一、转移抑制:转移抑制基因对癌细胞在继发部位生长的调节作用（论文文献综述）
王正想[1]（2021）在《miRNA-633通过调控KAI 1对恶性黑色素瘤生物学行为的影响》文中认为目的:恶性黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的一种,进展迅速,易出现血液和淋巴结转移。近几十年来,全世界恶性黑色素瘤的发病率逐年增加。与任何其他肿瘤性疾病不同,对于原发性或转移性黑素瘤仍然没有有效的治疗方法。尽管早期诊断黑色素瘤对患者预后有所改善,但晚期恶性黑素瘤的5年生存率仍然很低。因此,迫切需要研究新的生物标记物来检测和治疗该疾病。因此,进一步研究恶性黑素瘤的病因和及其发展的分子作用机制,成为提高恶性黑素瘤的治疗效率以及患者生存率的关键。KAI 1是在人类染色体11p11.2上发现的一种能够抑制肿瘤转移的抑癌基因,KAI 1也称为CD82,是一种属于四跨膜蛋白超家族的Ⅲ型成员跨膜蛋白。四跨膜蛋白的特征是四跨膜区域,由四个到六个保守性良好的细胞外半胱氨酸残基,形成大概两个到三个二硫键,细胞外环中的Cys-Cys-Gly基序和跨膜域中的极性残基。在生物学上四跨膜蛋白与许多细胞水平的病变有关,如:病毒侵袭,突触形成和免疫反应。有研究证实,KAI 1通过调节细胞粘附及融合,抑制细胞运动和增殖等多种机制来抑制肿瘤转移。KAI 1的这些抑制机制和功能通过与细胞粘附分子和其他四跨膜蛋白相互作用调节细胞膜的结构来实现的。KAI 1基因在正常组织中普遍表达,其mRNA在肺,肝,胎盘,脾脏和肾脏中较高,在骨骼肌,胰腺,胸腺也有中度表达。在肿瘤发展过程中p53可以通过启动子中的共有结合序列下调KAI 1的表达,并且已经在卵巢癌,胃癌,脑癌,子宫癌中检测到该基因表达水平降低。KAI 1还可以减弱表皮生长因子（EGFR）信号通路的传导,从而抑制肿瘤的转移。值得注意的是,在肺癌中,KAI1还可以通过上调mi R-203和直接下调FZD2抑制Wnt信号通路来抑制肺癌转移。因此,KAI 1可能是一个肿瘤临床诊治新的靶点,但目前关于KAI 1在恶性黑素瘤中的异常表达尚缺乏详实的实验依据。Micro RNA（miRNA）是一类小的非编码RNA（约22个核苷酸）,在调节下游基因表达过程中起重要作用。miRNA主要通过与下游靶基因mRNA的3′-untranslated region（3′-UTR）结合,调节下游靶基因表达,进一步抑制蛋白质合成。人类近50%的miRNAs位于与肿瘤相关的基因区域或染色体的脆弱位点,miRNAs被认为是调节转录后基因表达的关键因子。在各种类型的肿瘤中,miRNAs既可作为癌基因也可作为抑癌基因,分别称为癌基因mi R和抑癌基因mi R。近年来研究表明,越来越多的miRNAs成为诊断肿瘤和判断预后的生物标志物,并成为抗肿瘤新药研究的热点。但miRNA-633通过调控KAI 1对黑色素瘤生物学行为的影响至今未见报道,且其对恶性黑素瘤细胞增殖、迁移及侵袭性的影响及机制尚未阐明。为此,本研究通过miRNA生物信息方法预测与KAI 1基因相关的miRNAs,发现miRNA-633在恶性黑素瘤中与KAI 1的关系密切,因此验证miRNA-633与KAI 1的靶向调节关系是本课题研究一个重点。为进一步明确miRNA与恶性黑素瘤的关系,我们检测恶性黑素瘤细胞系及正常人表皮黑素细胞中miRNA-633的表达,为进一步验证miRNA-633和恶性黑素瘤的关系,我们检测了人恶性黑素瘤组织miRNAs的表达。最后,本课题采用体外恶性黑素瘤细胞实验,以期明确miRNA-633对恶性黑素瘤细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响。本课题深入研究miRNA-633与KAI 1靶向调控关系,进一步阐明miRNA-633或KAI基因在恶性黑素瘤中的作用机制,以期为miRNA-633或KAI 1成为恶性黑素瘤临床预防和治疗的新靶点提供理论依据,也为最终阐明恶性黑素瘤的分子机制奠定基础。方法:1.预测与KAI 1相关的miRNAs并验证miRNA-633与KAI 1的靶向调节使用Target Scan,mi Randa及Starbase查找可能与KAI 1相关的miRNAs,预测miRNA-633与KAI 1的3’-UTR的结合区域。常规培养恶性黑素瘤B16和A375细胞系,应用构建miRNA-633 inhibitor及mimics,转染B16与A375细胞,检测miRNA-633 inhibitor及mimics的有效性。分别在上述两个细胞系中转染miRNA-633 mimics与其相应对照miRNA-NC,同时分别转染构建好的KAI 1野生型（WT）与突变型（MUT）载体,进行双荧光素酶活性实验,验证miRNA-633是否可作用于KAI3’UTR区。应用构建miRNA-633的mimics与其相应对照miRNA-NC,分别转染B16和A375细胞,用real time-PCR实验检测KAI 1 mRNA的表达变化,用Westblot法检测KAI蛋白的表达变化。2.研究miRNA-633对黑素瘤细胞B16和A375细胞增殖、迁移及侵袭性的影响,探讨其调控KAI 1表达的作用分子机制。常规培养恶性黑素瘤B16和A375细胞系,应用构建miRNA-633inhibitor及其相应对照miRNA-NC,分别转染B16和A375细胞,转染后不同时间点（0,24h,48h,72h）,采用MTT法检测检测细胞的增殖能力。在不同时间点（0,24h）,采用划痕实验检测细胞的侵袭能力。于相同时间点（24h）,采用Transwell实验检测细胞的迁移能力。结果:1.预测在恶性黑素瘤中与KAI 1相关的miRNAs通过生物信息方法预测,结果发现与KAI1调控相关的miRNAs有miRNA-362-3p、miRNA-338-5p、miRNA-622、miRNA-197、miRNA-203、miRNA-633共6个,miRNA-633存在与KAI 1 3’UTR区结合序列（Fig.1-3）。并且miRNA-633在恶性黑素瘤组织与癌旁中表达的差异性最大。为了检验miRNA-633 inhibitor和miRNA-633 mimics的转染效率,我们分别在细胞株B16和A375中转染了miRNA-633 inhibitor和miRNA-633 mimics。实验结果显示,miRNA-633在两种细胞中的抑制和表达是成功的。为了进一步验证miRNA-633是否可作用于KAI 13’-UTR区,并通过与KAI13’-UTR结合的方式来调节KAI 1基因的表达。分别在上述两个细胞系中转染miRNA-633的mimics与其相应对照miRNA-NC,同时共转染KAI的野生型（WT）与突变型（MUT）载体,进行双荧光素酶活性实验,结果发现,与KAI1（WT）载体共转染后,miRNA-633mimics组与miRNA-NC组相比荧光素酶活性降低,而与KAI1（MUT）转染后两组的荧光素酶活性无显着差别,进一步说明miRNA-633能与KAI 1 3’-UTR区发生结合。为进一步验证miRNA-633和KAI 1的靶向调节关系,我们使用miRNA-mimics分别转染B16和A375细胞,转染48小时后,结果发现两种细胞系中miRNA-633表达显着升高,与之相反KAI 1蛋白水平均降低,进一步说明miRNA-633通过与靶基因KAI 1的3′-UTR区结合下调了KAI 1的表达,也就是说KAI 1是miRNA-633靶基因。2.对黑素瘤细胞B16和A375细胞增殖、迁移及侵袭性的影响应用构建miRNA-633的inhibitor及其相应的对照组（miRNA-NC）,转染B16和A375细胞,MTT检测细胞的增殖能力,结果表明细胞增殖能力增强。用transwell系统分析黑素瘤细胞B16和A375细胞细胞的侵袭,结果表明miRNA-633 inhibitor可以抑制黑素瘤细胞的侵袭。划痕实验结果表明,miRNA-633inhibitor抑制了B16和A375细胞的迁移。结论:1.从预测结果分析得出,与KAI 1相关的上游miRNA包括miRNA-362-3p、miRNA-338-5p、miRNA-622、miRNA-197、miRNA-203、miRNA-633。miRNA-633在恶性黑素瘤细胞系及组织中的表达差异性最大,结合预实验及文献复习,因此我们选取miRNA-633作为研究对象,检测KAI 1对恶性黑素瘤细胞的增殖、侵袭及迁移具有重要意义。2.本课题采用双荧光素酶基因报告实验,进一步验证了miRNA-633可以与靶基因KAI 1的3’-UTR区结合并调控KAI 1的表达,也就是说KAI 1是miRNA-633靶基因。3.miRNA-633 inhibitor可以通过调节KAI 1的表达抑制黑素瘤细胞的增殖,侵袭及迁移,该研究的发现为恶性黑素瘤的基因治疗提供新靶点,并为寻找新的治疗手段提供方向。
玉荣[2]（2021）在《LIM Homeobox家族基因DNA甲基化水平与宫颈癌的关系及其在放疗中的作用》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:甲基化是肿瘤发生的重要因素,而放疗可改变机体细胞的DNA甲基化状态。全基因组甲基化高通量测序可提供精确而全面基因甲基化信息。本实验对宫颈癌患者放射治疗（放疗）前后的DNA甲基化进行测序分析,同时结合放疗的临床效果,筛选出与宫颈癌放疗显着相关的基因LIM-homebox家族关键基因LHX2、LHX5和LHX9基因与癌症的发生和发展存在的关系,并且宫颈癌中研究较少。本研究旨在探讨放疗前后差异甲基化的LHX2、LHX5和LHX9与宫颈癌的发生、发展及在放疗中的作用。研究方法:1)全基因组甲基化测序分析:对放疗前、后宫颈癌样品进行BS-seq和差异DMR分析,进行功能注释,筛选与宫颈癌放疗疗效相关的差异基因。2)采用BSP-PCR,荧光定量PCR,WB等方法测定宫颈癌组织中的基因组甲基化、mRNA表达、蛋白水平,采用Elisa在放射治疗中的宫颈癌患者血清中分别探究LHX2、LHX5和LHX9表达特征,并结合临床病理特征,确认目的基因甲基化和多水平表达特征变化与宫颈癌发生、发展的关系。3)通过放疗、去甲基化药物、过表达、沉默等手段改变宫颈癌细胞系SiHa和C33A中目的基因甲基化状态和表达特征,分别检测不同处理方法对细胞侵袭、转移、生长、凋亡等特征的影响,解析基因甲基化和表达特征变化与宫颈癌的关系。结果:1)通过BS-seq构建了三例宫颈癌患者放射前后的全基因组DNA甲基化图谱,mCG为三例患者基因组甲基化的主要方式;三例患者癌组织内存在2666、2873和1411个差异甲基化区域,涉及1287、1261和789个基因;2)差异基因中,LHX2、LHX5和LHX9与宫颈癌放疗敏感患者体内甲基化特征一致,均为放疗后甲基化降低;3)经过表达特征分析发现,LHX2、LHX5和LHX9的甲基化水平和基因表达水平可作为区分部分FIGO分期的标志基因;4)5-Aza-dC和放疗处理SiHa、C33A细胞后,导致目的基因甲基化水平下降,mRNA和蛋白表达水平升高,并且处理后的宫颈癌细胞均出现生长缓慢,侵袭和迁移能力下降的结果,且凋亡显着。研究发现,侵袭相关基因MMP2 MMP9 RacI的表达量下降,凋亡相关csap3等表达上调。5)通过构建目的基因过表达细胞株,发现LHX2过表达细胞株的侵袭、迁移和凋亡功能增强,呈现正向影响;而LHX5和LHX9过表达细胞株抑制了细胞的侵袭转移,呈负向影响。6)通过放疗和去甲基化激活目的基因表达之后,再使用siRNA干扰目的基因,构建目的基因沉默细胞株,LHX2基因沉默细胞株增殖速度升高,侵袭转移提高,凋亡基因表达量下降,LHX2可能是促癌基因。而沉默LHX5和LHX9后的放疗宫颈癌细胞出现相反的特征,推测可能是抑癌基因。总结:放疗诱导了LIM-homebox家族关键基因LHX2,LHX5和LHX9的甲基化降低,并且发现了LHX2可能是促癌基因,在放疗后的宫颈癌中行使抑制癌细胞凋亡等功能。LHX5和LHX9可能是抑癌基因,在放疗激活后有利于宫颈癌的治疗。
马晓丽[3]（2021）在《ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究目的是探讨整合素连接激酶（ILK）基因对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,研究其在食管癌中功能,为食管癌的精准诊疗奠定理论基础和临床参考。方法:1)采用meta分析评价ILK在消化系统肿瘤组织中的表达,及与消化系统肿瘤临床表型及预后间的相关性;2)筛选ILK高表达的人食管鳞癌细胞系,建立ILK慢病毒干扰序列。将ILK慢病毒干扰序列转染食管鳞癌细胞系TE-1和KYSE-150,用q RT-PCR检测干扰载体转染后ILK的表达。在细胞水平上,利用MTT增殖、克隆检测、流式细胞仪凋亡检测、Transwell小室侵袭及划痕愈合等技术,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;3)建立ILK慢病毒干扰载体,转染KYSE-150细胞。在裸鼠皮下分别接种sh ILK及对照细胞株,建立KYSE-150细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过观察肿瘤生长,测量肿瘤大小和体积。在动物水平上,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞生长的影响。基于RNA-seq技术筛选食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测其可能的发病机制,筛选可能参与食管癌发生发展的关键调控基因及相关信号通路。结果:第一部分:meta分析结果显示ILK在消化系统肿瘤组中高表达,ILK表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。第二部分:在体外ESCC细胞水平,沉默ILK基因后,可显着抑制TE-1、KYSE-150细胞增殖和集落形成,促进TE-1、KYSE-150细胞凋亡。ILK基因消减后,TE-1、KYSE-150细胞侵袭及迁移能力明显减弱。第三部分:裸鼠移植瘤动物模型结果发现,ILK干扰组裸鼠肿瘤生长缓慢,相比较于对照组,肿瘤的重量及体积均偏小,ILK基因消减后影响了裸鼠成瘤的能力。基于RNA-seq技术,ILK基因干扰后挖掘到5540个食管癌差异表达基因,其中上调基因为2839个,下调基因为2601个。上调的基因有SOD2、IRF6、PER1、PHLDB2、TNFAIP3等,下调的基因有RPL21、HYOU1、WARS、SUPT16H、DHCR24等。可能参与TNF信号通路、AMPK信号通路、Fox O信号通路、P53信号通路、NF-k B信号通路等。结论:ILK在消化系统肿瘤中高表达,与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。ILK基因消减抑制ESCC细胞增殖、克隆形成、侵袭及转移,促进细胞凋亡。体内致瘤研究证实,ILK基因消减会阻碍KYSE-150移植瘤的生长。基于RNA-seq技术筛选出食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测差异表达基因,可能相关的信号传导通路。
黄咏莲[4]（2021）在《miR-613通过靶向TAGLN2抑制甲状腺乳头状癌的增殖、迁移和侵袭》文中研究表明研究背景:甲状腺癌是最常见的恶性肿瘤之一。在近25年中发病率约增加2倍,目前在临床恶性肿瘤中占1%。甲状腺癌的常见病理类型主要分为以下四种:乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌。甲状腺癌发病率的显着增加,在很大程度上是由于甲状腺乳头状癌的增加所导致的。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是最常见的甲状腺癌类型,占80%-85%。目前PTC的主要治疗方式包括甲状腺切除术（包括颈部淋巴结清扫）、放射性碘（RAI）治疗和TSH抑制治疗。虽然PTC的总体预后较好,但是仍有部分病例复发风险大,降低了患者的生活质量。除此之外,淋巴结转移在PTC患者中非常普遍,大概有80%的病例伴有颈部淋巴结的转移。据最近的文献报道,PTC患者的淋巴结转移与局部复发和生存率有着密切关联。目前,PTC发病和进展的机制尚不完全清楚,进一步探讨与其发生发展及恶性生物学特征相关的因素,揭示其潜在分子机制,为寻找治疗和改善预后的新靶点提供新的方向,也对进一步提高PTC的整体治疗水平,提高患者生活质量具有重要意义。MicroRNA（miRNA）是一类短链非编码的小分子RNA,长度为18～25nt。广泛存在于真核生物中。成熟体microRNA被核糖体识别并整合入RNA诱导的基因沉默复合体（RNA induced silencing complex,RISC）,其功能主要通过特异性识别特定mRNA 3’UTR,与结合位点序列的完全或不完全互补,诱导mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而起到抑制蛋白质合成的作用。近年来,随着有关microRNA越来越多的研究和报道,miRNA被发现在肿瘤发生、恶性进展以及放化疗耐药和抵抗中发挥着不可或缺的作用。Zhang等人的研究表明,在膀胱癌细胞内上调miR-145-5p的表达能够明显抑制细胞的生长和运动能力。在甲状腺滤泡癌中,miR-1通过沉默其靶基因CCND2的表达抑制甲状腺滤泡癌细胞的进展。除此之外,在肺癌、乳腺癌、上颌窦鳞状细胞癌、胆囊癌等多种恶性肿瘤中发现microRNA发挥着抑癌或促癌作用。miR-613是近几年新发现的一个微小RNA,只有一个5’端成熟体,miRNA近年来被发现在多种恶性肿瘤中表达异常,并且在体内或体外改变miR-613的表达,可以调控肿瘤的生长,然而,miR-613在甲状腺乳头状癌发生中的作用机制尚不明确。研究方法:1、收集107例甲状腺乳头状癌患者的癌组织和配对的癌旁正常甲状腺组织。应用实时定量PCR（RT-PCR,real-time quantitative polymerase chain reaction）检测组织中miR-613的表达情况,并分析miR-613表达水平与PTC患者淋巴结转移、多灶性等临床病理特征之间的关系。2、培养三株甲状腺乳头状癌细胞系（K1,TPC-1,BCPAP）和甲状腺正常滤泡上皮细胞系（Nthy-ori-3-1,N3）,RT-PCR检测细胞内miR-613的表达情况,比较PTC细胞系和滤泡上皮细胞系内miR-613表达的差异。3、在PTC细胞系内转染miR-613 mimics以过表达miR-613,RT-PCR检测miR-613的表达水平以评估转染效率并确定最佳转染浓度。实验分组如下:control组（未转染组）、NC组（negative control组）和mimics组（过表达miR-613组）,然后分别通过MTS、伤痕愈合实验和Matrigel基质胶侵袭实验检测在PTC细胞内过表达miR-613对细胞生长、迁移以及侵袭能力的影响;4、在PTC细胞系内过表达miR-613,western blotting检测细胞内上皮细胞间质化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）标志物E-钙黏蛋白（Ecadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达,比较各组间上述蛋白表达的差异。5、Targetscan,miRDB,RNAInter和miRWalk数据库预测miR-613下游靶基因,取四个数据库交集以确定下游靶标。双荧光素酶报告实验验证靶基因TAGLN2 mRNA 3’UTR（3’untranslated region）和miR-613的结合;RT-PCR和western blotting分别检测甲状腺乳头状癌组织和配对的癌旁正常组织中TAGLN2 mRNA和蛋白的表达水平,以及在PTC细胞系内过表达miR-613后,细胞内TAGLN2 mRNA和蛋白的表达水平;6、功能回复实验分组如下:control组（未转染组）、mimics组（过表达miR-613组）和mimics+TA组（共转染miR-613 mimics和TAGLN2过表达质粒组）。分别通过MTS、伤痕愈合实验和Matrigel基质胶侵袭实验检测在PTC细胞生长、迁移以及侵袭能力的变化;Western bloting检测EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达水平,比较各组间蛋白表达的差异。7、分别在PTC细胞系内过表达和敲减TAGLN2,实验分组如下:control组（未转染组）、p CMVTAGLN2（过表达TAGLN2组）、p CMV-control组（过表达空载体组）、sh-TAGLN2组（敲减TAGLN2组）和sh-control组（敲减空载体组）。Western blotting检测各组PTC细胞内PI3K/AKT通路蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT）的表达水平,比较各组间蛋白表达差异。结果:1、RT-PCR结果显示,在癌组织中miR-613相对表达量为1.339±0.523,明显低于miR-613在癌旁正常组织中的表达（3.756±0.934,p<0.01）;并且miR-613的异常表达与PTC颈部淋巴转移密切相关（p<0.01）,而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、包膜侵犯以及多灶性无关（p>0.05）。2、与甲状腺正常滤泡上皮细胞N3相比,miR-613在三株甲状腺乳头状癌细胞系K1,TPC-1和BCPAP中的表达水平均明显降低（p<0.05）。miR-613在以上四株细胞系中的表达分别为1.074±0.291,0.195±0.043,0.201±0.053,0.270±0.052。3、与未转染组（control）和阴性对照组（negative control）相比,过表达组（miR-613 mimics）中miR-613的表达水平明显升高（p<0.01）,而未转染组和阴性对照组之间无明显差异（p>0.05）。MTS检测结果显示:与未转染组和阴性对照组细胞增殖能力相比,K1、TPC-1和BCPAP细胞过表达组的细胞增殖能力明显被抑制（p>0.05）。划痕愈合实验检测结果显示:对划痕愈合面积进行测量,K1细胞未感染组、阴性对照组和过表达组平均划痕愈合面积百分比分别为68.6%±1.40%,74.7%±1.80%,52.6%±3.20%;TPC-1细胞为40.7%±2.30%,28.1%±1.60%,38.4%±1.50%;BCPAP细胞为38.6%±3.60%,37.2%±2.80%,28.0%±1.90%,过表达miR-613后细胞的迁移能力明显减弱（p<0.05）。Transwell检测过表达miR-613对PTC细胞侵袭能力的影响:K1细胞未感染组、阴性对照组和过表达组平均细胞数为225.8±14.3,157.3±25.7,268.0±22.5;TPC-1细胞为496.20±73.5,220.2±5.4,498.2±73.7;BCPAP细胞为568.6±25.6,233.8±24.2,532.0±34.1,在PTC细胞内过表达miR-613能够显着抑制其侵袭能力（p<0.05）。4、Western blotting用于检测过表达miR-613后,E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和基质金属蛋白酶2的表达水平的变化。结果显示:在K1细胞中,miR-613过表达组E-钙黏蛋白相对表达量（4.433±0.082）明显高于未转染组（1±0.119,p<0.001）和阴性对照组（1.317±0.037,p<0.001）;N-钙黏蛋白相对表达量（0.218±0.004）明显低于未转染组（1±0.121,p<0.01）和阴性对照组（0.903±0.011,p<0.001）;波形蛋白相对表达量（0.501±0.008）明显低于未转染组（1±0.064,p<0.01）和阴性对照组（1.013±0.012,p<0.001）;金属基质蛋白酶2相对表达量（0.545±0.014）明显低于未转染组（1±0.092,p<0.01）和阴性对照组（0.840±0.016,p<0.001）。在TPC-1细胞中,未感染组、阴性对照组和过表达组中E-钙黏蛋白的相对表达量分别为1±0.018,1.074±0.030,1.959±0.021,过表达组的表达量明显高于未转染组（p<0.001）和阴性对照组（p<0.001）;未感染组、阴性对照组和过表达组中N-钙黏蛋白的相对表达量分别为1±0.230（p<0.05）,0.942±0.015（p<0.001）,0.395±0.035;波形蛋白的相对表达量分别为1±0.058（p<0.01）,1.128±0.030（p<0.001）,0.581±0.021;金属基质蛋白酶2的相对表达量分别为1±0.016（p<0.0001）,0.898±0.047（p<0.001）,0.240±0.009,这三种蛋白在过表达组中均明显降低。BCPAP细胞miR-613过表达组E-钙黏蛋白的相对表达水平为1.460±0.014,高于未转染组1.033±0.141（p<0.05）和阴性对照组1.299±0.015（p<0.01）;过表达组N-钙黏蛋白、波形蛋白和金属基质蛋白酶2的相对表达量分别为0.474±0.034,0.544±0.019和0.267±0.009,明显低于未转染组（1±0.017,p<0.01;1±0.007,p<0.0001;1±0.017,p<0.0001）和阴性对照组（0.887±0.039,p<0.01;0.986±0.016,p<0.0001;1.078±0.037,p<0.0001）。而未转染组和阴性对照组之间无显着差异（p>0.05）。5、Targetscan、miRDB、RNAInter和miRWalk四个在线数据库预测肌动蛋白结合蛋白TAGLN2可能是miR-613直接下游靶基因。双荧光素酶报告实验结果显示,共转染野生型WT质粒+mimics组的荧光比值（1.768±0.085）明显低于共转染野生型WT质粒+NC组的荧光比值（2.324±0.043,p<0.05）。同时,共转染突变型MUT质粒+mimics组的荧光比值（2.819±0.102）与共转染突变型MUT质粒+NC组的荧光比值（2.761±0.172,p>0.05）之间差异无统计学意义,证实TAGLN2 mRNA 3’UTR能够与miR-613直接结合。Western blotting及RTPCR结果显示甲状腺乳头状癌组织中TAGLN2 mRNA及蛋白相对表达量分别为1.831±0.197和1.237±0.145,明显高于癌旁组织（0.973±0.080,p<0.001和0.836±0.145,p<0.01）。同时,在PTC细胞中,通过mimics过表达miR-613,结果显示miR-613抑制细胞内TAGLN2 mRNA和蛋白的表达。6、过表达miR-613的PTC细胞,其恶性生物学行为（增殖、迁移和侵袭）被明显抑制,而共过表达miR-613和TAGLN2的细胞的恶性生物学行为被回复;同时细胞内EMT相关标志物蛋白的表达水平也发生了改变:重新过表达TAGLN2后,细胞内E-钙黏蛋白表达降低,而N-钙黏蛋白、波形蛋白和金属基质蛋白酶2的表达均增高。7、在上调TAGLN2的表达能够增加PTC细胞内p-PI3K和p-AKT蛋白的表达;同时,下调TAGLN2的表达能够降低PTC细胞内p-PI3K和p-AKT蛋白的表达。而无论上调还是下调TAGLN2的表达,PI3K和AKT蛋白的表达水平无明显变化。结论:1、在甲状腺乳头状癌中,miR-613在癌组织中的表达明显低于其配对的癌旁正常组织,并且其表达水平与PTC的颈部淋巴结转移有关,说明miR-613可能在甲状腺乳头状癌细胞的侵袭调控中发挥一定的作用。2、miR-613能够明显抑制PTC细胞增殖、迁移及侵袭能力,以及抑制上皮细胞间质化。过表达miR-613在改善PTC恶性表型方面发挥着重要的作用。3、miR-613参与调节肌动蛋白结合蛋白TAGLN2的表达,在细胞内过表达TAGLN2可以抵消miR-613对PTC细胞的抑制作用,可能是miR-613在甲状腺乳头状癌中发挥抑癌作用的生物学机制。4、TAGLN2可以激活PI3K/AKT信号通路,提示我们TAGLN2可能通过激活PI3K/AKT促进EMT的进展。本研究结果可能为甲状腺乳头状癌的治疗提供新的靶点。
张冬[5]（2020）在《IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用》文中研究说明研究背景癌症是世界上最常见的死亡原因,在所有癌症中肺癌是病死率最高的,肺癌的病死率高是由于肺组织中癌细胞的增殖失控和早期转移。目前认为,长期暴露于烟草烟雾、遗传因素、空气污染是肺癌发生的主要原因。众多研究表明,肺癌通过不同遗传途径、分子表达谱及治疗反应性呈现出明显的多态性和遗传异质性,现已确定许多基因和蛋白质在癌症发生的复杂信号通路中发挥至关重要的作用。然而,目前有关肺癌发生的确切机制仍知之甚少。干扰素诱导跨膜蛋白（interferon induced transmembrane protein,IFITM）基因家族是1984年首次在IFN诱导的神经母细胞瘤的cDNA中被发现,到目前为止,人类已发现五个 IFITMs（IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5 及 IFITM10）亚基因。IFITM蛋白家族的成员均由大约130个氨基酸构成,有两个跨膜蛋白区域穿插在一个保守的细胞质区。以往的研究表明,他们属于一个小鼠基因的家族成员,由2个短的具有高度相似性但由不同N末端和C端的核心序列的跨膜结构域蛋白组成。人类的同源基因（IFITM1,IFITM2,IFITM3）都聚集在11号染色体上,IFITM家族的主要功能是调节免疫功能,抑制病毒合成或复制,调节成骨细胞骨矿化,IFITM蛋白还被认为在细胞周期控制和细胞凋亡中起作用。其中,IFITM3又称1-8U,首先在结肠肿瘤及溃疡性结肠炎患者的结肠粘膜中分离,研究证实其可作为溃疡性结肠炎相关性结肠癌的首选标记物,并且IFITM3的表达与大肠癌的转移和预后呈正相关;IFITM3的表达水平也被证实在星形胶质细胞瘤细胞中的水平显着高于正常小鼠的星形胶质细胞水平,IFITM3上调可影响神经胶质瘤细胞的增殖浸润,已被认为是脑胶质瘤发生和侵袭的关键因素;其它研究显示IFITM3在头颈部鳞状细胞癌、食管鳞癌、胃癌、肝癌组织中过度表达,预示患者预后不良,在上述癌组织中IFITM3的高水平表达促进癌细胞的增殖,并与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及远处转移等密切相关,而基因敲除技术能显着下调IFITM3的mRNA及其蛋白水平,显着抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞周期停滞、促进细胞衰老和凋亡;IFITM3蛋白在浸润性乳腺癌中高表达,并且与雌激素受体和孕激素受体水平显着相关。因此,IFITM3被认为是癌症发生发展的重要参与者,可能通过直接或间接途径抑制癌细胞的凋亡,促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。目前关于IFITM3在癌症发病机制中所发挥的具体功能和潜在机制仍不清楚,而对于IFITM3在肺癌中的研究目前更是鲜为人知。在人们日益追求高质量生活的今天,癌症的早发现、早治疗显得尤为重要,进一步研究IFITM3在癌症进展中的作用机制具有重要意义。本课题以IFITM3基因为切入点,通过检测IFITM3蛋白在肺腺癌组织中表达水平,分析肺腺癌组织中IFITM3表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系,并以此为基础,通过慢病毒介导的基因沉默及过表达技术,沉默及过表达肺腺癌细胞IFITM3基因,观察其对肺腺癌细胞株生长、迁移及侵袭的调节作用,以及上皮间质转化（EMT）是否也发生于肺腺癌的进展过程中,基质金属蛋白酶（MMP-2,MMP-9）在其中的具体作用如何,p38-MAPK信号通路是否在肺腺癌进展中发挥了积极作用,p38-MAPK信号通路特异性激动剂TNF-α和抑制剂SB203580是否可改变这一进程,同时通过裸鼠成瘤能力进一步验证IFITM3基因的促细胞增殖作用。研究目的明确IFITM3在肺腺癌发生中的作用,通过分析IFITM3蛋白在肺腺癌组织的表达,观察沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞生长、迁移、侵袭、细胞凋亡和细胞周期分布的影响,探讨IFITM3在肺腺癌进展中的作用机制,并为寻找新的生物学标志物及新的治疗方法奠定基础。研究方法1.肺腺癌癌组织中IFITM3蛋白的表达:收集50例肺腺癌组织,采用免疫组织化学染色方法检测肺腺癌组织中IFITM3的表达,分析肺腺癌中IFITM3表达及其临床意义。2.采用实时定量 PCR 检测 16HBE、H1299、H1395、H1437、H1975 及 A549细胞中IFITM3的mRNA及蛋白表达水平,选择高表达的的细胞株,通过慢病毒介导的基因沉默技术,构建IFITM3特异性沉默表达载体,转染至高表达IFITM3的肺腺癌细胞株;选择低表达的的细胞株,通过慢病毒介导的基因过表达技术,构建IFITM3特异性过表达载体,转染至低表达IFITM3的肺腺癌细胞株,通过实时定量PCR及Western blot检测IFITM3基因沉默及过表达的效率。3.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞增殖的影响:通过软琼脂培养克隆形成实验检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞克隆形成能力的影响。4.通过流式细胞仪检测沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞周期分布的影响;流式细胞仪分析沉默及过表达IFITM3基因后肺癌细胞周期分布。Western Bolt检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞周期蛋白的影响;流式细胞仪分析沉默及过表达IFITM3基因后肺癌细胞早期凋亡。5.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞侵袭及迁移的影响:通过Transwell侵袭实验及Transwell迁移实验检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞侵袭及迁移能力的影响;6.沉默及过表达IFITM3基因对裸鼠成瘤能力的影响:将沉默IFITM3基因的H1299细胞及过表达IFITM3基因的A549细胞和对照组H1299细胞,分别接种于裸鼠左侧腋下接种观察出瘤,接种后第30天处死,测量瘤重量及瘤体体积。7.通过Western Bolt检测沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶蛋白表达及对上皮细胞间质转化标志物表达的影响:Western blot检测沉默及过表达IFITM3基因后MMP-2及MMP-9的表达情况;Western blot检测沉默及过表达IFITM3基因对EMT标记物Vimentin、Snail及E-cadherin表达的影响。8.Western blot检测p38-MAPK信号通路在IFITM3诱导EMT中的作用:Western blot检测沉默IFITM3基因组加入p38-MAPK通路激活剂TNF-α后磷酸化p38、Vimentin、Snail及E-cadherin的表达情况;过表达IFITM3基因组加入p38-MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580后磷酸化p38、Vimentin、Snail及E-cadherin的表达情况。研究结果:1.IFITM3蛋白在人肺腺癌中的表达及临床意义结果表明,50例肺腺癌组织中的IFITM3蛋白表达呈阳性的有41例（82.00%）。TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期）患者肺癌组织内IFITM3的表达高于TNM分期（Ⅰ+Ⅱ期）患者;在有淋巴结转移患者肺癌组织内IFITM3表达高于无淋巴结转移病例,提示IFITM3蛋白在肺癌组织内的表达与淋巴结转移和TNM分期有关。2.肺腺癌细胞IFITM3的表达及转染效率。采用了实时定量 PCR 检测 16HBE、H1299、H1395、H1437、H1975 及 A549细胞中IFITM3的mRNA表达水平,Western blot检测各细胞株IFITM3的蛋白表达水平。结果显示,IFITM3在人支气管上皮样细胞16HBE仅有少量表达,在H1299和H1975细胞表达较高,在H1395和A549细胞表达较低,因此,选择H1299和H1975细胞行基因沉默,选择H1395和A549细胞行基因过表达进行下一步研究。并通过实时定量PCR及Western blot检测转染效率,1v-shIFITM3转染H1299和H1975细胞后IFITM3 mRNA及蛋白的表达被明显的抑制;过表达质粒转染H1395和A549细胞后IFITM3 mRNA及蛋白的表达则明显增加。3.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞增殖的影响:采用软琼脂培养克隆形成实验显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞克隆形成能力明显下降,提示沉默IFITM3能够抑制肿瘤细胞生长;过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞克隆形成能力明显增强,提示过表达IFITM3能够促进肿瘤细胞生长。4.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞周期分布、细胞周期蛋白及肺癌细胞早期凋亡的影响流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示随着IFITM3的下调,处在G0/G1期的细胞数量显着增加,而在G2/M期及S期的细胞减少,这些结果表明,沉默IFITM3表达,可将H1299和H1975细胞阻滞于G0/G1期,从而抑制肿瘤细胞的增殖;随着IFITM3的过表达,处在G0/G1期的细胞数量显着减少,而在G2/M期及S期的细胞增加,过表达IFITM3促进H1395和A549细胞的增殖。Western blot检测细胞周期蛋白结果显示沉默IFITM3表达,可降低H1299和H1975细胞CDK4及cyclin D1的表达,而P21的表达升高;过表达IFITM3,可升高H1395和A549细胞CDK4及cyclin D1的表达,P21则表达降低。Annexin V-FITC及PI复染法流式细胞仪检测肺癌细胞早期凋亡结果显示沉默IFITM3促进H1299和H1975细胞早期凋亡,过表达IFITM3抑制H1395和A549细胞早期凋亡。5.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞侵袭及迁移能力的影响Transwell侵袭实验结果显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞侵袭能力明显降低,过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞侵袭能力明显增强。Transwell迁移实验结果显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞迁移能力明显降低。过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞迁移能力明显增强。6.沉默及过表达IFITM3基因对裸鼠成瘤能力的的作用沉默IFITM3基因可抑制H1299细胞裸鼠成瘤能力,过表达IFITM3基因可增强A549细胞裸鼠成瘤能力。7.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶蛋白表达及对上皮细胞间质转化标志物表达的影响:Western blot检测IFITM3基因对MMP-2及MMP-9的表达结果显示,沉默IFITM3表达可降低H1299和H1975细胞MMP-2及MMP-9的表达,过表达IFITM3可升高H1395和A549细胞MMP-2及MMP-9的表达。Western blot检测IFITM3基因对EMT标记物的表达结果显示,沉默IFITM3可降低H1395和H1975细胞Vimentin及Snail的表达,E-cadherin的表达升高;过表达IFITM3可升高H1395和A549细胞Vimentin及Snail的表达,E-cadherin的表达降低。8.Western blot检测p38-MAPK信号通路在IFITM3诱导EMT中的作用Western blot实验结果表明沉默IFITM3基因,非磷酸化p3 8表达无明显改变,磷酸化p38的表达显着下降,在沉默IFITM3基因的H1299和H1975细胞中加入TNF-α,p38-MAPK通路激活后E-cadherin的表达降低,磷酸化p38、Vimentin、Snail的表达升高;过表达IFITM3基因,非磷酸化p38表达无明显改变,磷酸化p38的表达显着增加,在过表达IFITM3基因的H1395和A549细胞中加入SB203580特异性抑制p38-MAPK信号通路,E-cadherin的表达升高,磷酸化p38、Vimentin、Snail的表达显着降低,这些结果表明:IFITM3可以通过p38-MAPK信号通路诱导EMT的发生。研究结论1.IFITM3蛋白在肺腺癌组织内呈现高表达,并与淋巴结转移和TNM分期有关。2.沉默IFITM3基因后,肺腺癌细胞的增殖能力下降,并促进其凋亡;过表达IFITM3基因后,肺腺癌细胞的增殖能力上升,并减少其凋亡。3.沉默IFITM3基因导致肺腺癌细胞侵袭和迁移能力明显降低,过表达IFITM3基因导致肺腺癌细胞侵袭和迁移能力明显增强。4.沉默IFITM3基因可抑制肺腺癌细胞裸鼠成瘤能力,过表达IFITM3基因可增强肺腺癌细胞裸鼠成瘤能力。5.沉默IFITM3基因导致MMP-2、MMP-9蛋白的表达降低,过表达IFITM3基因后MMP-2、MMP-9蛋白的表达升高,IFITM3可以通过p38-MAPK信号通路诱导上皮细胞间质转化的发生,从而促进肺癌细胞的侵袭和转移能力。以上结果提示IFITM3在肺腺癌细胞的增殖、侵袭、转移中发挥重要作用,IFITM3表达与肺腺癌的病情发展有关,IFITM3有望成为肺腺癌治疗的新靶点。
高勇强[6]（2020）在《KAI1基因对胃癌细胞体外生长、迁移的影响》文中认为目的:用转染慢病毒载体的方式改变不同胃癌细胞株中KAI1基因的表达量,探讨KAI1基因对胃癌细胞体外生长与迁移能力的影响。方法:1.将人低分化胃癌细胞BGC823分组,分别为转染KAI1基因过表达慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-KAI1-3Flag的实验组（BGC823-OE组）、转染空病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS的阴性对照组（BGC823-NC组）和未做特殊处理的空白对照组（BGC823-Ctrl组）;同时将人高分化胃癌细胞MKN28进行分组,分别为转染KAI1基因慢病毒RNA干扰载体pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA（KAI1）的实验组（MKN28-siRNA组）、转染空病毒载体pLKD-CMV-EGFP-Puro-U6-shRNA的阴性对照组（MKN28-NC组）以及未做特殊处理的空白对照组（MKN28-Ctrl组）,病毒感染72小时后荧光显微镜下观察各组细胞中绿色荧光蛋白EGFP的表达,并通过加药筛选方法建立稳定转染的细胞株。2.应用蛋白印迹实验（Western Blot,WB）和实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR）方法检测各组细胞株中KAI1蛋白和mRNA的表达情况。3.四唑盐比色法（MTT）检测各组细胞株的体外生长增殖情况。4.流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测各组细胞株细胞周期的改变情况。5.采用Transwell实验检测各组细胞株体外迁移情况。结果:1.各组细胞慢病毒感染72h后,荧光显微镜下观察到两种胃癌细胞实验组和NC组中有大量荧光蛋白EGFP的表达,而Ctrl组中未观察到绿色荧光的表达,用加药筛选的方法成功扩增构建出实验组与NC组的稳转细胞株。2.BGC823-OE组中的KAI1蛋白以及mRNA的相对表达量显着高于BGC823-NC组及BGC823-Ctrl组（P<0.05）;而MKN28-siRNA组中的KAI1蛋白以及mRNA的相对表达量显着低于MKN28-NC组及MKN28-Ctrl组（P<0.05）;两种细胞的NC组与Ctrl组中的KAI1蛋白和mRNA的相对表达量差异之间无统计学意义（P>0.05）。3.BGC823-OE组在24h、48h、72h的相对增殖率明显低于BGC823-NC组以及BGC823-Ctrl组在同时段的相对增殖率,且差异具有显着性（P<0.05）;而MKN28-siRNA组在24h、48h、72h的相对增殖率则明显高于MKN28-NC组以及MKN28-Ctrl组在同时段的相对增殖率,差异同样具有显着性（P<0.05）;两种细胞的NC组与Ctrl组在24h、48h、72h的相对增殖率之间的差异无统计学意义（P>0.05）。4.BGC823-OE组细胞周期的S期占比明显少于BGC823-NC组以及BGC823-Ctrl组,差异具有显着性（P<0.05）;MKN28-siRNA组细胞周期S期占比则明显多于MKN28-NC组以及MKN28-Ctrl组,差异同样具有显着性（P<0.05）;两种细胞的NC组与Ctrl组S期比例之间差异无统计学意义（P>0.05）。5.BGC823-OE组细胞的迁移数目要明显少于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组,差异有显着性（P<0.05）;MKN28-siRNA组细胞迁移数目则多于 MKN28-NC组和MKN28-Ctrl组,差异有显着性（P<0.05）;两种细胞的NC组与Ctrl组细胞迁移量差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.成功构建稳定高表达KAI1基因的人胃癌BGC823细胞株以及稳定低表达KAI1基因的人胃癌MKN28细胞株。2.上调KAI1基因的表达量可以抑制BGC823细胞株的体外增殖与迁移;下调KAI1基因的表达量可以促进MKN28细胞株的体外增殖与迁移。3.KAI1基因可将胃癌细胞生长周期阻滞于G0G1期。4.KAI1基因对不同胃癌细胞株体外生长与迁移能力具有负向调控作用。
韩希然[7]（2020）在《LASS2/TMSG1基因通过神经酰胺途径参与人肺癌A549细胞增殖、凋亡及其机制的研究》文中指出目的本课题旨在深入了解LASS2/TMSG1基因对体外培养人肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,并观察LASS2/TMSG1基因在裸鼠皮下移植瘤生长过程中的作用,并初步探讨LASS2/TMSG1基因诱导人肺癌A549细胞凋亡的相关分子机制。方法1.流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测LASS2/TMSG1基因过表达前后人肺癌A549细胞的凋亡情况。2.平板克隆形成实验检测LASS2/TMSG1基因过表达前后人肺癌A549细胞的体外增殖能力。3.构建人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察LASS2/TMSG1基因过表达前后裸鼠皮下移植瘤的生长情况。4.苏木精-伊红染色,观察裸鼠皮下肿瘤组织的镜下形态、克隆形成情况、凋亡坏死情况及肿瘤转移情况。5.免疫组织化学染色观察LASS2/TMSG1基因过表达前后裸鼠皮下肿瘤组织中Ki67的表达情况。6.ELISA方法检测LASS2/TMSG1基因过表达前后人肺癌A549细胞上清液及裸鼠肿瘤组织匀浆中神经酰胺及P38 MAPK蛋白的表达情况。7.运用SPSS22.0软件分析数据,P<0.05（作为分析标准）认为差异显着,有统计学意义。结果（1）本课题组先前的实验结果显示,在人肺癌A549细胞中,经Western Blot检测发现过表达组肺癌细胞内LASS2/TMSG1蛋白表达水平明显升高,表明已成功构建LASS2/TMSG1基因过表达组。（2）流式细胞术结果显示,LASS2/TMSG1基因过表达组细胞的凋亡率（%）显着高于阴性对照组,分别为:31.51±1.41、11.72±1.07,（t=1.10,P<0.05）。（3）平板克隆形成实验结果显示,LASS2/TMSG1基因过表达组细胞克隆形成百分比（%）显着低于阴性对照组,分别为:12.17±4.51、31.83±10.13,（t=3.07,P<0.05）。（4）裸鼠移植瘤形成实验结果表明,与阴性对照组相比,LASS2/TMSG1基因过表达组裸鼠肿瘤体积（mm3）增长较慢,但无统计学意义（P>0.05）。测量两组裸鼠肿瘤组织的最终质量与体积,LASS2/TMSG1基因过表达组肿瘤组织的平均质量（g）略低于阴性对照组,分别为0.23±0.10,0.28±0.13,（t=0.75,P>0.05）;LASS2/TMSG1基因过表达组肿瘤组织的平均体积（mm3）低于阴性对照组,分别为90.60±45.26,143.90±89.40,（t=1.41,P>0.05）,差异不显着。（5）通过苏木精-伊红染色观察发现,两组肿瘤细胞均呈现低分化腺癌形态;LASS2/TMSG1基因过表达组肿瘤细胞平均克隆形成数目（1.29±0.49）明显低于阴性对照组（2.29±0.95）,（t=2.48,P<0.05）;与阴性对照组相比,LASS2/TMSG1基因过表达组肿瘤组织的坏死灶较大较彻底;两组裸鼠均未发现肝、脾、肾及淋巴结转移。（6）通过免疫组织化学染色发现,LASS2/TMSG1基因过表达组的裸鼠肿瘤组织中Ki67阳性率（%）（27.15±9.36）明显低于阴性对照组（44.80±6.05）,（t=4.48,P<0.05）。（7）ELISA检测结果显示,在人肺癌A549细胞上清液中LASS2/TMSG1基因过表达组的神经酰胺含量（μmol/L）显着高于阴性对照组,分别为155.00±3.83、128.50±13.71,（t=3.22,P<0.05）;裸鼠肿瘤组织匀浆中LASS2/TMSG1基因过表达组的神经酰胺含量（μmol/L）显着高于阴性对照组,分别为265.00±19.34、226.20±7.99,（t=3.21,P<0.05）;人肺癌A549细胞上清液中LASS2/TMSG1基因过表达组的P38 MAPK蛋白含量（ng/m L）显着高于阴性对照组,分别为86.47±1.04、78.38±1.38,（t=8.14,P<0.05）;裸鼠肿瘤组织匀浆中LASS2/TMSG1基因过表达组的P38 MAPK蛋白含量（ng/m L）显着高于阴性对照组,分别为89.93±3.92、62.32±3.54,（t=9.06,P<0.05）,差异显着。结论LASS2/TMSG1基因作为一种肿瘤转移抑制基因,不仅可以调节肿瘤细胞的增殖,对肿瘤细胞的凋亡过程也有一定影响。LASS2/TMSG1基因可能会通过诱导神经酰胺的合成,进一步激活其下游的效应分子P38 MAPK蛋白等,启动级联信号传导通路,从而发挥促进人肺癌细胞凋亡,抑制人肺癌细胞增殖的作用。
夏露花[8]（2020）在《nm23表达在NSCLC中的研究及PET/CT对其分期与放疗计划的影响》文中研究说明目的:研究和探讨nm23基因与其他基因（EGFR,VEGF）在非小细胞肺癌中的表达、临床意义及其相关性,为临床治疗非小细胞肺癌疾病选取最有效的药物提供更多的参考信息。靶向逆转nm23基因对非小细胞肺癌在放疗敏感性中的影响研究,并探讨其可能机制。探讨使用PET/CT与增强CT两种检查方法对nm23表达的非小细胞肺癌分期及对放疗计划的影响。方法:1)选取180例nm23表达阳性的非小细胞肺癌患者的肿瘤组织标本,将其列为研究组。选取上述研究组中的53例非小细胞癌标本的癌旁正常肺组织作为对照组。检测两组的nm23和EGFR、VEGF基因的表达,对比其差异。对上述180例患者进行回顾性分析,分析在不同性别、病理类型、分化程度、淋巴结转移、肿瘤分期方面nm23、EGFR、VEGF三者表达的差异及其相关性。2)采用实时荧光PCR检测不同非小细胞肺癌细胞株A549和细胞株H1299中nm23 mRNA中表达水平;对照组细胞株A549给予照射处理,实验组则将过表达nm23重组质粒转染A549后给予照射处理;采用克隆形成实验检测各组细胞集落形成情况;采用实时荧光PCR检测各组nm23 mRNA表达并进行统计学分析;采用Western Blot检测两组PI3K和AKT蛋白表达,分析其表达的差异。3)选取213例nm23表达的非小细胞肺癌患者为研究对象,根据患者图像检查方法的不同,将其分为PET/CT组与增强CT组。在PET/CT组中,对比nm23表达强阳性（>++）组nm23表达阳性（≤++）组的SUVmax及GTVPET/CT。观察对比PET/CT组与增强CT组两组图像下,肿瘤分期改变情况、靶区勾画的体积大小、危及器官靶区的照射剂量,评估其对放疗靶区勾画的差异,对分期及放疗计划的影响。结果:1)EGFR、VEGF和nm23在非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的表达:非小细胞癌组中的EGFR、VEGF阳性率均显着高于对照组,而nm23阳性率显着低于对照组,差异具有统计学意义。EGFR、VEGF和nm23表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系:（1）在性别、肿瘤分化程度方面:EGFR、VEGF、nm23阳性表达比较差异均无统计学意义;（2）病理类型方面:腺癌组EGFR阳性表达率高于鳞癌组;VEGF、nm23阳性表达率在腺癌、鳞癌上差异无统计学意义;（3）肿瘤分期方面:EGFR阳性表达率在肿瘤分期为Ⅲ—Ⅳ期组高于肿瘤分期为Ⅰ—Ⅱ期组,差异有统计学意义;VEGF、nm23在分期Ⅰ—Ⅱ期与Ⅲ—Ⅳ期中差异无统计学意义。（4）淋巴结转移方面:EGFR、VEGF阳性表达率有淋巴结转移组的高于无淋巴转移组;nm23的阳性表达率有淋巴结转移组低于无淋巴结转移组。（5）相关性分析结果显示:在非小细胞癌组织中,VEGF和EGFR不存在明显相关性;VEGF和nm23之间也不存在明显相关性,但EGFR与nm23与之间呈负相关性。2)A549和H1299非小细胞癌细胞株中nm23mRNA表达水平差异有统计学意义,A549非小细胞肺癌细胞株nm23表达水平较低;实验组与对照组MLD值和SF2值差异有统计学意义;实验组与对照组各放疗剂量下,细胞存活量差异有统计学意义;实验组与对照组在各放疗剂量下,nm23 mRNA表达水平差异有统计学意义;实验组与对照组在各放疗剂量下,PI3K和AKT蛋白表达水平差异有统计学意义。3)在PET/CT组中,nm23表达强阳性组SUVmax与GTVPET/CT均低于nm23表达阳性组。PET/CT组与增强CT组两组图像相比,两组在非小细胞癌分期改变、大体靶区体积（GTV）、危及器官的放疗照射量方面差异均有统计学意义。结论:（1）对nm23、EGFR和VEGF进行免疫组化检测,有助于临床了解非小细胞肺癌患者病变程度,为制定治疗方案及选择合适的药物提供更多有价值的信息。（2）靶向逆转nm23可增强非小细胞肺癌放疗敏感性,与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关。（3）了解nm23基因在非小细胞肺癌中的表达情况,能够为放疗靶区的制定提供更多有价值的信息。PET/CT在非小细胞肺癌放疗中,有助于提高靶区勾画的准确性,同时也能够更好的保护周围正常组织、器官,使患者获益。
乔书培[9]（2019）在《miR-486-3p特异性过表达系统构建及在癌症中的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理miRNA是一类由18-24个碱基组成的物种间保守的非编码RNA,在多种生物学过程中发挥着重要的作用,参与发育,分化以及干性维持。miRNA的异常表达跟许多人类疾病（如癌症）的发生以及发展密切相关。本研究发现miR-486-3p在癌症组织中的表达相对于癌旁组织显着下调,随后TCGA数据库miR-486-3p表达数据与乳腺癌患者生存率相关性分析发现,miR-486-3p高表达病人生存率显着高于低表达病人,预示miR-486-3p在癌症中发挥着重要作用。因此,本研究将开展miR-486-3p在癌症中的作用以及机制分析。随着miRNA存贮平台的建立以及生物信息学的发展,miRNA互补对特殊结构被发现,而本研究的miR-486刚好能够被加工成互补miRNA对,即miR-486-5p与miR-486-3p成熟体互补配对,本研究发现miRNA-486互补对特殊结构导致利用传统的miRNA模拟物以及过表达pri-miRNA的方法均不能实现miR-486-3p的特异性过表达,为此,在sh RNA慢病毒表达系统的基础上,本研究建立了针对miR-486-3p特异性过表达的慢病毒系统,且该系统同时适用于其他miRNA互补对单一miRNA的特异性过表达。利用建立的miR-486-3p的特异过表达慢病毒系统,本研究分析了miR-486-3p对癌症生物学特性的影响,发现miR-486-3p能够通过调控癌细胞周期显着抑制癌细胞增殖以及克隆形成,且荷瘤鼠表皮瘤实验证实,在体内miR-486-3p也具有抑制癌细胞增殖的作用。其次,过表达miR-486-3p能够显着诱导癌症细胞的凋亡,增加癌细胞的化疗敏感性。另外,还发现miR-486-3p能够通过影响癌细胞形态进而抑制癌细胞的侵袭以及迁移。为进一步探讨miR-486-3p影响癌症生物学特性的分子机制,本研究利用RNA-Seq技术筛选出与细胞形态改变相关的基因TBCA、HMGA1、ARPC1B以及Rac3作为miR-486-3p的潜在靶基因,通过报告基因活性以及Western blot验证,本研究首次证实miR-486-3p靶向调控TBCA、HMGA1、ARPC1B以及Rac3基因。随后对靶基因是否参与miR-486-3p调控癌症生物学特性过程进行探究,结果表明,分别下调TBCA、HMGA1、ARPC1B以及RAC3均影响癌细胞的细胞周期,下调TBCA、HMGA1以及ARPC1B能够通过影响细胞形态来抑制癌细胞的侵袭以及迁移,但RAC3基因的下调对细胞形态以及癌细胞的侵袭迁移没有影响。最后,利用尾静脉注射稳转萤火虫荧光素酶的癌细胞制备小鼠体内转移模型,结合小动物活体成像,本研究证实过表达miR-486-3p以及下调其靶基因TBCA、HMGA1以及ARPC1B表达均能够抑制癌细胞体内的转移。利用GO以及KEGG富集分析RNA-Seq数据,本研究发现并验证miR-486-3p的过表达能够使MAPK信号通路发生改变,MAPK信号通路的改变会影响癌细胞增殖,凋亡以及侵袭迁移等生物学特性。且本研究证实miR-486-3p至少能够通过靶向下调其靶基因影响ERK的磷酸化水平从而对癌症的生物学特性产生影响。癌症干细胞是癌症复发以及转移的根源,为了进一步明确miR-486-3p在癌症转移中的作用,本研究通过模拟癌症干细胞微环境构建了简单高效的癌症干细胞筛选以及富集平台来探究miR-486-3p在癌症干细胞中的作用。结果表明,过表达miR-486-3p以及敲低其靶基因TBCA、HMGA1以及ARPC1B显着抑制癌症干细胞团的生长以及体内的转移。miR-486-3p至少能够通过靶向下调其靶基因TBCA、HMGA1以及ARPC1B调控MAPK信号通路来抑制癌症干细胞的自我增殖以及体内的转移。综上所述,本研究成功构建了miR-486-3p特异性过表达的慢病毒系统。利用构建的系统证实miR-486-3p至少能够通过靶向下调其靶基因TBCA、HMGA1、ARPC1B以及RAC3调控MAPK信号通路在癌症的发生发展以及癌症干细胞自我复制增殖以及体内转移中发挥着重要的作用。本研究为癌症的分子治疗提供了一个新的作用靶点,也为miR-486-3p用于临床的癌症治疗提供了理论依据。
高阳[10]（2019）在《乳腺癌新标记物的筛选及其作用研究》文中研究指明近年来我国乳腺癌发病率迅速上升,已经成为排名第一位的女性恶性肿瘤,并且逐年呈现年轻化的趋势。然而,目前已知的用于预测和有效治疗乳腺癌的方法是有限的。即便已经通过大量的研究致力于提高乳腺癌的诊断和总体生存率,但是现有的预测和综合治疗还面临有效率不高或者缓解期不长的问题。DNA甲基化及lncRNA（长非编码RNA）具有作为乳腺癌新型标志物的巨大潜力。理想的生物标志物应易于获得的,如果可以从体液（例如血清或尿液）中取样,则特别理想。而在人体体液中确实可以检测到DNA及lncRNA。目前,尚未将DNA甲基化及lncRNA鉴定为人体体内乳腺癌的潜在生物标志物。但已经有lncRNA被鉴定为其他癌症（如肝癌和前列腺癌）中的生物标志物。由于DNA甲基化和lncRNA在乳腺癌进展中起重要作用,因此它们是潜在的新型治疗靶点。本课题旨在发现乳腺癌中的潜在DNA甲基化及lncRNA标志物,为乳腺癌提供预警、诊断、监控病情、判断预后的分子生物学指标,此外通过对与乳腺癌密切相关的DNA甲基化和lncRNA进行干扰,研究其在乳腺癌中的主要生物学功能。首先,本研究通过对油田总医院449例乳腺癌临床样本进行分析,发现普遍性的乳腺癌患者为浸润性导管癌,其它相对较少见的浸润性癌包括小叶癌、腺癌、粘液腺癌、乳头状癌。接下来,本研究通过TCGA数据库对以上类型的乳腺癌组织和正常组织进行了高通量分析,筛选出了差异表达的基因,结果显示,乳腺癌中有108个上调基因和320个下调基因,DAVID功能注释分析结果显示,所有上调的基因富集功能与所有下调基因富集功能完全不同。上调的基因富集功能与细胞周期有关,尤其是M期,但下调的基因富集功能是受调节的激素刺激,细胞增殖等。之后对调控这些基因表达的的相关DNA甲基化情况和lncRNA进行了分析。差异表达基因和异常DNA甲基化位点的高通量分析结果表明,甲基化分析显示乳腺癌中有301个高甲基化CpG位点和242个低甲基化CpG位点,GREAT功能注释分析结果表明,所有高甲基化CpG位点富集功能完全不同于所有低甲基化CpG位点富集功能。超甲基化的CpG位点位于乳腺癌的致病基因附近,但是低甲基化的CpG位点位于防御反应基因附近。通过筛选不同表达的基因和不同甲基化的CpG位点获得30个CpG位点相关基因的结果。Pearson相关系数结果显示,有26个CpG位点显着调节了23个下游基因（p<0.05）。在26个CpG位点中,21个CpG位点是负调节位点,其通常位于基因转录起始位点的500bp附近,并且这些基因在乳腺癌中表达最低。同时,这些基因在乳腺癌中是高甲基化CpG位点,其中包括LEP和EDN3,它们是参与激素调节的两个基因。通过高通量筛选出了乳腺癌组织和癌旁组织差异表达lncRNA,并确定了Mir600HG为研究对象,表达结果显示,Mir600HG在癌旁组织中高表达。通过相关性分析,Mir600HG与乳腺癌14个基因差异表达密切相关,与DNA甲基化所调控的基因进行比对,其中IGF1,ENPP2,LEP和EDN3四个基因属于共有基因。最后,本研究通过对油田总医院所收集的乳腺癌患者样本进行验证分析,结果显示,与癌旁组织进行比较,DNA甲基化和Mir600HG确实在乳腺癌中存在显着性差异,并且IGF1,ENPP2,LEP和EDN3四个基因也存在差异表达。利用Kaplan-Meier Plotte对四个基因进行生存分析,四个基因IGF1,ENPP2,LEP和EDN3的结果显示这些基因的高表达显着与预后良好有关。黄芩苷是一种黄酮类物质,来自于中草药黄芩的根部,是黄芩发挥作用的主要物质,本研究利用黄芩苷处理MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌症细胞和MDB-MB-231异种移植小鼠,结果显示,黄芩苷可以有效地抑制DNA甲基化,进而有效地提高以上四个基因的表达,并且进一步影响乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌症细胞进行Mir600HG的干扰和过表达也得出了相同的结论,并且本研究也证明Mir600HG作为Mir600的初级转录物发挥作用。以上结果证明,DNA甲基化和Mir600HG对IGF1,ENPP2,LEP和EDN3四个基因的调控是乳腺癌患者是否患病以及患病程度的重要标识,对乳腺癌肿瘤的产生以及肿瘤进一步发展具有非常重要的作用,通过调控DNA甲基化和Mir600HG来进一步调控可以有效地抑制乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,是乳腺癌潜在的诊断标识物和治疗靶点。
二、转移抑制:转移抑制基因对癌细胞在继发部位生长的调节作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转移抑制:转移抑制基因对癌细胞在继发部位生长的调节作用（论文提纲范文）
（1）miRNA-633通过调控KAI 1对恶性黑色素瘤生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 恶性黑素瘤中miRNAs及其与KAI 1的靶向关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miRNA-633通过调控KAI 1对恶性黑素瘤细胞B16和A375细胞增殖、迁移及侵袭性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 恶性黑素瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）LIM Homeobox家族基因DNA甲基化水平与宫颈癌的关系及其在放疗中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一节 宫颈癌研究进展 |
| 1.1 宫颈癌发病率和死亡率 |
| 1.2 宫颈癌发生的因素 |
| 1.3 宫颈癌的预防和筛查 |
| 1.4 宫颈癌的治疗 |
| 1.4.1 宫颈癌的手术治疗 |
| 1.4.2 宫颈癌的放射治疗 |
| 1.4.3 宫颈癌的化学治疗 |
| 第二节 宫颈癌与DNA甲基化 |
| 2.1 DNA甲基化概念及生物学功能 |
| 2.2 DNA甲基化检测手段 |
| 2.3 宫颈癌与低甲基化 |
| 2.4 宫颈癌与高甲基化 |
| 2.5 宫颈癌相关基因甲基化的临床应用 |
| 2.5.1 相关基因甲基化在肿瘤诊断中的特点和不足 |
| 2.5.2 肿瘤相关基因DNA甲基化研究在肿瘤治疗上的意义 |
| 第二章 全基因组甲基化测序分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样本 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 甲基化文库的构建、测序 |
| 2.2.1.1 DNA提取 |
| 2.2.1.2 DNA片段末端修复、3'端加A碱基，连接测序接头 |
| 2.2.1.3 重亚硫酸盐处理 |
| 2.2.2 测序数据质量评估 |
| 2.2.3 生物信息分析流程 |
| 2.2.4 参考序列比对分析 |
| 2.2.5 甲基化位点检测及分析 |
| 2.2.6 甲基化位点分布分析 |
| 2.2.7 差异甲基化分析 |
| 2.2.8 DMR相关基因GO富集和KEGG分析 |
| 第三节 结果 |
| 3.1 测序数据统计 |
| 3.2 甲基化基本信息统计 |
| 3.2.1 不同类型甲基化位点的比例统计 |
| 3.2.2 功能区域甲基化水平分布 |
| 3.3 差异甲基化区域(DMRs)鉴定及注释 |
| 3.4 差异DMR基因GO富集分析 |
| 3.5 差异DMR基因KEGG富集分析 |
| 3.6 DMR区域模式聚类分析 |
| 3.7 DMR基因染色体上的分布 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第三章 宫颈癌LHX基因启动子甲基化及其与临床病理特征的关系 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 组织样本 |
| 1.2 主要实验器材 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 PCR引物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病例特征分析及样本收集 |
| 2.1.1 组织学观察及分组 |
| 2.2 检测目的基因基因组甲基化水平 |
| 2.2.1 组织DNA提取 |
| 2.2.2 亚硫氢酸盐处理模板DNA |
| 2.2.3 BSP-PCR扩增 |
| 2.2.4 PCR产物凝胶电泳 |
| 2.2.5 PCR产物回收纯化 |
| 2.2.6 测序载体的构建 |
| 2.2.7 重组质粒的转化 |
| 2.2.8 阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.9 PCR产物测序与分析 |
| 2.3 目的基因表达量特征检测 |
| 2.3.1 RNA提取 |
| 2.3.2 cDNA的合成 |
| 2.3.3 PCR检测组织标本cDNA质量 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶检测 |
| 2.3.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)定量 |
| 2.4 蛋白水平检测目的基因表达量变化 |
| 2.4.1 蛋白提取 |
| 2.4.2 制备SDS-PAGE凝胶 |
| 2.4.3 样品变性及电泳 |
| 2.4.4 凝胶转膜及其检测 |
| 2.5 免疫组化进行蛋白表达定位 |
| 2.5.1 免疫组化检测宫颈癌组织中关键蛋白的表达量 |
| 2.6 酶联免疫反应检测患者治疗过程血液中目的蛋白的表达量变化 |
| 2.6.1 Elisa检测患者血清中目的蛋白表达量 |
| 2.7 目的基因多水平表达量与病理特征之间的关联分析 |
| 第三节 结果 |
| 3.1 宫颈癌临床病理特征 |
| 3.2 宫颈组织中LHX2 LHX5和LHX9基因甲基化水平检测 |
| 3.3 宫颈癌组织LHX2、LHX5和LHX9基因启动子甲基化与分期相关性分析 |
| 3.4 宫颈癌组织中目的基因LHX2、LHX5和LHX9基因表达量检测 |
| 3.5 宫颈癌组织LHX2、LHX5和LHX9基因表达量与分期相关性分析 |
| 3.6 目标基因Westernblot蛋白表达检测结果 |
| 3.7 宫颈癌组织LHX2、LHX5和LHX9蛋白表达量与分期相关性 |
| 3.8 免疫组化检测宫颈癌组织中关键蛋白的表达位置 |
| 3.9 Elisa检测患者血清中目的蛋白表达量 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第四章 宫颈癌细胞系验证LHX2、LHX5和LHX9基因甲基化状态与功能分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验器材及品牌 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.2.4 去甲基化处理 |
| 2.2.5 细胞放射治疗处理 |
| 2.2.6 甲基化的水平检测 |
| 2.2.7 RT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 2.2.7.1 细胞RNA提取 |
| 2.2.1.2 RT-PCR |
| 2.2.8 WB检测蛋白表达水平 |
| 2.2.9 过表达和沉默目的基因 |
| 2.2.9.1 过表达质粒构建 |
| 2.2.9.2 siRNA合成 |
| 2.2.9.3 细胞转染 |
| 2.2.10 细胞生物学检测 |
| 2.2.10.1 转染后细胞增殖检测 |
| 2.2.10.2 Transwell检测细胞侵袭和转移 |
| 2.2.10.3 流式检测细胞凋亡 |
| 2.2.11 数据差异统计学分析方法 |
| 第三节 结果 |
| 3.1 普通SiHa，C33A两种鳞癌细胞中LHX2,LHX5和LHX9基因甲基化水平 |
| 3.2 X射线对目的基因在SiHa,C33A两种鳞癌细胞中的甲基化水平的影响 |
| 3.3 5-Aza-dC药物对目的基因在SiHa,C33A两种鳞癌细胞中的甲基化水平的影响 |
| 3.4 普通SiHa，C33A两种鳞癌细胞中LHX2,LHX5和LHX9基因表达量 |
| 3.5 5-Aza-dC药物和放射治疗处理后细胞中三个基因表达量变化 |
| 3.6 5-Aza-dC药物和放射治疗对SiHa和C33A细胞影响 |
| 3.6.1 5-Aza-dC药物和放射治疗对SiHa和C33A细胞生长影响 |
| 3.6.2 5-Aza-dC药物和放射治疗对SiHa和C33A细胞侵袭影响 |
| 3.6.3 5-Aza-dC药物和放射治疗对SiHa和C33A细胞转移影响 |
| 3.6.4 5-Aza-dC药物和放射治疗对SiHa和C33A细胞凋亡影响 |
| 3.6.5 5-Aza-dC和放射治疗对SiHa和C33A细胞中凋亡和和侵袭相关基因的影响 |
| 3.7 过表达LHX2,LHX5和LHX9基因对宫颈癌细胞影响 |
| 3.7.1 过表达目的基因对细胞侵袭能力影响 |
| 3.7.2 过表达目的基因对细胞转移能力影响 |
| 3.7.3 过表达目的基因对细胞凋亡影响 |
| 3.7.4 过表达目的基因对细胞中侵袭和凋亡相关基因的影响 |
| 3.8 siRNA干扰抑制目的基因对宫颈癌细胞功能的影响 |
| 3.8.1 放射治疗后细胞的基因被沉默后细胞增殖速度出现下降 |
| 3.8.2 沉默放射治疗后的细胞中目的基因后影响了宫颈癌细胞的侵袭能力 |
| 3.8.3 沉默放射治疗后的细胞中目的基因后影响了宫颈癌细胞的转移能力 |
| 3.8.4 放射治疗后细胞基因被沉默后凋亡被抑制 |
| 3.8.5 放疗后的细胞中目的基因被沉默后对凋亡分子和侵袭相关蛋白表达量的影响 |
| 3.9 siRNA干扰抑制目的基因对去甲基化的宫颈癌细胞功能的影响 |
| 3.9.1 去甲基化后的细胞的基因被沉默后细胞增殖速度出现变化 |
| 3.9.2 沉默去甲基化后的细胞中目的基因后影响了宫颈癌细胞的侵袭能力 |
| 3.9.3 沉默去甲基化后的细胞中目的基因后影响了宫颈癌细胞的转移能力 |
| 3.9.4 沉默去甲基化后的细胞中目的基因后影响了宫颈癌细胞的凋亡分子和侵袭相关蛋白的表达量 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（3）ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 ILK表达与消化系统恶性肿瘤临床表型及预后相关性的Meta分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 检索数据库 |
| 1.2 文献纳入和排除标准 |
| 1.3 文献筛选和资料提取 |
| 1.4 研究方法学质量评价 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 ILK对食管鳞癌细胞恶性表型的功能影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 细胞系及来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ILK对食管鳞癌体内成瘤性的影响及生物信息学分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 整合素连接激酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（4）miR-613通过靶向TAGLN2抑制甲状腺乳头状癌的增殖、迁移和侵袭（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:miR-613在PTC组织和细胞系中表达降低,并与PTC患者淋巴结转移有关 |
| 1 前言 |
| 2 材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象及分组 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 实时定量PCR(q-PCR) |
| 2.3.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-613在PTC组织和细胞系中的表达 |
| 3.2 miR-613与PTC临床病理特征之间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:miR-613抑制PTC细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象及分组 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 miR-613mimics序列合成及细胞转染 |
| 2.3.3 细胞增殖实验(MTS法) |
| 2.3.4 细胞迁移(Wound healing assay) |
| 2.3.5 侵袭实验(Transwell) |
| 2.3.6 Western blot检测EMT蛋白标志物 |
| 2.3.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 过表达miR-613抑制PTC细胞增殖 |
| 3.2 过表达miR-613抑制PTC细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.3 过表达miR-613对EMT相关蛋白的表达影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:miR-613通过下调TAGLN2抑制PTC细胞的恶性生物学行为 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1.主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象及分组 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 生物信息学分析 |
| 2.3.3 双荧光素酶报告实验 |
| 2.3.4 实时定量PCR(q-PCR) |
| 2.3.5 细胞转染 |
| 2.3.6 细胞增殖实验(MTS法) |
| 2.3.7 细胞迁移(Wound healing assay) |
| 2.3.8 侵袭实验(Transwell) |
| 2.3.9 Western blot检测EMT蛋白标志物 |
| 2.3.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TAGLN2是miR-613的直接下游靶基因 |
| 3.2 TAGLN2在PTC组织中表达上调 |
| 3.3 miR-613通过TAGLN2影响PTC细胞的增殖,迁移,侵袭及EMT |
| 3.4 TAGLN2激活EMT相关信号通路 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 MiR-613在恶性肿瘤中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写及符号说明 |
| 第一部分 IFITM3蛋白在肺腺癌组织及肺腺癌细胞中的表达 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IFITM3基因对肺癌细胞生物学特性的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IFITM3基因对MMP及对EMT的影响及机制 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及不足 |
| 综述: 肺癌的基因组及分子生物学标记物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文及奖励 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（6）KAI1基因对胃癌细胞体外生长、迁移的影响（论文提纲范文）
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）LASS2/TMSG1基因通过神经酰胺途径参与人肺癌A549细胞增殖、凋亡及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 抑癌基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）nm23表达在NSCLC中的研究及PET/CT对其分期与放疗计划的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 nm23、EGFR、VEGF在 NSCLC中的表达及其相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 仪器与试剂 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 靶向逆转nm23 对非小细胞肺癌放疗敏感性的影响及可能机制. |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 PET/CT对 nm23 表达的NSCLC分期和放疗计划的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 实验观测指标 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 nm23 基因研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（9）miR-486-3p特异性过表达系统构建及在癌症中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究目的和意义 |
| 1.2 miRNA概述 |
| 1.2.1 miRNA的发现历程 |
| 1.2.2 miRNA生物起源以及生物学功能 |
| 1.3 miRNA与肿瘤及肿瘤干细胞 |
| 1.3.1 miRNA表达异常与肿瘤 |
| 1.3.2 肿瘤与肿瘤干细胞 |
| 1.3.3 miRNA与肿瘤干细胞 |
| 1.4 miRNA研究方法概述 |
| 1.5 miR-486研究概述 |
| 1.6 本文的主要研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及细胞 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 癌症干细胞的筛选以及培养 |
| 2.2.3 质粒构建 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 病毒颗粒的制备以及稳转细胞系的构建 |
| 2.2.6 细胞活性氧检测 |
| 2.2.7 细胞活力检测 |
| 2.2.8 细胞周期检测 |
| 2.2.9 细胞凋亡检测 |
| 2.2.10 细胞侵袭以及迁移检测 |
| 2.2.11 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.12 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.13 RT-q PCR |
| 2.2.14 细胞免疫荧光 |
| 2.2.15 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.2.16 裸鼠转移瘤实验 |
| 2.2.17 石蜡包埋切片 |
| 2.2.18 石蜡包埋切片HE染色 |
| 2.2.19 本文主要用的统计分析软件 |
| 第3章 miR-486-3p特异过表达慢病毒系统的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 miR-486-3p在癌症中的表达规律分析 |
| 3.3 传统过表达mi RNA方法未能实现mi R-486-3p特异性过表达 |
| 3.3.1 化学合成mi RNA模拟物未能实现mi R-486-3p的特异性过表达 |
| 3.3.2 病毒介导的pri-mi RNA未能实现特异mi RNA的过表达 |
| 3.4 特异性过表达miR-486-3p慢病毒系统的构建 |
| 3.4.1 sh RNA慢病毒系统用于mi RNA过表达初步探索 |
| 3.4.2 特异性过表达miR-486-3p慢病毒系统的建立 |
| 3.5 miR-486-3p种子区域的突变对下游靶基因的影响分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 miR-486-3p对癌细胞生物学特性的影响分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 miR-486-3p在癌症细胞中的表达规律分析 |
| 4.3 miR-486-3p对癌细胞增殖与克隆形成的影响 |
| 4.4 miR-486-3p对癌细胞周期的影响分析 |
| 4.5 过表达miR-486-3p对癌细胞凋亡的影响分析 |
| 4.6 过表达miR-486-3p对癌细胞化疗敏感性的影响分析 |
| 4.7 miR-486-3p对癌细胞形态以及侵袭迁移的影响 |
| 4.8 过表达miR-486-3p对荷瘤鼠皮下成瘤的影响分析 |
| 4.9 本章小结 |
| 第5章 miR-486-3p影响癌症生物学特性的分子机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 RNA-sequencing数据分析以及验证 |
| 5.2.1 过表达miR-486-3p癌细胞差异表达基因分析 |
| 5.2.2 差异基因GO以及KEGG功能富集分析 |
| 5.2.3 RNA-seq数据定量验证 |
| 5.3 miR-486-3p调控信号通路以及靶基因验证 |
| 5.4 靶基因敲低对癌症生物学特性影响及其机制分析 |
| 5.4.1 靶基因敲低对癌细胞周期以及凋亡的影响 |
| 5.4.2 靶基因敲低对癌细胞细胞形态以及侵袭迁移的影响 |
| 5.4.3 靶基因敲低对MAPK信号通路的调控分析 |
| 5.5 miR-486-3p过表达以及靶基因下调对癌细胞体内的转移影响分析 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 过表达miR-486-3p对癌症干细胞的影响分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 模拟肿瘤微环境癌症干细胞筛选平台的建立 |
| 6.3 miR-486-3p以及靶基因下调对癌症干细胞增殖以及体内转移的影响分析 |
| 6.4 mi R-486-3p通过下调靶基因影响MAPK信号通路进而影响癌症干细胞增殖 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）乳腺癌新标记物的筛选及其作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题研究背景及意义 |
| 1.2 乳腺癌概述 |
| 1.2.1 乳腺癌的发病率和死亡率 |
| 1.2.2 乳腺癌的危险因素 |
| 1.2.3 乳腺癌的病理特征 |
| 1.2.4 乳腺癌的分子生物学特征 |
| 1.3 DNA甲基化与乳腺癌 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 染色质结构和DNA甲基化紧密连锁,参与控制基因表达程序 |
| 1.3.3 癌症中DNA甲基化的两个相互矛盾的异常 |
| 1.3.4 乳腺癌中基因的高甲基化,在沉默肿瘤抑制基因中的作用 |
| 1.3.5 整体低甲基化与乳腺癌中的高甲基化共存 |
| 1.3.6 整体低甲基化在乳腺癌中的可能作用 |
| 1.3.7 整体低甲基化在乳腺癌中的治疗和诊断意义 |
| 1.4 LncRNA对基因的表达调控 |
| 1.4.1 LncRNA的介绍 |
| 1.4.2 LncRNA的功能 |
| 1.4.3 LncRNA与乳腺癌 |
| 1.5 黄芩苷与肿瘤 |
| 1.6 本论文的主要研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 乳腺癌患者样本收集 |
| 2.1.2 实验动物模型及细胞系 |
| 2.1.3 载体、菌株及抗体 |
| 2.1.4 主要实验试剂 |
| 2.1.5 常用实验仪器、生物信息学网站和软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA甲基化和基因表达谱的数据 |
| 2.2.2 筛选不同的表达基因 |
| 2.2.3 筛选差异的DNA甲基化 |
| 2.2.4 分层聚类分析 |
| 2.2.5 功能注释分析 |
| 2.2.6 生存分析 |
| 2.2.7 细胞增殖检测(MTT) |
| 2.2.8 细胞周期分析 |
| 2.2.9 Transwell分析 |
| 2.2.10 划痕伤口愈合分析 |
| 2.2.11 双荧光素酶报告分析 |
| 2.2.12 裸鼠成瘤 |
| 2.2.13 裸鼠给药 |
| 2.2.14 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.15 蛋白质印迹(Western Blot) |
| 2.2.16 石蜡包埋 |
| 2.2.17 H&E染色与免疫组化 |
| 2.2.18 总RNA提取 |
| 2.2.19 反转录cDNA |
| 2.2.20 实时定量PCR |
| 2.2.21 统计分析 |
| 第3章 乳腺癌样本的采集及病理特征分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 乳腺癌患者组织与临床数据收集 |
| 3.3 乳腺癌患者肿瘤样本的类型检测与统计 |
| 3.3.1 乳腺癌患者形态学数据分析 |
| 3.3.2 乳腺癌患者免疫组化数据分析 |
| 3.4 乳腺癌患者临床数据筛选 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 乳腺癌编码与非编码基因差异表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 乳腺癌差异表达基因筛选与功能富集分析 |
| 4.2.1 乳腺癌组织与癌旁组织的差异表达基因 |
| 4.2.2 乳腺癌上调基因和下调基因的不同功能 |
| 4.3 与乳腺癌差异表达基因相关的DNA甲基化 |
| 4.3.1 乳腺癌中异常的DNA甲基化标记筛选 |
| 4.3.2 乳腺癌中的DNA甲基化异常导致乳腺癌相关基因的异常表达 |
| 4.4 乳腺癌和癌旁组织差异表达lncRNA的筛选 |
| 4.4.1 乳腺癌和癌旁组织差异表达lncRNA |
| 4.4.2 乳腺癌中的Mir600HG低表达导致乳腺癌相关基因的异常表达 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 乳腺癌DNA甲基化和LncRNA标志物的功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 乳腺癌和癌旁组织差异表达基因验证 |
| 5.2.1 定量分析乳腺癌和癌旁组织 |
| 5.2.2 差异表达基因对乳腺癌患者生存的影响 |
| 5.3 乳腺癌和癌旁组织差异DNA甲基化验证 |
| 5.4 乳腺癌和癌旁组织差异表达lncRNA的验证 |
| 5.4.1 验证Mir600HG在乳腺癌和癌旁组织表达差异 |
| 5.4.2 Mir600HG对乳腺癌病人的生存影响 |
| 5.5 DNA甲基化的功能分析 |
| 5.5.1 黄芩苷对DNA甲基化的抑制作用 |
| 5.5.2 抑制DNA甲基化对基因表达的影响 |
| 5.5.3 抑制DNA甲基化对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响 |
| 5.6 Mir600HG对乳腺癌症细胞增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 5.7 Mir600HG作为Mir600的初级转录物发挥作用 |
| 5.7.1 Mir600的功能 |
| 5.7.2 Mir600HG作为Mir600的初级转录物发挥作用 |
| 5.8 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、转移抑制:转移抑制基因对癌细胞在继发部位生长的调节作用（论文参考文献）
- [1]miRNA-633通过调控KAI 1对恶性黑色素瘤生物学行为的影响[D]. 王正想. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]LIM Homeobox家族基因DNA甲基化水平与宫颈癌的关系及其在放疗中的作用[D]. 玉荣. 南方医科大学, 2021(02)
- [3]ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究[D]. 马晓丽. 新疆医科大学, 2021
- [4]miR-613通过靶向TAGLN2抑制甲状腺乳头状癌的增殖、迁移和侵袭[D]. 黄咏莲. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用[D]. 张冬. 山东大学, 2020(04)
- [6]KAI1基因对胃癌细胞体外生长、迁移的影响[D]. 高勇强. 遵义医科大学, 2020
- [7]LASS2/TMSG1基因通过神经酰胺途径参与人肺癌A549细胞增殖、凋亡及其机制的研究[D]. 韩希然. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [8]nm23表达在NSCLC中的研究及PET/CT对其分期与放疗计划的影响[D]. 夏露花. 新疆医科大学, 2020(07)
- [9]miR-486-3p特异性过表达系统构建及在癌症中的作用及其机制研究[D]. 乔书培. 哈尔滨工业大学, 2019(01)
- [10]乳腺癌新标记物的筛选及其作用研究[D]. 高阳. 哈尔滨工业大学, 2019(01)