐明线粒体IDO1源性单线态氧及核自噬是否介导apelin-13/APJ促MCs-ECs粘附,并在ROS-自噬基础上进一步深入探讨线粒体IDO1源性单线态氧-核自噬途径,揭示apelin-13促MCs-ECs粘附的分子机制,为以APJ受体为药物作用靶标的AS新药筛选提供有力证据。方法:1、Western Blot 测定 HUVECs 中 IDO1、Lamin B1、LC3、ICAM1、VCAM1的表达;2、RNA 干扰:设计 siRNA 链干扰 HUVECs 中 IDO1、Lamin B1 的表达;3、线粒体单线态氧荧光探针Si-DMA检测HUVECs中线粒体单线态氧的水平;4、免疫电镜观察人脐静脉内皮细胞核自噬标志蛋白Lamin B1相关胶体金阳性数量;5、免疫荧光观察人脐静脉内皮细胞Lamin B1和LC3共定位;6、Calcein AM标记单核细胞,荧光显微镜观察MCs与ECs的粘附情况;结果:1、Apelin-13 诱发 HUVECs 核自噬;2、Apelin-13减弱HUVECs核自噬标志蛋白Lamin B1表达;3、Apelin-13 促进 HUVECs 中 Lamin B1 与 LC3 共定位;4、Apelin-13诱导HUVECs线粒体单线态氧产生;5、单线态氧清除剂1-histidine抑制apelin-13诱导的HUVECs线粒体单线态氧产生;6、单线态氧清除剂1-histidine逆转apelin-13抑制的HUVECs中Lamin B1 表达;7、单线态氧清除剂1-histidine抑制apelin-13促进的HUVECs中Lamin B1与LC3共定位;8、Apelin-13 促进 HUVECs 中 IDO1 表达;9、IDO1 siRNA抑制apelin-13诱导的HUVECs线粒体单线态氧产生;10、IDO1 siRNA 逆转 apelin-13 抑制的 HUVECs 中 Lamin B1 表达;11、IDO1 siRNA 抑制 apelin-13 促进的 HUVECs 中 Lamin B1 与 LC3共定位;12、IDO1 siRNA 抑制 apelin-13 促进的 HUVECs 中 ICAM1、VCAM1表达;13、IDO1 siRNA 抑制 apelin-13 诱导的 MCs-HUVECs 粘附;14、单线态氧清除剂1-histidine抑制apelin-13促进的HUVECs中ICAM1、VCAM1 表达;15、单线态氧清除剂1-histidine抑制apelin-13诱导的MCs-HUVECs粘附;16、Lamin B1 siRNA 抑制 apelin-13 促进的 HUVECs 中 ICAM1、VCAM1表达;17、Lamin B1 siRNA 抑制 apelin-13 诱导的 MCs-HUVECs 粘附;结论:线粒体IDO1源性单线态氧诱导核自噬介导apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附
徐佳倩[2]（2020）在《NRF2的SUMO化修饰在KLK肺腺癌运动和侵袭中的作用及其机制研究》文中研究指明NRF2[Nuclear factor erythroid 2（NFE2）related factor 2]是一种在对抗氧化应激过程中发挥关键作用的转录调节因子。本课题组前期鉴定到人NRF2蛋白的SUMO1（Small ubiquitin-like modifier 1）修饰位点是其第110位赖氨酸残基（K110）,且该位点不受SUMO2/3修饰。同时,我们还证实该位点的SUMO化修饰能够应答丝氨酸饥饿,促进肝癌细胞在正常营养和丝氨酸缺乏状态下的生长。Kras激活突变是肺腺癌细胞中突变的常见类型,并且常合并Stk11（Serine/threonine kinase 11,也叫做Lkb1）的缺失突变;另外,肺腺癌细胞中也常见Keap1（Kelch like ECH associated protein 1）的失活突变。KEAP1-NRF2是细胞中调控NRF2稳定性的重要通路,当Keap1发生失活突变时,NRF2蛋白稳定性增加,在细胞质中累积并移位至细胞核内,通过转录激活下游基因的表达,调节细胞内的氧化还原状态和细胞代谢表型。在本研究中,为了探讨NRF2 SUMO化修饰对于肺腺癌运动和侵袭能力的影响,我们以KLK（Kras激活突变、Lkb1失活突变和Keap1失活突变）肺腺癌细胞为研究对象,在敲减内源NRF2蛋白的基础上,回补外源野生型NRF2和SUMO化修饰位点突变的NRF2 K110R,通过Transwell实验发现NRF2的SUMO化修饰对于抑制KLK肺腺癌细胞的体外运动和侵袭至关重要。机制上,NRF2的SUMO化修饰通过转录激活Cat（过氧化氢酶,Catalase）,分解H2O2（过氧化氢,Hydrogen peroxide）,降低细胞内ROS（活性氧,Reactive oxygen species）水平,提高抗氧化应激能力;而当NRF2 SUMO化修饰位点突变后,轻度上升的ROS可作为信号分子激活JNK-c-Jun信号通路,并通过增强细胞与细胞粘附和焦点粘连,促进肿瘤细胞的体外运动和侵袭。我们进一步发现,与中度和重度氧化刺激下NRF2蛋白表达上调发挥抗氧化应激能力不同,在轻度氧化刺激下,NRF2 SUMO化修饰水平降低后,其抗氧化应激能力下降,导致细胞内轻度升高的ROS作为信号分子,促进KLK肺腺癌细胞的体外运动和侵袭。综上所述,本研究发现了一条全新的受到NRF2 SUMO化修饰调控的信号通路,通过Cat-ROS-JNK-c-Jun轴调控KLK肺腺癌的进程,有望为临床治疗Kras突变肺腺癌这种难治性肿瘤提供靶点和线索。
刘翔[3]（2019）在《去泛素化酶BAP1在抗病毒天然免疫应答中的作用与机制研究》文中研究表明作为机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线,天然免疫系统主要通过一系列模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）识别结构上较保守的病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）或探测自身异常细胞来源的危险相关分子模式（danger associated molecular pattern,DAMP）以监控病原体感染或感知细胞生存压力。模式识别受体被激活后将进一步活化相应下游信号通路,最终激活NF-κB、AP-1和IRF等转录因子以驱动炎性细胞因子、趋化因子及干扰素的转录活化,杀伤并清除入侵病原体或自身异常的组织细胞,保护机体健康。翻译后修饰（post-translational modification,PTM）是蛋白质功能调控的重要方式,其中泛素化修饰由E1-E2-E3泛素酶系统与去泛素化酶共同调节,在抗原提呈、细胞分化、免疫防御与炎症等诸多免疫过程中扮演重要角色。泛素是由76个氨基酸残基构成的高度保守的小分子多肽,单体分子量为8.6kDa,可通过本身Lys 6、11、27、29、33、48、63七个赖氨酸残基或头尾相连形成线性泛素化修饰。目前研究最为成熟的是介导蛋白酶体途径降解的K48连接泛素化修饰以及与蛋白激酶活化相关的K63连接泛素化修饰。去泛素化酶能够与泛素修饰系统共同调控某一蛋白位点的泛素化水平,由于泛素可以多种方式多聚化偶联,在蛋白质功能调节过程中作用广泛且重要。去泛素化酶分类上属于蛋白水解酶超家族,家族成员众多,绝大多数为半胱氨酸蛋白酶,但功能和机制研究仍然不十分完善,其在天然免疫应答调控中的作用仍有待进一步研究。在本课题中,我们通过去泛素化酶家族小干扰RNA（siRNA）文库去筛选并试图发现在天然免疫细胞抗病毒感染模型中具有显着功能的潜在研究对象。针对筛选体系所采用的VSV、SeV和HSV-1感染模型,我们分别筛选得到了一系列调控抗病毒天然免疫信号的潜在研究对象,其中一些已被报道并与我们所筛选得到的效应一致,这印证了我们筛选体系的可行性。对于大部分在天然免疫调控研究领域尚未被报道的去泛素化酶基因,我们优先选择在不同种类病毒感染模型中具有一致且最显着差异表型的BRCA1相关蛋白1（BRCA1-associated protein 1,BAP1）作为研究对象,以期发现具有普适性的天然免疫抗病毒调控机制。已有研究表明BAP1参与了细胞周期、分化、转录和DNA损伤修复等许多重要生命过程,而BAP1的突变会提高黑色素瘤、间皮瘤、肾细胞癌等多种恶性肿瘤的发病几率,但BAP1在天然免疫应答调控的作用尚不清楚,值得进一步研究。通过体外功能实验,我们发现BAP1能够显着上调病毒感染与外源性核酸模拟物诱导的I型干扰素的表达和分泌,增强细胞抗病毒感染能力并显着抑制病毒胞内复制增殖。由于BAP1基因缺陷小鼠胚胎致死,即使髓系特异性敲除也会引发髓系细胞白血病,因而我们尝试利用慢病毒感染野生型小鼠肺脏的方法构建了BAP1肺脏特异性过表达及敲低小鼠模型。通过体内肺脏流感病毒感染模型,我们发现BAP1能够诱导I型干扰素与炎症因子的分泌并增强干扰素刺激基因的表达,从而抑制流感病毒在肺脏的复制增殖。此外,BAP1可以缓解流感病毒感染导致的肺组织炎性细胞浸润及小鼠体重减轻,能够延长致死剂量感染小鼠的生存期并提高其生存率。在机制研究中,通过干扰原代巨噬细胞中BAP1的表达,我们发现,BAP1的表达下调会显着抑制病毒感染诱导的IRF3的磷酸化而对其他信号通路分子无明显影响。通过荧光素酶报告基因实验我们发现,BAP1能有效增强IRF3及其上游信号通路分子诱导的IFNβ基因表达的活化。通过构建BAP1截短体结合报告基因实验,BAP1对IFNβ基因表达的活化效应依赖于其泛素化酶活性及核定位。进一步实验发现,BAP1能够促进病毒刺激下IRF3二聚化及核转位。利用外源性免疫共沉淀筛选信号通路分子,BAP1能够与IRF3显着相互作用,我们进一步在原代巨噬细胞中验证了内源性BAP1与IRF3的结合。利用BAP1截短体进行免疫共沉淀实验,结果表明BAP1与IRF3的相互作用主要依赖于BAP1 UCH-H区域。接下来的实验证明,BAP1的表达降低会促进IRF3蛋白酶体途径降解,并进一步验证BAP1能够下调IRF3 K48泛素化修饰水平而对其他类型泛素化修饰无明显影响。为了进一步明确BAP1的作用机制,我们利用分离胞浆胞核组分后免疫共沉淀的方式发现二者均见BAP1与IRF3的相互作用,但胞核中结合随病毒感染增强。值得注意的是,我们发现病毒感染诱导的IRF3 K48泛素化修饰主要发生在胞核组分中,并且BAP1主要抑制胞核中IRF3的降解。进一步实验发现,能与IRF3相互作用且具有去泛素化酶活性的BAP1 UCH-H截短体由于缺乏入核能力并不能有效抑制核内IRF3的K48泛素化修饰及降解。查询已有文献报道,未见IRF3 K48泛素化修饰明确位点,因此挑选人鼠间保守的14个潜在泛素化赖氨酸位点构建Lys-Arg点突变体。实验结果表明Lys77和Lys87是IRF3 K48泛素化修饰的关键位点,突变后显着抑制IRF3降解,构建双位点突变体后实验发现,IRF3 K77/87R双位点突变较K77R K87R单位点突变进一步抑制IRF3降解并增强IFNβ报告基因的活化,但对病毒感染诱导的IRF3核转位无明显差异。利用野生型及单、双位点IRF3突变体进行免疫共沉淀实验发现,过表达BAP1可以下调WT IRF3及IRF3 K87R点突变体K48泛素化修饰水平而对IRF3 K77R及K77/87R突变体K48泛素化修饰水平无明显影响,这一结果提示BAP1特异性作用于Lys77位点去泛素化修饰。为了进一步明确负责IRF3 Lys77位点K48泛素化修饰的E3泛素连接酶,我们筛选已被报道IRF3 K48连接泛素化修饰E3,发现UBE3C能够显着增强Lys77位点的泛素化水平,TRIM26能够增强Lys87位点的泛素化水平。在病毒感染早期BAP1明显升高而在后期逐渐恢复正常水平,而UBE3C表达水平晚于BAP1也有所升高并最终恢复到正常水平。我们的研究提示,在病毒急性感染期,BAP1表达升高并抑制核内IRF3 K48连接泛素化修饰介导的降解以放大抗病毒免疫效应;在感染后期,UBE3C表达逐渐增高并逆转BAP1的促炎效应,使IRF3活化恢复到正常水平以免过度应答损伤机体。综上所述,本研究发现了抑癌基因BAP1正向调控抗病毒天然免疫应答的新功能,鉴定出抗病毒天然免疫信号通路中关键转录因子IRF3上能够被K48泛素化修饰的位点Lys77和Lys87,同时揭示了E3泛素连接酶UBE3C能够与BAP1拮抗调节IRF3的新机制,进一步完善了IRF3表达水平与功能的调控网络,同时也为进一步理解BAP1的抑癌机制提供了新思路,为干预癌症与病毒感染提供了潜在作用靶点。
劳一敏[4]（2016）在《SUMO蛋白酶SENP3对巨噬细胞活化的调控以及对基因表达谱和小鼠表型的影响》文中认为SUMO（small ubiquitin-related modifier）是一类重要的类泛素蛋白,它能够通过对底物蛋白进行翻译后修饰,影响底物蛋白的稳定性、定位和活性,进而参与许多人体生理活动和重大疾病如肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、脑损伤等的发生和发展。SUMO化修饰是一个可逆的过程,SUMO特异的蛋白酶SENP家族能调控蛋白质的去SUMO化修饰。我们既往研究证明SUMO蛋白酶SENP3是应答细胞氧化应激的重要分子,通过调控一系列分子、特别是转录因子的SUMO2/3修饰,使细胞内基因表达格局发生“重编程”,从而介导细胞对氧化应激的应答,在肿瘤细胞恶性行为中扮演了促进的角色。在本实验室前期工作基础上,我们以Helicobacter pylori（H.pylori）诱导巨噬细胞活化和胃炎的细胞、小鼠模型以及病人标本为对象,对SENP3在炎症中的作用进行了研究,发现了其在巨噬细胞胞质中对炎症信号通路的调控和去除SUMO化修饰的靶分子,也观察到干预SENP3在细胞和个体水平对H.pylori诱导的胃炎发生发展的影响。同时期平行开展了干预SENP3的胃癌细胞数字基因表达谱的检测和分析,试图认识SENP3影响基因表达的全貌。我们还制作了SENP3巨噬细胞特异性敲除小鼠,引进、繁育了SENP3全身杂合敲除的小鼠,试图利用前者阐明SENP3对巨噬细胞功能的影响,用后者初步发现SENP3对个体发育、生长、代谢和疾病的影响。胃癌的发生是一个多因素、多步骤的过程,其中幽门螺杆菌感染引起的慢性炎症与胃癌的发生发展关系密切。目前,对于在胃炎和胃癌中SUMO底物蛋白如何被SUMO化修饰以及去SUMO化修饰的报道甚少。因此,寻找胃炎和胃癌中的SUMO底物蛋白,阐明其分子机制,对于胃炎和胃癌的治疗具有重要意义。慢性炎症造成细胞氧化应激和适应。在炎症微环境下,活性氧升高,单核/巨噬细胞被活化并介导炎症反应,但其分子机制是否涉及活性氧所调控的重要蛋白质翻译后修饰尚不清楚。我们前期研究发现在人胃炎组织中,胃幽门螺杆菌感染的粘膜间质组织中巨噬细胞的数目和SENP3阳性程度呈正相关,这给我们提示巨噬细胞中的SENP3可能参与了H.pylori感染的胃炎的发生发展。因此,我们拟探究巨噬细胞中SENP3介导的氧化应激应答反应是否对巨噬细胞活化有促进作用,是否对胃炎的发生发展有促进作用。本研究第一部分通过考察SENP3对巨噬细胞活化的分子机制,揭示巨噬细胞SENP3对胃炎发生发展的作用。我们通过巨噬细胞与H.pylori共培养实验以及C57小鼠H.pylori感染慢性胃炎模型,证明细菌通过氧化应激诱导巨噬细胞中SENP3累积;通过沉默巨噬细胞中SENP3,发现SENP3能够促进细菌引起的巨噬细胞活化;通过检测炎症信号通路,发现SENP3能够促进p-JNK的蛋白水平,这提示SENP3可能对JNK信号通路中的MAP2K分子有去SUMO2/3修饰的可能;通过免疫共沉淀实验,确认JNK上游特异的激酶MKK7分子能够被SUMO3修饰,并且其赖氨酸K18位是SUMO修饰位点;对于MKK7的SUMO化修饰如何调控p-JNK,我们通过SUMO融合蛋白的免疫共沉淀实验,证明MKK7 K18的SUMO修饰使MKK7和JNK结合减弱,从而使p-JNK蛋白水平降低。通过巨噬细胞SENP3特异敲除的C57小鼠的胃炎模型,从动物水平证明了巨噬细胞SENP3能够促进胃炎的发生发展。这些发现证明活性氧通过SENP3调控细胞质蛋白质翻译后修饰促进巨噬细胞活化和胃炎的发生发展,将为更深入认识活性氧与炎症提供新的资料,也为后续研究活性氧、炎症与胃癌的关系打下基础。已知被SENP3调控的蛋白主要定位于细胞核内,其中又以转录因子居多。我们前期的研究发现SENP3在胃癌和其他肿瘤中的一系列底物,主要是转录因子FOXC2、Sp1、Stat3、p53,SENP3通过对这些转录因子的De-SUMO化而调控它们的功能,起到促进胃癌和其他肿瘤发生发展的作用。因此,在与第一部分平行进行的第二部分工作中,我们在胃癌细胞SGC7901中敲低SENP3,检测数字基因表达谱,并对数据进行分析,试图发现SENP3调控胃癌发生发展所涉及的基因改变全貌,并寻找其中的重要转录因子。主要发现数字基因表达谱中1379个差异表达的基因,上调表达基因318（23.1%）个,下调基因1052（76.9%）个。这些差异基因主要集中于代谢、泛素介导的蛋白水解和内质网中的蛋白质处理信号通路。首先我们调查了SENP3相关的泛素介导的蛋白水解信号通路,敲低SENP3后,泛素相关酶的m RNA表达水平下降。我们在SGC7901中敲低SENP3发现细胞中的泛素修饰减少,过表达SENP3则泛素修饰增加,这说明SENP3通过调控泛素相关的酶影响了细胞中的泛素修饰。小鼠基因是与人类基因最相似的,人们通常利用基因敲除小鼠作为人类疾病的模型来研究基因的作用。由于纯合敲除SENP3的小鼠死于胚胎早期,我们引进、繁育了SENP3+/-小鼠。我们在饲养和繁殖过程中发现SENP3+/-小鼠发育较为迟缓,并且个体尺寸比同一窝野生型C57小鼠小。因此,第三部分通过对SENP3+/-小鼠表型的考察、记录和初步分析,试图对SENP3在生物体整体的功能首次作出初步阐释,以利于研究SENP3在人类疾病中的作用。
阮喜云[5]（2009）在《hTRX-PR39融合基因重组腺伴病毒载体的构建及对缺氧鸡胚的促血管生成作用》文中指出背景目前,脑血管病的发病率和病死率不断升高,尤其成为了威胁人类身体健康的突出问题和医学研究的热点问题。新的治疗药物和物理治疗方法的临床应用,不断地改善着急诊的抢救成功率和延长了病人的生命,但是依然不能从根本上逆转病人病理生理变化,受损的脑机能难以恢复。本课题根据近年来脑血管病后组织修复的细胞学和分子生物学研究进展,设计了HRE（低氧反应元件）调控的分泌表达“血管生成的总开关”—PR39与人硫氧还蛋白hTRX融合表达的重组腺相关病毒,通过介入方式转导有脑供血不足和具有梗塞性脑血管病倾向的脑组织和血管。目的是希望在脑缺氧和梗塞发生早期能起动PR39的分泌表达,通过它特异的抑制泛素-蛋白酶体对HIF-1α的降解,来增加血管形成的细胞因子和受体（VEGFA、KDR、FLT-1和FGF-1）长期持续性高表达,实现脑缺氧和梗塞发生后的早期神经元修复和血管再建,也通过PR39具有的抗炎症反应、抗缺血缺氧应激凋亡作用,人硫氧还蛋白的抗氧化、抗细胞凋亡、保护缺血再灌注损伤及神经因子样作用等,保护受损害神经细胞的存活和功能。它将为缺血性脑血管病的预防和治疗寻找新的理论和方法。目的为了探讨PR39对脑缺血的保护作用,本研究构建腺相关病毒（AAV）介导的融和基因hTRX-PR39,验证其在人脐静脉内皮细胞（ECV304细胞株）表达;在缺氧ECV304细胞内提高VEGF-A,VEGFR-1,VEGFR-2,FGFR-1,Syndecan-4表达水平及抗缺氧应激凋亡作用及其对缺氧环境鸡胚的促血管生成作用。方法1.设计合成PR39的正向和反向引物,使用互为引物模板PCR方法,扩增获得两端具有BamHI和Ecor721酶切位点的PR39cDNA片段。将该片段克隆到pGEM-Teasy中,转化细菌筛选阳性克隆,酶切鉴定,序列测定分析。2.以已有hTRX片段为模板,设计合成hTRX的正向和反向引物,PCR扩增获得具有Eco721和EcoI酶切位点的hTRX cDNA片段。并将其克隆到pGEM-T easy中,转化细菌筛选阳性克隆,酶切鉴定,序列测定分析。3.BamH I和EcoR721双酶切pGEM-T-hTRX和pGEM-T-PR39,将获取的PR39/BamHI,EcoRI721片段克隆到pGEM-T-hTRX/BamHI,EcoRI721载体中,构建了pGEM-T-hTRX-PR39载体。4.酶切上述载体获取hTRX-PR39融合基因,将其插入具有相应酶切位点的pSSCMV病毒载体质粒中,得到重组腺相关病毒载体质粒。5.将已构建的重组腺相关病毒载体质粒、腺病毒辅助质粒PFG140和包装质粒pAAV/Ad三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞系,通过同源重组获得hTRX-PR39重组腺相关病毒载体,收集病毒,斑点杂交（Dot blot）法测定病毒滴度。6.AAV-hTRX-PR39和空病毒载体（EV）分别感染ECV304,免疫细胞化学检测hTRX表达情况,以此验证融合基因在的ECV304表达。7.将ECV304分为AAV-hTRX-PR39组和PBS组,在1%、5%O2条件下培养,应用台盼蓝染色法进行活细胞计数,观察hTRX-PR39对缺氧细胞的保护作用。8.流式细胞仪检测（FCM）分析低氧环境下ECV304细胞凋亡情况。9.应用定量PCR检测仪检测ECV304中VEGF-A,VEGFR-1,VEGFR-2,FGFR-1,Syndecan-4及PR39的表达水平。10.120只鸡胚随机分为AAV-hTRX-PR39组和PBS组,将各组细胞分别在低氧（1%O2、5%O2）和常氧（20%O2）条件培养,图象软件Image Pro Plus（IPP）分析鸡胚尿膜囊（CAM）血管密度。结果1.经DNA测序证实,PCR获得了编码具有Eco721和EcoI酶切位点的hTRX cDNA片段和编码BamH I和EcoR721酶切位点的PR39cDNA片段。分析证实核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。2.hTRX-PR39融合基因经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确,测序结果与实验设计的序列完全一致。3.重组质粒pGEM-T-hTRX-PR39酶切图谱证实我们已经将hTRX-PR39融合肽cDNA克隆到pGEM-T表达载体中。4.成功构建了重组腺相关病毒质粒pSSCMV/hTRX-PR39。包装、回收病毒后,Dot blot法测定重组病毒滴度为3.46×1012～3.46×1013PFU/ml。5.免疫细胞化学检测到重组hTRX-PR39的AAV载体能在ECV304中进行表达。6.定量PCR检测到重组AAV-hTRX-PR39可提高缺氧ECV304中VEGF-A,VEGFR-1,VEGFR-2,FGFR-1,Syndecan-4及PR39的表达水平,明显高于PBS组（P＜0.001）。7.流式细胞仪分析低氧环境下ECV304细胞周期图,实验组ECV304中凋亡率明显小于PBS组。8.低氧环境下,实验组的鸡胚尿膜囊血管密度明显大于PBS组。在常氧环境下,血管密度并无明显差别。结论1.应用PCR成功克隆出具有EcoR721和EcoRI酶切位点的hTRX cDNA片段。2.应用PCR成功克隆出具有BamH I和EcoR721酶切位点的PR39cDNA片段。3.成功构建了pGEM-T-hTRX-PR39载体。4.成功构建了pSSCMV/hTRX-PR39重组腺相关病毒载体,并成功包装了较高浓度的重组病毒。5.hTRX-PR39具有抗缺氧应激细胞凋亡作用。6.重组AAV-hTRX-PR39载体对缺氧鸡胚血管生成具有显着的促进作用。
周鹏[6]（2009）在《若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达》文中研究说明以大黄鱼（Larimichthys crocea）性腺为材料,采用SMART（switching mechanism at 5’end of RNA transcript）技术和DSN （duplex-specific nuclease）处理构建了大黄鱼性腺线性化cDNA文库,并从文库中随机挑取了3961个克隆进行测序,共获得3535条高质量的表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）。序列经聚类分析后共得到2916条Unigene,包括415条contigs和2501条singletons。初步分析结果表明：该线性化文库的库容为4.3×106pfu/mL,文库重组率达95.8%,EST的非冗余率为82.49%, Unigene的平均长度为355 bp。经生物信息学分析,1785个为已知基因占总ESTs的61.21%；其中与性腺发育相关的基因66个,占已知基因的3.70%。微卫星分析发现共有129条EST序列含有149个微卫星重复序列,包括6条与性腺发育相关的ESTs。利用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）技术分析了11个与性腺发育相关基因在大黄鱼性腺的表达情况。结果显示精巢特异性LRR基因（testis-specific LRR）只在大黄鱼精巢中表达（P<0.05）；雄性特异性致死3样1基因（MSL3L1）,雄激素相互作用受体核蛋白激酶基因（ARINPK）,精子发生凋亡相关蛋白基因（SARP）,热休克蛋白70（HSP70）和细胞周期蛋白A1基因（cyclin A1）在精巢中的表达量高于卵巢（P<0.05）；相反,组织蛋白酶C基因（Cathepsin C）,核自身抗原精蛋白基因（NASP）和细胞周期蛋白B1 （cycli B1）在卵巢中的表达量高于精巢（P<0.05）；促分裂原激活蛋白激酶1（MAPK1）和泛素C末端水解酶L5 （UCH-L5）在精巢和卵巢中表达没有显着差异（P>0.05）。在上述结果的基础上,利用SMART-RACE技术或RT-PCR技术克隆了大黄鱼性腺发育相关基因cyp19a、cyp19b、cyclin B1、CDC2、UBE2D和UBC9全长cDNA序列,其长度分别为1805 bp、2268 bp、1882 bp、1151 bp、798 bp和846 bp,可分别编码518、500、397、303、147和148个氨基酸的前体蛋白。利用qRT-PCR技术分析这些基因在大黄鱼各器官的表达情况,结果显示：cyp19a在卵巢中的表达量显着高于精巢（P<0.01）,且cyp19a在精巢和卵巢中的表达均极显着高于其它各器官（P<0.01）; cyp19b在端脑、中脑、下丘脑、脾和肝有较高表达量,在雄性大黄鱼的血中表达量最高。在性腺表达量极低。cyclin B1和CDC2基因在性腺中的表达量极显着高于其它各器官（P<0.01）,且在卵巢中的表达量较精巢高（P<0.05）。UBE2D在脾脏和性腺中表达量较高,其它器官表达量较低,在性腺中的表达极显着高于其它各器官（除脾脏外）（P<0.01）。UBC9在性腺中表达量较高,且极显着高于其它各器官（P<0.01）。
王东,仲召阳,李增鹏,杨镇洲,Mark R Kelley[7]（2007）在《双功能基因APE1敲低后人体骨肉瘤细胞基因表达谱变化的研究》文中提出目的探索APE1敲低后骨肉瘤细胞恶性表型受抑的可能机制,以及APE1相互作用的可能分子。方法应用免疫印迹和AP核酸内切酶活性检测确证合成APE1 siRNA对人体骨肉瘤细胞HOS APE1基因的敲低作用;应用GEAr-rayTMQ系列cDNA微阵列研究HOS细胞APE1敲低后基因表达谱的改变。结果APE1 siRNA对HOS细胞APE1基因具有特异性“敲低”作用,其抑制效率为91.5%。APE1抑制对cDNA微阵列六族途径均有影响,其中对细胞周期族基因影响较少;96个基因中有42个基因有明显变化（43.8%）,其中CDK4、FGFR2、KAI1和NCAM1表达上升,其余38个基因表达均呈下降。结论APE1的敲低对骨肉瘤细胞的细胞周期及DNA损伤、细胞凋亡、信号转导、细胞黏附、血管生成、肿瘤转移途径基因均有影响。
丁永霞[8]（2006）在《枯否细胞封闭对内毒素介导肝脏MAPK和STAT信号转导的影响》文中研究指明目的:内毒素激活肝脏枯否细胞（kupffer cells, KCs）丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPK）信号转导通路,Janus激酶（janus protein tyrosine kinase, JAK）/信号转导子与转录激活子（signal transducer and activator of transcription, STATs）即JAK/STAT信号转导通路,使其大量分泌释放TNF-α、ROS等活性物质,导致肝脏发生氧化应激,引起肝损伤。三氯化钆（gadolinium chloride, GdCl3）可抑制KCs活化,减轻内毒素所致肝损伤,但封闭KCs是否是可以通过调节MAPK、JAK/STAT信号转导通路来实现肝脏保护作用尚未阐明。为此本实验利用小鼠内毒素血症模型,探讨KCs封闭对内毒素介导肝脏上述信号转导的影响。方法:Ⅰ雄性昆明种小鼠连续二天尾静脉分别注射GdCl3（10mg/kg）或等量的生理盐水,第三天腹腔注射半乳糖胺/脂多糖（Galn/LPS）（13mg/3ug/只）或生理盐水,分别于Galn/LPS或生理盐水注射后0.5h、1h、1.5h、6h内眦静脉取血,测血浆ALT活性,取肝脏测其GSH、MDA、TNF-α含量。Ⅱ雄性昆明种小鼠连续二天尾静脉分别注射GdCl3（10mg/kg）或等量的生理盐水,第三天腹腔注射LPS（5mg/kg）或等量的生理盐水,分别于0.5h、2h、6h后取出肝脏,检测肝脏MEK1/2、ERK1/2、p38MAPK、STAT1、STAT3蛋白表达及磷酸化水平。结果:经GdCl3预处理动物血浆ALT活性和肝脏MDA含量明显下降,而GSH含量则升高。LPS可促进肝脏MEK1/2、ERK1/2、p38MAPK、STAT1、STAT3蛋白磷酸化表达;GdCl3预处理能不同程度地抑制LPS诱导的肝脏MEK1/2、ERK1/2、p38MAPK、STAT1、STAT3蛋白磷酸化表达。结论:GdCl3可通过封闭KCs减轻LPS诱导肝内TNF-α、ROS等活性物质的释放,增强肝脏抗氧化应激能力,从而保护肝脏。GdCl3封闭KCs可通过调节肝脏MAPK与JAK/STAT信号转导通路,实现肝脏保护作用。
杨作森[9]（2004）在《大肠癌中Plk1和p53过表达及二者的相关性研究》文中研究表明癌症被认为是通过多种的异常的基因的积累而导致的基因疾病，在它的一个重要的特点就是癌症细胞可以不受控制地生长繁殖，表现出“永生性”。中心体在细胞的有丝分裂中有重要作用，而与其相关的 Ｐｌｋ１ 就显得格外引人注意。 近来的 ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ 激酶作为一个新出现的细胞－循环调节因子家族的成员展现出在多个种属诸如果蝇、酵母以及哺乳动物中经由 Ｍ 期进程的关键作用。在真核细胞中，蛋白质磷酸化作用在促进细胞周期的进程中发挥关键作用，大多数调节细胞－循环转换的酶是细胞周期蛋白－依赖激酶（ＣＤＫｓ），但是毫无疑问在结构上与 ＣＤＫｓ 不同的 ＰＯＬＯ 蛋白质激酶也发挥了重要的作用，这些激酶可能既调节 ＣＤＫｓ 的功能又能协调 ＣＤＫｓ 使进入特殊的细胞－周期的转换。 ＰＬＫ 家族中发现的成员，从果蝇黑胃中丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶“ＰＯＬＯ”在对于表现出晚期幼虫和早期蛹的致命性突变体的研究期间被鉴定。ｐｏｌｏ 基因的突变体能导致异常的有丝分裂的高发生率和在幼虫神经母细胞中的异常染色体的分离。细胞频繁表现出高度浓缩的染色体，单极纺锤体以及未组装的纺锤体极体。相似的表现型也可以在雄性减数分裂中见到，表明 ＰＯＬＯ 激酶对于有丝分裂和减数分裂中纺锤体的功能都是必需的。与有丝分裂的作用一致，ＰＯＬＯ 激酶的活性被报道在多核体胚胎中分裂后期到末期的后期达到高峰。 与果蝇 ｐｏｌｏ 相关的激酶在广泛的从酵母到人类中的组织上被定性。ＰＯＬＯ 类似物的公认的功能在芽殖酵母、裂殖酵母、哺乳动物以及蛙类中被鉴定。在基因分析的基础上，不光是酿酒酵母中观察到的表现型表现出不精确的协调性，而且到目前还没有在二者之间有补充的报道。特殊的是芽殖酵母 ｃｄｃ５ 突变体在有丝分裂后期停滞带有部分分离的染色体在一个延长的饿纺锤体上，表明 Ｃｄｃ５ｐ 可能介导后来的事件使双极纺锤体形成。相对的是，裂殖酵母 Ｐｌｏ１ 激酶看起来既能调节纺锤体的形成又能调节它的分离，而失去了 Ｐｌｏ１ 的功能则导致既有一个有丝分裂的停滞，细胞表现出在单极纺锤体上浓缩的染色体，又有之后的核分裂的失败。Ｐｌｏ１ 的一个重要的在分离中调节因子的功能是观察得到的，是肌动蛋白环的形成以及隔膜材料的沉积都因 Ｐｌｏ１ 的缺如而受影响；而且，Ｐｌｏ１ 的过表达能扳机在细胞循环中各个点上发生分离。这是有可能的即 ＰＬＫｓ 可能完成一些不同的功能在不同的组织中。有选择的是由废除 ＰＬＫ 功能所致的最终结果在每一个组织中都有可能依赖于细胞循环周期事件的精密的时间性。 在哺乳动物中，一些不同的 ＰＬＫｓ 都被鉴定。并且认为特异的 ＰＬＫｓ 可能在细胞周期的不同阶段发挥作用，这很有吸引力。在这些 ＰＬＫｓ 中，Ｐｌｋ１ 最接近果蝇 ＰＯＬＯ。 ·92·<WP=100>吉林大学博士学位论文 所有目前已知的 ＰＬＫｓ 都在 Ｎ－末端有它们的催化区域，并且它们实质上分享了序列上的相似性。不光是在它们的催化区域上，并且也在它们的 Ｃ－末端区域上。特殊的是一个 ３０ 个氨基酸的结构（这里叫 ｐｏｌｏ－ｂｏｘ）是高度保守的并且可能表现出ＰＬＫｓ 的特性的信号。 在哺乳动物的细胞周期中，Ｐｌｋ１ 在有丝分裂的调控中发挥关键的作用。Ｐｌｋ１ 参与了中心体循环、纺锤体的形成以及染色体分离的调节，Ｐｌｋ１ 蛋白在 Ｓ 到 Ｇ２ 期开始积累，并在有丝分裂之后下降。在此之前已经有人研究了在支气管－肺泡癌、鳞状细胞癌、食管癌、胃癌和肺癌中有 Ｐｌｋ１ 的过表达。有人已经提出将 Ｐｌｋ１ 作为肿瘤细胞增殖因素的一个标志物。 ｐ５３ 肿瘤抑制因子基因通过捕获杀死潜在的肿瘤细胞在防止癌症发展中发挥重要作用，突变的 ｐ５３ 基因导致了 ｐ５３ 活性功能的丢失，可在大约半数的人类癌症中被找到。这是肿瘤中最常见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。 ｐ５３ 是一个非常有效的细胞生长的抑制因子，包括细胞循环的停滞和／或程序性细胞死亡，这依赖与细胞的类型以及环境因素。ｐ５３ 功能的调节作用因此对于允许正常细胞的分裂以及肿瘤抑制作用都是很关键的 －－－ ｐ５３ 的功能必须是有充分地缓冲作用，它能允许正常的生长和发展，同时保留有在对于和肿瘤发生有关的应激反应中的快速的诱导功能。因此看起来有证据显示由 ｐ５３ 功能控制的主要机制是 ｐ５３蛋白水平的调节，ｐ５３ 蛋白的定位的控制以及 ｐ５３ 功能的调整，特别是它有这样的功能即可作为序列特殊的转录因子。ｐ５３ 蛋白服从于一些翻译后的修饰以及与其他众多的细胞蛋白质相互作用，这些修饰和蛋白质间的相互作用对于 ｐ５３ 稳定性定位以及功能的调节有影响。 一些在癌症中的反常的增殖作用中有作用的致癌基因已经被显示出能够诱导ｐ５３，有在阻止肿瘤的发展中发挥关键作用的功能。然而，这些主要的致癌基因也是正常细胞循环进程的重要组成部分，这就提出这样一个问题，在
徐蔚晶[10]（2002）在《分子伴侣与白细胞介素-2促增殖信号通路的相互作用——信号分子伴侣Hsp90功能研究》文中指出促进多种免疫细胞增殖是细胞因子白细胞介素-2（IL-2）最为重要的生理功能，关于这一功能相关的信号转导也得到了广泛而深入的研究，多条信号通路被揭示参与其中。本论文工作发现，胞内蛋白折叠系统参与了IL-2促增殖信号调节，“信号分子伴侣”Hsp90具体行使了这一作用。并在此基础上，详细探讨了Hsp90与多种增殖相关信号分子功能的关联。初步阐明Hsp90分子作为胞内“信息体”的重要成员，参与了对信号分子活性的精密调节。快速激活的转录因子Stat5是IL-2促增殖信号通路中重要的效应分子。实验发现胞内Hsp90分子可以与Stat5形成特异性复合物，而且它们的相互作用影响着IL-2刺激下Stat5的激活，并进一步明确了二者相互作用的分子区域。Src家族酪氨酸激酶p56Lck是通路上游关键的启动激酶。论文工作不仅证明p56Lck与Hsp90的相互作用影响其胞内水平，而且初步探讨了Hsp90特异性抑制剂Geldanamycin （GA）对其下游信号的影响。实验还以p56Lck的调节功能域为“钓饵”酵母双杂交筛选了外周血淋巴细胞cDNA库，以期进一步探索与其相互作用的信号分子。端粒酶参与的抗凋亡信号转导与增殖密不可分，是决定细胞生命的重要指标。论文工作从体内、体外两个方面证明，Hsp90的参与保证了IL-2刺激细胞中端粒酶的正常活性。本论文另一部分工作深入研究了IL-2诱导TNF-β基因转录启动的调节机制。证明其启动子区除受Jak-Stat通路调节的-200GASL1元件之外，还存在着一个非常重要的-130EBS元件。并初步阐明MAPK通路中的p38激酶参与其功能调节，揭示了MAPK通路与Jak-Stat通路之间的协同作用。进一步工作利用酵母单杂交系统，寻找与-130EBS元件相互作用的转录因子。
二、泛蛋白连接酶Ubc9参与氧还蛋白Ref 1的降解（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、泛蛋白连接酶Ubc9参与氧还蛋白Ref 1的降解（论文提纲范文）
（1）线粒体IDO1源性单线态氧诱导核自噬介导apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略语索引 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 实验材料 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 HUVECs细胞培养 |
| 3.2 Western Blot(蛋白免疫印迹) |
| 3.3 线粒体单线态氧检测(Si-DMA) |
| 3.4 免疫电镜 |
| 3.5 免疫荧光 |
| 3.6 Si RNA干扰 |
| 3.7 单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附 |
| 3.8 统计学方法 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 Apelin-13诱导人脐静脉内皮细胞发生核自噬 |
| 4.2 Apelin-13诱导人脐静脉内皮细胞线粒体单线态氧产生 |
| 4.3 单线态氧清除剂l-histidine抑制apelin-13诱导的人脐静脉内皮细胞线粒体单线态氧产生及核自噬 |
| 4.4 Apelin-13促进人脐静脉内皮细胞IDO1表达 |
| 4.5 IDO1 si RNA抑制apelin-13 诱导的人脐静脉内皮细胞线粒体单线态氧产生及核自噬 |
| 4.6 线粒体IDO1源性单线态氧参与apelin-13促单核细胞-血管内皮细胞粘附 |
| 4.7 核自噬介导apelin-13 促单核细胞-血管内皮细胞粘附 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献翻译 SUMO化调节FMRP介导的树突棘的消除与成熟 |
| 综述 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）NRF2的SUMO化修饰在KLK肺腺癌运动和侵袭中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NRF2的结构、活性调控与功能 |
| 1.1.1 NRF2的结构 |
| 1.1.2 NRF2表达和活性的调控 |
| 1.1.3 NRF2的功能 |
| 1.2 NRF2与SUMO化修饰 |
| 1.2.1 SUMO化修饰 |
| 1.2.2 NRF2的SUMO化修饰 |
| 1.3 NRF2 与非小细胞肺癌和KRAS突变肺腺癌 |
| 1.3.1 NRF2与非小细胞肺癌 |
| 1.3.2 NRF2与Kras突变肺腺癌 |
| 1.4 NRF2、ROS与肿瘤转移 |
| 1.4.1 NRF2与肿瘤转移 |
| 1.4.2 ROS与肿瘤转移 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 耗材 |
| 2.1.5 抗体 |
| 2.1.6 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建质粒 |
| 2.2.1.1克隆 |
| 2.2.1.2酶切 |
| 2.2.1.3连接 |
| 2.2.2 转化 |
| 2.2.3 挑取单克隆并进行抽提 |
| 2.2.4 构建稳转细胞株 |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹法即Western blot |
| 2.2.6 使用Ni~(2+)-NTA检测NRF2 SUMO化修饰 |
| 2.2.7 抽提RNA |
| 2.2.8 反转录 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 RNA-seq |
| 2.2.11 Transwell实验 |
| 2.2.12 流式检测细胞ROS水平 |
| 2.2.13 检测H_2O_2水平 |
| 2.2.14 检测GSH/GSSG水平 |
| 2.2.15 克隆形成实验 |
| 2.2.16 细胞凋亡实验 |
| 2.2.17 染色质免疫沉淀实验 |
| 2.2.18 数据统计以及分析方法 |
| 2.3 常用试剂配方 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 NRF2的SUMO化修饰抑制KLK肺腺癌运动和侵袭 |
| 3.2 NRF2的SUMO化修饰通过调控NRF2的抗氧化应激能力和细胞内ROS水平,抑制KLK肺腺癌运动和侵袭 |
| 3.3 轻度氧化刺激下调KLK肺腺癌中NRF2的SUMO化修饰,促进细胞运动和侵袭 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 NRF2的SUMO化修饰抑制KLK肺腺癌运动和侵袭 |
| 4.1.1 我们前期结果发现人NRF2的SUMO化修饰位点在K110位 |
| 4.1.2 在KLK肺腺癌中,NRF2 对运动和侵袭的调控不依赖于BACH1 的表达 |
| 4.1.3 NRF2 K110位的SUMO化修饰抑制KLK肺腺癌的运动和侵袭 |
| 4.1.4 NRF2 K110位的SUMO化修饰对KLK肺腺癌转移的调控 |
| 4.2 NRF2的SUMO化修饰维持NRF2 的抗氧化应激功能 |
| 4.2.1 NRF2的SUMO化修饰能转录激活Cat的表达 |
| 4.2.2 NRF2的SUMO化修饰缺失所造成的ROS水平升高,可激活JNK-c-Jun信号通路 |
| 4.2.3 NRF2的SUMO化修饰可能通过JNK-c-Jun通路调控细胞与细胞间粘附和焦点粘连 |
| 4.3 轻度氧化刺激下调NRF2的SUMO化修饰 |
| 4.3.1 氧化应激对NRF2表达和活性的调控 |
| 4.3.2 轻度氧化刺激下调NRF2的SUMO化修饰及其可能的机制 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（3）去泛素化酶BAP1在抗病毒天然免疫应答中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 去泛素化酶家族小干扰RNA文库筛选体系的建立与优化 |
| 3.2 高通量筛选调节抗病毒天然免疫的去泛素化酶 |
| 3.3 BAP1 可以显着正向调控抗病毒天然免疫 |
| 3.4 BAP1 在小鼠肺脏感染流感病毒过程中发挥保护性作用 |
| 3.5 BAP1 可以促进病毒感染诱导的IRF3 的活化 |
| 3.6 BAP1 可以与IRF3 相互作用 |
| 3.7 BAP1 抑制IRF3 泛素化介导的蛋白酶体途径降解 |
| 3.8 BAP1 主要在核内抑制IRF3 K48 泛素化降解 |
| 3.9 Lys77 位点是IRF3 降解相关的重要K48 泛素化位点 |
| 3.10 BAP1 催化IRF3 K77 位点去泛素化修饰并抑制降解 |
| 3.11 BAP1与E3 泛素连接酶UBE3C共同调控IRF3 泛素化水平及活性 |
| 4 讨论 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 综述：IRF3 翻译后修饰与天然免疫调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和学术交流 |
| 致谢 |
（4）SUMO蛋白酶SENP3对巨噬细胞活化的调控以及对基因表达谱和小鼠表型的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 全文缩略语中英文对照 |
| 绪论 |
| 一、活性氧与肿瘤、炎症的关系 |
| 二、幽门螺杆菌引起的胃炎和胃癌 |
| 三、SUMO化修饰(SUMOylation)与去SUMO化修饰(DeSUMOylation) |
| 四、SUMO化修饰与巨噬细胞炎症信号通路 |
| 五、SUMO修饰与泛素化修饰 |
| 六、JNK和 MKK7 |
| 七、FOXP1 |
| 第一部分 巨噬细胞SENP3在幽门螺杆菌引起的胃炎中的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 小鼠 |
| 1.2.2 人胃炎标本由上海长征医院病理科提供 |
| 1.2.3 细胞 |
| 1.2.4 细菌菌株 |
| 1.2.5 质粒 |
| 1.2.6 主要试剂 |
| 1.2.7 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养、复苏和冻存 |
| 1.3.2 细胞转染 |
| 1.3.3 幽门螺杆菌H.pylori与巨噬细胞共培养 |
| 1.3.4 质粒构建 |
| 1.3.5 质粒提取 |
| 1.3.6 总RNA提取 |
| 1.3.7 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 1.3.8 实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR) |
| 1.3.9 蛋白质免疫印迹 |
| 1.3.10. 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP) |
| 1.3.11 Ni-NTAbeadspulldown |
| 1.3.12 活性氧检测 |
| 1.3.13 巨噬细胞趋化迁移实验 |
| 1.3.14 巨噬细胞吞噬实验 |
| 1.3.15 提取骨髓来源巨噬细胞 |
| 1.3.16 细胞核质分离 |
| 1.3.17 C57小鼠基因型鉴定 |
| 1.3.18 C57小鼠幽门螺杆菌感染胃炎模型 |
| 1.3.19 小鼠胃组织处理 |
| 1.3.20 苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin)染色 |
| 1.3.21 免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 1.3.22 SENP3flox小鼠的制备 |
| 1.3.23 统计学分析 |
| 1.3.24 本课题用到的引物序列 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 幽门螺杆菌(H.pylori)通过活性氧依赖的方式诱导巨噬细胞SENP3蛋白累积 |
| 1.4.2 巨噬细胞的SENP3是其应答炎症反应能力的关键调控因子 |
| 1.4.3 SENP3调控巨噬细胞炎症应答中JNK的激活 |
| 1.4.4 MKK7能够被SENP3去SUMO化修饰 |
| 1.4.5 SENP3通过去除MKK7SUMO化修饰而激活JNK磷酸化 |
| 1.4.6 成功建立巨噬细胞-上皮细胞共培养系统 |
| 1.4.7 成功构建SENP3Ly Z2-cre小鼠 |
| 1.4.8 巨噬细胞SENP3特异敲除小鼠的幽门螺杆菌感染胃炎发生率较低 |
| 1.5 小结 |
| 1.6 讨论 |
| 第二部分 SENP3调控胃癌细胞功能的数字基因表达谱分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞 |
| 2.2.2 细菌菌株 |
| 2.2.3 质粒 |
| 2.2.4 主要试剂 |
| 2.2.5 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养和转染 |
| 2.3.2 质粒构建 |
| 2.3.3 稳敲细胞系的建立:sh-RNA SENP3 SGC7901 |
| 2.3.4 数字基因表达谱测序 |
| 2.3.5 数字基因表达谱测序数据分析流程 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 稳敲SENP3的胃癌细胞p LVX-shRNA-SENP3SGC7901的建立 |
| 2.4.2 提取RNA的质量验证 |
| 2.4.3 数字基因表达谱测序概况 |
| 2.4.4 差异表达基因的功能分析 |
| 2.4.4.1 GO分析 |
| 2.4.4.2 Pathway富集分析 |
| 2.4.5 SENP3促进泛素降解途径 |
| 2.4.6 FOXP1的SUMO修饰 |
| 2.4.7 FOXP1在胃癌细胞中的表达情况 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 讨论 |
| 第三部分 SENP3+/-小鼠表型的初步观察分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 小鼠 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 C57小鼠组织蛋白提取 |
| 3.3.2 C57小鼠基因型鉴定 |
| 3.3.3 苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin)染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 SENP3在C57小鼠各组织中的蛋白表达情况 |
| 3.4.2 SENP3+/-小鼠表型分析 |
| 3.4.2.1 体重分析 |
| 3.4.2.2 各器官大小比较 |
| 3.4.2.3 主要脏器组织学 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间参加的会议 |
（5）hTRX-PR39融合基因重组腺伴病毒载体的构建及对缺氧鸡胚的促血管生成作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一 脑缺血的临床治疗研究进展 |
| 二 脑缺血的基因治疗研究进展 |
| 三 基因治疗技术的研究进展 |
| 四 腺相关病毒和腺相关病毒载体及其研究进展 |
| 第二部分 实验设计 |
| 一 研究拟解决的问题 |
| 二 研究的总体思路 |
| 第三部分 实验方法与结果 |
| 第一章 人硫氧还蛋白hTRX cDNA的克隆及序列分析 |
| 一 构建方案 |
| 二 材料和方法 |
| 三 结果 |
| 第二章 PR39 cDNA的克隆和序列分析 |
| 一 构建方案 |
| 二 材料和方法 |
| 三 结果 |
| 第三章 融合基因hTRX-PR39 cDNA的克隆和序列分析 |
| 一 构建方案 |
| 二 材料方法 |
| 三 结果 |
| 第四章 表达hTRX-PR39重组腺相关病毒的构建、包装及滴度测定 |
| 一 构建方案 |
| 二 材料方法 |
| 三 结果 |
| 第五章 分泌表达hTRX-PR39重组腺相关病毒在ECV304中表达情况的实验研究 |
| 一 材料 |
| 二 方法 |
| 三 结果 |
| 第六章 分泌表达hTRX-PR39重组腺相关病毒对低氧血管内皮细胞VEGF-A,VEGFR-1,VEGFR-2,FGFR-1,Syndecan-4的表达及低氧鸡胚促血管生成的实验研究 |
| 一 材料 |
| 二 方法 |
| 三 结果 |
| 第四部分 讨论 |
| 一 抗菌肽PR39克隆及序列分析 |
| 二 hTRX基因及其序列合成、分析 |
| 三 hTRX-PR39融合基因的克隆及序列分析 |
| 四 重组病毒rAAV/hTRX-PR39的构建 |
| 五 分泌表达hTRX-PR39重组腺相关病毒在ECV304中表达 |
| 六 分泌表达hTRX-PR39重组腺相关病毒对低氧VEGF-A,VEGFR-1,VEGFR-2,FGFR-1,Syndecan-4的表达及低氧鸡胚促血管生成作用 |
| 七 本研究的意义及创新 |
| 第五部分 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附 待发表英文论文一 |
| 附 待发表英文论文二 |
| 附 待发表英文论文三 |
（6）若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 本研究的目的与意义 |
| 1.2 均一化全长cDNA文库构建的意义 |
| 1.3 表达序列标签的概述 |
| 1.4 鱼类性腺发育相关基因的研究进展 |
| 1.5 本研究的技术路线 |
| 第二章 大黄鱼性腺线性化cDNA文库构建及ESTs分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大黄鱼性腺总RNA的抽提和mRNA的分离纯化 |
| 2.2.2 cDNA文库构建和质量检测 |
| 2.2.3 ESTs聚类和微卫星分析 |
| 2.2.4 ESTs同源分析和注释 |
| 2.2.5 部分性腺发育相关基因在性腺的表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 线性化文库构建效率 |
| 2.3.2 含微卫星序列的EST序列分析 |
| 2.3.3 性腺发育相关基因及表达分析 |
| 第三章 大黄鱼性腺发育相关基因克隆及器官表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 各器官RNA的提取 |
| 3.2.2 SMART-RACE技术获取基因全长 |
| 3.2.3 合成RT-PCR cDNA第一链和PCR扩增 |
| 3.2.4 割胶纯化基因片段 |
| 3.2.5 与质粒载体连接 |
| 3.2.6 连接产物转化 |
| 3.2.7 质粒插入片段的检测 |
| 3.2.8 质粒测序及测序结果拼接 |
| 3.2.9 目的基因的生物信息学分析 |
| 3.2.10 荧光定量PCR分析各基因在各器官的表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 总RNA的抽提结果 |
| 3.3.2 RACE-PCR扩增结果 |
| 3.3.3 RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.4 Cyp19a基因序列分析及在各器官中的表达 |
| 3.3.5 Cyp19b基因序列分析及在各器官中的表达 |
| 3.3.6 Cyp19b基因序列分析及在各器官中的表达 |
| 3.3.7 CDC2基因序列分析及在各器官中的表达 |
| 3.3.8 UBE2D基因序列分析及在各器官中的表达 |
| 3.3.9 UBC9基因序列分析及在各器官中的表达 |
| 3.3.10 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的学术论文和研究成果 |
（7）双功能基因APE1敲低后人体骨肉瘤细胞基因表达谱变化的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞培养 |
| 1.2 APE1 siRNA转染 |
| 1.3 免疫印迹 |
| 1.4 AP核酸内切酶活性检测 |
| 1.5 cDNA阵列分析 |
| 1.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 APE1 siRNA抑制APE1蛋白表达及核酸内切酶活性 |
| 2.2 cDNA微阵列杂交分析 |
| 3 讨论 |
（8）枯否细胞封闭对内毒素介导肝脏MAPK和STAT信号转导的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 部分英文缩写及含义 |
| 正文 |
| 前言 |
| 实验一 三氯化钆封闭枯否细胞对 Galn/LPS 诱导的小鼠急性肝损伤发生的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 三氯化钆封闭枯否细胞对内毒素激活肝脏MAPK和STAT的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（9）大肠癌中Plk1和p53过表达及二者的相关性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一章 Plk 家族的研究进展 |
| 一. plｋ 家族成员 |
| 二. plks与细胞循环各细胞器的联系 |
| 三. plks的CooH结构域的研究 |
| 四. Plks在细胞循环中的控制作用 |
| 五. plk 家族成员在间期细胞－周期转换中的作用 |
| 六. plks在减数分裂中的研究 |
| 七. plk1 在临床方面的应用 |
| 第二章 ｐ53 肿瘤抑制因子的功能 |
| 一. ｐ53基因功能 |
| 二. ｐ53蛋白的结构 |
| 三. ｐ53基因家族 |
| 四. ｐ53的相关研究 |
| 五. ｐ53功能的调节 |
| 六. 确定反应的选择 |
| 七. 抑癌基因 ｐ53 的应用研究 |
| 八. 激活 ｐ53 基因网络功能的上游分子事件 |
| 九. 细胞内 ｐ53 蛋白表达水平的维持和调节 |
| 第三章 实验内容 |
| 前言 |
| 材料方法与结果判定 |
| 实验一:大肠癌中plk1和ｐ53蛋白的免疫组化染色 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 实验流程 |
| 三. 显微镜下观察 |
| 实验二:对于大肠癌中plk1和ｐ53的westernblot分析 |
| 一. 实验原理 |
| 二. 材料与方法 |
| 三. 实验流程 |
| 实验三:大肠癌中 plk1 与 ｐ53ｍ 的原位杂交 |
| 一. 基本原理 |
| 二. 材料与方法 |
| 三. 实验流程 |
| 实验结果 |
| 一. 结果判定 |
| (一) 免疫组化结果判定 |
| (二) westernblot 结果判定 |
| (三) 原位杂交结果判定 |
| 二. 结果分析 |
| 结果讨论 |
| 一. 大肠癌中POLO-like 激酶 1 的表达 |
| 二. 在大肠癌中 ｐ53 的表达 |
| 三. 大肠癌中 P1K1 与 ｐ53 的相关性分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文及获奖情况 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
（10）分子伴侣与白细胞介素-2促增殖信号通路的相互作用——信号分子伴侣Hsp90功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 关键词 |
| 第一部分 信号分子伴侣Hsp90功能研究 |
| 引言 |
| 第一章 Hsp90参与IL-2诱导的转录因子Stat5活性调节 |
| 1.1材料与方法 |
| 1.2结果 |
| 1.2.1Hsp90特异性抑制剂GA影响转录因子Stat5功能 |
| 1.2.2GA阻抑转录因子Stat5酪氨酸磷酸化 |
| 1.2.3胞内存在“Hsp90-Stat5”复合体 |
| 1.2.4Ba/F3β细胞中验证Hsp90对Stat5的功能影响 |
| 1.2.5IL-2刺激与“Hsp90-Stat5”复合体形成 |
| 1.2.6Hsp90参与维持胞内Stat5蛋白水平 |
| 1.2.7 Stat5与Hsp90相互作用的结构区域研究 |
| 1.3讨论 |
| 第二章 Hsp90与p56Lck激酶及其下游信号 |
| 2.1材料与方法 |
| 2.2结果 |
| 2.2.1Hsp90与p56Lck激酶在IL-2刺激细胞中存在相互作用 |
| 2.2.2GA处理降低p56Lck激酶胞内水平 |
| 2.2.3GA不影响p56Lck激酶下游转录因子AP-1激活 |
| 2.2.4GA不影响p56Lck激酶下游转录因子NF-AT入核 |
| 2.2.5 酵母双杂交筛选与p56Lck激酶相互作用的信号分子 |
| 2.3讨论 |
| 第三章 Hsp90保证了IL-2诱导下的端粒酶活性升高 |
| 3.1材料与方法 |
| 3.2结果 |
| 3.2.1IL-2刺激增强端粒酶活性 |
| 3.2.2GA处理降低IL-2诱导的端粒酶活性 |
| 3.2.3体外免疫去除Hsp90蛋白降低端粒酶活性 |
| 3.2.4 Hsp90反义核酸削弱胞内端粒酶活性 |
| 3.3讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 IL-2诱导TNF-β基因转录启动机制的深入研究 |
| 引言 |
| 4.1材料与方法 |
| 4.2结果 |
| 4.2.1TNF-β基因启动区-130EBS元件的发现 |
| 4.2.2IL-2诱导“-130EBS元件－核因子”复合体形成 |
| 4.2.3-130EBS元件参与IL-2刺激下TNF-β基因转录启动调节 |
| 4.2.4 磷酸化过程参与-130EBS元件激活 |
| 4.2.5 p38激酶参与-130EBS元件激活 |
| 4.2.6 p38激酶影响TNF-β基因启动子IL-2响应性 |
| 4.2.7 -130EBS元件的结合验证 |
| 4.2.8 单杂交筛选与-130EBS元件相互作用的反式因子 |
| 4.3讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1.缩略词 |
| 附录2.在学期间发表论文 |
四、泛蛋白连接酶Ubc9参与氧还蛋白Ref 1的降解（论文参考文献）
- [1]线粒体IDO1源性单线态氧诱导核自噬介导apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附[D]. 颜家龙. 南华大学, 2021
- [2]NRF2的SUMO化修饰在KLK肺腺癌运动和侵袭中的作用及其机制研究[D]. 徐佳倩. 上海交通大学, 2020(01)
- [3]去泛素化酶BAP1在抗病毒天然免疫应答中的作用与机制研究[D]. 刘翔. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(10)
- [4]SUMO蛋白酶SENP3对巨噬细胞活化的调控以及对基因表达谱和小鼠表型的影响[D]. 劳一敏. 上海交通大学, 2016
- [5]hTRX-PR39融合基因重组腺伴病毒载体的构建及对缺氧鸡胚的促血管生成作用[D]. 阮喜云. 山东大学, 2009(12)
- [6]若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达[D]. 周鹏. 集美大学, 2009(02)
- [7]双功能基因APE1敲低后人体骨肉瘤细胞基因表达谱变化的研究[J]. 王东,仲召阳,李增鹏,杨镇洲,Mark R Kelley. 第三军医大学学报, 2007(01)
- [8]枯否细胞封闭对内毒素介导肝脏MAPK和STAT信号转导的影响[D]. 丁永霞. 山西医科大学, 2006(01)
- [9]大肠癌中Plk1和p53过表达及二者的相关性研究[D]. 杨作森. 吉林大学, 2004(04)
- [10]分子伴侣与白细胞介素-2促增殖信号通路的相互作用——信号分子伴侣Hsp90功能研究[D]. 徐蔚晶. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）, 2002(02)