一、流行性感冒病毒鸡胚高产株的遗传特性分析（论文文献综述）
宋文爽[1]（2020）在《冻干鼻喷流感减毒活疫苗生产用毒种的工艺优化研究》文中提出冻干鼻喷流感减毒活疫苗采用鼻喷途径免疫,能激发人机体的细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫,具有减免注射疼痛,免疫保护作用持久,有一定作用交叉保护作用等优点,特别适合儿童接种免疫。本文我们将介绍流感病毒生产工艺优化,提高毒种病毒滴度,从而提高疫苗产量,降低生产成本。创造更大经济效益。本研究采用SPF鸡胚作为流感病毒生产基质,经过毒种制备,探索WHO世界卫生组织推荐的2019-2020年北半球流感毒株组H1N1（A/17/Brisbane/2018/8175（H1N1）pdm09）型流感病毒、H3N2（A/17/Brisbane/2018/3610（H3N2））型流感病毒以及B（B/Colorado/06/2017-CDC-LV17B）型流感病毒的工艺研究。主要研究结果如下:1、以病毒滴度为参考指标,确定了H1N1型别毒种最适宜制备工艺参数为:稀释度10-5、培养温度32.5℃、培养湿度75%、培养时间52h、冷胚时长20h。2、以病毒滴度为参考指标,确定了H3N2型别毒种最适宜制备工艺参数为:稀释度10-6、培养温度33.0℃、培养湿度75%、培养时间60h、冷胚时长16h。3、以病毒滴度为参考指标,确定了B型别毒种最适宜制备工艺参数为:稀释度10-6、培养温度31.5℃、培养湿度65%、培养时间68h、冷胚时长16h。4、经过质量检查合格,建立了3种型别流感病毒种子库,供商业化生产冻干鼻喷流感减毒活疫苗生产使用。本研究确立了毒种生产工艺参数,为冻干鼻喷流感减毒活疫苗的生产提供参考,应用于生产中单枚鸡胚生产疫苗由原来的3.5支提高到10.3支,大大节约成本,提高产量,为企业创造更大经济价值。
夏炫梓[2]（2020）在《20172018年广州市乙型流感病毒HA、NA基因特征及中西药抗病毒药效初筛研究》文中研究说明【背景】根据WHO流感监测数据显示,2017年第45周至2018年第13周,在全球范围内,乙型流感病毒成为季节性流感的优势株,其中Yamagata谱系占据主导优势,对人群的健康带来一定程度的影响。针对流感的防治,西医主要通过注射流感疫苗进行免疫预防和使用化学药物阻断病毒的繁殖进程,中医药通过抑制病毒复制、调节机体炎症反应等多方面发挥作用。化学药物主要以神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道阻滞剂为主,传统中药主要以单味中药和中药复方为主。反向遗传学对流感病毒的基因研究具有重要的意义。甲型流感病毒的反向遗传学技术平台已被广泛构建和应用,而乙型流感病毒的反向遗传学技术平台的成功构建却鲜有报道。【目的】本研究深入了解2017～2018年广州市流行的乙型流感病毒HA和NA的基因特征和流行原因,探索病毒序列新变异是否会引起病毒功能性改变,为流感监测防控和药物治疗流感提供科学依据。另外,构建乙型流感病毒反向遗传学平台,为乙型流感病毒基因研究和中药抗乙型流感病毒机制研究提供基础。【方法】一、采集2017年12月～2018年4月在广州市哨点医院的流感患者的咽拭子样本,应用免疫荧光法检测出乙型流感病毒样本后进行病毒分离培养和病毒RNA提取,通过一步法RT-PCR扩增病毒目的基因血凝素和神经氨酸酶,再进行基因序列测定和分析。二、根据序列比对分析的结果,选用神经氨酸酶基因上具有未报导过的氨基酸突变位点的9株病毒进行奥司他韦和帕拉米韦体外药物敏感性实验筛选,观察是否存在耐药性病毒株,以及使用连花清瘟胶囊进行体外抗病毒活性实验,观察奥司他韦、帕拉米韦与连花清瘟胶囊抑制病毒活性之间的差异。使用100TCID50的病毒量感染MDCK细胞后,分别加入连续半数稀释浓度的奥司他韦溶液、帕拉米韦溶液和连花清瘟胶囊溶解液,观察细胞病变和计算IC50值。三、根据序列比对分析的结果,选用血凝素基因上具有未报导过的氨基酸突变位点的9株病毒进行生长曲线实验观察病毒株之间增殖能力的差异。使用0.01MOI的病毒量感染MDCK细胞,分别在24h、48h和72h回收病毒上清液,再通过空斑实验来观察病毒株的增殖能力。四、使用pHW2000载体为骨架,构建包含各个病毒基因片段的8个重组质粒,将质粒混合后转染293T和MDCK混合细胞,培养后通过感染MDCK细胞进行病毒传代,进而完成乙型流感病毒的拯救。【结果】一、总共分离扩增2017～2018年乙型流感病例鼻咽拭子样本40份,成功分离出38株,初步鉴定出Yamagata系28株,Victoria系10株。对38株乙型流感病毒的HA、NA基因进行测序并构建进化树进行分析,（1）HA进化分析显示:28株Yamagata系乙型流感病毒的HA基因均属于Yamagata Clade 3分支,并且与疫苗株B/Phuket/3073/2013属于同一亚支,还有一个亚支为B/Wisconsin/1/2010类似株;10株Victoria系乙型流感病毒均属于Victoria Clade 1A分支,其中以B/Hong Kong/286/2017和B/Norway/2409/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲1、▲2）中未出现广州市流行株。（2）NA进化分析显示:28株Yamagata系乙型流感病毒中有27株的NA基因属于Yamagata Clade 3分支,并且与疫苗株B/Phuket/3073/2013属于同一亚支;10株Victoria系乙型流感病毒均属于Victoria Clade 1A分支,以B/Norway/2409/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲2）中未出现广州市流行株,以B/Hong Kong/286/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲1）中出现广州市流行株。另外,发现了病毒株B/Guangdong/GZ20/2018毒株为BY-HA/BV-NA系间重配病毒。对38株乙型流感病毒进行HA、NA氨基酸序列分析,（1）HA氨基酸序列分析:28株Yamagata系病毒株（包括B/Guangdong/GZ20/2018）共有11个氨基酸位点发生突变,28株均携带L187Q和M266V突变;另外,发现突变位点S93P、R151K、N179K、P342S、V421A、N436S、T547I。B/Guangdong/GZ14/2018毒株缺失第540位氨基酸。B/Guangdong/GZ40/2018毒株发现T136I位点突变,位于120环抗原表位上。10株Victoria系病毒株共有7个氨基酸位点发生突变,10株均携带I132V、N144D和A214T突变,其中I132V位于抗原表位120环上,N144D位于抗原表位150环上;另外,发现突变位点A169T、K227R、N248D和P343S。（2）NA氨基酸序列分析:27株Yamagata系病毒株（不包括B/Guangdong/GZ20/2018）共有22个氨基酸位点发生突变,26株（96.3%）携带I49M突变,19株（70.4%）携带R65H突变,24株（88.9%）携带I171M突变,25株（92.6%）携带D342K突变,另外两株病毒B/Guangdong/GZ16/2018和B/Guangdong/GZ34/2018在342位点则携带D342N突变,27株（100%）均携带K373Q突变,17株（63%）携带S402P突变;另外,发现突变位点I6T、F12L、V45I、P48S、A67V、A67T、G70E、P76L、N144S、R186I、F266L、E308G、R315K、T372N、T389I、K419E、T437I。10株Victoria系病毒株和系间重配株B/Guangdong/GZ20/2018共有12个氨基酸位点发生突变,11株均携带I120V、K220N、S295R、N340D、E358K突变,8株（73%）携带D384G突变,3株（27%）携带V401I突变;另外,发现突变位点P48T、T106I、I262M、M369V、V422I。二、所选取的9株病毒株中有5株存在不同程度的耐药性,而且5株病毒均属于Yamagata谱系。连花清瘟胶囊对其中4株耐药性程度较大的病毒株和药物敏感性参考株的体外活性抑制作用相近。三、Yamagata谱系病毒株B/Guangdong/GZ19/2018、B/Guangdong/GZ23/2018、B/Guangdong/GZ24/2018、B/Guangdong/GZ28/2018和B/Guangdong/GZ29/2018具有比B/Guangdong/GZ40/2018更强的增殖能力;Victoria谱系病毒株B/Guangdong/GZ39/2018的增殖能力比B/Guangdong/GZ11/2018更突出;系间重配株B/Guangdong/GZ20/2018的增殖能力弱于其他8株病毒。总体而言,Yamagata谱系病毒株在增殖能力上比Victoria谱系病毒株更强。四、成功构建乙型流感病毒反向遗传学平台。【结论】2017～2018年度WHO推荐的三价流感疫苗株未能对广州市人群形成良好的保护作用。因此,须密切关注乙型流感病毒的变异情况以及和疫苗株的匹配度,以便及时制定合理的疫苗更新和接种方案,对流感进行科学有效的防控。流行株中存在的对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和帕拉米韦产生耐药性的现象,以及耐药株和药敏株之间存在未报导过的氨基酸突变位点,而连花清瘟胶囊发挥传统中药的优势,对耐药性病毒株具有稳定的抗病毒活性作用。另外,Yamagata系流行株具有比Victoria谱系流行株更强的增殖能力,而不同谱系的毒株之间的增殖能力也存在一定的差异,并且,不同谱系的病毒株之间存在未报导过的氨基酸突变位点。其中的机制需进一步验证。
张诚[3]（2019）在《两株河北省流感病毒流行株的致病性和传播能力研究》文中进行了进一步梳理流感是一种由流感病毒引起的急性呼吸道疾病的简称,流感每年都会发生。流感是重要的人兽共患病之一,对人类健康以及兽医公共卫生安全构成一定威胁。2018年流感的流行特点和往年有所不同,不仅有乙型流感病毒的感染,还合并了甲型H1N1流感病毒的感染,乙型流感患者数量相对多,但症状较轻,甲型流感患者数量少,但症状可能会较重。另外,少部分的流感患者是甲型流感病毒和乙型流感病毒的混合感染,患者发病较急,容易发展成为重症流感。对2018年河北省流感病毒流行株进行致病性和传播能力的研究,可为河北省流感的防控提供理论和技术支撑。本研究于2018年流感流行季在河北分离、鉴定两株流感流行株,分别命名为A/Hebei/F076/2018（H1N1）（简称F076）毒株与B/Hebei/16275B/2018（简称16275B）毒株。遗传进化分析结果表明,F076毒株并未发生跨物种流感病毒间的重组,F076毒株的HA基因与NA基因均位于Swine分支内;16275B毒株的各基因组片段来自不同的毒株,16275B毒株的HA基因位于B Victoria分支内,与B/Guangzhou/56/2016遗传距离最近。受体结合特性试验结果表明,F076毒株与16275B毒株均只具有α-2,6唾液酸受体结合能力,这意味着两株病毒均只具有感染哺乳动物的可能。流感病毒在MDCK细胞上的复制能力试验结果表明,F076毒株和16275B毒株在MDCK细胞上均具有良好的增殖能力。动物致病性试验结果表明,F076毒株和16275B毒株感染小鼠均表现了临床症状。在试验期间,感染F076毒株的小鼠死亡率为40%;感染16275B毒株小鼠的死亡率为0。流感病毒在小鼠不同组织中的分布试验表明,感染F076毒株第3天的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑中均能检测到病毒,第5天的小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中能检测到病毒,第7天的小鼠仅肺脏中能检测到病毒;感染16275B毒株小鼠第3天、第5天和第7天的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑的结果均为阴性。病理变化观察结果表明,F076毒株和16275B毒株感染小鼠3天、5天和7天的肺脏均出现了流感相关病理变化。免疫组化染色结果表明,F076毒株和16275B毒株感染小鼠3天、5天和7天的肺脏均能检测到病毒抗原。传播试验结果表明,F076毒株和16275B毒株均具有在豚鼠间传播的能力,F076毒株在豚鼠间通过直接接触传播的效率为66.7%,气溶胶传播效率为33.3%;16275B毒株通过直接接触传播的效率为100%,气溶胶传播效率为33.3%。本研究结果表明,2018年河北省分离的F076毒株和16275B毒株只有感染哺乳动物的潜力,F076毒株对小鼠致病性强于16275B毒株,F076毒株直接接触传播的效率弱于16275B毒株,而F076毒株和16275B毒株的气溶胶传播效率相同。
蒋大秀[4]（2019）在《2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究》文中研究指明H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）对家禽表现为低致病性,引起呼吸道症状、产蛋下降等轻微症状,感染鸡排毒时间长,如若继发感染其它病原体死淘率将增加,造成养禽业严重的经济损失。近年来,不断有H9N2亚型AIV感染人的病例出现,甚至有患者病情严重,H9N2病毒对哺乳动物致病力的机制的研究与其它亚型禽流感病毒相比相对较少。H9N2亚型AIV具有流行范围广、传播效率高的流行特点,而且能够提供内部基因给其它亚型流感病毒产生重组病毒,具有大流行的风险,应对其进行长期监测和病原特点分析。本研究对2016年10月至2018年9月期间华东地区活禽交易市场（Live poultry markets,LPMs）和家禽养殖场进行了禽流感病毒流行病学监测,并对H9N2亚型AIV进行了病毒的分离鉴定和基因测序,同时选取了代表性H9N2亚型AIV进行了传播性试验、S基因型H9N2亚型AIV进行了小鼠的致病性试验。1、H9N2亚型禽流感病毒病原学调查2016年10月至2018年9月期间,在华东地区LPMs共采集泄殖腔/喉头棉拭子样品2183份,经SPF鸡胚分离和血凝-血凝抑制试验鉴定了 518株AIV和NDV病毒,病毒总阳性分离率为23.73%,其中H9N2亚型252株（11.54%,252/2183）;养鸡场疑似H9N2临床样品中分离鉴定156株H9N2亚型AIV。LPMs病毒阳性样品中H9N2病毒分离率最高（48.65%,252/518）,其次是 H5 亚型（21.81%,113/518）、H3 亚型（14.1%,73/518）、H7亚型（4.83%,25/518）等。2011年7月到2016年9月（统计周期约为12个月）分离率在 0.21%-0.78%,2016 年 10 月至 2018 年 9 月为 8.49%-15.12%,LPMs 中 H9N2 亚型AIV阳性分离率有明显上升。鸡仍然是H9N2亚型AIV的易感宿主;样品主要来源于华东地区江苏、安徽、山东等省市;近两年LPMs中的H9N2亚型AIV在夏季亦有较高的分离率,未表现出明显的季节性流行特征,可能与病毒的热稳定性增强有关。2、华东地区家禽中流行的H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征本文对测得的394个HA基因、302个NA基因、69组内部基因的核苷酸及其编码氨基酸进行了系统性分析,并选取其中具有代表性的69个分离株绘制出全基因系统发生树进行遗传进化分析。运用MEGA6.0邻接法（neighbor-joining method,NJ）绘制出了各基因片段的系统发生树,经分析,HA基因、NA基因均属于Y280-Like,内部基因PB2基因、M基因属于G1-Like,其余4个内部基因均属于F/98-Like,本研究中的H9N2亚型分离株均属于S基因型。H9N2分离株潜在糖基化位点与2012年分离株WJ57基本一致,389个分离株（389/394）HA蛋白具有7个潜在N-糖基化位点（HA1:11,123,280,287,295;HA2:154,213）,与Y280相比,缺失了 HA1 200位糖基化位点,增加了 HA1 295位糖基化位点;294株（294/302）病毒NA蛋白具有5个潜在N-糖基化位点（69,86,146,200,234）,与WJ57/12相似。其中,有11（11/302）个分离株增加了 NA蛋白第44位、14（14/302）个增加了第402位潜在N-糖基化位点。可影响病毒的受体结合特性的HA蛋白226位几乎（392/394）均发生了 Q→L突变,更倾向于结合哺乳动物受体。前期研究表明HA蛋白381K与PA蛋白672L是影响H9N2亚型AIV气溶胶传播特性的关键氨基酸位点,本研究中6个毒株（6/394）发生了 K381R的突变,PA蛋白第672位均为L。PA蛋白K356R、PB2蛋白E627K是影响H9N2亚型AIV对哺乳动物致病性的重要的氨基酸位点,本研究中所有的分离株PB2蛋白均为627E、PA蛋白均为356R。3、H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性初步研究2016年以来H9N2病毒在鸡群中分离率明显上升,且不断有人感染病例报道,不同基因型毒株传播能力、致病性是否不同,目前还没有系统的研究。从近12年H9N2亚型AIV中筛选出16株进行气源性传播试验,包括3株O基因型（SD07、W4和Dh0801D11）,1株T基因型（HeN86）,和12株S基因型。16株病毒中符合HA381K和PA672L的毒株有W4、HeN86、C1、HeN131、SQ68、WJ57、TM118、SDKD1、AH320、AH463、FJ1802 和 292HZ共12株。S基因型H9N2亚型AIV均具有气源性传播特性,即使GC510、A6的HA蛋白381为R,但是2008年分离株C1只能检测到血清转化而无排毒;其它基因型毒株中除HeN86具有上述分子标记但无气溶胶传播特性,其余病毒均符合。近两年的S基因型毒株气源性传播能力增强,暴露组排毒时间早、排毒持续时间长（第9天）、血清转化水平高;AH320和SDKD1毒株可跨宿主传播（鸡-豚鼠）,而且在检测期范围内暴露组豚鼠排毒直到暴露后14天。8个S基因型H9N2亚型AIV对小鼠低致病性,体重增长率在17.06%-22.89%,均有不同程度的增重降低,SDKD1组增重最少。病毒复制水平和组织分布差异明显,主要在肺脏复制,特别是攻毒后第3天和第5天,部分毒株在心脏、肾脏、肝脏和脾脏中亦能检测到病毒。感染后第3天、5天,各个攻毒组小鼠肺脏均呈现出以瘀血、出血、肺泡间质增生或广泛的炎性细胞渗透等间质性肺炎变化。因此,S基因型病毒普遍具有气源性传播能力、对小鼠低致病性但可从鸡传播给豚鼠,且在小鼠中组织分布更广,提示对公共卫生可能存在威胁。
宋彦丽[5]（2018）在《siRNA对流感病毒血凝素及神经氨酸酶基因的抑制作用及其在病毒重配中应用的研究》文中提出siRNA是广泛存在于生物体内的非编码RNA,其介导的RNAi过程可高效、特异的沉默靶基因,被广泛应用于抗病毒的研究中。已有研究表明,针对流感病毒M,NP等基因的siRNA能够通过抑制基因表达,抑制病毒的增殖。本研究制备了多条针对PR8病毒抗原基因HA和NA的siRNA,测定了其对流感病毒的抑制作用及对基因组的影响。此外,本研究还尝试利用siRNA进行流感病毒疫苗株的重配。在第一部分中,设计了PR8病毒特异地siRNA。通过测序获得疫苗株PR8和野毒株H3N2的序列,根据siRNA设计规则设计了针对PR8病毒HA、NA基因的特异性siRNA。通过序列比对检测并排除与H3N2同源的siRNA序列,最终设计并合成针对PR8的HA和NA基因的特异性siRNA序列共12条。其中包括HA和NA特异的长度为19nt的common siRNA各3条以及长度为25bp的stealth siRNA各3条。在第二部分中,检测了siRNA的抑制效果及特异性。分别在MDCK和MTY6细胞上优化了siRNA抑制实验的转染试剂、浓度及收毒时间等条件。根据优化的条件,通过NA活性、CCID50实验检测了NA特异的siRNA单条、两条及三条联合使用对PR8的抑制效果。结果显示:NA-105与NA-199联合使用的抑制效果最明显,抑制率为86.07%,且不与H3N2发生非特异反应。通过NA活性及血凝实验检测了HA特异的siRNA的抑制效果,显示:HA-56与HA-802联合使用抑制效果明显,抑制率为57.88%,且不与H3N2发生非特异反应。HA与NA特异的siRNA联合使用对PR8的抑制效率,约为95%,高于上述HA或NA siRNA各自联合使用的抑制效果,且对H3N2无抑制作用,特异性好。在第三部分中,用HA和NA特异的siRNA进行PR8与H3N2病毒的重配。采用三种方式制备病毒混合液:（1）在MTY6细胞上分别先后感染PR8和H3N2,细胞病变90%时收获病毒混合液;（2）灭活的PR8与未灭活的H3N2共同感染鸡胚24h后收获病毒混合液;（3）灭活的H3N2与未灭活的PR8共同感染鸡胚24h后收获病毒混合液。共同转染NA-105、NA-199和HA-56、HA-802 siRNA抑制病毒混合液中的PR8病毒增殖,通过噬斑实验筛选单克隆并用RT-qPCR和RT-PCR对病毒进行鉴定。经多轮筛选鉴定并未检测到重配株存在,并对可能的原因进行了分析。在MTY6细胞上用siRNA对PR8病毒连续抑制三代后,通过深度测序检测了siRNA作用下流感病毒基因的突变情况。
李卓凡[6]（2018）在《乙型流感病毒减毒活疫苗安全性和有效性研究》文中提出流感病毒减毒活疫苗（LAIV）通过滴鼻感染途径接种,既能够诱导产生血清中和抗体,又能刺激粘膜免疫应答。目前上市的LAIV以鸡胚为培养基质生产。鸡胚作为生产基质,除了其供应周期制约着疫苗的生产能力之外,还存在着可能因为接种活疫苗引入外源因子污染的风险。Vero细胞是人用生物制品生产普遍采用的细胞基质,但在Vero细胞上进行流感病毒培养时,不同毒株间产量差异大或不能连续传代。目前,国际上仅见对甲型流感Vero细胞适应株的研究,尚未见乙型流感Vero细胞适应株的研究。本研究首先以乙型流感病毒Vero冷适应株BVca作为母本株,与2017-2018年BV系流行株B/上海松江/1173/2017（BV-W）通过反向遗传学重配。重配过程中,以primer cocktail同时克隆乙型流感8基因片段,同源重组的方式连接pHW2000构建乙型流感病毒阳性筛选系统,建立了高效、快速的反向遗传学拯救技术。将流行株HA、NA和母本株6个内部基因片段拯救出乙型流感Vero细胞冷适应株BWVca,该重配毒株可在Vero细胞上25℃连续传代,具有冷适应性（cold-adapted,ca）、温度敏感表型（temperature sensitivity,ts）以及减毒特性（attenuation,att）,在优化的培养条件下病毒滴度可达7.5 LgTCID50/mL,可作为乙型流感减毒活疫苗备选株。减毒活疫苗在接种人体后与野毒株的重配引起人们的担心。流感病毒基因组含有8个节段,当两个不同毒株同时感染同一个细胞时,随机重配会出现256种组合。本研究中,由于所选毒株具有相同的表面抗原,我们将研究重点集中在流感病毒的核糖核蛋白复合体（RNP）的构成基因PB1、PB2、PA、NP中,并将M、NS以单个或同时互换的方式进行组合。将减毒株BWVca与野毒株BV-W的基因片段逐个互换,重配获得34株重组病毒。通过对34株病毒是否具有att特性,对毒株的生物安全性进行评定。在34株病毒中,11株病毒具有部分att特性（符合att判定标准但肺组织有病毒载量）,23株病毒具有完全att特性。通过这些结果,我们证明了疫苗备选株BWVca作为疫苗备选株具有生物安全性,同时首次证明了母本株BVca可以作为乙型流感减毒活疫苗的供体株。鸡胚流感减毒活疫苗Flumist（?）由于在2013-2016流感季免疫效力较低,在2016年被免疫实践咨询委员会（ACIP）建议停用,减毒活疫苗免疫增强研究成为了热点。我们在本研究中将制备的减毒活疫苗与免疫增强剂PolyI:C、鞭毛蛋白FLIC以及2种CpG ODN结合,发现我们制备的流感减毒活疫苗与FLIC或PolyI:C佐剂同时免疫小鼠后,能够增强疫苗的交叉保护效果,将同系病毒保护率分别提高30%和20%,将异系病毒保护率分别提高40%和30%。本研究在优化反向遗传学技术基础上,通过减毒母本毒株与流行株重配获得含有流行株有效表面抗原,并保持母本毒株ts、ca和att表型特征的重配毒株,能够用于Vero细胞流感减毒活疫苗生产;进一步将减毒株与野毒株的部分随机重配,证明了减毒活疫苗使用不会导致毒力的返祖;添加佐剂能够增强流感减毒活疫苗交叉保护性。
杨静[7]（2018）在《镇江市流感病毒时空分布特征及其流行株HA和NA基因变异规律的研究》文中研究说明目的:流行性感冒,简称流感,是由流感病毒（Influenza Virus,IV）引起的急性呼吸道传染病,可造成世界范围内的广泛流行。本研究从流行病学、分子生物学、血清学等方面出发,旨在掌握镇江市流感流行趋势,为该市预测疫苗防治效果及防控流感流行提供科学依据。方法:1.收集2014-2016年镇江市哨点医院采集的流感样病例样本,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行病毒分型,从《中国流感监测信息系统》中导出相应的监测数据,结合实验室结果进行流行病学统计分析。2.对流感病毒核酸阳性样本开展病毒分离以获得流行株,分别扩增其HA和NA基因后测序,利用分子生物学软件对序列进行拼接、比对和分析,与WHO推荐的北半球疫苗株以及省内外代表株等比对溯源。3.对不同年龄组健康体检人群进行甲型H1N1、甲H3、乙型（BY/BV）流感抗体水平检测和分析。结果:1.2014-2016年镇江市流感的流行具有季节性,冬春季是其发病高峰,夏季也会出现小的流行。三年流行株以甲型H1N1、甲H3、乙型（BY/BV）混合交替流行为主。流感病毒对性别的敏感性无差异,但是60岁及以上、5岁人群感染阳性率仍最高。七个辖市区均有流感病毒的检出。2.十三株甲型H1N1分离株与疫苗株A/California/07/2009的HA和NA核苷酸同源性均在95.6%以上。七株HA与江苏株A/Jiangsu-Danyang/SWL1836/2014的亲缘性最近,一株与疫苗株高度同源。九株NA与疫苗株聚集在一起。与疫苗株HA氨基酸位点进行比对,Sa区十一株发生了K173Q突变,一株同时发生K181E突变;Ca1区三株发生V183I突变,但是受体结合位点、糖基化位点均未发现变异,抗原性没有发生改变。3.十三株甲H3分离株与2014/2015疫苗株A/Texas/50/2012、2015/2016疫苗株A/Switzerland/9715293/2013相比,HA和NA的核苷酸和氨基酸同源性都保持在94.8%以上。两株HA与2013/2015疫苗株A/Texas/50/2012高度同源,一株与2015/2016疫苗株A/Switzerland/9715293/2013同源。共有十株发生了多个氨基酸位点的突变,但相关耐药位点氨基酸以及糖基化位点基本保守。4.十四株乙型分离株,BY之间、BV之间HA和NA的核苷酸和氨基酸的同源性均在95.2%以上。两株发生了HA-Y2/NA-V1的系间重配,一株发生了HA-V1/NA-Y2的系间重配。BY系毒株与2014/2015疫苗株B/Massachusetts/2/2012比较,普遍发生120环、150环、190螺旋等氨基酸位点改变的有5株;与2015/2016疫苗株B/Phuket/3073/2013比较,普遍发生120环、150环、190螺旋氨基酸位点改变的有五株。BV系毒株与疫苗株B/Brisbane/60/2008比较,发生120环、150环等氨基酸位点改变的有两株,发生120环氨基酸位点改变的有一株,其中一株还同时发生了I97M突变（190螺旋）。对分离株NA活性位点监测尚未发现变异,但有四株出现了新的糖基化位点204NET。5.一千份血清的检测结果显示,健康人群中抗IAV抗体阳性率水平均高于抗IBV抗体水平,。甲型H1N1、甲3、BY和BV亚型流感病毒抗体保护率分别为24.4%、26.7%、28.4%和18.6%,GMT分别为46.1、47.9、66.1和35.5,抗体保护水平总体较低,且高效价的抗体不多。5岁组和15岁组的各型流感病毒抗体阳性率、保护率、GMT值都明显都比其它三组人群高,而60岁及以上组值都较低。阳性抗体人群中,40.7%出现了同一个体多次感染不同亚型流感病毒的现象。结论:1.2014-2016年镇江市流感病毒呈现多种亚型混合流行的状态,每种亚型所占比重不同,提示需要长期开展流感监测以进一步揭示其流行规律。在流感流行季节需重点关注老人和小孩,加强流感防治的宣传教育,针对特定的年龄段使用特定的疫苗,防止群体性流感疫情的爆发流行。2.十三株镇江甲型H1N1分离株基因多态性增加,没有发生抗原性的改变,受体结合位点、糖基化位点均未发现变异,结合同源性分析,提示WHO推荐的疫苗株A/California/07/2009仍具有较高的免疫保护作用。3.十三株甲H3分离株有可能是由其它省份的病毒迁徙所致,部分毒株与疫苗株有差异,虽未形成新的亚型,但其基因特性和抗原性出现了一定程度的变异。相关的耐药位点以及糖基化位点基本保守,对现使用的神经氨酸酶抑制剂仍然敏感。4.十四株乙型分离株,有两株均发生了HA-Y2/NA-V1的系间重配,一株发生了HA-V1/NA-Y2的系间重配。这种系间重配株是否会造成本地区IBV的局部爆发,还需进一步持续监测。HA1区抗原表位120环、150环、160环以及190螺旋存在着不同程度的点突变,提示部分毒株的抗原性出现改变,疫苗的保护效果可能降低。5.人群甲型H1N1、甲H3、BY和BV亚型流感抗体保护水平总体较低,且高效价的抗体不多,提示本地区易发生流感的流行。因此,我们在开展流感病毒流行病学以及病原学监测的同时,还要继续对分子进化特征、人群流感病毒免疫水平等持续监测,从多角度共同研判流感病毒流行趋势,为流感的防控提供科学依据。
耿兴良[8]（2017）在《三价Vero细胞季节性流感减毒活疫苗的研究》文中研究指明疫苗是预防流感流行的主要有效手段,现阶段使用和在研的流感疫苗分为裂解灭活疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗。流感减毒活疫苗（简称LAIV）以滴鼻方式接种,可引起包括体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫在内的更为持久的免疫保护。目前只有美国和俄罗斯以鸡胚为基质生产减毒活疫苗。鸡胚生产疫苗存在卵清蛋白过敏和供应周期长等缺点,尤其是LAIV生产过程没有病毒灭活步骤,存在将鸡源性传染性病原体散播至人群的风险。Vero细胞是WHO推荐用于人用生物制品生产的细胞基质,可通过发酵罐大规模培养。然而,Vero细胞对流感病毒不敏感,多数流感病毒不能在Vero细胞上连续传代。国外虽然投入巨资开发Vero细胞流感疫苗,但全球仍未见以Vero细胞为培养基质生产的LAIV问世。选育流感病毒Vero细胞冷适应母本毒株对于LAIV的研发至关重要。国外仅见一株甲型冷适应株A/Singapore/1/57ca（H2N2）的报道,乙型的尚未见报道。本实验室经过10多年的研究,成功选育出甲型和乙型Vero细胞冷适应株A/Yunnan/1/2005Vca（H3N2Vca）、B/Yunnan/1/2011Vca（BVca）。经鉴定,两株病毒能够在Vero细胞25℃稳定传代培养,且具有冷适应性（ca）、温度敏感特性（ts）和减毒特性（att）等表型特征。我们将 H3N2Vca 和 BVca 的 8 个基因片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS）克隆至双向表达载体PHW2000,筛选出能协同工作的8个质粒,拯救的毒株能在Vero细胞25 ℃稳定传代培养,且具备ca、ts和att特性,表明Vero细胞流感减毒母本株基因组库构建成功。按照6+2模式,将含H3N2Vca和BVca的6个内部基因的PHW2000质粒与含2013-2014年WHO推荐北半球季节性流感疫苗生产用毒株 A/ChristChurch/16/2010（H1N1）、A/Texas/50/2012（H3N2）、B/Massachusetts/2/2012（BY）的表面抗原基因 HA、NA 的 PHW2000 质粒,共转染293T细胞,拯救获得了三株Vero细胞LAIV候选株:A/ChristChurch/16/2010Vca、A/Texas/50/2012Vca、B/Massachusetts/2/2012Vca。经鉴定,重配毒株具有 ca、ts 和att特性,病毒形态轮廓清晰,为有囊膜病毒;蚀斑以及Western实验证明重配毒株能在Vero细胞上较好的增殖;测序结果显示,重配毒株在Vero细胞连续传代过程中表面抗原基因HA、NA未发生实质性改变。将Vero细胞在无血清培养基中传代建立了无血清Vero细胞库,液氮保存复苏成活:以0.1MOI的病毒量接种1:2传代无血清培养36 h的Vero细胞,在病毒维持液pH7.2-7.4、TPCK胰蛋白酶浓度0.8ug/ml时获得较高的病毒产量。将工作种子批病毒在Vero细胞大规模培养,病毒液经浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化,得到单价病毒液的ca、ts及att等表型特征没有改变。制成的三价LAIV滴鼻免疫小鼠,一免组免后28天抗H1N1、H3N2、BY抗体滴度分别为1:234.67、1:248.3和1:239.3;二免后抗体滴度继续升高,在28天时抗H1N1、H3N2、BY抗体滴度分别:1:490.667、1:606.7和1:485.3;一免和二免组免后14d肺洗液sIgA含量分别为2217.6ng/ml和3329.5ng/ml。免疫雪貂后,血清抗体滴度高达1:2000,其IL-4、IL-6等细胞因子的含量均显着高于阴性对照组。挑战试验证明Vero细胞三价LAIV能有效保护动物病毒感染。本研究首次在国际上构建了甲型和乙型Vero细胞流感减毒株的基因组库,并用于三价（四价）季节性LAIV病毒种子批的制备。后续制备的三价Vero细胞季节性LAIV具有较好的安全性和免疫保护效果。
周健[9]（2017）在《微载体生物反应器培养Vero细胞和甲型流感病毒制备流感灭活疫苗的研究》文中研究指明流感病毒通过抗原重配或漂移产生新的病毒,每年在全球引起较高的发病率和死亡率。疫苗是预防流感的主要有效手段。目前上市的流感疫苗主要有灭活苗、减毒活疫苗和重组HA疫苗,基本上都以鸡胚作为生产基质。采用鸡胚生产疫苗的缺点:存在外源因子污染的风险;鸡胚供应周期长,尤其是当大流行流感来袭时有可能因禽流感的流行,会影响鸡胚供应。鉴于此,WHO鼓励开展以哺乳动物细胞代替鸡胚作为流感疫苗生产基质的研究。Vero细胞是WHO批准生产人用疫苗的传代细胞系,能够利用生物反应器进行大规模培养,已广泛用于疫苗生产。然而,Vero细胞对流感病毒不敏感,多数流感毒株连续传代效价降为0。流感病毒的高变异性,WHO每年都要根据各监测点提供的信息推测下一年度的流行株。一般地,流行株在鸡胚和Vero细胞产毒量都较低,推选出来的毒株需要与高产母本株遗传重配制备新的疫苗生产用毒株,在流感高发季节来临前必须完成疫苗种子批制备、疫苗生产及其检定,时间紧张。因此,稳定而快速地制备毒种显得尤其重要。本研究以本实验室前期选育出的Vero细胞适应A/kunming/1/2005va作为母本株,比较点突变法和一步克隆技术的效果,并对不同转染方法拯救流感病毒进行研究,建立了以一步克隆法及Effectene Transfection Reagent转染制备Vero细胞流感疫苗候选株的反向遗传学技术。并依此法,以Vero细胞适应株A/kunming/1/2005va的六个核心片段PB2、PB1、PA、NP、NS、M与流行株A/上海嘉定/SWL1970/2015（H1N1）的表面抗原HA和NA组合,拯救出了新的疫苗候选株H1N1嘉定Va,具有在Vero细胞高产的表型。鉴于Vero细胞缺乏将流感病毒HA0裂解成HA1的酶,只有在培养液中添加胰酶,病毒才能组装成熟。有血清培养细胞时残留的血清会导致胰酶失活。无血清培养细胞是目前疫苗生产的研究热点,可克服血清成分对病毒培养的干扰,还可消除培养时潜在污染源并利于分离纯化。本研究通过优化生物反应器培养方法和发酵工艺参数,建立了生物反应器,无血清培养流感病毒的生产工艺。并对病毒收获液进行过滤澄清、超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换层析和甲醛灭活等后处理工艺研究。选用不同凝胶及离子介质进行纯化工艺比较研究,最终确定使用Sepharose 4 Fast Flow和CaptoQ时病毒回收率高,杂蛋白去除率在99%以上,疫苗蛋白含量不高于10μg/剂、DNA残余量≤100pg/剂,以上指标均达到现行中国药典及WHO标准。综上所述,本课题建立了反向遗传学快速稳定制备Vero细胞流感疫苗候选株,并以生物反应器微载体无血清培养Vero细胞和流感病毒,首次将Capto Q用于Vero细胞流感病毒纯化,病毒回收率高,制备的流感灭活疫苗安全有效,将促进全球流感疫苗生产技术的升级换代。
王晓亮[10]（2017）在《宁夏地区猪流感流行病学调查及病毒分离株遗传变异分析》文中认为猪流感（SI）是由A型流感病毒引起的一种急性、传染性呼吸道疾病,其临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、发热及衰竭;虽然该病的死亡率不高,但其影响猪的发育,延缓猪的生长及出栏时间,给养殖业带来重大经济损失;同时猪被认为是流感病毒的“中间宿主”和“混合器”,可同时感染禽流感病毒（AIV）和人流感病毒,并可重组产生具有新遗传特性、致病性的具有大流行潜力的新病毒。因此,开展猪流感病毒（SIV）的监测和遗传进化分析,对猪流感的防控及人间流感大流行的预测具有重要意义。本研究对2013-2014年宁夏11个市25个规模猪场采集的920份血清样品和920份双鼻孔拭子进行血清学和病原学检测。血清学检测结果显示,H1N1、H3N2亚型SIV抗体阳性率分别为21.2%和2.6%,H1N1+H3N2抗体阳性率为0.65%;病原学检测结果显示,SIV阳性样品128份,阳性率13.9%。随后,于2013-2014年走访宁夏22个市的养猪场、屠宰场及部分散养户,采集猪血清样品及双鼻孔拭子,进行血清学、病原学检测。血清学检测结果显示,1710份被检血清中,H1亚型SI抗体阳性率（11.81%）明显高于H3亚型SI抗体阳性率（0.46%）,H1+H3亚型SI抗体阳性率为0.35%,H5、H9亚型抗体阳性率分别为0.06%和0.18%;病原学检测结果表明,4230份双鼻孔棉拭子样品中,588份为SIV阳性,阳性率13.9%。监测结果说明宁夏地区流行的SIV以H1N1亚型为主,同时存在H1N1和H3N2亚型混合感染和SIV隐性带毒情况。为了研究宁夏地区猪流感病毒遗传进化特性,对分离到的5株H1N1亚型SIV和4株H3N2亚型进行了M2基因遗传进化分析。结果显示,5株H1N1亚型SIV中,4株病毒属于北美H1N1 SIV分支,1株病毒属于类人H1N1 SIV分支,说明宁夏流行的H1N1亚型SIV具有遗传多样性。分离的4株H3N2亚型SIV均属于类人H3N2 SIV,与广东、福建分离株同源性较高。为了进一步研究H1N1亚型SIV的遗传进化特征,对2011年分离的5株H1N1亚型SIV进行了基因组扩增、遗传进化分析、关键氨基酸位点分析。结果表明,5株H1N1亚型SIV具有遗传多样性,1株病毒属于类人H1N1 SIV分支,2株病毒属于经典H1N1 SIV分支,2株病毒为北美三源重组SIV（PB2、PB1、PA、NP、NS基因）与经典H1N1 SIV（HA、NA、M基因）的重组病毒。5株H1N1病毒受体结合位点处氨基酸存在差异,且抗原位点处氨基酸具有分支特异性,其中,3株病毒具有PB2 E627K变异。为了满足猪流感病毒检测的需求,本研究建立了SIV通用型RT-PCR方法、H1和H3分型RT-PCR方法,以及焦磷酸测序方法。通用型RT-PCR方法对SI阳性样品的扩增条带231bp,具有很好的特异性和重复性。分型RT-PCR方法可同时鉴定H1、H3、N1、N2亚型SIV,具有较好的特异性和重复性。焦磷酸测序反应以通用型RT-PCR扩增产物为模板,测序区域覆盖猪流感病毒M2基因金刚烷胺耐药性相关位点,可用于病毒抗药性的快速鉴定。本研究对宁夏地区SIV进行系统监测,并对分离株进行遗传进化分析、关键氨基酸位点分析,研究结果丰富了我国猪流感病毒流行病学数据库,加深了对宁夏地区猪流感流行现状的了解,为我国猪流感的科学防控提供理论基础。
二、流行性感冒病毒鸡胚高产株的遗传特性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、流行性感冒病毒鸡胚高产株的遗传特性分析（论文提纲范文）
（1）冻干鼻喷流感减毒活疫苗生产用毒种的工艺优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒简介 |
| 1.1 流感病毒 |
| 1.2 流感病毒的形态结构 |
| 1.3 流感病毒的特性 |
| 第二章 流感疫苗简介 |
| 2.1 流感灭活疫苗 |
| 2.2 流感减毒活疫苗 |
| 2.3 毒种工艺优化意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 毒种制备工艺及毒种病毒滴度的测定 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 毒种制备工艺 |
| 1.3 流感病毒滴度测定(EID50法) |
| 第二章 H1N1型毒种工艺研究 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 H3N2型毒种工艺研究 |
| 3.1 材料和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 B型毒种工艺研究 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 质量检测及种子库建立 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.2 实验结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）20172018年广州市乙型流感病毒HA、NA基因特征及中西药抗病毒药效初筛研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 2017~2018年广州市乙型流感病毒HA、NA基因特征分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 中西药抗乙型流感病毒药效初筛及病毒增殖能力检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 乙型流感病毒反向遗传学平台构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读研究生学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）两株河北省流感病毒流行株的致病性和传播能力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 流感简介 |
| 1.2 甲型流感病毒研究进展 |
| 1.2.1 甲型流感流行的危害 |
| 1.2.2 甲型流感病毒的中间宿主 |
| 1.2.3 甲型流感病毒的传播途径 |
| 1.2.4 感染流感病毒的动物模型 |
| 1.2.5 甲型流感的临床症状、诊断及治疗 |
| 1.2.6 甲型流感的预防 |
| 1.3 乙型流感病毒研究进展 |
| 1.3.1 甲型和乙型流感病毒的分子差异 |
| 1.3.2 乙型流感病毒的宿主 |
| 1.3.3 乙型流感病毒的演变 |
| 1.3.4 乙型流感的临床表现 |
| 1.3.5 乙型流感相关的病理变化及发病机制 |
| 1.4 影响季节性流感强度的因素 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 流感病毒阳性拭子及试验地点 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 流感病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1 病毒分离及HA鉴定 |
| 2.2.2 病毒基因组RNA的提取 |
| 2.2.3 病毒基因组的c DNA合成及PCR鉴定 |
| 2.3 流感病毒的全基因序列测定 |
| 2.3.1 病毒基因组RNA的提取 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 PCR扩增 |
| 2.4 流感病毒的同源性及遗传进化分析 |
| 2.4.1 流感病毒的同源性分析 |
| 2.4.2 流感病毒的遗传进化分析 |
| 2.5 流感病毒受体结合特性分析 |
| 2.5.1 鸡红细胞的制备 |
| 2.5.2 α-2,3-sialidase处理的鸡红细胞制备 |
| 2.5.3 羊红细胞制备 |
| 2.5.4 霍乱弧菌神经氨酸酶处理的鸡红细胞的制备 |
| 2.6 流感病毒的EID_(50) 测定 |
| 2.7 流感病毒在MDCK细胞上的复制能力 |
| 2.8 流感病毒对小鼠的致病性 |
| 2.8.1 小鼠体重变化与存活率 |
| 2.8.2 流感病毒在小鼠不同组织中的分布 |
| 2.8.3 小鼠肺脏病变观察及免疫组化染色 |
| 2.9 流感病毒在豚鼠间的传播能力研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流感病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 甲型H1N1 流感病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.2 乙型流感病毒的分离鉴定结果 |
| 3.2 流感病毒的全基因序列测定结果 |
| 3.2.1 甲型HINI流感病毒的全基因序列测定结果 |
| 3.2.2 乙型流感病毒的全基因序列测定结果 |
| 3.3 流感病毒的同源性及遗传进化分析 |
| 3.3.1 甲型H1N1 流感病毒的同源性分析 |
| 3.3.2 乙型流感病毒的同源性分析 |
| 3.3.3 流感病毒的遗传进化分析 |
| 3.4 流感病毒受体结合特性分析 |
| 3.4.1 甲型H1N1 流感病毒的受体结合特性分析 |
| 3.4.2 乙型流感病毒的受体结合特性分析 |
| 3.5 流感病毒的鸡胚半数感染量测定结果 |
| 3.5.1 甲型H1N1 流感病毒的鸡胚半数感染量测定结果 |
| 3.5.2 乙型流感病毒的鸡胚半数感染量测定结果 |
| 3.6 流感病毒在MDCK细胞上的复制能力 |
| 3.6.1 甲型H1N1 流感病毒在MDCK细胞上的复制能力 |
| 3.6.2 乙型流感病毒在MDCK细胞上的复制能力 |
| 3.7 流感病毒对小鼠的致病性分析 |
| 3.7.1 小鼠体重变化与存活率 |
| 3.7.2 流感病毒在小鼠不同组织中的分布 |
| 3.7.3 小鼠肺脏病变观察及免疫组化染色结果 |
| 3.8 流感病毒在豚鼠间的传播能力研究 |
| 3.8.1 甲型H1N1 流感病毒在豚鼠间的传播能力研究 |
| 3.8.2 乙型流感病毒在豚鼠间的传播能力研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文情况 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述: H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究 |
| 前言 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒流行病学 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒基因片段遗传进化及表达蛋白功能 |
| 3 H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性研究 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒病原学调查 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 华东地区家禽中流行的H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性初步研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）siRNA对流感病毒血凝素及神经氨酸酶基因的抑制作用及其在病毒重配中应用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验流程和技术路线 |
| 第一部分 流感病毒基因测序及特异的siRNA设计合成 |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二部分 siRNA对疫苗株PR8的抑制效果及特异性 |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分 HA与NA特异的siRNA在PR8与H3N2病毒重配中的应用 |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 全文总结 |
| 后续需要解决的问题及工作计划 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录一 PR8和H3N2病毒基因序列 |
| 附录二 PR8与H3N2HA和NA序列比对 |
| 致谢 |
（6）乙型流感病毒减毒活疫苗安全性和有效性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 乙型流感病毒母本毒株与流行株的反向遗传学重配研究 |
| 第一节 乙型流感病毒阳性质粒系统构建 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二节 乙型流感病毒母本毒株与流行株的反向遗传学重配 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三节 乙型重配流感病毒的生物学特性评价及培养优化 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二章 乙型流感Vero细胞减毒株安全性研究 |
| 前言 |
| 第一节 乙型流感病毒母本毒株内部基因与流行株基因的组合拯救重组病毒 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二节 重组病毒ts、att特性研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三节 重组病毒表型控制基因初步分析 |
| 1.实验材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 乙型流感减毒活疫苗免疫佐剂研究 |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 序列及氨基酸比对 |
| 附录Ⅱ 基本实验操作 |
| 附录Ⅲ 溶液配制 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）镇江市流感病毒时空分布特征及其流行株HA和NA基因变异规律的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 表面抗原HA和NA分子特征 |
| 1.1.3 抗原变异 |
| 1.1.4 流行与监测 |
| 1.1.5 疫苗株的筛选 |
| 1.1.6 人群血清中流感病毒抗体水平的意义 |
| 1.1.7 主要问题 |
| 1.2 本研究的目的、内容及技术路线 |
| 1.2.1 本研究的目的 |
| 1.2.2 本研究的内容 |
| 1.2.3 技术路线 |
| 第二章 2014-2016年镇江市流感病毒监测与时空分布特征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 样本采集 |
| 2.2.1 流感样病例定义 |
| 2.2.2 流感病毒监测哨点医院 |
| 2.2.3 流感病毒监测网络实验室 |
| 2.3 样本运送与保存 |
| 2.4 流感病毒病原学检测 |
| 2.4.1 核酸提取 |
| 2.4.2 亚型鉴定 |
| 2.5 流感病毒细胞培养 |
| 2.5.1 细胞株、流感病毒标准参考抗血清来源 |
| 2.5.2 主要材料和仪器 |
| 2.5.3 MDCK细胞的复苏 |
| 2.5.4 MDCK细胞的传代 |
| 2.5.5 MDCK细胞的冻存 |
| 2.5.6 分离培养 |
| 2.6 流感病毒鸡胚分离 |
| 2.6.1 主要材料和仪器 |
| 2.6.2 验卵 |
| 2.6.3 鸡胚接种 |
| 2.6.4 鸡胚尿囊液和羊水的收获 |
| 2.7 流感病毒鉴定 |
| 2.7.1 血凝试验 |
| 2.7.2 血凝抑制试验 |
| 2.8 实验结果 |
| 2.8.1 时间分布 |
| 2.8.2 型别分布 |
| 2.8.3 性别分布 |
| 2.8.4 人群分布 |
| 2.8.5 地区分布 |
| 2.9 讨论 |
| 第三章 2014-2016年镇江市流感病毒流行株HA和NA基因变异规律的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 流行株的选择 |
| 3.3.2 病毒核酸提取 |
| 3.3.3 HA和NA基因扩增引物设计 |
| 3.3.4 PCR反应体系 |
| 3.3.5 PCR反应循环参数 |
| 3.3.6 PCR反应产物的纯化与回收 |
| 3.3.7 目的基因序列测定 |
| 3.3.8 目的基因序列分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PCR扩增结果 |
| 3.4.2 甲型H1N1型流感病毒分子进化特征 |
| 3.4.3 甲H3型流感病毒分子进化特征 |
| 3.4.4 乙型流感病毒分子进化特征 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 2014-2016年镇江市人群流感病毒抗体水平研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 人群的选择 |
| 4.2.3 血清的采集和保存 |
| 4.2.4 血清的预处理 |
| 4.2.5 半加敏血凝抑制试验 |
| 4.2.6 质量控制 |
| 4.2.7 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 血清学结果 |
| 4.3.2 不同亚型流感抗体水平 |
| 4.3.3 不同年龄组流感抗体水平 |
| 4.3.4 不同性别组流感抗体水平 |
| 4.3.5 同一个体多种流感抗体水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 主要结论 |
| 4.6 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和参加的课题 |
（8）三价Vero细胞季节性流感减毒活疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Vero细胞流感病毒母本减毒株基因组库的构建 |
| 引言 |
| 第一章 甲型Vero细胞流感母本减毒株基因组库的构建 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二章 乙型Vero细胞流感母本减毒株基因组库的构建 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 三价Vero细胞流感季节性流感LAIV的制备及评价 |
| 引言 |
| 第一章 反向遗传学重配技术制备Vero细胞季节性LAIV原始种子批的研究 |
| 引言 |
| 第一节 反向遗传学重配技术制备Vero细胞季节性甲型LAIV病毒原始种子批 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二节 反向遗传学重配制备Vero细胞季节性LAIV乙型病毒原始种子批 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二章 Vero细胞季节性LAIV主代及工作种子批病毒的制备 |
| 引言 |
| 第一节 原始种子批病毒在Vero细胞上的增殖特性研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二节 Vero细胞季节性LAIV病毒种子批的制备 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三章 三价Vero细胞季节性LAIV的制备 |
| 引言 |
| 第一节 三价Vero细胞LAIV工作种子批的无血清培养 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二节 三价Vero细胞季节性LAIV的制备 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四章 Vero细胞季节性流感三价LAIV安全性及免疫原性评价 |
| 引言 |
| 第一节 三价Vero细胞季节性LAIV的安全性评价 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二节 三价Vero细胞季节性LAIV的免疫原性评价 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二部分 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| LAIV的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）微载体生物反应器培养Vero细胞和甲型流感病毒制备流感灭活疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 流感病毒反向遗传学重配及其Vero细胞适应性研究 |
| 前言 |
| 第一章 流感病毒A/kunming/1/2005va(H3N2) Vero细胞适应性研究 |
| 引言 |
| 第一节 流感病毒Vero细胞高产适应株的传代稳定性 |
| 第二节 H3N2/Va流感病毒Vero细胞适应性点研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 反向遗传学重配方法拯救流感病毒的研究 |
| 引言 |
| 第一节 流感病毒中国流行株H1N1(嘉定分离株)在Vero细胞上的传代观察 |
| 第二节 点突变法和一步快速克隆法技术的比较 |
| 第三节 两种转染试剂拯救流感病毒的效果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 生物反应器无血清培养Vero细胞和甲型流感病毒制备灭活疫苗 |
| 前言 |
| 第一章 生物反应器无血清培养Vero细胞和甲型流感病毒的工艺研究 |
| 引言 |
| 第一节 生物反应器无血清培养Vero细胞的研究 |
| 第二节 生物反应器无血清Vero细胞培养甲型流感病毒的研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 Vero细胞甲型流感病毒灭活疫苗后处理工艺的研究 |
| 引言 |
| 第一节 Vero细胞甲型流感灭活疫苗后处理工艺的研究 |
| 第二节 Vero细胞甲型流感灭活疫苗的有效性及安全性研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文小节 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ Vero细胞适应株基因序列 |
| 附录Ⅱ 基本实验操作 |
| 附录Ⅲ 溶液配置 |
| 附录Ⅳ 缩略语 |
| 附录Ⅴ 图表索引 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）宁夏地区猪流感流行病学调查及病毒分离株遗传变异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 猪流感流行及研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 形态结构 |
| 1.2 基因组与编码蛋白 |
| 2 流行情况 |
| 2.1 H1N1亚型 |
| 2.2 H3N2亚型 |
| 2.3 重组猪流感病毒 |
| 3 优势谱系 |
| 3.1 北美猪流感 |
| 3.2 欧洲猪流感 |
| 3.3 亚洲猪流感 |
| 4 公共卫生学意义 |
| 5 临床症状 |
| 6 检测技术 |
| 6.1 传统的诊断技术 |
| 6.2 分子生物学诊断技术 |
| 7 防治 |
| 7.1 疫苗免疫 |
| 7.2 临床治疗 |
| 7.3 加强管理 |
| 第二章 宁夏猪流感血清流行病学调查 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 HI试验 |
| 1.2 间接ELISA试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 HI试验 |
| 2.2 间接ELISA试验 |
| 2.3 RT-PCR |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪流感病毒分子生物学方法的建立与应用 |
| 1 SIV通用型RT-PCR方法的建立 |
| 1.1 引物设计 |
| 1.2 RNA提取 |
| 1.3 RT-PCR反应 |
| 1.4 目的基因的测序 |
| 1.5 目的基因的序列比对分析 |
| 1.6 通用型RT-PCR |
| 2 SIV H1、H3分型RT-PCR方法的建立 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 RNA提取 |
| 2.3 RT-PCR反应 |
| 2.4 目的基因的测序 |
| 2.5 目的基因的序列比对分析 |
| 2.6 分型RT-PCR |
| 3 SIV焦磷酸测序检测方法的建立 |
| 3.1 引物设计 |
| 3.2 RNA提取 |
| 3.3 RT-PCR反应 |
| 3.4 焦磷酸测序反应 |
| 4 讨论 |
| 第四章 宁夏猪流感病毒的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品的采集及处理 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 遗传进化关系分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 宁夏H1N1亚型猪流感病毒分离株 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒分离与鉴定 |
| 1.2 基因组测序 |
| 1.3 基因序列拼接与分析 |
| 1.4 遗传进化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 SIV分离鉴定 |
| 2.2 遗传进化分析 |
| 2.3 关键氨基酸位点分析 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
四、流行性感冒病毒鸡胚高产株的遗传特性分析（论文参考文献）
- [1]冻干鼻喷流感减毒活疫苗生产用毒种的工艺优化研究[D]. 宋文爽. 吉林农业大学, 2020(03)
- [2]20172018年广州市乙型流感病毒HA、NA基因特征及中西药抗病毒药效初筛研究[D]. 夏炫梓. 广州医科大学, 2020(01)
- [3]两株河北省流感病毒流行株的致病性和传播能力研究[D]. 张诚. 河北农业大学, 2019(12)
- [4]2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究[D]. 蒋大秀. 扬州大学, 2019
- [5]siRNA对流感病毒血凝素及神经氨酸酶基因的抑制作用及其在病毒重配中应用的研究[D]. 宋彦丽. 中国食品药品检定研究院, 2018(05)
- [6]乙型流感病毒减毒活疫苗安全性和有效性研究[D]. 李卓凡. 北京协和医学院, 2018
- [7]镇江市流感病毒时空分布特征及其流行株HA和NA基因变异规律的研究[D]. 杨静. 江苏大学, 2018(02)
- [8]三价Vero细胞季节性流感减毒活疫苗的研究[D]. 耿兴良. 北京协和医学院, 2017(02)
- [9]微载体生物反应器培养Vero细胞和甲型流感病毒制备流感灭活疫苗的研究[D]. 周健. 北京协和医学院, 2017(02)
- [10]宁夏地区猪流感流行病学调查及病毒分离株遗传变异分析[D]. 王晓亮. 甘肃农业大学, 2017(12)