一、复制衰老的分子生物学进展（论文文献综述）
王靖怡[1]（2021）在《血管抗衰方通过miR-146a/TRAF6/NF-κB改善血管衰老机制研究》文中指出血管衰老在机体衰老过程中发挥重要作用,现已成为心脑血管疾病的首要危险因素。目前,血管衰老相关研究多集中于机制层面,临床干预手段较为局限,多围绕防治危险因素或改善内皮功能等方面展开。中医对于衰老的认识历史久远,围绕“未老先养”理念构建了丰富的理论和诊疗体系。因此,深入挖掘中医衰老相关认知,结合现代研究方法,进一步探索延缓血管衰老的具体干预措施及其机制是有意义的。有鉴于此,在“七情”须使合和指导下,结合血管衰老病生理过程及中医对血脉理论相关认识,选用植物基源相近、成分相似、传统功效互有重叠和补充的人参和三七组成血管抗衰方,共同发挥益气活血,通补血脉之功。为明确该方能否针对血管衰老发挥效用,本研究利用生物信息学、网络药理学、临床研究及细胞实验多种方法,旨在探索血管抗衰方的临床有效性及其具体作用机制,以期为延缓血管衰老提供切实有效的干预手段。目的利用生物信息学对衰老内皮细胞差异表达miRNA分子进行筛选,并预测差异表达miRNA分子作用的靶基因及下游通路,初步构建调控关系,利用网络药理学预测血管抗衰方干预血管衰老可能的作用靶点及涉及的生物学功能,通过临床研究验证其有效性及安全性,并在细胞实验中探讨其发挥作用的分子机制,系统构建“中医理论-组方用药-生信预测-临床验证-机制研究”的研究模式,以揭示血管抗衰方可从miRNA水平改善血管衰老。方法第一部分利用生物信息学方法筛选衰老内皮细胞差异表达miRNA及血管抗衰方延缓血管衰老作用靶点预测研究首先,利用GEO数据库筛选衰老内皮细胞差异表达miRNA分子,对GSE92655和GSE37092两个数据集进行分析,利用R语言（3.6.3版本）处理数据矩阵,以|log2FC|≥ 1 且 adjusted P value<0.05 作为筛选 DEMs（Differentially Expressed miRNAs）的条件,对筛选出的DEMs进行VENN交集,寻找共同的DEMs信息,利用ggplot2包绘制火山图并对DEMs进行标注,利用GEO2R分析工具对表达矩阵进行归一化处理后绘制相关图形。其次,利用TargetScan、miRTarBase 8.0、miRDB三大数据库对DEMs下游靶基因进行预测,进行VENN交集以提高预测准确性,同时利用Metascape网站对差异表达miRNA下游靶基因进行富集分析,miRpathDB2.0数据库及KEGG筛选并明确后续研究的下游通路。最后,利用口服生物利用度（oral bioavailability,OB≥30%）和类药性（drug-likeness,DL≥0.18）作为筛选条件,在TCMSP平台筛选血管抗衰方组成药物人参、三七主要活性成分,并利用CNKI及PubMed对其结果进行补充,利用TCMSP、ETCM及PharmMapper（norm fit≥0.9）获取成分靶点信息,利用cytoHubba获取排名前十的活性成分;利用NCBI、GeneCards、HAGR、OMIM收集血管相关疾病与衰老相关基因,取交集获得血管衰老相关基因,构建疾病靶点数据集,通过对成分靶点与疾病靶点取交集筛选出血管抗衰方主要活性成分发挥延缓血管衰老功效的潜在靶点,进行蛋白-蛋白互作网络构建与富集分析,以明确血管抗衰方可能参与的生物学过程或所涉及的信号通路。第二部分血管抗衰方干预血管衰老临床试验及miR-146a/TRAF6/NF-KB调控关系初步探索采用自身前后配对设计,对血管抗衰方临床有效性及安全性进行探索性研究,纳入血管动脉硬化检测诊断为动脉硬化的受试者共40例,给予血管抗衰方进行为期4周的干预。临床研究分为3部分开展,分别为有效性、安全性及探索性指标。有效性研究中分为主要疗效指标和次要疗效指标,主要疗效指标包括受试者脉搏波传导速度数值变化,以及血管僵硬度评级变化;次要结局指标包括血压、踝臂指数、生化指标、细胞因子、血液流变学及颈动脉超声。安全性指标包括血尿常规、肝肾功能及凝血功能,用以评估该药物的临床安全性。探索性指标包括:受试者血浆样品NO及ET-1变化情况以反映内皮功能变化;利用实时荧光定量PCR技术检测血液样品中miR-146a、TRAF6、NF-κB及下游相关炎症因子表达水平变化,并采用2-△△Ct计算治疗前后差异表达倍数。第三部分血管抗衰方调控miR-146a/TRAF6/NF-KB干预衰老内皮细胞作用机制研究首先,筛选合适的药物诱导模型,分别采用不同浓度梯度Ang Ⅱ和TNF-α对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）诱导24h,光镜下观察细胞形态学变化,CCK8法检测细胞增殖情况,SA-β-gal染色检测细胞衰老情况,流式检测细胞周期,RT-qPCR检测不同模型诱导后对miR-146a表达影响情况,综合选取适宜的造模药物及浓度。其次,在药物诱导模型上,进行血管抗衰方、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和三七总皂苷PNS无毒浓度筛选,利用CCK8法检测上述药物对细胞增殖抑制率的影响,以确定适宜药物干预浓度。最后,进行药物干预衰老内皮细胞的机制研究,共分为:对照组、TNF-α模型组、TNF-α模型组+人参皂苷Rg1组、TNF-α模型组+三七皂苷R1组、TNF-α模型组+人参皂苷Rg1组+三七皂苷R1组、TNF-α模型组+血管抗衰方组、TNF-α模型组+三七总皂苷PNS组,对各组细胞分别进行CCK8检测、SA-β-gal染色、流式检测,从增殖、衰老、细胞周期等功能层面评估药物作用,利用RT-qPCR、Western Blot和ELISA检测,判断miR-146a/TRAF6/NF-κB及其下游炎症效应分子表达水平变化。结果第一部分1、GSE92655 和 GSE37092 中获得 3 个共同的 DEMs,分别为 hsa-miR-146a、hsa-miR-181a、hsa-miR-1275。共同上调 DEM 为 hsa-miR-181a,共同下调 DEM为hsa-miR-1275,has-miR-146a在两个数据集中呈现不同差异表达趋势,故选定为本研究主变量;2、miRTarBase 8.0、TargetScan、miRDB 中对 miR-146a 下游靶基因预测交集为14 个:ERBB4、IRAK1、TRAF6、CD80、CARD10、LRP2、RARB、NUMB、CCDC6、PPP1R11、ROBO1、KDM2B、LFNG、SLC10A3,涉及前额发育、激活NF-κB诱导的激酶活性、模式规范过程、前额神经元产生、细胞间受体信号通路等。miRpathDB2.0及KEGG筛选出miR-146a与NF-κB信号通路及炎症反应关系密切。构建miR-146a/TRAF6/NF-κB作为血管衰老的可能机制。3、筛选出人参活性成分27个,作用靶点201个,三七活性成分12个,作用靶点150个,二者共同作用靶点为139个,cytoHubba分析排名前10的活性成分包括:三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等;四个数据库共获得246个血管衰老相关靶点;将成分靶点与疾病靶点取交集后有22个共同靶点,PPI网络及MCODE聚类显示以炎症和凋亡为主,GO和KEGG分析显示涉及调控NF-κB信号通路。预测血管抗衰方可能通过调控NF-κB信号通路改善血管衰老。第二部分1、血管抗衰方能够降低患者脉搏波传导速度,改善血管僵硬度评级,改善受试者血压水平,降低总胆固醇水平,升高高密度脂蛋白胆固醇水平,改善血液流变学情况,降低血液粘稠度;2、血管抗衰方对受试者血常规、肝肾功能无明显影响,对患者凝血功能有一定的调节作用;3、血管抗衰方可以降低受试者血浆中ET-1水平;在miR-146a/TRAF6/NF-KB调控关系验证中发现,血管抗衰方能够下调受试者miR-146a和NF-κB以及NF-κB1的表达水平,上调TRAF6表达水平,对于NF-κB通路后续效应因子也具有下调作用,以VCAM下调最为明显。第三部分1、形态学方面,TNF-α与Ang Ⅱ诱导后,HUVEC细胞排列逐渐稀疏,体积增大,胞内逐渐浑浊,且与Ang Ⅱ相比,TNF-α诱导后的细胞排列更为稀疏松散;CCK8法检测结果显示,采用Ang Ⅱ诱导细胞与对照组相比无显着变化,200ng/ml、100ng/ml和50ng/ml TNF-α对细胞增殖存在抑制作用,且存在浓度依赖现象;SA-β-gal染色阳性率显示,与对照组相比,Ang Ⅱ在四个浓度下诱导HUVEC的染色阳性率无显着变化,而TNF-α四个浓度均可使HUVEC的SA-β-gal染色阳性率升高;流式检测发现两种药物均可使细胞在G0/G1期聚集,且随诱导浓度的增加,GO/G1期占比随之增加。综上,选择100ng/ml TNF-α为模型诱导药物;2、CCK8法筛选药物无毒浓度分别为:人参皂苷Rgl 50μg/ml;三七皂苷R112.5μg/ml;三七总皂苷50μg/ml;血管抗衰方200μg/ml;3、功能层面,五种干预方式均能显着降低细胞增殖抑制率,提高细胞增殖能力,其中,以三七总皂苷和血管抗衰方效果更为明显;五种干预方式均能显着减少衰老细胞的数量和程度,其中人参皂苷Rg1+三七皂苷R1、三七皂苷R1更为明显;五组干预方式均能显着降低细胞G0/G1期占比,改善细胞周期阻滞,其中三七总皂苷和人参皂苷Rg1效果更为明显;4、在miR-146a/TRAF6/NF-κB通路验证中,五组药物均能降低miR-146a、TRAF6表达水平,五组药物干预后与模型组相比能够降低磷酸化形式的IκBα和磷酸化的p65,对于NF-κB起到一定的抑制作用,对于NF-κB通路下游相关炎症效应分子表达水平的改变具体包括:人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg1+三七皂苷R1、三七总皂苷PNS可以降低TNF-α水平,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、血管抗衰方可以降低IL-1β的表达水平,人参皂苷Rg1+三七皂苷R1、血管抗衰方、三七总皂苷PNS可以降低VCAM表达水平;5、对于衰老相关分子标志物p16和p21而言,五组药物均能有效降低p16的表达水平,但对于p21表达水平的降低,以三七皂苷R1、血管抗衰方、三七总皂苷PNS为主发挥效应。结论1、生物信息学方法筛选出衰老血管内皮细胞差异表达miRNA分子为miR-146a,预测并构建miR-146a/TRAF6/NF-κB作为血管衰老炎症相关调控环节;2、血管抗衰方改善血管衰老临床有效,能够改善血管壁僵硬程度、内皮舒缩功能及血液粘稠度,对miR-146a/TRAF6/NF-κB可发挥调控作用,其中以miR-146a和NF-κB改善更为明显;3、血管抗衰方及其重要单体成分或组合形式,可以改善TNF-α诱导的内皮细胞衰老模型,降低衰老相关标志物水平,同时通过改善细胞增殖能力、减少细胞周期阻滞发挥功效;能够显着降低miR-146a和TRAF6表达水平,抑制NF-κB通路激活,降低其下游炎症效应分子表达水平,抑制衰老相关炎症反应。
陈博[2]（2021）在《基于网络药理学研究当归补血汤延缓衰老的作用机制》文中提出衰老,是机体发育成熟后,各细胞、器官和组织在形态、结构以及生理功能等方面出现的退行性变化,且是由多种因素共同作用的结果。随着世界人口老龄化和衰老相关疾病发病率的不断增长,带来的社会和经济负担也在不断加重。因此,开展衰老机制研究,开发延缓衰老的药物,降低衰老相关疾病发病率,对改善人们生活水平,提高生活质量具有重要意义。中药已有几千年的历史,具有多成分、多靶点和多功能的作用特点,在预防和治疗复杂疾病等方面具有明显的优势。经典名方“当归补血汤”出自于金代名医李东垣所着《内外伤辨惑论》,其具有多种药理活性。在以往的研究中也报道过当归补血汤的抗衰老活性,但其延缓衰老的作用机制并未见国内外文献报道。因此,本文利用网络药理学方法,从整体和系统的角度出发,预测并验证当归补血汤延缓衰老的作用机制。本文首先利用网络药理学方法建立当归补血汤的抗衰老活性预测模型,以期能减少研究的盲目性、提高研究效率,然后采用分子生物学技术验证预测模型,同时,研究当归补血汤对衰老大鼠肝肾功能、造血功能以及免疫系统的影响,将网络药理学技术与传统的分子生物学技术相结合,系统阐明并揭示当归补血汤延缓机体衰老的作用机制。（1）采用网络药理学方法预测当归补血汤延缓衰老的分子机制,分析结果表明:当归补血汤主要有槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山奈酚等活性成分,主要作用于IL6、IL10、TNF、VEGFA、AKT1、TP53、SERPINE1、PPARG、HIF1A等靶点,通过对JAK-STAT信号通路、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、TCR信号通路、VEGF信号通路和m TOR信号通路的调节,抑制衰老引发的炎症反应,并通过调节自身免疫,调控细胞周期达到延缓机体衰老的目的。（2）通过检测大鼠肝肾组织和血清中的抗氧化和脂质过氧化指标发现,当归补血汤可提高衰老大鼠肝肾组织和血清中SOD和GSH含量,降低MDA水平增强机体的抗氧化能力,减少机体的氧化损伤,从而发挥延缓衰老的作用。（3）当归补血汤对衰老大鼠肝肾功能的影响结果发现,当归补血汤可降低血清中ALT、AST以及BUN、CRE的含量,减轻肾脏炎症和纤维化,从而起到对肝肾组织的保护作用。（4）当归补血汤对衰老大鼠骨髓造血功能的影响结果发现,当归补血汤可提高衰老大鼠外周血中WBC、RBC、PLT和骨髓中BMNC细胞数目,降低大鼠骨髓Sca-1+BMNC的粘附分子CD44和CD49d的表达,促进G1期阻滞的BMNC细胞进入S期。提示当归补血汤可通过增强细胞的分裂增殖,提高机体的造血机能,起到延缓机体衰老的作用。（5）当归补血汤通过降低大鼠血清中IL-6和TNF-α的释放,提高IL-10的含量,从而减轻机体的炎症损伤;并通过降低T淋巴细胞凋亡因子Fas/Fas L的表达,抑制T淋巴细胞的凋亡从而调节机体免疫水平;还可通过对PI3K-AKT/CDKRb通路和PI3K-AKT/MDM2-p53通路中蛋白表达的调节从而调节细胞周期、细胞增殖与凋亡,进而发挥其延缓衰老的作用。
陶冶[3]（2021）在《LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老》文中研究指明目的:细胞衰老是一种复杂的应激反应,是导致细胞生长停滞的一种不可逆状态,主要发生在细胞受到不同压力时,可以由多种不同因素（如复制应激、DNA损伤、氧化应激、癌基因诱导、化学疗法、线粒体功能障碍、表观遗传和旁分泌）所触发。恶性肿瘤是一种年龄相关疾病,是老年人主要的死亡原因之一。细胞衰老可以发生在不同的生理和病理过程中,在癌症治疗中,诱导细胞衰老是肿瘤发生发展的有效屏障,是重要的抑癌机制之一。随着抑癌机制研究的不断深入,通过诱导肿瘤细胞衰老来阻止肿瘤发展正逐渐受到重视,诱导肿瘤细胞衰老的具体生物学过程也越来越受到关注。长链非编码RNA（lncRNAs）通过在转录、转录后和表观遗传水平调控基因表达,在广泛的生物学过程中发挥着核心调节因子的作用。对lncRNAs重叠蛋白编码基因启动子区域的研究发现,许多lncRNAs都与细胞周期调控相关,这暗示了lncRNAs在不同生物学过程中以及在细胞命运最终决定过程中的潜在作用。近年来,十余种lncRNAs被发现与细胞衰老相关。有研究表明,lnc MEG3可以通过影响内皮细胞功能进而在调控血管内皮细胞衰老方面发挥重要的作用,所以深入探讨lnc MEG3在肿瘤细胞衰老过程中的作用机制,可能有助于揭示肿瘤细胞衰老与抑癌机制相互联系的分子基础,为诱导肿瘤细胞过程中lnc MEG3成为肿瘤治疗的新方向奠定基础。本课题组前期实验已经证实,在肿瘤细胞衰老过程中YAP出核增加,其表达受到抑制会导致细胞增殖能力下降。VGLL4是包含TDU结构域的VGLL家族转录辅因子（VGLL1-4）的成员,在多种肿瘤细胞中起到强大的抑癌作用,目前已有文献报道了在细胞增殖过程中,VGLL4作为一个共转录因子可以与YAP竞争性结合下游的转录因子。Lnc RNAs可以通过与miRNAs,m RNAs和蛋白质的相互作用在基因表达的表观遗传调控中起关键作用,而miRNAs也可以直接或间接地影响lncRNAs的表达水平。许多文献已经报道了lncRNAs通过发挥分子海绵的作用影响下游miRNAs的表达水平。越来越多的证据表明,lncRNA/micro RNA/m RNA调控轴参与了多种细胞生物学过程。鉴于诱导肿瘤细胞衰老的转录及转录后调控在基因表达中的重要作用,本实验旨在前期工作基础上明确lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴在依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老过程中的生物学作用,并进一步探索诱导肿瘤细胞衰老对于癌症治疗的重要意义。研究方法:1、体外培养肺腺癌A549细胞系及乳腺癌MCF-7细胞系,利用依托泊苷诱导并构建上述两种肿瘤细胞的衰老模型;2、利用SA-β-Gal染色验证上述建立的A549及MCF-7细胞模型的衰老程度;3、利用Western Blot检测细胞衰老过程中,衰老相关基因的表达变化,利用qRT-PCR检测衰老相关基因及衰老相关分泌表型基因的m RNA表达变化;4、利用流式细胞仪检测并验证依托泊苷诱导的A549及MCF-7细胞衰老模型的细胞周期阻滞情况;5、利用生物信息学分析并筛选依托泊苷诱导A549细胞衰老过程中的差异基因;6、利用qRT-PCR检测lnc MEG3的表达水平并检测lnc MEG3高或低表达对肿瘤细胞衰老程度及衰老相关基因表达水平的影响;7、利用免疫荧光法检测衰老过程中VGLL4的核定位情况;分离并提取细胞核、浆蛋白,利用Western Blot检测VGLL4在细胞胞浆及胞核中的表达情况;8、利用生物信息学方法预测lnc MEG3及VGLL4的靶micro RNA,利用双荧光素酶报告检测目的基因与靶micro RNA的结合情况;9、利用qRT-PCR及Western Blot检测miR-16-5p的表达水平并检测miR-16-5p高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因表达水平的影响;10、利用qRT-PCR检测VGLL4的表达水平并检测VGLL4高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因m RNA表达水平的影响;11、利用Western Blot检测VGLL4的表达水平并检测VGLL4高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因蛋白表达水平的影响;12、利用SA-β-Gal染色及Western Blot检测lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4调控轴的功能:对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因蛋白表达水平的影响。结果:1、低剂量依托泊苷可以诱导A549及MCF-7细胞衰老;2、LncMEG3在A549及MCF-7细胞衰老模型中表达升高;3、低表达lnc MEG3显着抑制A549及MCF-7细胞衰老,高表达lnc MEG3在一定程度上促进A549及MCF-7细胞衰老;4、在A549及MCF-7细胞衰老模型中,共转录因子VGLL4与YAP形成竞争性抑制,VGLL4在细胞核内表达增加,在细胞内总表达水平上调;5、在A549及MCF-7细胞衰老模型中,lnc MEG3通过直接相互作用抑制miR-16-5p的表达;6、Mi R-16-5p参与了A549及MCF-7细胞的衰老过程;7、VGLL4在A549及MCF-7细胞衰老过程中是miR-16-5p的直接靶基因;8、VGLL4参与了A549及MCF-7细胞衰老过程的调控;9、在A549及MCF-7细胞衰老过程中VGLL4的表达受lnc MEG3的调控;10、在A549及MCF-7细胞衰老过程中,lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴发挥了调控作用。结论:1、在肿瘤细胞衰老过程中,lnc MEG3通过海绵效应与miR-16-5p结合并抑制miR-16-5p表达,进而解除miR-16-5p对VGLL4表达的抑制作用,最终影响肿瘤细胞衰老过程;2、肿瘤细胞衰老过程中VGLL4表达水平上调且受lnc MEG3的调控;3、肿瘤细胞衰老过程中存在VGLL4的细胞内异位。
翟留涛[4]（2021）在《假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构与功能研究》文中提出端粒酶是一种特殊的逆转录酶,它的核心催化区由蛋白质催化亚基—端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase:TERT）和RNA亚基—端粒酶RNA（Telomerase RNA:TER）两部分组成。与其他逆转录酶相比,端粒酶最大的特点就是能够以自身携带的一段RNA序列为模板,反复合成端粒DNA,从而解决真核生物线性染色体的末端复制问题,维护基因组的完整性。然而,端粒DNA的合成是一个复杂而精致的过程,中间涉及到端粒DNA的延伸、复制的精确终止、DNA-RNA杂交链的解离及DNA与RNA解离后发生移位,使DNA重新和模板区配对,开始新一轮的合成等多个步骤。目前对这些过程的分子机制并不清楚,而高分辨率的三维结构是阐明分子机制的关键。此外,端粒酶的结构与功能具有物种特异性,研究不同物种端粒酶的结构与功能,才能全面而深刻的理解端粒酶的作用机制。但目前对端粒酶的结构知之甚少,尤其是对酵母端粒酶的空间结构更是一无所知。本文以假丝酵母（Candida tropicalis与Candida albicans）端粒酶为研究对象,通过大肠杆菌表达系统获得了高纯度的假丝酵母端粒酶逆转录酶（Candida tropicalis TERT,Ct TERT与Candida albicans TERT,Ca TERT）。然后与RNA组装成有活性的复合体,在体外利用引物延伸实验对其延伸活性进行了研究,结果发现:（1）假丝酵母端粒酶逆转录酶在体外只能延伸一轮,不具有反复合成能力;（2）假丝酵母端粒酶发挥活性不需要TER中的Pseudoknot（PK）及Three-way-junction（TWJ）等结构元件,只要有模板区（Template）的存在就能进行端粒DNA的合成;（3）假丝酵母端粒酶逆转录酶在体外具有典型的逆转录酶功能,能够以任意RNA为模板催化相应DNA的合成。接着,我们利用X射线晶体衍射技术及小角散射技术（Small angle X-ray scattering,SAXS）对假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构进行了研究,最终成功解析出包括TERT单蛋白晶体结构(Ct TERT178-879:2.47?,Ct TERT158-745:2.84?)及TERT与TWJ的复合体(Ct TERT158-879-TWJ:2.85?,Ca TERT177-867-TWJ:2.98?,Ca TERT95-867-TWJ:3.46?)在内的多套高分辨率的晶体结构。Ct TERT晶体结构显示,Ct TERT的C端结构域（C-terminal extension,CTE）占据了之前在其他物种TERT结构中观察到的环形腔,呈“闭合”状态。通过晶体结构分析及SAXS实验发现,这种闭合状态并不是晶体堆积造成的,而是TERT的一种固有属性,并且这种“闭合”属性不受RNA的影响。与Ct TERT呈“闭合”状态的空间构象刚好相反,Ca TERT的TRBD-RT-CTE形成环形,呈“开放”状态,并且Ca TERT-TWJ复合体是二聚体。我们通过结构分析及生化实验验证,揭示了Ca TERT-TWJ形成二聚体的结构基础。此外,分析Ct TERT及Ca TERT与TWJ的复合体晶体结构,揭示了酵母中TERT识别TWJ的分子机制。重要的是,我们直接证明了TWJ的P6.1与TERT的CTE之间的相互作用。此后,又通过SAXS及活性测定实验证明了TERT的CTE是可以灵活转动的,并且这种构象变化是TERT的内在属性。有趣的是,分子动力学模拟结果显示,CTE构象的变化能够使RNA与DNA的杂交双链发生解离,随后我们通过功能实验对其进行了验证。在分析Candida TERT晶体结构时,发现在TRBD的N端存在一个U形loop结构,我们把它命名为U-motif,通过结构分析及序列比对发现此结构在端粒酶中非常保守,进一步深入的研究发现U-motif能够调控端粒DNA的合成。最后,我们根据对CTE及U-motif的结构分析及功能实验,提出了端粒酶合成端粒DNA的分子模型。
张浩[5]（2021）在《Apelin通过AMPK/Autophagy通路调控间充质干细胞衰老的机制研究》文中研究说明在全世界范围内,心肌梗死（Myocardial Infarction,MI）存在高患病率和高死亡率的特点,尤其是老龄人群。近年来,大量的动物实验和临床试验证实间充质干胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）移植对MI有良好的治疗效果,逐渐成为了医学领域研究热点。目前,MSCs治疗MI以自体移植为主。然而对于MI这一与年龄相关疾病而言,MSCs的整体质量随着患者本身的年龄增长出现衰老,导致功能下降。因此,对来源于老年人的骨髓间充质干细胞（bonemarrow-derived MSCs,BMSCs）,在体外进行改造增强其功能具有重要意义。目的:1.比较年轻间充质干细胞（young mesenchymal stem cells,YMSCs）和衰老间充质干细胞（aged mesenchymal stem cell,AMSCs）的功能差异。2.明确Apelin介导AMPK/Autophagy通路调控MSCs衰老。方法:1.CCK8,Ki67免疫荧光染色法,累计群体倍增数实验检测MSCs增殖能力。2.SA-β-gal衰老试剂盒检测MSCs衰老。3.荧光定量RT-PCR检测MSCs中Apelin的m RNA表达量。4.ELISA试剂盒检测YMSCs和AMSCs分泌Apelin的能力。5.Western blot检测YMSCs和AMSCs的Apelin蛋白,衰老相关蛋白p16,p21,自噬相关蛋白p62,Beclin,LC3ΙΙ/Ι表达水平。6.透射电镜检测YMSCs和AMSCs细胞中的自噬小体数量。7.使用si RNA质粒转染YMSCs敲低Apelin,SA-β-gal衰老试剂盒检测衰老,Western blot检测Apelin蛋白,衰老相关蛋白p16,p21,自噬相关蛋白p62,Beclin,LC3ΙΙ/Ι,透射电镜检测细胞中自噬小体数量。8.使用慢病毒感染AMSCs过表达Apelin,Western blot检测Apelin蛋白,分别给予自噬抑制剂（3-MA）和AMPK抑制剂（化合物C）后,SA-β-gal衰老试剂盒检测衰老程度,Western blot检测AMPK,p-AMPK,自噬相关蛋白p62,Beclin,LC3ΙΙ/Ι,透射电镜检测细胞中自噬小体数量。结果:1.AMSCs增殖能力降低。CCK8实验与Ki67免疫荧光结果表明与YMSCs相比较,AMSCs的增殖明显下降（P<0.01）。2.AMSCs出现细胞衰老。AMSCs的SA-β-gal阳性率显着高于YMSCs（P<0.01）。AMSCs在P7代就基本停止了生长,而YMSCs可以继续增殖到P11代左右。随着代数增加,AMSCs增殖速率逐渐减缓,且远低于YMSCs。3.AMSCs中Apelin表达水平低且自噬功能受损。Western blot,RT-PCR,ELISA试剂盒结果表明在AMSCs中Apelin蛋白和m RNA,Cd M中Apelin浓度水平均显着低于YMSCs（P<0.01）与YMSCs相比较,AMSCs的衰老相关蛋白p16,p21表达显着升高（P<0.01）;自噬相关蛋白p62表达增高,Beclin,LC3ΙΙ/Ι表达降低（P<0.05）。透射电镜结果表明AMSCs自噬小体数量也显着少于YMSCs（P<0.01）。4.在YMSCs中敲低Apelin通过Autophagy调控细胞衰老状态。用Apelin-si RNA处理YMSCs后,Western blot结果表明Apelin在YMSCs表达减少（P<0.001）,衰老相关蛋白p16,p21表达水平增高（P<0.05）,自噬相关蛋白p62表达增高（P<0.001）,而Beclin,LC3ΙΙ/Ι表达降低（P<0.05）。SA-β-gal阳性率也显着增高（P<0.01）。5.在AMSCs中过表达Apelin通过AMPK/Autophagy通路,使细胞年轻化。在AMSCs中过表达Apelin后,Western blot结果表明在Apelin在AMSCs表达增高（P<0.01）,SA-β-gal阳性率降低（P<0.01）,透射电镜检测细胞中自噬小体数量增加（P<0.01）,衰老相关蛋白p16,p21表达水平减少（P<0.01）,自噬相关蛋白p62表达减少（P<0.001）,Beclin,LC3ΙΙ/Ι表达增高（P<0.01）。使用3-MA后则会减弱这种作用。同时过表达Apelin后p-AMPK表达增加（P<0.001）,SA-β-gal阳性率降低（P<0.01）,透射电镜检测细胞中自噬小体数量增加（P<0.001）,但是使用AMPK抑制剂Compound C后则会降低上述作用。结论:1.与YMSCs相比较,AMSCs增殖能力下降,存在明显的衰老。2.与YMSCs相比较,AMSCs中Apelin蛋白和m RNA以及Cd M中含量均下降显着,而衰老相关蛋白p16,p21表达升高。3.敲低Apelin通过Autophagy调控YMSCs衰老。4.过表达Apelin通过AMPK/Autophagy通路使AMSCs年轻化。
张树文[6]（2021）在《基于氧化应激探讨槲皮素防治椎间盘退变的实验研究》文中研究指明目的:（1）以D-半乳糖构建髓核细胞衰老模型,并探讨其诱导髓核细胞衰老的氧化应激机制;（2）分析槲皮素对D-半乳糖诱导髓核细胞衰老、衰老相关分泌表型以及细胞外基质合成、分解代谢的影响;探讨槲皮素通过p38 MAPK信号通路调控自噬减轻D-半乳糖诱导髓核细胞衰老退变的分子机制;（3）经皮细针纤维环穿刺建立SD大鼠尾椎椎间盘退变模型,探究槲皮素在椎间盘退变防治中的作用。方法:（1）通过CCK-8细胞活性实验、细胞周期实验评估D-半乳糖对髓核细胞增殖活性的影响;应用衰老相关标记物检测D-半乳糖对髓核细胞衰老及衰老相关分泌表型的影响;通过RT-q PCR、免疫荧光以及翻红O染色分析D-半乳糖诱导髓核细胞衰老对细胞外基质代谢的影响;通过检测细胞内活性氧ROS、超氧化物歧化酶SOD和脂质过氧化产物MDA明确D-半乳糖诱导髓核细胞衰老的氧化应激机制。（2）通过CCK-8细胞活性实验、细胞周期实验评估槲皮素对D-半乳糖抑制髓核细胞增殖活性的影响;通过β-半乳糖甘酶染色、β-半乳糖甘酶活性、RT-q PCR等分析槲皮素对D-半乳糖诱导髓核细胞衰老及衰老相关分泌表型的影响;使用条件培养基共培养模式分析槲皮素抑制髓核细胞衰老及衰老相关分泌表型对单核巨噬细胞迁移和极化作用的影响;通过Western blot分析槲皮素对MAPK（JNK、ERK、p38）信号通路的影响。（3）通过Western blot、免疫荧光以及电镜扫描明确槲皮素对髓核细胞自噬的激活作用;使用3-MA抑制剂抑制自噬明确槲皮素通过激活自噬减轻D-半乳糖诱导的髓核细胞衰老和细胞外基质降解的保护作用;使用p38MAPK抑制剂SB203580明确槲皮素通过调节p38MAPK介导的自噬保护椎间盘退变。（4）通过X线透视和MRI扫描在影像学上评估槲皮素防治椎间盘退变的作用;使用HE染色评估椎间盘的病理变化,阿利新蓝和翻红O-固绿染色、免疫组织化学分析椎间盘组织中细胞外基质蛋白聚糖的含量和分布;应用免疫组织化学评估槲皮素对细针穿刺诱导椎间盘细胞凋亡和自噬指标的影响。结果:（1）CCK-8细胞增殖活性和细胞周期结果表明50g/L的D-半乳糖明显降低髓核细胞的增殖活性并出现细胞周期G1期阻滞;β-半乳糖甘酶染色、β-半乳糖甘酶活性以及衰老相关蛋白p53、p21、p16均明显增加;RT-q PCR结果提示衰老相关分泌表型在衰老髓核细胞中明显增加,以CCL2和MMP13最为显着;RT-q PCR、免疫荧光、翻红O染色结果表明衰老髓核细胞中II型胶原和蛋白聚糖明显降低;D-半乳糖诱导氧化应激反应,包括ROS和MDA含量的升高以及超氧化物歧化酶SOD活性的降低。（2）CCK-8结果表明25u M槲皮素对髓核细胞活性无影响,且逆转D-半乳糖对髓核细胞活性的抑制作用;细胞周期结果表明槲皮素减轻D-半乳糖引起的G1周期阻滞;条件培养基对单核巨噬细胞的迁移和极化实验表明槲皮素抑制髓核细胞衰老的条件培养基减少了单核巨噬细胞的迁移和向M1型巨噬细胞的极化作用;Western blot结果表明槲皮素通过调节JNK、ERK、p38 MAPK信号通路保护髓核细胞免受氧化应激损伤。（3）Western Blot、免疫荧光以及电镜结果表明槲皮素可以激活自噬并通畅自噬流,自噬相关蛋白Beclin-1和LC3II/I的表达升高,p62表达降低,给予3-MA预处理髓核细胞明显降低了槲皮素对髓核细胞自噬激活的作用;抑制自噬减少了槲皮素对髓核细胞外基质的保护作用,促进衰老相关蛋白和衰老相关分泌的表达;槲皮素降低了由D-半乳糖引起的p38MAPK、m TOR的磷酸化水平,抑制p38MAPK的磷酸化可以激活髓核细胞自噬并促进自噬流通畅。（4）细针穿刺成功构建椎间盘退变模型,椎间盘高度指数明显降低、Pfirrmann分级明显升高;槲皮素延缓细针穿刺诱导的椎间盘退变,增加椎间盘高度指数,降低Pfirrmann分级。HE染色结果表明模型组髓核面积减小,细胞数量减少,髓核与纤维环结构紊乱,槲皮素延缓椎间盘退变的进展,改善病理改良评分。阿利新蓝、翻红O-固绿以及蛋白聚糖免疫组织化学染色结果提示穿刺模型组损伤区髓核组织蛋白聚糖大量丢失且异常分布,槲皮素有效减少了蛋白聚糖的丢失和异常分布。免疫组织化学分析凋亡相关蛋白Bax和自噬相关蛋白Beclin-1,研究结果表明槲皮素处理减轻髓核细胞凋亡并促进髓核细胞的自噬水平。结论:（1）50g/L的D-半乳糖通过氧化应激途径诱导髓核细胞衰老和衰老相关分泌表型,降低髓核细胞活性,阻滞细胞周期,且加速细胞外基质分解代谢。（2）槲皮素预处理通过调控MAPK信号通路改善D-半乳糖诱导的髓核细胞衰老和衰老相关分泌表型的表达。（3）槲皮素通过p38MAPK介导的自噬抑制氧化应激诱导髓核细胞衰老退变。（4）槲皮素减轻细针穿刺诱导的椎间盘退变,影像学和组织病理学结果证实了其对椎间盘退变潜在的防治效果。
朱昊如[7]（2020）在《基于衰老分子机制探讨脾虚证-补中益气汤相关的生物学基础》文中提出基于“方证相关”理论剖析复杂方证关系是目前方剂学界面临的主要问题之一,而网络药理学为研究方证关系的现代内涵提供了新方法。中医学认为衰老与脾虚证关系密切,但目前脾虚与衰老关系的分子生物学研究几未有见,脾虚-衰老的分子机制尚不清楚。因此本研究基于方证相关理论,以补中益气汤与脾气虚证高度关联为逻辑依据,从衰老相立论,利用现代网络药理学方法探查补中益气汤分子药理网络;进一步根据该方的作用预测,在整体-系统-分子水平上,动态观察脾虚证模型演变过程中衰老相关病理生理及生物分子变化,以及补中益气汤的相关效用机制。论文分为文献综述和实验研究两部分。文献综述主要涉及近年“方证相关”的研究进展、脾虚证-衰老相关研究进展及补中益气汤现代研究进展三方面内容;实验研究主要包括脾虚证分子内涵与补中益气汤作用相关的网络药理学研究、脾虚证演变与衰老相关的探讨、以及从衰老探察脾虚证现代内涵及补中益气汤效用机制三部分。研究一脾虚证分子内涵与补中益气汤作用相关的网络药理学研究方法:利用TCMSP平台,分别检索补中益气汤组方药味（黄芪、白术、升麻、陈皮、柴胡、人参、甘草、当归、生姜、大枣）活性成分及其关联靶点,利用STRING平台建立靶点PPI网络并导入cytoscape,利用MCODE插件对PPI网络进行聚类来提取核心靶点簇后,使用ClueGO插件对核心靶点进行GO及KEGG富集,提取主要病/生理功能及生物分子信号通路。结果:①筛选得到补中益气汤活性成分143种,关联靶点162个,其中155个靶点之间存在PPI关系,聚类得到核心簇9个。②富集得到GO条目13组,包括NO生物合成、促进平滑肌细胞增殖等;富集得到KEGG条目12组,包括AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路等。结论:脾虚证-补中益气汤的关联机制内涵可能涉及由AGE-RAGE通路、IL-17通路及松弛素通路主导的,通过介导核转录因子NF-kB来调节促炎细胞因子分泌的炎性调节过程。研究二脾虚证演变与衰老相关的探讨方法:Wistar大鼠随机分为对照组与模型组,每组各18只。对照组常规饲养,模型组采用“游泳力竭+饥饱失常”法复制脾虚模型。各组大鼠:①隔日观察外观行为评分,每日称量摄食量,每周末观测体质量及粪便含水率。②于实验第2-4周末进行强迫负重游泳实验,测定负重游泳时长;实验第3、4周进行Morris水迷宫实验,测定定位航行实验逃避潜伏期和空间探索实验的游泳速度、潜伏期、平台穿梭次数、目标象限路程比及探索路线。③于实验第14、21、28d灌服D-木糖溶液后收集尿液,ELISA法测定尿D-木糖含量,计算D-木糖排泄率。于实验第15、22、29d随机分三批麻醉处杀:取脾脏、胸腺称重计算脏器指数;取血清,利用ELISA法测定GAS、MTL、AGEs、BDNF、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平,利用生化法测定CRP水平;取海马,利用ELISA法测定AGEs、Aβ1-40、Aβ1-42、glu、GABA、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。结果:较之于对照组,模型组大鼠:①a.实验第2-4周皮肤毛发、行为状态、活跃程度、睡眠状态积分显着升高（P<0.01）;第1-4周体质量、摄食量显着降低（P<0.01）;第3、4周粪便含水率升高（P<0.05）。b.实验第4周负重游泳时间显着降低（P<0.01）。c.实验第4周脾脏指数与胸腺指数显着降低（P<0.01）;第2-4周尿D-木糖排泄率显着降低（P<0.01）,血清VIP水平降低;第3、4周血清GAS水平降低;第4周血清MTL水平降低（P<0.05或0.01）。②a.实验第3、4周空间探索潜伏期升高、穿越平台次数减少、目标象限路程比降低（P<0.05）,探索路线呈随机策略。b.实验第2-4周海马GABA水平降低;第3、4周海马IL-1β水平显着升高;第4周海马Aβ140、血清BDNF水平降低（P<0.05 或 0.01）,海马 AGEs、Aβ1-42/Aβ1-40、glu、IL-6、TNF-α 水平升高（P<0.05或0.01）。c.实验第2周血清IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05或0.01）;第4周血清IL-1β、TNF-α水平显着降低（P<0.01）。结论:脾虚大鼠模型演化过程逐渐出现学习记忆能力下降的脑衰老表现,其分子特征体现为海马毒性蛋白累积、炎性水平升高与递质稳态兴奋性失衡。研究三从衰老探察脾虚证现代内涵及补中益气汤效用机制方法:Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量给药组与高剂量给药组,每组各8只。对照组常规饲养,模型组及各给药组按研究二方法持续造模4周,低、高剂量给药组自第15d至第28d起分别按5.85g/kg/d、17.55g/kg/d灌服补中益气汤水煎液。各组大鼠:①按研究二时间及方法观测外观行为评分、摄食量、体质量及粪便含水率。②按研究二方法,于实验第4周末进行强迫负重游泳实验;第4周进行Morris水迷宫实验。③实验第28d按研究二方法测定尿D-木糖排泄率。于实验第29d麻醉处杀后:取脾脏、胸腺计算脏器指数;取血清,ELISA法测定GAS、MTL、BDNF、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平;取海马,ELISA 法测定 AGEs、Aβ1-40、Aβ1-42、glu、GABA、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平,免疫组化法测定 p65NF-kB,Western-blot 测定 p65NF-kB、p-p65NF-kB、RAGE、Iba-1,免疫荧光双标法测定NeuN+cleavedcaspase-3、Iba-1+TNF-α、Iba-1+TGF-β1共表达;取下丘脑,免疫组化法测定p65 NF-kB,Western-blot测定p65 NF-kB、p-p65 NF-kB、Iba-1。结果:①较之于对照组,模型组大鼠:a.皮肤毛发、行为状态、活跃程度、睡眠状态积分升高（P<0.05或0.01）,体质量、摄食量显着降低（P<0.01）;粪便含水率升高（P<0.05）。b.负重游泳时间显着降低（P<0.01）;尿D-木糖排泄率,血清GAS、MTL水平显着降低（P<0.01）;血清VIP水平显着升高（P<0.01）。c.空间探索潜伏期显着增加（P<0.01）,穿梭平台次数与目标象限路程比均降低（P<0.05）,空间探索路线呈随机式策略。d.血清BDNF水平降低（P<0.05）;海马AGEs、Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40、RAGE、glu、Iba-1、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平上升（P<0.05 或 0.01）;p65NF-kB 表达量及活化程度上升（P<0.05或0.01）,GABA、TGF-β1水平降低（P<0.05或0.01）,NeuN 与 cleaved caspase3、Iba-1 与 TNF-α 共表达数增加（P<0.05 或 0.01）。e.下丘脑Iba-1表达量、p65NF-kB表达量及其活化程度显着上升（P<0.01）,GnRH表达量显着降低（P<0.01）。f.脾脏及胸腺指数显着降低（P<0.01）,血清IL-1β、TNF-α及TGF-β1水平显着降低（P<0.01）。②较之于模型组,各给药组大鼠:a.一般表征行为积分、体质量、摄食量、粪便含水率均有不同程度改善（P<0.05或0.01）。b.负重游泳时间显着增加（P<0.01）;尿D-木糖排泄率,血清GAS、MTL水平均升高（P<0.05或0.01）;血清VIP水平均显着降低（P<0.01）。c.空间探索潜伏期显着缩短（P<0.01）,空间探索路线呈趋向式策略;高剂量组大鼠穿梭平台次数增加（P<0.05）。d.血清BDNF水平升高（P<0.05）;海马NeuN与cleaved caspase3、Iba-1与TNF-α共表达数均降低（P<0.05）,Iba-1与TGF-β1共表达数均增加（P<0.05或0.01）;p65NF-kB表达量及活化程度均下调（P<0.05 或 0.01）;AGEs、Aβ1-42、RAGE、glu、Iba-1、IL-1β 水平均降低（P<0.05或0.01）,其中低剂量组大鼠海马IL-6与TNF-α水平显着降低（P<0.01）;TGF-β1水平显着升高（P<0.01）。e.下丘脑Iba-1表达量、p65NF-kB表达量及其活化程度降低（P<0.05或0.01）,GnRH表达量均升高（P<0.05）。f.高剂量组大鼠胸腺指数、血清IL-1β及TNF-α水平均升高（P<0.05或0.01）;各给药组大鼠血清TGF-β1水平均升高（P<0.05 或 0.01）,IL-6 水平显着降低（P<0.01）。结论:脾虚大鼠同时存在海马炎性衰老与外循环免疫衰老,AGEs/RAGE/NF-kB通路介导的小胶质细胞M1型激活与神经元凋亡可能是脾虚大鼠出现脑衰老表现的潜在机制。补中益气汤具有良好的健脾抗衰效用,其机制可能涉及抑制海马AGEs/RAGE/NF-kB信号通路过度激活及诱导小胶质细胞向M2型转化来保护神经元。本研究将方证相关理论与网络药理学分析手段相结合,以衰老为切入点,从整体-器官-细胞-分子层面系统探察了补中益气汤-脾虚证关联的机制,为探索中医方-证关联的生物学基础提供了新思路。
何林熹[8]（2020）在《中医体质分类辨识及肾阳虚体质线粒体基因SNP研究》文中研究说明目的:1.研究通过系统梳理古今文献,厘清中医体质内涵和外延,深入考证中医体质分类与辨识体系,构建中医体质客观化辨识体系。为中医体质临床应用奠定理论基础。2.为探索体质客观化分类与辨识诊断的有效途径,以肾阳虚体质为切入点,采用线粒体基因组全测序方法,筛选肾阳虚体质线粒体基因SNP位点。通过位点功能注释,探索肾阳虚体质辨识的分子生物学基础,为肾阳虚体质分类及辨识筛选可能的生物标志物。方法:1.文献研究（1）文献检索:古代文献检索以“体质”、“禀质”、“素质”、“禀赋”、“气禀”、“禀质”、“素禀”为关键词在《中华医典》中对两汉至明清的古籍文献进行检索。此外以“体质内涵”、“体质辨识”、“体质诊断”、“体质分类”、“体质差异”、“Constitution of Traditional Chinese Medicine”、“Constitution of TCM”为关键词在CNKI、Pub Med上检索1979年1月至2018年12月期间公开发表的文献。（2）文献摘录:按照文献纳入排除标准对文献进行摘录和整理。（3）文献整理归纳与凝练:通过文献整理、归纳古今文献,凝练中医体质的学术思想,并以此为核心,深入考证中医体质分类与辨识方法,厘清体质内涵及外延。2.肾阳虚体质受试者线粒体基因SNP研究。（1）肾阳虚体质受试者纳入:根据课题组前期制定的肾阳虚体质评判标准初步筛选肾阳虚体质受试者,采用《中医体质分类判定标准》排除受试者中阳虚体质外的其余兼夹体质。经3名中医诊断学专业人员诊断确认后,签署知情同意书纳入实验研究。（2）线粒体基因组全测序:肾阳虚体质受试者血液样本采集后,抽取样本线粒体DNA,经质检、扩增后进行线粒体基因组全测序。（3）线粒体基因SNP位点筛选:将纳入受试者DNA序列与线粒体基因标准序列进行比较,筛选肾阳虚体质受试者的共同SNP位点。（4）线粒体基因SNP位点分子生物学功能注释。结果:1.文献研究（1）检索纳入古代文献条目3997条;检索到现代中文文献2603篇,英文文献150篇。根据纳入排除标准筛选后纳入中文文献365篇,英文文献16篇。（2）体质形成:体质的形成秉承于先天得养于后天,以先天为主后天为辅。（3）体质内涵:体质是在先天禀赋和后天环境共同作用下,“身心合一”观的指导下,在外貌体态、生理特征、精神情志方面所表现的人体特质。（4）体质分类:古代体质分类以“阴阳”“五行”为纲。其中《灵枢·通天》和《灵枢·阴阳二十五人》中分类最为详尽,涵盖面最广。现代体质分类主要包括病理体质分类法和更为多元化的综合分类法14种,并对特殊群体（如儿童、妇女）的体质进行了分类。（5）体质辨识:中医古代体质辨识内涵非常丰富,其中主要包括外貌体态、生理特点及心理特点。现代中医体质辨识研究聚焦于中医体质的客观化诊断,其中中医体质量表的运用最为广泛。此外,四诊信息的客观化及现代生物学指标的引入推动了体质客观化的发展。（6）体质分类辨识体系框架:形成以“身心合一”观为核心,外貌体态特征为基础,分子生物学及客观化舌、脉诊信息数据为参考,体质问卷量表数据为辅助的中医体质客观化分类辨识体系框架。2.肾阳虚体质受试者线粒体基因SNP研究（1）通过体质量表评定和专业人员评估共纳入肾阳虚体质受试者31例。（2）基因序列比对筛选了10个肾阳虚体质共同突变位点,这些位点分别位于以下6个基因片段上:MT-RNR1（m.73A>G,m.263A>G,m.750A>G,m.1438A>G）、MT-RNR2（m.3105ACN>AC）、MT-CO1（m.7028 C>T）、MT-ATP6（m.8860A>G）、MT-ND4（m.11719 G>A）、MT-CYB（m.14766 C>T,m.15326A>G）。位点中有2个位点m.73A>G及m.263A>G位于线粒体DNA上游非编码区,其余位点均位于外显子区域。（3）肾阳虚体质线粒体基因位点注释发现突变位点与衰老进程、能量代谢、生殖功能及精神情志异常相关。结论:1.体质是在先天禀赋和后天环境共同作用下,“身心合一”观指导下,外貌体态、生理功能和精神情志方面所表现的个体特质。“身心合一”思想贯穿整个体质分类、体质辨识的全过程,是体质理论的核心思想。2.以“身心合一”观为核心,外貌体态特征为基础,分子生物学及客观化舌、脉诊信息数据为参考,体质问卷量表数据为辅助的中医体质客观化分类辨识体系的构建为中医体质诊断客观化奠定了理论基础。3.线粒体基因SNP改变所导致的线粒体功能不良可能是肾阳虚体质形成的生物学基础,这是肾阳虚体质实质研究新的切入点。4.研究筛选出的6个基因及其上的10个位点可能是肾阳虚体质辨识的潜在生物标志物。5.体质的分子生物学基础研究,是探索体质分类辨识客观化的途径之一。
刘齐[9]（2020）在《阴虚质女性渐衰期的肠道菌群与宿主NF-κB信号通路共变化机制研究》文中提出目的:人体的衰老和老化一直是医学研究的重点内容,养生防衰也是人们最为关注的主题。明确衰老的机制,阐明衰老过程中人体各组织、器官乃至细胞、分子的生理病理改变,有助于解释各类疾病的原理,同时也有利于人类的防病和保健。中医体质学说是中医理论体系中的主要学说之一,以此为切入点剖析衰老的机制,可以进一步完善中医学对衰老的认识。人的体质与衰老具有相关性,偏颇体质更易衰老,其中阴虚质的衰老特征表现最明显。同时肠道菌群对人体衰老的过程有一定影响,并与宿主的相关基因存在共同变化特征。已有研究提示,阴虚质存在肠道微生物失衡,及与细胞衰老经典NF-kB活化途径相关因子mRNA表达异常等现象。《黄帝内经》中记载女性在“五七”至“七七”年龄阶段具有逐渐衰老的特点,这一阶段属于女性的“渐衰期”。而阴虚质女性渐衰期肠道菌群是否参与基因共变化调控尚未证实。本课题基于“体衰相关论”,通过研究阴虚质女性渐衰期的多项血液生化指标以及肠道微生物的情况,揭示阴虚质女性渐衰期特有的生理特点和菌群特征,以此为基础研究宿主NF-κB信号通路相关基因mRNA的表达与肠道内微生物的共变化机制。方法:依据中华中医药学会2009年发布的《中医体质分类与判定》标准进行体质判定,选取年龄35-49周岁阴虚质和平和质女性各30名志愿者,采集血液和粪便样本。血液样本一部分运用生化法进行血液生化指标检测,另一部分使用Trizol试剂分离总RNA,反转录后用预混液将cDNA和引物采用qRT-PCR分析,研究编码TAK1,NFKBIA,CCL4,BCL2A1和IL8的mRNA相对表达水平。粪便采集完成后,提取样本的基因组DNA,使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,再做PCR处理。以PCR产物的浓度为依据等量混样,后用1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物,剪切回收目标条带,进行相关文库的构建后,开始16S rDNA测序。最后通过对肠道微生物检测定量各组样品中细菌的丰度和转录组mRNA表达量计算之间的皮尔森相关系数,找到它们的相关性,研究菌群与基因之间共变化的关系。结果:1.与平和质组相比,阴虚质组样本的TG、HGB、PDW、MPV、RDW-SD、P-LCR数值均较低,WBC、RDW-CV的数值均较高（P<0.05）,其中两组PDW、MPV、RDW-CV、RDW-SD、P-LCR的指标差异具有显着性（P<0.01）。2.在各水平上,与平和质组相比,阴虚质组具有独特的肠道菌群特征,在菌群的相对丰度,多样性,功能注释和代谢通路等多个方面存在差异。而肠道菌群物种相对丰度的差异性是两组肠道菌群各方面差异的物质基础,其中阴虚质组相对丰度较大（P<0.05）的微生物类别分别是:脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、不明蓝细菌科（unidentified Cyanobacteria）、互养菌科（Synergistaceae）、甲烷杆菌科（Methanobacteriaceae）、不明弧菌科（unidentified Victivallales）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）和优杆菌科（Eubacteriaceae）;刺骨鱼菌属（Epulopiscium）、不明蓝细菌属（unidentified Cyanobacteria）、芽孢杆菌属（Cloacibacillus）、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、不明弧菌属（unidentified Victivallales）、Sanguibacteroides菌属。阴虚质组相对丰度显着较大（P<0.01）的微生物类别分别是:蓝细菌门（Cyanobacteria）、互养菌门（Synergistetes）和广古菌门（Euryarchaeota）;变形菌纲（Deltaproteobacteria）、不明蓝细菌纲（unidentified Cyanobacteria）、互养菌纲（Synergistia）和甲烷杆菌纲（Methanobacteria）;脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）、不明蓝细菌目（unidentified Cyanobacteria）、互养菌目（Synergistales）、甲烷杆菌目（Methanobacteriales）和根瘤菌目（Rhizobiales）;不明根瘤菌科（unidentified Rhizobiales）;和草酸杆菌属（Oxalobacter）。阴虚质组相对丰度较小（P<0.05）的微生物类别分别是:弧菌目（Vibrionales）;弧菌科（Vibrionaceae）;粪芽孢菌属（Coprobacillus）,弧菌属（Vibrio）。阴虚质组相对丰度显着较小（P<0.01）的微生物类别分别是:梅迪巴特菌属（Merdibacter）。3.与平和质相比,阴虚质组中NFKBIA、CCL4mRNA表达显着上调,BCL2A1 mRNA显着下调（P<0.05）。同时相关基因的表达与阴虚质组的肠道菌群特征微生物存在较广泛的正相关关系,与平和质组肠道微生物存在负相关关系。结论:本课题以中医理论关于女子“五七”至“七七”的生理特征描述为切入点,将中医理论关于女性“天癸”衰老过程论和中医体质理论相结合,重点研究阴虚质女性“五七”至“七七”渐衰期的生理病理分子生物学特征,综合运用基因遗传学、微生物分子生态学和多变量统计分析方法,将反映先天遗传的基因表达与反映后天获得影响的肠道微生物关联起来,探明阴虚质女性渐衰期肠道菌群和基因共变化的部分调控机制。研究发现阴虚质女性渐衰期与平和质相比,在血液生化指标和肠道菌群方面存在一定差异性。阴虚质这种血液生化指标的特点可能反映了促炎因子在炎性衰老过程中起到的作用,且衰老程度重于平和质。另一方面,与平和质相比,阴虚质肠道菌群的差异性也是阴虚质人群衰老特征较其他体质更明显的原因之一。结合NF-κ B信号通路相关mRNA的表达结果分析,证实了相关基因存在与肠道菌群的共变化机制,同时与平和质相比,这种阴虚质的共变化特点是机体衰老倾向更高的原因之一。
林聪[10]（2020）在《PRMT1介导的组蛋白H4稳定性在细胞衰老中的作用和机制研究》文中提出细胞衰老是不可逆的细胞周期停滞过程。多种因素可以触发细胞衰老,包括端粒缩短、致癌信号传导、氧化应激和DNA损伤。衰老细胞的特征包括细胞周期停滞、激活DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）、增强衰老相关的分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype,SASP）、衰老相关的β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）活性提高和染色质结构变化。染色质结构的变化是通过改变其组成成分来介导的。例如,衰老的细胞显示出核小体的核心组蛋白H3和H4水平降低。已有研究表明,随着年龄的增长,在酵母和哺乳动物肝脏中,核糖体占有率的下降与基因表达的整体上调有关,而抑制核小体占有率的下降则延长了其寿命。这些研究表明衰老伴随组蛋白水平的改变。目前为止,组蛋白减少在细胞衰老中的作用和机制还远未阐明。PRMT1是哺乳动物细胞中一种重要的表观修饰酶,介导组蛋白H4第3位精氨酸的不对称二甲基化（H4R3me2as）,具有激活基因转录的作用。过去几十年的研究表明PRMT1与衰老密切相关。PRMT1可以甲基化DAF-16/FOXO,阻断AKT对其磷酸化,增加长寿相关基因的表达,从而延长秀丽隐杆线虫的寿命。在细胞水平,PRMT1功能缺失的细胞表现出细胞周期延迟,检查点激活,基因组不稳定和抑制细胞增殖。我们以前的研究也表明,敲低PRMT1会阻止乳腺癌细胞的生长并诱导细胞衰老。但是,PRMT1介导的H4R3me2as在细胞衰老中的作用仍然是未知的。我们本论文的研究发现,敲低PRMT1在诱导细胞衰老的同时,组蛋白H4的水平明显降低。随后,我们在Ras、Etoposide、H2O2诱导的细胞衰老中发现4种核心组蛋白均下调,而且组蛋白H4的下调要早于其他三种核心组蛋白,表明组蛋白H4下调可能是衰老的早期标志物。进一步的研究表明,组蛋白H4下调是由于其自身稳定性降低造成的;蛋白质免疫共沉淀证实组蛋白H4的泛素化水平并未发生改变,而蛋白酶体调节组分PA200与组蛋白H4的结合增强,表明PA200蛋白酶体途径介导组蛋白H4的降解。此外,我们发现PRMT1介导的H4R3me2as修饰的下调要早于组蛋白H4的降解;通过RNA干扰技术靶向PRMT1-3’UTR敲低内源的PRMT1,再外源过表达野生型的PRMT1抑制组蛋白H4的降解,而外源过表达酶活突变的PRMT1则没有;蛋白质免疫共沉淀和肽段pull down实验证实H4R3me2as修饰抑制PA200与组蛋白H4的结合,表明PRMT1介导的H4R3me2as修饰维持组蛋白H4的稳定。在分子机制方面,组蛋白H4的降解降低核小体占位,进而改变细胞内的基因表达网络,激活细胞周期抑制因子基因p21和GADD45A,SASP基因FGF2、MMP3、IL11和IGFBP7,抗凋亡基因BCL-XL和BCL-W的转录,最终导致细胞衰老。此外我们还发现,抗衰老药物二甲双胍、雷帕霉素和白藜芦醇能够抑制组蛋白H4降解,组蛋白H4的回复明显早于cyclinA2的回复、p21的降低以及SA-β-gal阳性细胞的比例下降,表明组蛋白H4可以作为抗衰老药物筛选的分子靶标。总之,本研究揭示了PRMT1介导的H4R3me2as通过调节组蛋白H4稳定性来调节细胞衰老的新功能。我们还发现组蛋白H4可以作为早期衰老指标和潜在的抗衰老药物筛选标志物,为衰老的早期鉴定和抗衰老药物筛选提供了重要理论基础。
二、复制衰老的分子生物学进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、复制衰老的分子生物学进展（论文提纲范文）
（1）血管抗衰方通过miR-146a/TRAF6/NF-κB改善血管衰老机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 |
| 综述一 血管衰老研究进展 |
| 综述二 人参三七应用沿革及血管抗衰方配伍理论基础 |
| 前言 |
| 第一部分 利用生物信息学方法筛选衰老内皮细胞差异表达miRNA及血管抗衰方延缓血管衰老作用靶点预测研究 |
| 第一章 基于GEO数据库筛选衰老内皮细胞差异表达miRNA |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第二章 差异表达miRNA下游靶基因及作用通路预测和筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学预测血管抗衰方改善血管衰老作用靶点 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第二部分 血管抗衰方干预血管衰老临床试验及miR-146a/TRAF6/NF-κB调控关系初步验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第三部分 血管抗衰方调控miR-146a/TRAF6/NF-κB干预衰老内皮细胞作用机制研究 |
| 第一章 药物诱导衰老细胞模型构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第二章 药物干预内皮细胞衰老机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 中医药科技查新报告书 |
（2）基于网络药理学研究当归补血汤延缓衰老的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩写词(Abbreviations) |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 衰老的研究进展 |
| 1.1.1 衰老的相关学说 |
| 1.1.2 抗衰老的研究进展 |
| 1.2 当归补血汤的抗衰老作用 |
| 1.3 网络药理学的发展 |
| 1.4 本课题的研究内容、目的和意义 |
| 第2章 通过网络药理学预测当归补血汤延缓衰老的作用机制 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 当归补血汤有效成分和靶点的筛选 |
| 2.2.2 衰老靶点的获取 |
| 2.2.3 蛋白相互作用网络(PPI)的构建 |
| 2.2.4 核心靶点分析 |
| 2.2.5 基因和通路的富集分析 |
| 2.2.6 化合物-靶点-作用通路网络的构建 |
| 2.2.7 成分-靶点分子对接 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 活性化合物的筛选 |
| 2.3.2 药物与疾病的交集靶点 |
| 2.3.3 PPI网络的构建与核心靶点的获取 |
| 2.3.4 基因功能与通路分析 |
| 2.3.5 化合物-靶点-作用通路网络的构建 |
| 2.3.6 核心靶点的分子对接结果 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 第3章 当归补血汤对衰老大鼠的肝肾功能及造血机能的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 药材和试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 当归补血汤的制备 |
| 3.2.2 大鼠衰老模型的建立及取材 |
| 3.2.3 当归补血汤对衰老大鼠外观、体重及脏器系数的影响 |
| 3.2.4 肝肾组织匀浆制备 |
| 3.2.5 BCA法检测匀浆中蛋白含量 |
| 3.2.6 当归补血汤对衰老大鼠抗氧化相关指标的影响 |
| 3.2.7 当归补血汤对肝肾功能的影响 |
| 3.2.8 当归补血汤对衰老大鼠造血机能的影响 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 大鼠一般状态及外观变化观察 |
| 3.3.2 当归补血汤对衰老大鼠体重的影响 |
| 3.3.3 当归补血汤对衰老大鼠脏器系数的影响 |
| 3.3.4 当归补血汤对衰老大鼠的抗氧化保护作用 |
| 3.3.5 当归补血汤对肝肾功能的影响 |
| 3.3.6 当归补血汤对衰老大鼠外周血和骨髓造血机能的影响 |
| 3.4 讨论与结论 |
| 第4章 当归补血汤延缓衰老的作用机制验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 当归补血汤对衰老大鼠免疫功能的作用 |
| 4.2.2 Western blot方法检测通路中各蛋白的表达 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 当归补血汤对炎症相关蛋白表达的影响 |
| 4.3.2 归芪多糖对衰老大鼠T淋巴细胞相关凋亡蛋白因子的影响 |
| 4.3.3 当归补血汤对衰老大鼠各蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论与结论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
| 附录B 溶液的配制 |
（3）LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:LncMEG3 促进依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老 |
| 1 前言 |
| 1.1 细胞衰老 |
| 1.2 Lnc RNA-MEG3 |
| 1.3 立题依据 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 主要溶液配制 |
| 2.2.3 依托泊苷诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 2.2.4 Western blot检测目的蛋白的表达水平 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测目的基因mRNA的表达水平 |
| 2.2.6 SA-β-gal衰老染色 |
| 2.2.7 si RNA转染 |
| 2.2.8 质粒转染 |
| 2.3 GEO数据下载 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 低剂量依托泊苷可以诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 3.2 使用不同方法验证依托泊苷诱导的A549 及MCF-7 细胞衰老模型 |
| 3.3 LncMEG3 在肿瘤细胞衰老模型中表达升高 |
| 3.4 LncMEG3 可以调控肿瘤细胞衰老 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:LncMEG3 通过miR-16-5p/VGLL4 轴调控肿瘤细胞衰老过程 |
| 1 前言 |
| 1.1 Micro RNA-16-5p |
| 1.2 VGLL4 |
| 1.3 VGLL4 作为共转录因子与YAP竞争性结合下游转录因子 |
| 1.4 立题背景 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 主要溶液配制 |
| 2.2.3 依托泊苷诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 2.2.4 Western blot检测目的蛋白的表达水平 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测目的基因m RNA的表达水平 |
| 2.2.6 SA-β-gal衰老染色 |
| 2.2.7 siRNA转染 |
| 2.2.8 质粒转染 |
| 2.2.9 免疫荧光 |
| 2.2.10 双荧光素酶报告基因系统 |
| 2.2.11 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提 |
| 2.3 Starbase数据库的使用 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 共转录因子VGLL4 在肿瘤细胞衰老过程中在细胞核内及总表达水平均上调 |
| 3.2 在肿瘤细胞衰老过程中,lnc MEG3 通过发挥海绵效应,调控miR-16-5p的表达 |
| 3.3 MiR-16-5p参与了肿瘤细胞衰老过程 |
| 3.4 VGLL4 在肿瘤细胞衰老过程中是miR-16-5p的直接靶基因 |
| 3.5 VGLL4 参与了肿瘤细胞衰老过程的调控 |
| 3.6 在肿瘤细胞衰老过程中VGLL4 的表达水平受lnc MEG3 的调控 |
| 3.7 在依托泊苷诱导的A549及MCF-7 细胞衰老模型中,lnc MEG3 通过miR5p/VGLL4 轴发挥调控作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 LncRNAs与细胞衰老的相关性及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 端粒 |
| 1.2 端粒酶概述 |
| 1.2.1 端粒酶的发现 |
| 1.2.2 端粒酶的结构组成 |
| 1.2.3 端粒酶的生物学特性 |
| 1.2.4 端粒酶与衰老及疾病 |
| 1.3 端粒酶结构研究进展 |
| 1.3.1 赤拟谷盗TERT晶体结构 |
| 1.3.2 四膜虫端粒酶电镜结构 |
| 1.3.3 人端粒酶电镜结构 |
| 1.4 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 基因及引物 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 实验试剂与耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 常用溶液及培养基的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因克隆与载体构建 |
| 2.2.2 蛋白表达纯化 |
| 2.2.3 RNA体外转录与纯化 |
| 2.2.4 端粒酶延伸活性测定 |
| 2.2.5 动态光散射实验(DLS) |
| 2.2.6 分子筛排阻层析实验(SEC) |
| 2.2.7 蛋白酶切消化实验 |
| 2.2.8 氨基酸和RNA序列的生物信息学分析 |
| 2.2.9 晶体的获得 |
| 2.2.10 晶体数据收集与解析 |
| 2.2.11 等温滴定实验(ITC) |
| 2.2.12 X射线小角散射实验(SAXS) |
| 2.2.13 分子建模(Molecular modelling) |
| 第三章 假丝酵母端粒酶逆转录酶体外活性研究 |
| 3.1 Candida TERT体外不具有反复合成能力 |
| 3.2 Candida TERT体外延伸活性不依赖PK和 TWJ |
| 3.3 Candida TERT体外具有典型的逆转录酶功能 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Candida TERT晶体的获得与结构解析 |
| 4.1 CtTERT晶体的获得与衍射数据的收集及结构解析 |
| 4.1.1 CtTERT晶体初筛与优化 |
| 4.1.2 CtTERT晶体数据收集与结构解析 |
| 4.2 CaTERT晶体的获得与衍射数据的收集及结构解析 |
| 4.2.1 CaTERT晶体初筛与优化 |
| 4.2.2 CaTERT晶体数据收集及结构解析 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 Candida TERT结构与功能分析 |
| 5.1 Candida TERT晶体结构分析 |
| 5.1.1 CtTERT晶体结构分析 |
| 5.1.2 CaTERT晶体结构分析 |
| 5.2 CTE domain结构与功能分析 |
| 5.2.1 CTE空间构象的灵活变化是TERT的内在属性 |
| 5.2.2 CTE的转动可以使RNA-DNA杂交双链解离并调节端粒酶的合成能力 |
| 5.3 U-motif结构与功能分析 |
| 5.3.1 U-motif的结构特征 |
| 5.3.2 U-motif调控端粒DNA的合成 |
| 5.4 端粒酶合成端粒DNA的分子机制 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 讨论与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.2 展望 |
| 6.2.1 酵母全长TERT的空间结构 |
| 6.2.2 端粒酶小分子抑制剂的筛选 |
| 6.2.3 端粒酶全酶的工作机制 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）Apelin通过AMPK/Autophagy通路调控间充质干细胞衰老的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料与仪器 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 AMSCs的增殖能力降低 |
| 2 AMSCs出现细胞衰老状态 |
| 3 AMSCs中 Apelin低表达且自噬功能受损 |
| 4 Apelin通过Autophagy调控MSCs衰老 |
| 5 AMSCs中过表达Apelin,自噬功能恢复,细胞年轻化 |
| 6 Apelin通过激活AMPK信号通路提高Autophagy |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 主要英文缩略词表 |
| 附录 B 常用试剂配制方法 |
| 附录 C 个人简历 |
| 附录 D 综述 间充质干细胞衰老现状 |
| 参考文献 |
（6）基于氧化应激探讨槲皮素防治椎间盘退变的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 髓核细胞衰老退变模型的构建与评估 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 (一)槲皮素抑制氧化应激诱导髓核细胞衰老及衰老相关分泌表型 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 (二)槲皮素通过p38MAPK介导的自噬抑制髓核细胞衰老和衰老相关分泌表型 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 槲皮素减轻大鼠椎间盘退变的实验研究 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞衰老及衰老相关分泌表型在椎间盘退变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（7）基于衰老分子机制探讨脾虚证-补中益气汤相关的生物学基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 “方证相关”研究进展 |
| 前言 |
| 1 方证相关的文献研究与数据挖掘 |
| 2 方证相关的临床应用 |
| 3 方证相关的实验探索 |
| 4 方证相关的生物信息学研究 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 脾虚证与衰老相关的研究进展 |
| 1 脾虚与衰老关系的中医学认识 |
| 2 脾虚与衰老相关性的临床研究进展 |
| 3 脾虚与衰老相关性的实验研究进展 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 补中益气汤现代研究进展 |
| 1 补中益气汤的临床应用 |
| 2 补中益气汤药理研究 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 研究一 脾虚证分子内涵与补中益气汤作用相关的网络药理学研究 |
| 1 数据库及软件 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 脾虚证演变与衰老相关的探讨 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究三 从衰老探察脾虚证现代内涵及补中益气汤的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 立论背景及研究思路 |
| 2 脾虚模型大鼠的衰老样变及其生物学表征 |
| 3 脾虚证脑衰老样变的炎性损伤机制 |
| 4 补中益气汤的抗衰作用及其分子机制 |
| 5 研究创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）中医体质分类辨识及肾阳虚体质线粒体基因SNP研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要专业词汇缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 中医体质分类辨识研究 |
| 1.研究方法 |
| 1.1 古代文献来源 |
| 1.2 检索方法 |
| 1.3 资料摘录 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 体质形成的影响因素 |
| 2.1.1 体质秉承于先天——先天为主 |
| 2.1.2 体质得养于后天——后天为辅 |
| 2.2 中医体质内涵 |
| 2.2.1 体质古代内涵 |
| 2.2.2 体质现代内涵 |
| 2.3 中医体质分类 |
| 2.3.1 中医体质分类古代研究 |
| 2.3.2 中医体质分类现代研究 |
| 2.4 中医体质辨识 |
| 2.4.1 中医体质辨识古代研究 |
| 2.4.2 中医体质辨识现代研究 |
| 2.5 中医体质分类辨证体系框架 |
| 3.讨论 |
| 3.1 “身心合一”是中医体质的核心思想 |
| 3.2 基于体质分类辨识体系的智能化辨识设想 |
| 3.2.1 以外貌体态为基础——借鉴生物识别技术 |
| 3.2.2 以舌、脉诊信息为参考——加快仪器研发 |
| 3.2.3 以生物学指标为参考——筛选体质生物标志物 |
| 3.2.4 以体质问卷为辅助——完善体质量表 |
| 第二部分 肾阳虚体质线粒体基因SNP研究 |
| 1.研究方法 |
| 1.1 受试者纳入 |
| 1.1.1 肾阳虚体质判定 |
| 1.1.2 纳入标准 |
| 1.1.3 排除标准 |
| 1.1.4 伦理审查 |
| 1.2 样本采集 |
| 1.3 实验试剂和设备 |
| 1.3.1 实验主要试剂 |
| 1.3.2 实验主要器材 |
| 1.4 样本线粒体DNA抽提与质检 |
| 1.4.1 线粒体DNA的抽提与纯化 |
| 1.4.2 样本质检 |
| 1.5 线粒体DNA全测序 |
| 1.5.1 测序文库构建 |
| 1.5.2 文库质检 |
| 1.5.3 Cluster生成 |
| 1.5.4 上机测序 |
| 1.6 数据分析 |
| 1.6.1 数据库信息及数据分析程序 |
| 1.6.2 数据分析方法 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 肾阳虚体质受试者体质评分 |
| 2.2 肾阳虚体质受试者样本质检 |
| 2.3 数据分析结果 |
| 2.3.1 原始数据质量评估结果 |
| 2.3.2 测序序列质量评估结果 |
| 2.3.3 Indel检测统计结果 |
| 2.3.4 SNP检测统计结果 |
| 2.3.5 突变位点注释 |
| 3 讨论 |
| 3.1 线粒体功能不良是肾阳虚体质生物学基础研究新的切入点 |
| 3.2 线粒体基因组遗传特性 |
| 3.2.1 线粒体具有独立的遗传系统且基因突变率高 |
| 3.2.2 线粒体基因非编码调控区在复制和转录中起着重要作用 |
| 3.2.3 线粒体遵循较为严格的母系遗传规律 |
| 3.3 线粒体基因突变是对肾阳虚体质临床表现产生机制的有效阐释 |
| 3.3.1 能量代谢紊乱 |
| 3.3.2 生长发育异常 |
| 3.3.3 生殖功能减退 |
| 3.3.4 异常情绪状态 |
| 3.3.5 肾阳虚体质与遗传疾病 |
| 3.4 线粒体基因SNP位点与肾阳虚体质辨识 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件一:综述 肾阳虚证候及体质分子生物学基础研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二:肾阳虚体质判定标准表 |
| 附件三:伦理审查批件 |
| 附件四:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（9）阴虚质女性渐衰期的肠道菌群与宿主NF-κB信号通路共变化机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要中英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医体质与衰老的关系研究 |
| 1 衰老相关研究概况 |
| 2 中医体质与衰老的相关性研究 |
| 3 阴虚体质的相关研究 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 人肠道菌群与衰老的关系研究 |
| 1 肠道菌群的检测方法 |
| 2 肠道菌群与衰老相关性的研究现状 |
| 3 从肠道菌群的角度研究中医体质 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 肠道菌群与宿主NF-κB信号通路共变化研究概况 |
| 1 NF-κB信号通路的研究现状 |
| 2 NF-κB信号通路与衰老的关系 |
| 3 肠道菌群与宿主NF-κB信号通路的共变化研究 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 阴虚质女性渐衰期的血液生化指标特征研究 |
| 1 研究方法 |
| 2 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 结论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于16S rDNA测序技术的阴虚质女性渐衰期肠道菌群特征研究 |
| 1 研究方法 |
| 2 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 结论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 阴虚质女性渐衰期NF-κB信号通路mRNA的表达与肠道菌群的共变化机制研究 |
| 1 研究方法 |
| 2 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 结论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 《中医体质量表(2009版)》 |
| 附录2 《中医体质分类与判定》 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 1 发表论文 |
| 2 参加科研课题 |
（10）PRMT1介导的组蛋白H4稳定性在细胞衰老中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 引言 |
| 一、细胞衰老 |
| (一)细胞衰老简介 |
| (二)细胞衰老的生物标志物 |
| (三)细胞衰老的诱因 |
| 二、染色质结构和组蛋白修饰改变调控衰老的机制 |
| (一)染色质结构改变与衰老 |
| (二)组蛋白修饰在衰老过程中的变化 |
| 三、精氨酸甲基转移酶 |
| (一)精氨酸甲基化修饰 |
| (二)PRMTs家族简介 |
| (三)精氨酸甲基转移酶PRMT1的功能 |
| 四、抗衰老药物的研究进展 |
| (一)二甲双胍的抗衰老作用 |
| (二)雷帕霉素的抗衰老作用 |
| (三)白藜芦醇的抗衰老作用 |
| 五、本论文研究内容及意义 |
| (一)立题依据 |
| (二)研究内容及意义 |
| 第二部分 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验仪器 |
| (二)试剂 |
| (三)试剂盒 |
| (四)抗体 |
| (五)质粒 |
| (六)细胞系 |
| 二、实验方法 |
| I、分子生物学实验方法 |
| (一)表达质粒的构建 |
| (二)干涉质粒的构建 |
| (三)质粒提取 |
| (四)RNA提取、反转录和Real-time RT-PCR |
| (五)免疫印迹(Western Blot) |
| (六)免疫共沉淀(Co-IP) |
| (七)染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP) |
| (八)肽段pull down实验 |
| (九)微球菌核酸酶实验 |
| II、细胞生物学实验方法 |
| (一)细胞培养 |
| (二)细胞瞬时转染 |
| (三)慢病毒包装和侵染 |
| (四)衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验 |
| (五)免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| III、免疫组化(IHC) |
| IV、统计分析 |
| 第三部分 实验结果与分析 |
| 一、敲低PRMT1诱导成纤维细胞衰老以及组蛋白H4降低 |
| (一)敲低PRMT1 诱导人二倍体成纤维细胞IMR90 衰老以及组蛋白H4降低 |
| (二)敲低PRMT1 诱导人皮肤成纤维细胞CRL-1474 衰老以及组蛋白H4降低 |
| 二、组蛋白H4在细胞及个体衰老过程中优先降低 |
| (一)组蛋白H4在细胞衰老过程中优先降低 |
| (二)组蛋白H4在个体衰老过程中优先降低 |
| (三)组蛋白H4在静息状态和凋亡过程中无明显改变 |
| 三、PA200-蛋白酶体途径介导衰老过程中组蛋白H4的降解 |
| (一)H_2O_2处理或敲低PRMT1的IMR90细胞中H4的mRNA水平无变化 |
| (二)蛋白酶体途径介导组蛋白H4的降解 |
| (三)PA200蛋白酶体激活因子介导组蛋白H4的降解 |
| 四、PRMT1 介导的H4R3me2as修饰维持组蛋白H4 的稳定 |
| (一)PRMT1 介导的H4R3me2as修饰的下调要早于组蛋白H4 降解 |
| (二)PRMT1 介导的H4R3me2as修饰维持组蛋白H4 的稳定 |
| 五、组蛋白H4降解促进衰老相关基因表达 |
| (一)组蛋白H4降解促进核小体占位降低 |
| (二)组蛋白H4降解改变细胞内整体的基因表达网络 |
| (三)组蛋白H4降解激活细胞周期抑制子基因、SASP基因和抗凋亡基因表达 |
| 六、组蛋白H4可以作为潜在的抗衰老药物筛选标志物 |
| (一)抗衰老药物二甲双胍、雷帕霉素和白藜芦醇抑制组蛋白H4降解 |
| (二)组蛋白H4作为抗衰老药物筛选标志的优势 |
| 第四部分 讨论 |
| 一、PRMT1 介导的H4R3me2as维持组蛋白H4 的稳定性 |
| 二、PRMT1 介导的H4R3me2as与其他组蛋白修饰之间的crosstalk |
| 三、组蛋白H4降解与细胞衰老 |
| 四、组蛋白H4作为细胞衰老标志物和抗衰老药物筛选靶标的优越性 |
| 主要结论和创新点 |
| 一、主要结论 |
| 二、创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
四、复制衰老的分子生物学进展（论文参考文献）
- [1]血管抗衰方通过miR-146a/TRAF6/NF-κB改善血管衰老机制研究[D]. 王靖怡. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]基于网络药理学研究当归补血汤延缓衰老的作用机制[D]. 陈博. 兰州理工大学, 2021(01)
- [3]LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老[D]. 陶冶. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构与功能研究[D]. 翟留涛. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]Apelin通过AMPK/Autophagy通路调控间充质干细胞衰老的机制研究[D]. 张浩. 蚌埠医学院, 2021(01)
- [6]基于氧化应激探讨槲皮素防治椎间盘退变的实验研究[D]. 张树文. 新疆医科大学, 2021(01)
- [7]基于衰老分子机制探讨脾虚证-补中益气汤相关的生物学基础[D]. 朱昊如. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]中医体质分类辨识及肾阳虚体质线粒体基因SNP研究[D]. 何林熹. 成都中医药大学, 2020(01)
- [9]阴虚质女性渐衰期的肠道菌群与宿主NF-κB信号通路共变化机制研究[D]. 刘齐. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]PRMT1介导的组蛋白H4稳定性在细胞衰老中的作用和机制研究[D]. 林聪. 东北师范大学, 2020(01)