一、荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究（论文文献综述）
强焜,徐斌,胡薇,郑彬[1]（2022）在《等温扩增技术在疟原虫及巴贝虫检测中的应用》文中进行了进一步梳理近年来,等温扩增技术（isothermal amplification technology）凭借恒温条件下对核酸高效率扩增的优势在病原体检测领域展现出了巨大的潜力。疟疾与巴贝虫病作为两类严重危害人类健康的寄生虫病在临床表现与诊断方式上相似,存在误诊的风险。同时,这两类寄生虫病可通过血液传播。因此,高效、快速的检测技术对疟疾与巴贝虫病的诊断和保证血液制品安全有重要的意义。本文对现有针对疟原虫与巴贝虫的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）、重组酶介导等温扩增技术（recombinase-aided amplification,RAA）以及依赖解旋酶等温扩增技术（helicase-dependent amplification, HDA）等四类等温扩增技术的原理、特点及检测方式进行综述并对其应用前景进行展望。
侯谦[2]（2021）在《口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的初步建立与评价》文中研究说明快速简便的核酸检测方法能够在第一时间发现口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）,在疫情防控中发挥至关重要作用。实验室广泛使用的荧光PCR方法高度依赖于特定设备和专业人员,无法满足条件有限的基层检测需求,所以建立一种适于现场检测需求的新型核酸检测方法具有重要意义。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法具有操作简便、设备需求简单、快速、灵敏和特异等独有的优势,非常适于基层使用。本研究通过在反应液中引入染料,实现了RT-LAMP结果的直接肉眼可视化判断,建立了FMDV可视化RT-LAMP检测方法,为口蹄疫的现场检测提供了便利。首先对FMDV的A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3这七个血清型的基因组进行序列分析,选择高度保守的3D聚合酶基因作为RT-LAMP扩增靶区域。通过3D序列同源性分析,选择39条3D基因（3′端500bp）序列,在5′端引入T7启动子,合成后以Amp+的pUC57为载体进行重组。重组质粒（3D-T7pUC57）经鉴定正确后,用于后续试验。鉴于FMDV为RNA病毒,所以,以3D-T7pUC57质粒相应的RNA转录本为模板建立可视化RT-LAMP检测方法。通过对RT-LAMP引物、引物浓度、反应时间和反应温度、以及显色剂（羟基萘酚蓝、钙黄绿素、SYBR green I、中性红、酚红和溴百里酚蓝）的系统系列筛选,建立了FMDV可视化RT-LAMP检测方法。RT-LAMP的总反应体系20μL,包括RT-LAMP缓冲液15.2μL,Bst AMV酶混合液1.5μL,外引物F3和B3各0.04μL（100μM）,内引物FIP和BIP各0.5μL（100μM）,环引物Floop和Bloop各0.11μL（100μM）,中性红1μL（500μM）,模板1μL。反应时间55 min,反应温度65℃。反应结束后,若反应管溶液变为粉红色判为阳性,若为橘黄色则判为阴性。交叉反应实验表明FMDV可视化RT-LAMP不与BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV和PCV3等病毒发生反应,具有良好的分析特异性。以10倍倍比稀释的RNA转录本为模板进行分析敏感性检测,并与OIE推荐的检测方法进行比较,结果表明RT-LAMP检出限为104拷贝/μL,RT-q PCR和RT-PCR方法检出限分别为103和104拷贝/μL。采用FMDV可视化RT-LAMP检测39份代表7种FMDV血清型的3D RNA转录本和59份临床样品,并与RT-q PCR和RT-PCR进行比较,结果表明RT-LAMP方法的阴、阳性检出率为100%和95.7%。对6份临床样品10倍倍比稀释后进行检测,结果表明RT-LAMP与RT-PCR检出限相近,相当于RT-q PCR CT值为32.5时检出的病毒含量。本研究成功地建立了FMDV可视化RT-LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性。操作简便,设备需求简单（恒温热块）,结果直接肉眼观察判断,能够满足基层现场检测需求,具有良好的应用前景。
姚亚文[3]（2021）在《基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是一种寄生于鸡肠道危害严重的寄生虫病。目前,该病主要依赖于药物防治,药物的长期广泛使用导致鸡球虫出现严重耐药性。为研究鸡球虫耐药性产生的分子机制,本研究对柔嫩艾美耳球虫敏感株（DS）和盐霉素耐药株（SMR）进行全基因组重测序,利用选择性清除方法筛选出可能与盐霉素耐药相关的候选基因,并对3个耐药相关基因（柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35（EtCHP35）、柔嫩艾美耳球虫保守蛋白40（EtCHP40）和柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG））的特性进行了初步分析。1.全基因组重测序与选择性清除筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药相关基因本研究对柔嫩艾美耳球虫10株药物敏感株、3株实验室诱导的盐霉素耐药株和15株单卵囊分离的田间盐霉素耐药株进行了全基因组重测序分析,结果显示样品数据量均在1?Gb以上,Q20≥95%、Q30≥90%,与参考基因组比对结果显示比对率均高于82%,测序深度均大于14%,覆盖度（4×）均高于92%。利用选择性清除方法对柔嫩艾美耳球虫药物敏感株和盐霉素耐药株重测序结果进行分析,获得73个在敏感株受选择基因,共1221个SNPs位点,其中81个SNPs属于非同义突变;获得148个在盐霉素耐药株受选择基因,共2545个SNPs位点,其中118个SNPs位点属于非同义突变。GO富集分析结果显示,敏感株候选基因主要参与生物过程和分子功能,盐霉素耐药株候选基因主要参与生物代谢过程。KEGG通路分析结果显示,敏感株候选基因主要参与吞噬体、氧化磷酸化和新陈代谢等通路,盐霉素耐药株候选基因主要参与吞噬体,新陈代谢等通路。将选择性清除的候选基因与转录组结果关联分析,获得共有基因14个,这些基因主要参与核糖体和ATP转运等通路。2.3个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊c DNA第一链为扩增模板,成功克隆了EtCHP35,EtCHP40和EtSAG的ORF序列。对氨基酸序列分析显示,三个蛋白均无跨膜结构,有多个蛋白酶磷酸化位点,其中EtCHP35含一个逆转录酶位点,EtCHP40含一个天冬氨酸蛋白酶活性位点,EtSAG含一个信号肽,一个苏氨酸富集区,属于表面抗原家族（SAG family member）。成功构建原核重组表达质粒并诱导表达了三个重组蛋白（r EtCHP35,r EtCHP40和r EtSAG）,并制备了相应的抗体。3.3个耐药相关基因特性分析间接免疫荧光定位结果显示EtCHP35和EtCHP40主要分布在子孢子的表面和顶端,EtSAG主要分布在子孢子和第二代裂殖子的表面。体外抑制实验结果显示这3个蛋白与子孢子入侵宿主细胞无关。利用实时荧光定量PCR,对3个基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株（耐药株和敏感株）的mRNA转录水平进行分析,结果显示EtCHP35和EtSAG基因在敏感株孢子化卵囊阶段的mRNA转录水平最高,EtCHP40基因在第二代裂殖子阶段高表达。与敏感株相比,EtCHP35基因的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株和盐霉素耐药株第二代裂殖子阶段上调;EtCHP40基因在3株耐药株（地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株）第二代裂殖子阶段均上调,且在马杜拉霉素耐药株的转录水平显着高于其他耐药株;EtSAG基因的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株上调,在盐霉素和地克珠利耐药株的转录水平下调。且在不同浓度的盐霉素作用下,EtCHP35和EtCHP40的mRNA转录水平随着药物浓度的升高而升高。上述结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫耐药性产生的分子机制及建立田间鸡球虫耐药性快速检测方法提供了一定的基础。
吴翠[4]（2021）在《农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究》文中提出核酸扩增检测技术具有灵敏度高、特异性强等优点,在农产品安全检测领域发挥着越来越重要的作用。目前基于核酸扩增检测技术的系统普遍以实验室应用为主,存在检测耗时、体积大、成本高等缺点,不宜用于现场检测,严重限制了该技术的推广应用。本文针对快速双温PCR技术、环介导等温扩增技术以及数字核酸扩增技术,研究开发了基于这三种新型技术的核酸快速扩增和荧光检测便携式系统,以两种典型的农产品病原体（大肠杆菌和柑橘黄龙病菌）为检测对象,实现目标物的快速检测。本文主要研究内容及结果如下:（1）为了实现农产品病原体的快速定性分析,研制了一套快速双温PCR可视化检测系统,包括一台快速双温核酸扩增装置和一台便携式温控荧光可视化检测装置。构建了单一电机驱动的摇杆式双温区自动切换装置实现核酸的快速扩增,使得每个PCR循环中待测样品在双温区之间的转移时间小于1 s。针对形态各异的商业化PCR扩增样品容器,设计了适用于常规0.2 m L PCR管、罗氏玻璃毛细管和柔性毛细管的样品固定盘,提高了双温PCR可视化检测系统的通用性。以0.2 m L PCR管和罗氏玻璃毛细管为例,通过理论模拟和实验验证的方法评估了这两种样品容器在高速运动下的快速热传导效果,选用具有良好导热性的罗氏玻璃毛细管作为后续实验样品容器,其管内试剂最大升降温速率可达30℃/s。研究开发了一个便携式温控荧光可视化检测装置,避免了核酸开盖检测造成气溶胶污染等问题。该系统可在4 min内完成大肠杆菌DNA的快速可视化检测,且检测限与传统三温PCR一致,均为10 fg/μL。结果表明,该系统在农产品病原体核酸快速检测中展现出一定的应用潜力。（2）为了进一步实现农产品病原体的现场相对定量分析,提高系统的便携性和检测准确性,构建了可用于现场的便携式核酸扩增及荧光检测系统,包括便携式核酸扩增及荧光检测仪器样机（IF-Device）、一个无源试剂存储盒和一套现场核酸提取设备。该系统具有无源试剂存储、现场核酸提取、精确等温扩增、实时荧光检测等功能。IF-Device具有较强的抗光干扰特性,在三种不同光强（室外太阳光直射、室内白天日光灯照射、室内黑盒子）环境中,荧光信号数值变异系数（CV）均小于1%;较高的检测灵敏度,与进口PCR仪器Quant Studio 3比对结果表明,两者对荧光素钠检测灵敏度相当（检测限为1 n M）;良好的控温精度,设定值为65℃时控温误差只有0.31%,确保适宜的扩增环境和荧光检测信号的稳定。开发的无源环保试剂存储盒在高温（35℃）环境下,内部试剂温度能持续保持在4℃以下长达8 h,确保现场检测的可靠性。与进口仪器Quant Studio 3对标结果表明,本系统对大肠杆菌DNA和柑橘黄龙病菌检测限分别是10 pg/μL和0.2 pg/μL。对柑橘叶片中黄龙病菌的现场检测性能进行评估,该系统从核酸提取至输出检测结果整个过程可在40min内完成。以40个叶片样本为评估对象,该系统的阳性检出率与Quant Studio 3结果一致。研究表明,该便携式系统可适用于农产品病原体的现场快速筛查。（3）为了更进一步实现多种农产品病原体的绝对定量分析,设计了集手动样本分配、核酸扩增和产物检测于一体的双重数字LAMP微流控芯片,实现目标物的快速绝对定量检测。所构建的PDMS-玻璃微流控芯片包括液滴生成区和液滴存储区,总计64个并行出口以提高液滴生成速率,25μL样品可在2 min内完成分配。该芯片对离散相（核酸样品）流速具有较高的鲁棒性,当流速从100μL/hr增加到900μL/hr时,得到液滴的直径均在88-90μm区间内,为手动分配样品提供可能,摆脱了传统样品分配过程对精密设备的依赖。为了实现双重数字LAMP检测,采用荧光探针法进行产物检测。以大肠杆菌为研究对象,在所设计的微流控芯片上可实现DNA浓度从19.8到1980 copies/μL的数字LAMP检测,检测限为19.8 copies/μL（2.5 pg/μL）。采用两种不同波长的荧光基团分别对大肠杆菌DNA和λ噬菌体DNA的LAMP引物FIP进行修饰,实现两者同时绝对定量检测;在不同浓度的大肠杆菌DNA存在的情况下,相同λ噬菌体DNA浓度的测量值几乎保持一致,CV仅为4.54%。研究表明,该微流控芯片可为研发简便快速的便携式数字核酸检测系统提供硬件支持。
于园超[5]（2021）在《蛋白磷酸酶NIF4在恶性疟原虫红内期生长发育中作用机制的研究》文中研究说明目的:全球疟疾发生率和致死率严峻,传统的抗疟药物已不足以起到防治作用。青蒿素是抗疟疾使用最广泛的化合物,在全世界范围内的疟疾治疗中起着关键作用。PfNIF4蛋白是一种恶性疟原虫NLI相互作用样蛋白磷酸酶,其与FCP/SCP家族成员均具有催化RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ）的羧基末端结构域（carboxy-terminal domain,CTD）的“DxDx（T/V）”基序,且参与调控RNA转录。近年来RNAPⅡ参与调控var基因的转录机制已成为恶性疟原虫逃避宿主免疫的研究热点。同时,全基因组关联分析发现PfNIF4蛋白的Y1133N和V1157L位点突变与青蒿素抗药性高度相关。鉴于PfNIF4蛋白在恶性疟原虫生长发育及其青蒿素抗药性中的潜在作用,本研究拟通过分子生物学方法检测PfNIF4蛋白在疟原虫生长周期中的的表达和定位,以及在疟原虫红内期生长发育中的作用机制,并初步探讨PfNIF4蛋白与青蒿素抗药的相关性,以期为疟疾防治提供新的作用靶点。方法:本研究采用生物信息学分析,预测PfNIF4蛋白的结构、功能及其红内期定位情况。采用间接免疫荧光及免疫印迹技术检测PfNIF4蛋白在红内期和配子体阶段的定位与表达情况。采用CRISPR-Cas9及Glm S riboswitch技术构建PfNIF4蛋白敲减虫株(NIF4 inducible knockdown strain,NIF4iKD)。通过敲减PfNIF4蛋白,评估恶性疟原虫红内期生长发育,增值率,裂殖体侵袭和配子体发育情况。采用Quantitative RT-PCR鉴定PfNIF4蛋白敲减后,侵袭相关基因表达水平的变化。通过使用磷酸化抗体,检测PfNIF4蛋白敲减后,RNAPⅡ蛋白CTD结构域中七肽重复序列“YSPTSPK”第2和5位点（Ser2/5）磷酸化水平的改变。通过IC50方法检测,PfNIF4蛋白敲减后,疟原虫对双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）,青蒿琥酯（artesunate,AS）,蒿甲醚（artemether,AM）和甲氟喹（mefloquine,MFQ）的药物敏感性变化。实验数据采用Prism进行分析,P>0.05具有统计学意义。结果:1、生物信息学分析发现PfNIF4属于FCP/SCP家族成员,具有保守的CPDc结构域（catalytic domain of ctd-like phosphatases,CPDc）,且包含“DxDx（T/V）”基序。蛋白定位预测显示:PfNIF4蛋白定位于疟原虫的细胞核和/或细胞浆中。2、基因型PCR和Western blot实验结果提示,成功构建并筛选出NIF4iKD#C6虫株。Western blot实验结果显示PfNIF4蛋白在红内期和配子体阶段均有表达,且在裂殖体阶段表达水平达峰值。IFA显示:PfNIF4蛋白在红内期阶段定位于恶性疟原虫的细胞核（Pearson’s相关系数,0.49-0.66）,在雄配子体阶段定位于细胞浆（Pearson’s相关系数,0.07）。3、采用2.5 m M GLcN处理NIF4iKD#C6,可以显着降低PfNIF4蛋白表达水平（P<0.01）。红内期表型分析显示,PfNIF4蛋白敲减时,其在红内期原虫血症下降约35%。当PfNIF4蛋白表达量降低时,恶性疟原虫的红内期生长发育受到抑制,增值率由8.78±1.05降至5±1,其环状体生成量从5.99%±0.72%IEs降至2.55%±0.46%IEs。4、PfNIF4蛋白敲减时,配子体生成率在第6天开始下降（P<0.05）,但雄/雌配子体比率不变。5、当PfNIF4蛋白表达量下降时,参与裂殖子侵袭相关基因ron2、ron4、ron5、ron6、ron12、ama1、rhoph2、rhoph3、msp4、msa180和eba175下调。6、PfNIF4蛋白敲减上调七肽重复序列“YSPTSPK”中Ser2/5磷酸化水平约1.2倍。7、当PfNIF4蛋白敲减时,疟原虫对4种青蒿素相关药物敏感性显着上调。结论:1、PfNIF4蛋白与FCP/SCP家族成员均具有“DxDx（T/V）”基序。2、PfNIF4蛋白在环状体、滋养体、裂殖体和配子体阶段均有表达,且主要定位在疟原虫的细胞核中。3、PfNIF4蛋白表达下调对疟原虫增值具有一定的抑制作用,并且上调了对抗疟药物的敏感性,其机制与参与侵袭相关基因的转录水平及其磷酸化RNAPⅡ的CTD水平有关。
骈红茹,杨明珠,郑直[6]（2020）在《捕获和连接的环介导等温扩增技术》文中提出目的建立捕获和连接的环介导等温扩增（CLIP-LAMP）技术,为医学诊断和病原体检测提供新的技术手段。方法根据靶标DNA或RNA序列设计特异性的捕获探针和具有茎环结构的检测探针。无需核酸提取,直接裂解全血和干血片等样本后,通过捕获探针将靶核酸固定于96孔板上。检测探针进行特异性的连接反应,形成扩增模板,进行荧光定量的环介导等温扩增反应。将此方法应用于疟疾的检测中,定量检测疟原虫的18S rRNA,评估方法的灵敏度、特异性和重复性,并将其应用于临床样本的检测。结果此法具有较高的灵敏度和特异性,可检测到低至0.01个/μL的疟原虫,较传统的镜检和RDT灵敏度高,可准确检测到疟原虫的感染样品。此方法可在4 h内完成96个样本的检测,快速高效。结论建立了一种捕获和连接的等温扩增技术,为疾病的分子诊断和基因筛查提供了新的灵敏、高效的方法。
李玉玲[7]（2020）在《大湄公河次区域间日疟原虫遗传多样性和群体遗传学研究》文中研究指明背景:东南亚大湄公河次区域已制定到2030年彻底消除疟疾的目标。近年来该地区疟疾的发病率明显下降,但间日疟感染所占的比例明显增加,疟疾的传播主要集中于边境地区,输入性疟疾已经成为疟疾传播的主要来源。因此,深入了解间日疟原虫的传播动力学特征,比较实施疟疾控制措施前后间日疟原虫群体结构的变化,能够为制定针对性的疟疾控制策略提供理论依据。方法:应用10个微卫星分子标记对206个来自大湄公河次区域边境地区不同年份的间日疟原虫样本进行基因型分析,其中2004年中缅边境地区样本50例;2016年中缅边境地区样本52例;2012年泰国西部泰缅边境地区样本50例;2015年泰国西部泰缅边境地区样本54例,以评价中缅边境和泰缅边境地区间日疟原虫群体的遗传多样性和种群结构变化。结果:1.在强化的疟疾控制策略下,中缅边境和泰国西部泰缅边境地区间日疟原虫种群的遗传多样性水平仍然较高（HE=0.66-0.86）。中缅边境地区,2004年间日疟原虫种群的期望杂合度为0.76,2016年间日疟原虫种群的期望杂合度下降至0.66;而在泰缅边境地区,间日疟原虫种群的期望杂合度由2012年的0.80升高至2015年的0.86。4个间日疟原虫种群多克隆感染的比例差异显着（P<0.05）,在中缅边境地区,2004年间日疟原虫种群的多克隆感染比例为48%,2016年间日疟原虫种群的多克隆感染比例下降至30.7%（P<0.05）;在泰缅边境地区,2012年间日疟原虫种群的多克隆感染比例为40.0%,2015年间日疟原虫种群的多克隆感染比例下降至23.7%（P<0.05）。感染复数（MOI）同样呈现下降趋势。随着大湄公河次区域疟疾发病率的下降,间日疟原虫种群多位点连锁不平衡现象更加显着,表明间日疟原虫种群存在明显的空间聚类。2.中缅边境和泰国西部泰缅边境地区的4个间日疟原虫种群存在明显的遗传分化;在中缅边境和泰缅边境地区,不同年份的间日疟原虫种群间存在明显的遗传分化,在中缅边境地区,2004年间日疟原虫种群与2016年间日疟原虫种群间遗传分化系数(FST)为0.081;在泰缅边境地区,2012年间日疟原虫种群与2015年间日疟原虫种群间遗传分化系数为0.133。2004年中缅边境地区与2016年中缅边境地区以及2012年泰缅边境地区间日疟原虫种群间存在一定程度的聚类,表明这些间日疟原虫种群可能来源于共同的祖先。2015年泰缅边境地区间日疟原虫种群与其他间日疟原虫种群遗传分化明显,表明可能存在种群替换。2004年中缅边境地区间日疟原虫有效群体大小为4979,2016年中缅边境地区间日疟原虫有效群体大小下降为3052。泰缅边境地区间日疟原虫有效群体大小由6289升高至10259。3.本研究应用中缅边境、泰缅边境、中国安徽地区间日疟样本,创建了具有较高地理起源预测能力的微卫星面板,该微卫星面板应用较少数目的位点即可对间日疟原虫种群进行溯源检测,确定间日疟感染的地理起源,能够简便、快速实现对间日疟的流行病学监测,锁定感染源,为进一步制定针对性的控制策略提供理论依据和重要的基线信息。结论:大湄公河次区域实施强化的疟疾控制措施后,中缅边境和泰缅边境地区间日疟原虫种群存在明显的时间和空间遗传分化;但是间日疟原虫种群仍存在较高水平的遗传多样性。大湄公河次区域中缅边境和泰缅边境地区间日疟原虫种群的群体遗传学研究为该地区间日疟原虫的流行病学监测提供了理论依据。加强对中缅边境和泰缅边境地区间日疟原虫种群的流行病学监测,进而制定针对性的疟疾控制策略,对实现消灭疟疾的目标具有重要意义。
杨英超[8]（2019）在《利用CRISPR/Cas9技术建立删除Pfhrp2基因恶性疟原虫参考虫株及其对快速诊断试剂的影响研究》文中指出疟疾（Malaria）是全球广泛关注的重要公共卫生问题之一。该病是由蚊虫叮咬后子孢子（Sporozoites）进入人体从而引起疾病,可引起人类患病的疟原虫包括恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodiumvivax）、三日疟原虫（Plasmodium malarial）、卵形疟原虫（Plasmodium ovale）和诺氏疟原虫（Plasmodium knowlesi）。其中,恶性疟原虫致病力和危害最为严重,非洲大约99.7%的疟疾病例是由恶性疟原虫所导致的。根据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）疟疾报告,2017年全世界有2.19亿疟疾病例。在疟疾流行地区,某些病人在没有感染疟原虫的情况下可患有“疟疾样”发热,从而可导致错误使用抗疟药进行治疗。为防止抗疟药物滥用,世界卫生组织建议所有疑似疟疾病例的患者在使用抗疟药进行治疗之前需要使用显微镜或快速诊断试剂（Rapid diagnostic reagents,RDTs）来确诊。RDTs是采用双抗体夹心法原理定性检测人血中组氨酸富集蛋白2（Histidine-rich protein2,HRP2）用于恶性疟原虫的诊断。如果血样中含有HRP2抗原,将与金标抗HRP2抗体反应形成复合物,在层析作用下,被预先固定在膜上的抗HRP2抗体捕获,在检测区形成一条紫红色条带,此为阳性结果。由于RDTs操作简单,使用方便,成本低,结果可信而在全世界范围内被广泛应用。据WHO估算,2016年全球共交付3.12亿份RDTs,其中2.69亿份RDTs被在非洲地区使用。2010年在秘鲁亚马逊地区首次报道发现缺失Pfhrp基因的恶性疟原虫株。随后,在巴西、马里、塞内加尔和印度均有报道发现了缺失Pfhrp2基因的野生株。再有,位于恶性疟原虫PF3D7的13号染色体的Pfhrp3基因也富含组氨酸序列,因而其对于主要检测恶性疟原虫PfHRP2抗原的RDTs可能具有辅助作用。鉴于PfHRP2蛋白的有无,大小和所含的特征性重复序列存在诸多变异并可影响快速诊断试剂,因此获得缺失或删除Pfhrp基因的恶性疟原虫以便考核与评价以HRP2为基础的RDTs,基于考核结果对以HRP2为基础的RDTs提出建议。由于收集的恶性疟原虫感染者的血液样本中未发现缺失Pfhrp2基因的虫株,且随着基因编辑技术尤其是 CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9）方法取得的极大进步,有鉴于此,本课题组选择遗传背景清楚的恶性疟原虫国际标准株PF3D7,采用CRISPR-Cas9方法来特异性删除该恶性疟原虫国际标准株的hrp基因外显子2（exon 2）区域,包括设计了一个含有特异性sgRNA（single guide RNA）和重组同源臂及一个含有Cas9核酸内切酶共计两个质粒,电转化入疟原虫后,sgRNA可将Cas9酶靶向至Pfhrp2基因从而产生缺口诱发同源重组,经药物筛选后获得基因删除的疟原虫。随后提取转基因疟原虫的基因组DNA进行聚合酶链式反应,基因测序,蛋白免疫印迹（Western blot,WB）和Southern印迹（Southern blot）等试验证明了Pfhrp2 基因被从恶性疟原虫基因组删除,成功获得了删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫参考虫株。使用删除Pfhrp2的恶性疟原虫来考评已经获得国家药品监管机构批准的用于快速诊断恶性疟原虫感染的基于HRP2的RDTs。检测结果发现,若血液中含有删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫低于1000个虫/微升,则基于HRP2的RDTs不能检测出恶性疟原虫感染。若血液中删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫大于等于1000寄生虫/微升,则基于HRP2的RDTs仍可检出恶性疟原虫感染。为了深入研究在删除Pfhrp2基因后,应用以HRP2为基础的RDTs仍可检出患者感染恶性疟原虫这一疑问,本课题组重组表达了与HRP2高度同源的HRP3（Histidine-rich protein 3,HRP3）蛋白来开展研究。WB试验结果表明,无细胞蛋白表达系统成功制备了HRP3蛋白,证明了 HRP3蛋白可与识别HRP2蛋白的单克隆抗体结合,证实了HRP3蛋白的辅助诊断作用。综上所述,试验结果证实使用CRISPR-Cas9方法可在实验室建立删除Pfhrp2基因且遗传背景清楚的恶性疟原虫参考虫株;使用基因删除虫株考核基于HRP2的RDTs时,若恶性疟原虫的染虫率较低时,基于HRP2的RDTs可产生假阴性结果;若恶性疟原虫的染虫率较高时,基于HRP2的RDTs检测仍可获得阳性结果,可能的原因是HRP3辅助诊断恶性疟原虫感染。基于这些结果,恶性疟原虫流行区仍可继续使用基于HRP2的RDTs进行疾病诊断,若出现疑似假阴性的检测结果,应联合使用可检测其它抗原的RDTs再次检测以避免做出错误诊断。
张翠[9]（2018）在《约氏疟原虫CRISPR/Cas9技术的建立和ApiAP2转录因子家族基因功能分析》文中研究说明疟疾是由疟原虫感染导致的疾病,目前仍然是严重的全球公共卫生负担。虽然疟原虫基因组已经完成测序,但是多数基因的功能仍然未知。迄今为止,疟原虫基因功能研究依然缺乏高效的分析工具。新兴的基因编辑技术——规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）和Cas9核酸蛋白酶系统（CRISPR/Cas9）,已成功应用到多个物种的基因组编辑和修饰。本工作中,我们利用疟疾模型—鼠约氏疟原虫,建立了基于CRISPR/Cas9技术的单基因和多基因的修饰系统。首先,我们构建了单质粒表达系统pYC,实现了 Cas9蛋白、sgRNA和同源重组模板的共同导入。Cas9/sgRNA在基因组特异位点精确产生DNA双链断裂,然后通过同源修复,实现了三种常用类型的基因修饰。我们实现了 100%效率的基因敲除（Pysera2,PyPDH/E1α）,22%-45%效率的基因加标签（PY03652）和核苷酸替换（Pyhsp70）。pYC系统修饰后虫株因为有质粒残留,不能进行下一轮的遗传修饰。针对疟原虫基因功能研究中多基因修饰的技术需求,在pYC质粒基础上,引入负筛选基因——胞嘧啶脱氨酶和尿苷磷酸转移酶双功能酶（yfcu）,和正筛选基因——人二氢叶酸还原酶（hdhfr）融合表达,建立了 pYCm单质粒系统。通过乙胺嘧啶正筛选和5氟胞嘧啶负筛选的顺序操作,可以获得没有细胞内质粒残留的基因修饰虫株。通过pYCm系统,我们首先给内源基因Pyp28加了mCherry标签,进一步在Pyp28::mCherry虫株上敲除了动合子运动相关基因Pyctrp和Pycdpk3。CRISPR/Cas9技术的建立为疟原虫基因功能研究提供了高效工具。疟原虫生活史包括哺乳动物和按蚊两个宿主的多个发育阶段,每一个发育阶段都有独特的基因表达。令人意外的是,除了和植物中Apetala2转录因子类似的转录因子家族ApiAP2,疟原虫缺乏真核生物普遍存在的转录因子种类。虽然已知某些ApiAP2基因对于疟原虫发育有影响,但是仍有很多基因功能尚未阐明。我们系统地分析了约氏疟原虫中PyApiAP2的基因功能。利用CRISPR/Cas9技术的pYC质粒或者pYCm质粒系统,我们对26个PyApiAP2基因家族成员中的24个进行了尝试敲除,其中12个可以获得敲除克隆。然后对敲除克隆进行了全生活周期的表型分析,12个成功敲除的基因有10个在有性期和蚊期发育有功能,有两个基因之前在任何种属疟原虫中都没有研究过,它们是Pyap2-g3（PY17X1417400）和Pyap2-o5（PY17X1317000）。有 7 个基因成功加了标签,蛋白表达分析显示出和功能的一致性。我们给PyAP2-G3在N端融合了 6×HA标签,发现它大部分在细胞质中定位,少量在细胞核中定位。红细胞期和配子体时期都是类似的情况;同样的,我们也给PyAP2-05加了 6×HA标签并通过间接免疫荧光检测蛋白表达,PyAP2-05在裂殖体时期主要是细胞核定位,少量胞质定位,在配子体、合子和发育中的动合子都是完全细胞核定位,在成熟动合子中不表达（或者是表达量低检测不到）。另外,有两个基因（PY17X0523100和PY17X1323500）可以被成功敲除,但是没有发现表型缺陷,基因敲除虫株可以完成整个生活史。PY17X0523100在伯氏疟原虫的同源基因没有被成功敲除。我们的工作首次在约氏疟原虫中对PyApiAP2基因家族进行了系统地功能研究,揭示了疟原虫在有性阶段和蚊期传播的关键PyApiAP2,为深入理解转录因子介导的疟原虫基因表达调控提供了新角度。
宋观波,徐超,李瑾,孙慧,魏庆宽,黄炳成[10]（2018）在《分子生物学技术在疟疾诊断中的应用与展望》文中认为疟疾与艾滋病、结核是世界公认的危害人类生命健康的三大公共问题之一。世界卫生组织报告,2016年全球还有44.5万人死于疟疾,疟疾的早期快速诊断对于及时治疗感染病例,降低死亡率,显得尤为重要。疟原虫诊断主要分为病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断。传统病原学诊断是疟疾诊断公认的"金标准",但是在实际的临床应用中,病原体检测较为费时费力,且受专业镜检人员匮乏,临床经验等因素限制,容易造成漏诊和误诊,已远不能满足疟疾防治工作的需要。免疫学诊断主要采用检测抗原、抗体的血清学方法,由于可用于检测的特异性抗原较少、抗原抗体反应的干扰因素较多,血清抗体产生的时间较长等因素,使疟疾诊断的准确性和及时性上还有待提高。进入21世纪,随着核酸探针、聚合酶链反应、环介导等温扩增技术、下一代测序技术等的应用,为疟原虫的实验室检测提供了新的途径,表现出了越来越高的敏感度和特异度。本文就分子生物学技术在疟疾诊断领域中的应用与展望作一综述。
二、荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究（论文提纲范文）
（1）等温扩增技术在疟原虫及巴贝虫检测中的应用（论文提纲范文）
| 1 常见等温扩增技术原理及应用 |
| 1.1 环介导等温扩增技术与应用 |
| 1.2 重组酶聚合酶扩增技术与应用 |
| 1.3 重组酶介导的等温扩增技术与应用 |
| 1.4 依赖解旋酶等温扩增技术与应用 |
| 2 前景与展望 |
（2）口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的初步建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口蹄疫与口蹄疫病毒 |
| 1.2 口蹄疫流行现状与防控 |
| 1.3 FMDV诊断技术 |
| 1.4 环介导等温扩增技术及应用 |
| 1.4.1 LAMP简介 |
| 1.4.2 LAMP扩增原理 |
| 1.4.3 LAMP反应体系和产物检测 |
| 1.4.4 LAMP的发展及应用 |
| 1.5 目的与意义 |
| 第二章 口蹄疫病毒目的基因3D片段的筛选、合成与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂与溶液配制 |
| 2.1.2 生物信息学软件 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 FMDV七种血清型目的片段序列筛选与合成 |
| 2.2.2 FMDV七种血清型39 个甘油菌扩大培养及质粒DNA提取 |
| 2.2.3 重组质粒的PCR扩增鉴定及测序鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 FMDV七个血清型序列筛选结果 |
| 2.3.2 FMDV七种血清型甘油菌扩大培养及质粒DNA提取 |
| 2.3.3 FMDV七个血清型序列PCR鉴定及测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 FMDV可视化 RT-LAMP检测方法的建立及优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 主要生物试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 RNA模板制备 |
| 3.2.3 RT-LAMP方法引物筛选 |
| 3.2.4 RT-LAMP方法引物含量优化 |
| 3.2.5 RT-LAMP方法反应时间优化 |
| 3.2.6 温度优化 |
| 3.2.7 RT-LAMP方法染料的筛选 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 模板制备 |
| 3.3.3 RT-LAMP引物筛选结果 |
| 3.3.4 RT-LAMP方法引物浓度筛选结果 |
| 3.3.5 时间优化结果 |
| 3.3.6 温度优化结果 |
| 3.3.7 RT-LAMP方法染料的筛选结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 RT-LAMP方法的特异性、敏感性检测及临床样品检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒和病毒 |
| 4.1.2 主要生物试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 特异性测定 |
| 4.2.2 敏感性测定 |
| 4.2.3 临床样品的检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 交叉反应验证 |
| 4.3.2 敏感性检测 |
| 4.3.3 临床样品的检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗球虫药 |
| 1.1.1 聚醚离子载体类抗球虫药 |
| 1.1.2 化学合成类抗球虫药 |
| 1.2 鸡球虫耐药性产生的原因 |
| 1.2.1 遗传因素 |
| 1.2.2 药物选择压力 |
| 1.2.3 生物学因素 |
| 1.3 鸡球虫耐药性的研究现状 |
| 1.4 其他顶复门原虫耐药性的研究现状 |
| 1.5 全基因组重测序 |
| 1.6 选择性清除 |
| 1.7 展望 |
| 第二章 全基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药相关基因 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 试验药物 |
| 2.2.4 实验试剂 |
| 2.2.5 实验仪器 |
| 2.2.6 子孢子的收集与纯化 |
| 2.2.7 基因组重测序 |
| 2.2.8 选择性清除分析结果与转录组测序结果的关联分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 虫体的收集与纯化 |
| 2.3.2 DNA的提取检测 |
| 2.3.3 质控结果 |
| 2.3.4 样品与参考基因组比对结果 |
| 2.3.5 基于Hp&Fst的选择消除分析结果 |
| 2.3.6 候选基因SNP位点的分布 |
| 2.3.7 基因功能富集分析 |
| 2.3.8 与转录组的关联分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 3 个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物和实验虫株 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 试验仪器 |
| 3.2.4 敏感株孢子化卵囊的收集与纯化 |
| 3.2.5 cDNA第一链模板的制备 |
| 3.2.6 基因克隆 |
| 3.2.7 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因的克隆 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 3个耐药相关基因功能特性的初步分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物与细胞 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 实验虫株的收集与纯化 |
| 4.2.6 cDNA模板的制备 |
| 4.2.7 重组表达质粒的构建 |
| 4.2.8 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.2.9 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.10 重组蛋白的反应原性分析 |
| 4.2.11 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.12 实时荧光定量PCR |
| 4.2.13 间接免疫荧光定位 |
| 4.2.14 体外抑制实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组表达质粒的构建 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 4.3.4 重组蛋白的反应原性分析 |
| 4.3.5 3个基因在DS不同发育阶段的mRNA转录水平 |
| 4.3.6 三个蛋白在DS虫体上的定位分析 |
| 4.3.7 三个多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验 |
| 4.3.8 3个基因在不同耐药株和敏感株的转录水平分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 食源性致病菌及其检测技术 |
| 1.1.2 柑橘黄龙病菌及其检测技术 |
| 1.2 核酸扩增检测技术 |
| 1.2.1 快速双温PCR技术 |
| 1.2.2 环介导等温扩增技术 |
| 1.2.3 数字核酸扩增技术 |
| 1.3 核酸扩增和荧光检测系统的研究 |
| 1.3.1 核酸扩增和荧光检测系统概述 |
| 1.3.2 商业化核酸扩增检测系统 |
| 1.3.3 核酸扩增检测系统的国内外研究进展 |
| 1.4 国内外研究中尚存在的问题 |
| 1.4.1 快速PCR系统 |
| 1.4.2 便携式实时等温核酸检测系统 |
| 1.4.3 数字LAMP检测系统 |
| 1.5 研究目的、内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究目的和内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 快速双温PCR系统及荧光可视化检测方法建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 系统功能 |
| 2.3 系统设计 |
| 2.3.1 系统结构设计 |
| 2.3.2 系统硬件设计 |
| 2.3.3 系统软件设计 |
| 2.4 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 2.4.1 材料和试剂 |
| 2.4.2 仪器设备 |
| 2.4.3 实验方法 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 快速双温PCR装置性能评估 |
| 2.5.2 可视化荧光检测装置可行性评估 |
| 2.5.3 快速双温PCR扩增及可视化系统在大肠杆菌检测中的应用 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 单重实时荧光便携式等温检测系统研究及其应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 检测系统功能 |
| 3.3 检测系统设计 |
| 3.3.1 系统硬件设计 |
| 3.3.2 系统软件设计 |
| 3.3.3 系统外观设计 |
| 3.4 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 3.4.1 材料和试剂 |
| 3.4.2 仪器设备 |
| 3.4.3 系统性能评估方法 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 便携式系统性能评估 |
| 3.5.2 柑橘黄龙病Las型实际样品测量评估 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 双重数字等温扩增微流控芯片研究及其应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 微流控芯片研发 |
| 4.2.1 双重数字LAMP芯片功能 |
| 4.2.2 双重数字LAMP芯片设计 |
| 4.3 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 4.3.1 材料和试剂 |
| 4.3.2 仪器设备 |
| 4.3.3 芯片制作 |
| 4.3.4 系统评估方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 数字微流控芯片性能评估 |
| 4.4.2 数字LAMP检测体系的优化 |
| 4.4.3 双重数字LAMP微流控芯片在大肠杆菌检测中的应用 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（5）蛋白磷酸酶NIF4在恶性疟原虫红内期生长发育中作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验虫株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析网址及软件 |
| 2.2.2 NIF4~(iKD)虫株单克隆及鉴定 |
| 2.2.3 PfNIF4 蛋白的表达和亚细胞定位 |
| 2.2.4 PfNIF4 蛋白在红内期生长发育作用机制的研究 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测裂殖体阶段侵袭相关基因的转录水平 |
| 2.2.6 NIF4~(iKD)#C6中RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)CTD区的磷酸化水平检测 |
| 2.2.7 PfNIF4 蛋白在青蒿素及衍生物敏感性的影响实验 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 恶性疟原虫NIF4 蛋白的生物信息学研究 |
| 3.2 NIF4~(iKD)#C6 单克隆虫株鉴定 |
| 3.2.1 NIF4~(iKD)#C6 虫株PCR及 Western blot鉴定 |
| 3.2.2 NIF4~(iKD)#C6 虫株中葡萄糖胺对PfNIF4 重组蛋白敲减作用的鉴定 |
| 3.2.3 2.5 mM GLcN对亲本株3D7 生长发育无影响 |
| 3.3 PfNIF4 蛋白的表达和亚细胞定位 |
| 3.4 PfNIF4蛋白敲减后在红内期生长发育作用机制的研究 |
| 3.4.1 PfNIF4 蛋白敲减后在无性阶段生长发育的影响 |
| 3.4.2 PfNIF4 蛋白敲减后对裂殖子形成及侵袭能力的影响 |
| 3.4.3 PfNIF4 蛋白敲减后对配子体发育的影响 |
| 3.5 PfNIF4 蛋白敲减后对裂殖体阶段侵袭相关基因的转录水平的影响 |
| 3.6 PfNIF4蛋白敲减后对RNAPⅡ中CTD区的磷酸化水平的影响 |
| 3.7 PfNIF4 蛋白敲减后对部分青蒿素及衍生药物敏感性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性和自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 FCP/SCP蛋白磷酸酶家族成员功能作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）捕获和连接的环介导等温扩增技术（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品: |
| 1.1.2 主要试剂: |
| 1.2方法 |
| 1.2.1 样品的采集: |
| 1.2.2 捕获探针和检测探针的设计: |
| 1.2.3 标准品的准备: |
| 1.2.4 CLIP-LAMP实验方法: |
| 1.2.5 标准q-PCR: |
| 2 结果 |
| 2.1 CLIP-LAMP检测疟原虫的特异性分析 |
| 2.2 CLIP-LAMP检测疟原虫的灵敏度分析 |
| 2.3 CLIP-LAMP检测疟原虫的重复性分析 |
| 2.4 CLIP-LAMP在临床样本中的应用 |
| 3 讨论 |
（7）大湄公河次区域间日疟原虫遗传多样性和群体遗传学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 基于微卫星标记的间日疟原虫遗传多样性和群体遗传学研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样本采集 |
| 2.2 仪器和试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因组DNA提取 |
| 2.3.2 间日疟原虫虫种PCR确认 |
| 2.3.3 间日疟原虫微卫星基因分型 |
| 2.4 数据分析 |
| 2.4.1 微卫星基因型鉴定 |
| 2.4.2 多克隆感染分析 |
| 2.4.3 群体多样性分析 |
| 2.4.4 连锁不平衡分析 |
| 2.4.5 有效群体大小(Effective population size,Ne) |
| 2.4.6 瓶颈分析 |
| 2.4.7 群体遗传结构分析 |
| 2.4.8 主成分分析 |
| 2.4.9 系统进化分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 遗传多样性 |
| 3.1.1 等位基因个数 |
| 3.1.2 平均期望杂合度(H_E) |
| 3.1.3 等位基因丰度(A_R) |
| 3.1.4 单体型多样性 |
| 3.2 多克隆感染 |
| 3.3 有效群体大小 |
| 3.4 连锁不平衡 |
| 3.5 瓶颈分析 |
| 3.6 遗传分化 |
| 3.7 Mantel test分析 |
| 3.8 分子方差分析(AMOVA) |
| 3.9 群体结构分析 |
| 3.9.1 STRUCTURE分析 |
| 3.9.2 主成分分析 |
| 3.9.3 进化树分析 |
| 3.9.4 Network分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 大湄公河次区域间日疟原虫的传播动力学特征分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样本采集 |
| 2.2 仪器和试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因组DNA提取 |
| 2.3.2 间日疟原虫虫种PCR确认 |
| 2.3.3 间日疟原虫微卫星基因分型 |
| 2.4 数据分析 |
| 2.4.1 微卫星基因型鉴定 |
| 2.4.2 遗传多样性分析 |
| 2.4.3 连锁不平衡分析 |
| 2.4.4 群体遗传结构分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 遗传多样性 |
| 3.2 连锁不平衡 |
| 3.3 遗传分化 |
| 3.4 遗传结构分析 |
| 3.4.1 STRUCTURE分析 |
| 3.4.2 主成分分析 |
| 3.4.3 系统进化树 |
| 3.4.4 Network分析 |
| 3.5 区分间日疟原虫群体的微卫星面板 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）利用CRISPR/Cas9技术建立删除Pfhrp2基因恶性疟原虫参考虫株及其对快速诊断试剂的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究背景及意义 |
| 研究目标 |
| 研究内容及技术路线 |
| 第一阶段 |
| 第二阶段 |
| 第三阶段 |
| 第一部分 删除hrp2基因恶性疟原虫参考虫株的建立及验证 |
| 1 目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 删除hrp2基因恶性疟原虫L2图片 |
| 3.2 测序结果 |
| 3.3 恶性疟原虫3D7、L2虫株WB试验 |
| 3.4 Southem blot结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 对以HRP2为基础的RDTs的评价研究 |
| 1 目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 RDTs检测结果 |
| 3.2 评分结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 组氨酸富集蛋白2和组氨酸富集蛋白3无细胞表达和验证 |
| 1 目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白质的表达 |
| 3.2 Western blot结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 1 删除hrp2基因恶性疟原虫参考虫株的建立及验证 |
| 2 对以HRP2为基础的RDTs的评价研究 |
| 3 组氨酸富集蛋白2和组氨酸富集蛋白3无细胞表达和验证 |
| 结论 |
| 1 删除hrp2基因恶性疟原虫参考虫株的建立及验证 |
| 2 对以HRP2为基础的RDTs的评价研究 |
| 3 组氨酸富集蛋白2和组氨酸富集蛋白3无细胞表达和验证 |
| 文献综述 |
| 综述一 恶性疟原虫HRP2/3蛋白、国际标准品及RDTs性能测试 |
| 1 HRP2/3蛋白简介 |
| 2 RDTs简介 |
| 3 恶性疟原虫诊断试剂用国际标准品的建立 |
| 4 RDTs性能测试简介 |
| 综述二 基因编辑技术及其在疟原虫研究中的应用 |
| 1 背景 |
| 2 基于工程化核酸酶的基因编辑技术 |
| 3 Crispr/Cas9基因编辑技术 |
| 4 Crispr/Cas9基因编辑技术在疟原虫研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 HRPⅡ-L2-3-2质粒完整序列 |
| 2 pUF1-BSD-Cas9质粒完整序列 |
| 作者简介及发表的文章 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（9）约氏疟原虫CRISPR/Cas9技术的建立和ApiAP2转录因子家族基因功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疟疾 |
| 1.2 疟原虫的生活史 |
| 1.3 疟原虫的分子遗传学 |
| 1.4 CRISPR/Cas9技术在疟原虫领域的发展 |
| 1.5 疟原虫的配子体发育 |
| 1.5.1 配子体发生过程 |
| 1.5.2 配子体发生的相关基因 |
| 1.5.3 配子体发生的多层次调控 |
| 1.6 疟原虫的蚊期发育 |
| 1.6.1 配子发育和动合子形成 |
| 1.6.2 动合子穿越按蚊中肠上皮细胞 |
| 1.6.3 卵囊的发育 |
| 1.6.4 卵囊子孢子的释放 |
| 1.6.5 子孢子入侵按蚊唾液腺 |
| 1.7 疟原虫的转录调控 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 疟原虫CRISPR/Cas9单基因修饰方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 疟原虫虫株、实验小鼠以及按蚊 |
| 2.2.2 质粒的构建 |
| 2.2.3 疟原虫的电击转染 |
| 2.2.4 RNA的提取和RT-PCR |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.2.6 活细胞荧光观察 |
| 2.2.7 间接免疫荧光 |
| 2.2.8 流式细胞术 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 pYC质粒构建:Cas9和sgRNA的表达 |
| 2.3.2 基因敲除(knock out) |
| 2.3.3 基因加标签(knock in) |
| 2.3.4 核苷酸替换(nucleotide replacement) |
| 2.3.5 脱靶效应(off target)分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 本研究的创新点 |
| 2.4.2 本研究的优势 |
| 2.4.3 本研究的局限性 |
| 第三章 疟原虫CRISPR/Cas9多基因修饰方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 疟原虫虫株、实验小鼠以及按蚊 |
| 3.2.2 载体构建 |
| 3.2.3 疟原虫的电击转染 |
| 3.2.4 质粒的负筛选 |
| 3.2.5 红期生长曲线的测定 |
| 3.2.6 动合子的体外培养 |
| 3.2.7 动合子运动能力检测 |
| 3.2.8 mCherry荧光检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pYCm质粒构建:引入yfcu负筛选元件 |
| 3.3.2 pYCm和pYC比较:以Pyp28基因加mCherry标签为例 |
| 3.3.3 pYCm实现多基因顺序修饰 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 本研究的创新点 |
| 3.4.2 本研究的应用性 |
| 第四章 疟原虫转录因子ApiAP2家族基因的功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 疟原虫虫株、实验小鼠以及按蚊 |
| 4.2.2 载体的构建 |
| 4.2.3 疟原虫的电击转染及克隆虫株的鉴定 |
| 4.2.4 蚊媒感染 |
| 4.2.5 蚊期发育表型分析 |
| 4.2.6 红期生长曲线的测定 |
| 4.2.7 纯化配子体 |
| 4.2.8 雄配子体出丝率的统计 |
| 4.2.9 成熟动合子转化率的统计 |
| 4.2.10 动合子运动能力检测 |
| 4.2.11 间接免疫荧光 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转录因子PyApiAP2家族基因的敲除 |
| 4.3.2 转录因子PyApiAP2家族基因的加标签 |
| 4.3.3 配子体时期的关键基因功能分析 |
| 4.3.4 动合子和卵囊时期的关键基因功能分析 |
| 4.3.5 PY17X_0523100和PY17X_1323500功能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 本研究的主要发现和结论 |
| 4.4.2 本研究的思考 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 缩略语及中英文对照 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）分子生物学技术在疟疾诊断中的应用与展望（论文提纲范文）
| 1 DNA探针与寡核苷酸探针 |
| 2 聚合酶链反应 (PCR) |
| 2.1 复式PCR与多重PCR |
| 2.2 巢式PCR |
| 2.3 实时荧光定量PCR |
| 3 环介导等温扩增技术 |
| 4 下一代测序 (next generation sequencing, NGS) 技术 |
| 5 数字PCR |
| 6 展望 |
四、荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究（论文参考文献）
- [1]等温扩增技术在疟原虫及巴贝虫检测中的应用[J]. 强焜,徐斌,胡薇,郑彬. 中国热带医学, 2022(01)
- [2]口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的初步建立与评价[D]. 侯谦. 中国农业科学院, 2021
- [3]基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究[D]. 姚亚文. 中国农业科学院, 2021
- [4]农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究[D]. 吴翠. 浙江大学, 2021(01)
- [5]蛋白磷酸酶NIF4在恶性疟原虫红内期生长发育中作用机制的研究[D]. 于园超. 中国医科大学, 2021
- [6]捕获和连接的环介导等温扩增技术[J]. 骈红茹,杨明珠,郑直. 基础医学与临床, 2020(11)
- [7]大湄公河次区域间日疟原虫遗传多样性和群体遗传学研究[D]. 李玉玲. 中国医科大学, 2020(01)
- [8]利用CRISPR/Cas9技术建立删除Pfhrp2基因恶性疟原虫参考虫株及其对快速诊断试剂的影响研究[D]. 杨英超. 北京协和医学院, 2019(02)
- [9]约氏疟原虫CRISPR/Cas9技术的建立和ApiAP2转录因子家族基因功能分析[D]. 张翠. 厦门大学, 2018(08)
- [10]分子生物学技术在疟疾诊断中的应用与展望[J]. 宋观波,徐超,李瑾,孙慧,魏庆宽,黄炳成. 中国热带医学, 2018(04)