一、HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建与筛选（论文文献综述）
陈鑫烨[1]（2020）在《牛病毒性腹泻病毒抗原表位的筛选及其单克隆抗体的制备》文中指出牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）感染引起的一种以腹泻、粘膜溃疡为主要特征的接触性传染病。BVDV的天然宿主为牛,此外,还可以感染羊驼、绵羊、山羊、猪、骆驼、鹿、小鼠等40多种动物,是给全球畜牧业造成重大经济损失的重要病原。目前,BVDV在我国部分地区广泛流行,而我国尚无自主研发的商品化快速检测试剂,缺少有效的治疗和防控技术。随着我国集约化养殖业的发展,BVDV对我国养殖业的危害也将进一步扩大。因此,建立快速、有效的抗原/抗体检测方法对BVDV的防控意义重大。本研究通过对河南省7个地级市的部分养牛场进行了 BVDV流行病学调查,共检测了 429份牛血清,BVDV抗体阳性率高达64.34%,阴性检出率为32.63%,可疑检出率为3.03%,结果表明牛群中确实存在BVDV的感染与流行,并且流行情况较严重,应当引起重视。鉴于BoHV-1感染激发BVDV感染,两者混合感染后可以引起肺炎,死亡率较高。已知众多HDAC抑制剂在临床上已经被广泛应用,并且发现具有抗病毒和抑制炎症反应的作用。本文旨在从中筛选针对两者均具有抗病毒作用和抑制炎症相关信号的药物,以期用于BRDC的治疗。在本研究中,我们筛选到苯丙酸具有抑制BoHV-1复制的活性,但是能够激活炎症反应相关信号,故苯丙酸不具备治疗价值。因此,放弃对BVDV抗病毒作用进行研究。初步研究表明,苯丙酸不适合用于BVDV/BoHV-1引起的BRDC的治疗。获得BVDV B细胞表位对于疫苗研究及检测方法的建立均具有重要意义。本研究利用商品化的BVDV抗血清对噬菌体随机展示肽文库进行了 3轮淘选（吸附-洗脱-扩增）,对第三轮洗脱物进行滴定,随机挑选100个克隆并对其提取噬菌体DNA进行测序,经序列分析获得多个与阳性血清反应的噬菌体克隆（尽管部分克隆用于抗体检测试纸条的研究已申请专利,但是根据相关克隆获得的病毒表位的免疫学功能尚未完全得到验证,专利尚未提交申请,因此本论文中所有来自噬菌体的序列及病毒多肽氨基酸序列暂时不公布）。其中,噬菌体表位P3共重复出现了 35次,相对而言可能具有重要研究价值,所以本研究主要对P3及由P3推导的病毒表位（命名为P3-BVDV1/2）进行研究。用Dot-blot的方法进一步确定噬菌体P3与商品化BVDV抗体结合。根据噬菌体DNA测序与抗原表位鉴定结果,将源于噬菌体的模拟表位P3及P3-BVDV1/2的氨基酸序列送至生物公司合成相应多肽。然后将多肽分别与BSA和KLH偶联,用Western-blot或Dot-blot的方法进一步确定合成多肽与BVDV抗体的结合,结果表明P3及P3-BVDV1/2均能够与BVDV抗血清反应。以KLH-P3及KLH-P3-BVDV1/2免疫BALB/C小鼠,采集三免后的小鼠血清,经Dot-blot确定该血清能够与BVDV结合。结果表明,通过该文库筛选的多肽P3及P3-BVDV1/2也具有免疫原性。为了制备针对P3-BVDV1/2表位的单克隆抗体,根据Dot-blot原理,我们建立了一种快速、有效的筛选单克隆抗体的实验方法,将其命名为Dot-blot in well ECL。尽管本方法与传统方法一样也具有非特异性的缺陷,但是经过连续3次严格筛选,最终获得了一株针对P3-BVDV1/2的单克隆抗体,命名为11G9D10。测其轻链亚型为Kappa,重链亚型为IgM。利用该单克隆抗体进行胶体金标记,发现并不能与细胞培养的病毒反应,所以该单克隆抗体不能用于抗原检测试纸条的制备,所以有关该抗体的免疫学反应特性如亲和力等均无深入鉴定的价值。但是,整个过程证明该筛选的表位能诱导机体产生抗体,该表位或许具有潜在的疫苗研究价值。综上所述,尽管本研究未能获得理想的抗病毒药物,也未获得有价值的单克隆抗体,但是我们筛选到了部分BVDV表位,可能具有疫苗研究价值。另外,针对BVDV的血清学调查结果表明该病毒的确在河南省广泛流行,值得广大科研工作者投入更多的精力对该病毒的防控技术加强研究。
付鹏德[2]（2019）在《9R-P201与DOX联合用药对肝癌细胞的抑制作用及抗耐药机制研究》文中认为癌症已经成为危害人类生命健康的重大疾病之一,尤其对于亚洲人群而言,肝癌HCC的预防与治疗尤为重要。DOX作为肝癌治疗的临床一线药物,因其极易出现耐药性、剂量依赖性疗效和强的毒副作用,已经无法满足HCC患者治疗的需求,因此寻求新的分子靶向药物与合理的药物联合治疗方案设计成为肝癌治疗新的发展方向。FoxM1是一类高表达于各种肿瘤组织的,广泛参与肿瘤发生发展的转录激活因子,被誉为“癌症的致命伤”,是开发癌症治疗药物的极具潜力的重要靶点之一。P201是本实验室前期通过噬菌体展示技术,以FoxM1-DBD为直接靶点从成熟的噬菌体随机十二肽库中筛选得到的分子靶向多肽,前期实验发现简单修饰后的多肽9R-P201对肝癌细胞具有较强的抑制作用。本课题以肝癌细胞HepG2-C3A为主要研究对象,以降低DOX用药剂量和耐药性为主要目的,首先通过体外细胞增殖抑制率实验发现:9R-P201、DOX都可抑制肝癌HepG2-C3A细胞的增殖,其中DOX对肝癌细胞HepG2-C3A的增殖抑制率表现为剂量和时间依赖关系;分别设计联用浓度及作用时间梯度研究,结果发现9R-P201与DOX最佳联用方案为先加入9R-P201（60.0μg/mL）处理12小时,后加DOX（0.2μg/mL）共同处理24h,共36h。其次运用AO/EB双染、流式细胞仪凋亡检测、qRT-PCR、Western blot等分子生物学手段证实:与DOX单独用药组相比,9R-P201与DOX联合处理组可明显促进肝癌HepG2-C3A细胞凋亡,并通过下调FoxM1的表达,从而下调MDR1、ABCG2等耐药相关蛋白质的表达,使得HepG2-C3A细胞对DOX的耐药性降低。为进一步研究FoxM1的调控作用,我们通过慢病毒转染技术构建过表达FoxM1-c的稳定细胞株。其中重组载体测序所得序列信息与NCBI数据库序列比对结果为PCR扩增序列仅有三个同义突变点,其他均保持一致;293T慢病毒包装实验浓缩收集的病毒液经倍比稀释法测定滴度为:5.6×108 TU/mL;后转染HepG2-C3A细胞,经过嘌呤霉素筛选,与荧光显微镜下观察有绿色荧光,成功获得稳定过表达FoxM1-c的HepG2-C3A细胞株。为获得较P201具有更高抑癌效果的小分子靶向多肽,最后研究以重组表达的FoxM1-DBDp为靶标,通过四轮生物淘选,从噬菌体随机十二肽库中筛选获得了15条多肽序列;反筛测定发现有5条多肽序列P/N值较高,DS3.0分子动力学对接模拟发现:P15序列与FoxM1-DBD具有最低的结合自由能,具有进一步的研究价值。综上所述,9R-P201与DOX联合作用可以明显增强DOX对肝癌HepG2-C3A细胞的促凋亡作用,并通过下调FoxM1的表达使得MDR1、ABCG2等耐药相关蛋白的表达下调,从而使HepG2-C3A细胞对DOX的耐药性降低,表明9R-P201与DOX联合用药在肝癌优化治疗研究领域具有巨大的潜力;同时设计完成了过表达FoxM1-c的HepG2-C3A细胞株,为进一步深入研究奠定基础,最后以FoxM1-DBDp DNA结合结构域目的蛋白为靶标,从噬菌体随机十二肽库中筛选获得了15条多肽序列,为寻找更强疗效的分子靶向多肽提供重要的前期工作基础。
张庆明[3]（2013）在《阻断水貂肠炎细小病毒感染F81细胞的多肽筛选与验证》文中提出水貂肠炎细小病毒（MEV）是细小病毒科，细小病毒属成员，该病毒能够使水貂患上急性、烈性、高度接触性的病毒性肠炎，临床症状主要表现为剧烈腹泻。1949年该病最早由Schofield报道发生于加拿大，1952年Wills从病料中分离得到该病原，并命名为MEV。随后该病传播到美国、丹麦、芬兰、挪威、瑞士、英国和日本。我国有关MEV的最早报道是在1974年。目前，病毒性肠炎己经成为危害水貂养殖的重要疫病之一，给水貂养殖业带来巨大的经济损失。噬菌体随机肽库是将大量随机合成的寡核苷酸片段克隆到噬菌体外壳蛋白基因中，从而把各种随机多肽表达展示于噬菌体的表面的一种工具。噬菌体随机肽库现在已经成为筛选有效的抗病毒多肽的重要分子生物学工具。本实验旨在以纯化的完整病毒粒子为靶分子，用以淘选噬菌体随机肽库，以期获得能够与MEV特异性结合并且能够抑制病毒侵染宿主细胞的多肽，为研制新型的抗病毒制剂或者饲料添加剂奠定基础。本研究从患出血性肠炎的病死水貂中分离鉴定得到一株水貂肠炎细小病毒，经PCR鉴定，病原确定无误。对该病毒的主要衣壳蛋白VP2基因克隆到pMD18-T载体上进行了测序，并且将其与已知的MEV的VP2基因进行了同源率分析和氨基酸突变分析，结果表明该病毒的328位氨基酸残基由疏水性丙氨酸突变为亲水性苏氨酸。构建进化树结果表明，该病毒与近几年在中国流行的MEV毒株亲缘关系较近。随后对该病毒进行了大量培养，通过PEG沉淀的方法对其进行了浓缩和纯化，为噬菌体随机肽库的筛选打下了较好的基础。利用纯化的MEV病毒颗粒对噬菌体随机肽库进行筛选。三轮筛选后，噬菌体出现了明显的富集。利用ELISA对三轮筛选过后随机挑选的30个噬菌体单克隆的亲和力进行了进一步的鉴定，获得了12个高亲和力的噬菌体单克隆。对这12个噬菌体的体外抗病毒能力进行了检测，发现阳性克隆的抗病毒能力及其与MEV的亲和力不呈平行关系。提取这12个噬菌体单克隆的基因组，测序获知其所展示的相应多肽的序列，对多肽的序列进行了同源性分析，利用在线数据库软件预测分析了多肽特性和功能，最终确定序列Pr和Pl作为进一步活性验证的对象。人工化学合成了多肽Pr和Pl，首先测定了其对F81细胞的细胞毒性，确定了其无毒浓度。在无毒浓度的范围下，对多肽的抗病毒能力进行了检测，通过测定病毒的TCID50表明，两个多肽具有很好的抑制病毒繁殖的能力。通过不同时期将多肽和病毒液混合的方法，证明了多肽的作用方式是阻滞病毒与宿主细胞的结合或阻止病毒向宿主细胞内侵入，而对于病毒吸附后的复制过程没有明显的抑制作用。最后对多肽的特异性进行了检测，发现多肽对CPV和FPV亦具有一定的抗病毒作用，但是对CDV却没有抗病毒作用。本研究成功地分离得到一株MEV病毒，并利用噬菌体随机十二肽库技术筛选得到两个多肽，验证了其抗病毒能力和作用方式，为实现利用多肽预防或治疗MEV感染奠定了实验基础。
曾燚华[4]（2012）在《生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察》文中指出研究背景生殖支原体（Mycoplasma genitalium, Mg）是近年新明确的一种性病病原体，研究表明，Mg可能引起泌尿生殖道感染，与盆腔炎、呼吸道感染、关节炎等疾病有关，并可导致不育。另外，Mg还是引起艾滋病患者发生机会感染的主要病原体之一，被称为AIDS相关支原体。对于Mg的感染，目前仍然没有满足临床需要的疫苗可供使用，临床上急需安全、有效的疫苗以用于预防Mg的感染。生殖支原体粘附素蛋白（MgPa）是位于其尖形结构的一种主要的粘附素，其C端具有很强的免疫原性（最强区位于第1248～1364aa）。因此，MgPa是一种重要的中和抗原，在Mg的诊断和预防中起着重要的作用。本研究拟利用噬菌体展示随机肽库技术筛选MgPa的模拟表位，采用多抗原肽（MAP）的设计方案，制备并纯化含有模拟表位的八分枝MAP，并对其免疫原性进行研究。研究目的表达并纯化含生殖支原体MgPa优势表位(1075～1364aa的重组蛋白（rMgPa），制备并纯化rMgPa的多克隆抗体（pAb），以此pAb为靶分子，利用噬菌体展示随机12肽库筛选并鉴定MgPa的模拟表位，为研究MgPa的抗原表位结构提供实验依据；制备含有多个模拟表位的多抗原肽（MAP），检测其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答水平，为研制安全、有效的基于多个抗原表位的Mg表位肽疫苗奠定实验基础。研究方法（1）利用构建好的原核表达载体PET-30a（+）/MgPa在大肠杆菌中诱导表达MgPa的重组蛋白，并用ELISA、SDA-PAGE和Western blot等方法对其进行鉴定，再用Ni-NAT亲和层析柱纯化重组蛋白，用BCA法测定重组蛋白的浓度。（2）将经纯化的重组蛋白免疫新西兰兔以制备其相应的pAb，用饱和硫酸铵法和溴化氰活化的琼脂糖4B亲和层析柱纯化pAb，用间接ELISA法检测免疫兔血清中pAb的效价，再用Western blot鉴定pAb的特异性和免疫原性。（3）以此pAb为靶分子对噬菌体展示随机12肽库进行4轮生物淘洗，随机挑取经淘洗后的噬菌体克隆进行扩增培养，提取并纯化其单链DNA进行DNA测序分析，推导出噬菌体表面展示的外源性氨基酸序列，并用MIMOX工具进行生物信息学分析。用ELISA、竞争性结合试验和Western blot等方法检测噬菌体与pAb结合的特异性。（4）以多聚赖氨酸为核心基质，人工合成含有筛选到的模拟表位的八分枝MAP，用反向高效液相色谱（RP-HPLC）分析MAP的纯度，再用质谱分析仪测定MAP的分子量以期对其进行鉴定。（5）将30只6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为PBS组、WP组、AS组、KH组和混合组，将100L PBS或100g各种合成的MAP或其混合物分别经皮下多点注射免疫小鼠，共免疫4次，每间隔2w免疫1次。每次于免疫前1天剪尾取血，末次免疫后第14d摘眼球放血收集小鼠血清，无菌制备脾细胞悬液。（6）间接ELISA测定小鼠血清中的特异性IgG抗体及其亚类的水平；ELISA检测脾细胞培养上清中的IL-4和IFN-γ水平；MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖反应。研究结果（1）SDS-PAGE显示，IPTG诱导转化有PET-30a（+）／MgPa的大肠杆菌成功表达了一分子量约为37kD的含6×His的融合蛋白rMgPa，经Ni-NAT亲和纯化获得了较高纯度的目的蛋白，目的蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，BCA法测定经纯化的目的蛋白浓度达到1160μg/mL。（2）利用纯化的经复性后的rMgPa免疫新西兰兔后获得了相应的pAb，间接ELISA结果显示血清中特异性pAb的效价为1∶25600；Western blot的结果表明rMgPa能与免疫血清发生特异性结合；免疫血清经饱和硫酸铵法初步纯化，随后经亲和层析法纯化后得到具有较高纯度的抗rMgPa的pAb，SDS-PAGE分析的结果表明所制备的pAb的轻链分子量约为25kD，重链分子量约为50kD，因此，该pAb的分子量约为150kD。（3）以经纯化的抗rMgPa的pAb抗体为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行了4轮生物淘洗，第一轮和第四轮生物淘洗的产率分别为1.45×10-6和9.25×10-4，说明特异性噬菌体克隆得到了明显富集；经对45种不同的肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析，结果表明45个肽序列中的3组一致性的核心序列分别为： P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I。（4）ELISA实验的结果显示：45个含不同肽序列的噬菌体克隆中，共有36个为阳性噬菌体克隆，其中23个噬菌体克隆有较高的结合力，其A450值均高于1.5；竞争性结合试验的结果表明，这些噬菌体与pAb的特异性结合能被不同浓度的rMgPa部分抑制，且随着其浓度的增加其抑制效果也相应的增加；Western blot方法检测的结果表明A450值高于1.5的23个阳性噬菌体能与pAb发生特异性结合。（5）反向高效液相色谱分析的结果表明合成的3个MAP的纯度都在90%以上，质谱分析的结果说明所合成的MAP的分子量与预期的理论分子量基本一致，因此，成功地合成了较高纯度的3个模拟表位的MAP。（6）小鼠经4次免疫后，WP组、AS组、KH组和混合免疫组血清中IgG抗体的A450值分别为0.935±0.028、0.640±0.022、0.841±0.103和1.326±0.025，与PBS对照组（0.118±0.023）比较，均具有统计学意义（p<0.01）；与WP组、AS组和KH组相比，混合免疫组小鼠血清中IgG抗体的A450值升高更为明显（p<0.05）。（7）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的IgG抗体效价分别为1∶2560、1∶640、1∶2560和1∶5120。WP组、AS组、KH组和混合免疫组小鼠血清中的IgG抗体以IgG2a型为主，其相应的IgG2a/IgG1分别为1.835±0.125、1.708±0.180、1.690±0.202和2.095±0.179，均显着高于PBS组（0.967±0.142）（p<0.01）。（8）WP组、AS组、KH组和混合组的IL-4含量分别为55.588±2.407、42.996±1.935、54.754±2.270和81.598±2.649pg/mL，与PBS组（16.673±1.662）相比，具有统计学意义（p<0.01）。与WP、AS、KH组相比，混合组产生的IL-4水平具有显着性差异（p＜0.01）。（9）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的刺激指数（SI）分别为1.560±0.036、1.353±0.131、1.424±0.041和1.874±0.060，明显高于PBS组（1.107±0.032，p<0.01）；混合免疫组的刺激指数（SI）显着高于WP组、AS组和KH组（p<0.01）。（10）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的IFN-γ含量分别为168.496±7.919、98.327±5.030、111.437±5.243和235.815±8.430pg/mL，显着高于PBS组（31.476±1.717，p<0.01）；且与WP组、AS组、KH组相比，混合免疫组的脾淋巴细胞产生了更多的IFN-γ（p<0.01），差异具有统计学意义。结论（1）成功表达并纯化了分子量为37kD的重组蛋白rMgPa；（2）成功制备并纯化了高效价、高特异性的兔抗rMgPa的pAb；（3）成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位：P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I；（4）成功制备并纯化了3个模拟表位相应的MAP——WP、AS和KH；（5）WP、AS和KH均能刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，且混合免疫组诱导的免疫应答效果比单个MAP组更好。
冯波[5]（2012）在《蛋白质在固—液界面的靶向吸附及其特征研究》文中研究表明固-液界面的蛋白质吸附对抗体芯片,生物传感器,免疫分析以及其它分子识别技术来说必不可少。如何在保持正确空间取向和生物活性的同时高密度固定蛋白（包括抗原和抗体）是这些技术成功的关键因素,尤其是在微型化高通量平台中更是如此,例如微流控和纳流控芯片技术,这些处于领先地位的分析技术允许在同一实验中进行几千种分析物的并行检测。然而,吸附于固相基体表面的大部分蛋白质分子常常因接触基体刚性平面而导致其上的免疫结合位点被遮蔽,从而无法接近并识别对应的分析物,在后续检测中不能产生有效免疫响应,难以达到高灵敏、高通量的要求。为解决这一问题,本文致力于蛋白质分子在固-液界面吸附行为取向的控制与分析方法研究,以期最大程度地保持蛋白质分子的生物活性,达到靶向吸附的效果。1)用噬菌体随机展示肽库筛选得到能与聚苯乙烯（polystyrene,PS）基体亲和结合的12肽（我们称之为亲和标签肽）。3轮淘选后,通过对与聚苯乙烯亲和结合的噬菌体克隆进行测序,发现含有较多的芳香族氨基酸残基,芳香族氨基酸与聚苯乙烯的苯环之间存在p-p叠加效应——这可能是亲和标签肽对聚苯乙烯具有结合能力的原因。将淘选过程中出现次数最多的聚苯乙烯亲和标签肽命名为 Ligl（序列为 FKFWLYEHVIRG）。2)通过基因融合的方法将亲和标签肽Lig1插入ENV重组抗原的N端和C端,表达能被抗-HIV-1特异性抗体识别的亲和标签肽融合抗原,在此基础上建立抗-HIV-1 的酶联免疫（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测体系。在该ELISA体系下考察原核表达的亲和标签肽融合抗原在PS基体表面的吸附特征。实验结果表明亲和标签肽融合抗原具有更强的亲和吸附能力,并能以活性位点统一朝外的方式靶向吸附至聚苯乙烯微孔板,其吸附过程很少受到共存蛋白的干扰。采用Lig1-ENV作为包被抗原的抗-HIV-1酶联免疫体系在血清学诊断试验中亦表现出更高的灵敏度和特异性。3)通过基因融合的方法将亲和标签肽Lig1插入HCV嵌合抗原的N端和C端,表达能被抗-HCV特异性抗体识别的亲和标签肽融合抗原。在直接和间接酶联免疫检测体系下对比考察亲和标签肽融合抗原以及不带亲和标签肽的对照抗原的免疫反应性。实验结果表明,亲和标签肽Lig1对聚苯乙烯基体有很强的亲和结合能力（HCV-Lig1与对照抗原HCV对PS基体的亲和常数分别为2.6×108 M-1和2.9×105 M-1）,引导融合抗原以统一有序的方式靶向吸附至聚苯乙烯基体,抗原表面的特异性抗体结合位点得以充分暴露,由此显着提高其对分析物的检测灵敏度。原子力显微镜对吸附界面的表征结果证实亲和标签肽融合抗原能均匀、有序地吸附于聚苯乙烯基体表面,在吸附过程中与基体刚性平面接触而导致的构象扭曲也相对较轻。只要抗原的免疫结合位点不在抗原的N端和C端,亲和标签融合法应该是一种理想的蛋白质靶向吸附方案。4)通过模仿葡萄球菌干扰免疫调理的分子机制,提出了一种新颖简单的方法用于抗体的高密度靶向吸附固定。首先在葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal protein A,SPA）两端非对称引入HisTag组氨酸标签,获得2分子HisTag-SPA,后者以反向平行的方式组装5分子IgG抗体。通过HisTag组氨酸标签与镍离子的螯合作用,将抗体以三维立体排布的方式吸附于固相基体表面。抗原受体位点进而得以充分暴露,对分析物HBeAg的响应信号也由此显着增强,与对照相比,检测灵敏度增大了 64倍以上。Pull-down技术证明了 IgG抗体只能经SPA的连接间接地结合至镍离子基体,位于SPA一端的组氨酸标签与镍离子结合,而5个同源结构域结合IgG抗体的Fc段。以积分光密度（IOD）定量表示的5个杂交带的信号强度随SPA所含IgG结合域的个数逐一递增（IOD值分别为:14.55、35.78、81.53、217.37、263.15）,说明 Ni2+-NTA 凝胶珠经 SPA 结合的IgG抗体的量也逐渐增加。只要使用的抗体探针属于哺乳类动物IgG,该吸附固定方法即可用于构建高性能抗体阵列和生物传感器。5)将60Co γ-射线辐照改性的聚苯乙烯微孔板用于抗-HIV/抗-HCV抗体的间接酶联免疫测定。实验结果表明,经合适剂量（8-9 kGy）60Co辐照过的聚苯乙烯微孔板在血清学诊断试验中表现出比未经辐照处理的对照板高3-5倍的检测灵敏度。在酶标抗体浓度比对照低4倍以上的情况下,经60Co辐照改性的聚苯乙烯微孔板仍能保持与对照微孔板在同一灵敏度水平。吸附/解吸附实验、原子力显微镜以及X射线光电子能谱分析的结果能解释这种由辐照导致的聚苯乙烯微孔板在蛋白质吸附性能上的提升。在辐照过程中由于生成了大量的含氧基团,改善了聚苯乙烯表面的亲水性,并与蛋白质的氨基反应生成西佛碱键或肽键结构,从而能吸附更多的蛋白质分子（60Co辐照微孔板的蛋白吸附量是未辐照对照板的1.5-3倍）。直接ELISA实验结果表明60Co辐照能提高酶联免疫的灵敏度是由于聚苯乙烯微孔板对蛋白质抗原吸附量增加引起的,与包被抗原功能位点在界面的吸附取向或立体定位无关。6)通过测定抗体分子在固相基体表面的吸附量、吸附速率、吸附平衡时间以及平衡浓度,分别探讨了抗-HBeAg单克隆抗体在聚苯乙烯表面、HisTag-SPA/抗-HBeAg单克隆抗体在镍离子预包被表面的吸附动力学和吸附热力学特征。研究表明,抗-HBeAg单克隆抗体在聚苯乙烯表面的吸附属于单分子层吸附,为放热的物理过程,Langmuir模型能更好地拟合其吸附等温线（R2≥0.995）。该吸附过程的速率受液膜扩散和颗粒扩散联合控制,采用伪一级、伪二级动力学方程对其吸附动力学曲线进行拟合均可得到较好的结果;HisTag-SPA/抗-HBeAg单克隆抗体在镍离子预包被表面的吸附属多分子层吸附,为吸热过程,吸附量比在聚苯乙烯表面的吸附量大4-5倍,其吸附等温线符合Freundlich模型,吸附动力学行为符合伪二级动力学方程。液膜扩散模型及颗粒扩散模型均不适合用于拟合HisTag-SPA/抗-HBeAg单克隆抗体在镍离子预包被表面的吸附,考虑到该吸附属于多分子层的多元结合模式,存在紧贴固相基体表面的边界层,因此采用Weber-Morris模型对其动力学数据进行分段拟合,拟合结果证实了这种判断。HisTag-SPA/抗-HBeAg单克隆抗体在镍离子预包被表面的吸附过程分为2个阶段,第1阶段为快速吸附阶段,该阶段蛋白质分子从液相主体扩散到固相基体表面,边界层尚未形成;第2阶段为平缓吸附阶段,是吸附速率控制步骤,涉及到边界层的形成,HisTag-SPA与抗体分子及镍离子表面的同步相互作用,以及边界层内部分子间的位点适配与结合容量的动态调整。
岑峻宇[6]（2012）在《拟态弧菌OmpU抗原模拟表位的筛选鉴定及其免疫特性分析》文中研究说明水产动物腹水病是由拟态弧菌（Vibrio mimicus，Vm）引起的危害严重的细菌性疾病[1-6]。目前控制该病的主要手段是抗菌治疗，但是随着抗生素的长期使用，细菌产生耐药性，导致抗菌疗效不明显。因此，研制新型疫苗免疫防治腹水病是一个亟待解决的问题，而寻找保护性抗原表位是生产新型疫苗的基础[7-8]。拟态弧菌外膜蛋白U（Outer membrane protein U，OmpU）是一种具有良好抗原性和高度保守性的黏附素蛋白[9-10]，可作为首选疫苗候选分子，但其有效保护性抗原表位至今尚不明确。本研究以纯化的兔抗重组OmpUa多克隆抗体为靶标，应用噬菌体肽库技术筛选和鉴定出拟态弧菌OmpU蛋白的7个免疫优势模拟表位，并分析了模拟抗原表位的免疫原性和免疫保护性，研究结果为进一步研制黏附素表位疫苗奠定了基础。为了获取用于筛选拟态弧菌OmpU蛋白的B细胞模拟表位的分子靶标，采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法提纯兔抗重组OmpUa多克隆抗体。纯化的兔抗重组OmpUa抗体的纯度达到95%，浓度为1.5mg/mL，ELISA效价高达1:4096000，完全可用于后续的噬菌体随机肽库筛选试验。为了筛选鉴定OmpU蛋白的B细胞模拟表位，用纯化的兔抗重组OmpUa抗体为筛选靶标，对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗筛选。经过3轮淘洗后，噬菌体的投入产出比呈上升趋势，噬菌体得到较好富集。随机挑选68个噬菌体克隆，经双夹心ELISA和竞争ELISA鉴定出9个阳性噬菌体克隆。提取阳性噬菌体克隆单链DNA进行序列测定与分析，结果显示9个克隆共呈递HDSSKFPYVPSY、FNLHAWPTLDT、HAATVDKIENMR、GLNWSLSPADLI、DTAYEGNIARLM、FSSDSSKVHYPN和SVSEGMKPSPRP7个12肽序列，它们与OmpU蛋白均无3个以上连续的相同氨基酸残基，说明它们是模拟表位。阳性噬菌体克隆C17、C60和C67呈递共同基序DSSK-P，与OmpU蛋白的氨基酸残基（293-316aa）有较高同源性，表明D、S、S、K、P是构成OmpU蛋白B细胞表位的关键氨基酸。使用筛选鉴定的7个噬菌体阳性克隆作为抗原分7组免疫昆明小鼠，每组10只，同时做噬菌体原始肽库阴性对照和拟态弧菌灭活菌体阳性对照。免疫程序为：腹腔免疫，免疫剂量为1012PFU噬菌体/只，首免后14天二免，二免后10天三免，免疫途径和剂量均同首免。第3次免疫后7天测定出各组免疫小鼠血清中均产生较高滴度的特异性抗体，抗体的ELISA效价在1:51200～1:409600之间。攻毒试验结果显示，各组免疫小鼠分别获得了70%（7/10，C21克隆）、80%（8/10，C20和C25克隆）和100%（10/10，C17、C24、C60和C66克隆）的免疫保护，而噬菌体M13对照组的小鼠全部死亡。说明7个携带OmpU蛋白B细胞模拟表位的噬菌体克隆均具有良好的免疫原性和免疫保护性，C17、C24、C60和C66阳性噬菌体克隆所呈递的模拟表位可作为疫苗侯选表位。综上所述，本研究利用噬菌体随机肽库技术首次筛选鉴定了拟态弧菌OmpU蛋白的7个保护性模拟表位，其研究成果拥有自主知识产权，也为设计安全有效的黏附素表位疫苗奠定了坚实的基础。
赵红蕾,刁昱文,冯新,高宇,刘珊珊,顾敬敏,雷连成,韩文瑜[7]（2011）在《噬菌体展示肽库技术及其在分子病原细菌学研究中的应用》文中指出从噬菌体展示技术的基本原理、肽库的构建、噬菌体肽库的分类、噬菌体肽库的筛选方法等方面,综述了噬菌体展示肽库技术;从抗原表位研究、免疫诊断研究、基因疫苗研究、抗菌药物的靶向投递等方面,阐述了噬菌体展示肽库技术在分子病原细菌学中的应用;并对今后的研究方向进行了展望。
刘志文[8]（2010）在《从噬菌体十二肽库中筛选人钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽的研究》文中认为钠泵（Na+,K+-ATPase）是哺乳动物细胞膜上普遍存在的一种离子泵,它在维持体内电解质平衡、稳定细胞膜电位、信号转导等方面具有重要作用。钠泵由α、β、γ三个亚单位组成,其中α亚单位具有酶的活性和许多钠泵调节因子的结合位点。α亚单位有α1、α2、α3、α4四种亚型,各亚型的基本结构高度保守,有10个跨膜区（M1-M10）,其中M1-M2、M3-M4、M5-M6、M7-M8、M9-M10间的序列位于细胞膜外,称为膜外区,含有多种配体结合位点,如内源性钠泵抑制因子哇巴因通过这些位点与细胞膜上的钠泵结合,并通过一系列生物学作用导致血压升高。目前认为钠泵α亚基的第一个膜外区M1-M2是重要的钠泵抑制因子哇巴因的结合位点。然而,哇巴因到底是如何与钠泵发生相互作用的,如果用特异性结合短肽封闭这个位点,能否解除哇巴因对钠泵活性的抑制作用,从而达到治疗高血压的目的,迄今为止尚未有人尝试。因此本研究拟筛选钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽,以阻断或拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用,为进一步探讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制及高血压的治疗奠定基础。一、钠泵α1亚基M1-M2膜外区蛋白的克隆和表达目的:利用基因重组技术构建钠泵α1亚基M1-M2膜外区蛋白的表达载体,通过诱导表达获得蛋白,为随机肽库筛选实验提供靶分子。方法:（1）钠泵α1亚基M1-M2克隆载体的构建。以质粒YhNα1（含人钠泵α1亚基cDNA序列）为模板,PCR扩增得到α1亚基的2个基因片段:T1T2,T1T2D,其中T1T2含α1亚基N端至M2碱基序列,T1T2D含α1亚基N端至M1碱基序列。分别将其加尾后连接至克隆载体pGM-T并转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,得到质粒pGMT-T1T2,pGMT-T1T2D。测序验证基因序列是否与理论结果一致。（2）钠泵α1亚基M1-M2蛋白表达体系的构建。分别从T载体质粒上切下目的基因片段,双酶切连接到表达载体pET32a（+）上并转化入大肠杆菌Rosetta2,挑选阳性克隆,得到质粒pET32a（+）-T1T2,pET32a（+）-T1T2D。双酶切验证目的基因序列是否正确。1%接种表达菌,用终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达。结果:（1）以质粒YhNα1为模板进行PCR扩增得到基因片段T1T2,T1T2D,产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,在相应的位置出现明显的条带,说明基因片段扩增成功。将其加尾后连接至pGM-T载体并转化入大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆扩增并提取质粒,双酶切和测序结果显示基因序列与理论一致。（2）分别将目的基因片段与同样双酶切的pET32a（+）表达载体相连,转化Rosetta2感受态细胞,在含Amp的平板上筛选重组子。双酶切结果表明蛋白表达体系构建成功。（3）通过IPTG诱导,分别在大肠杆菌Rosetta2中表达T1T2和T1T2D融合蛋白。SDS-PAGE结果表明,T1T2D目的条带与理论值一致,而T1T2目的条带未表达。结论:利用基因工程的手段成功构建了T1T2与T1T2D的克隆载体和表达载体。T1T2D融合蛋白表达成功,但T1T2融合蛋白没有表达,推测可能由于T1T2片段包含跨膜区的氨基酸序列,导致疏水性过强所致。二、钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽的筛选目的:以人工合成的钠泵α1亚基M1-M2膜外区蛋白为靶标,通过噬菌体随机肽库（phage random peptide library）技术筛选能与之特异性结合的多肽,以阻断或拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用,为进一步探讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制及高血压的治疗奠定基础。方法:（1）采用固相筛选法,从噬菌体随机12肽库淘选特异性结合肽。以人工合成的钠泵α1亚基M1-M2多肽（ATEEEPQNDNLGGGS）作为靶分子,通过三轮“吸附-洗脱-吸附”的淘选,使能与靶蛋白结合的噬菌体展示多肽得到富集。（2）双夹心ELISA鉴定噬菌体阳性克隆:以钠泵α1亚基M1-M2膜外区多肽（ATEEEPQNDNLGGGS）包被ELISA板,同时设置阴性对照,将噬菌体克隆扩增后加入板中,加入HRP-抗M-13抗体,显色后于420 nm测定OD值。（3）浓度依赖性实验:以钠泵α1亚基M1-M2膜外区多肽（ATEEEPQNDNLGGGS）为靶蛋白,每个待鉴定克隆包被一排孔,将噬菌体克隆扩增后测定滴度,加入1012 pfu的噬菌体并进行5倍系列稀释,加入HRP-抗M-13抗体,显色后测定OD值,以稀释倍数对吸光度作图,观察噬菌体克隆结合力与浓度的关系。（4）M-13噬菌体ssDNA的提取及序列分析:从第三轮筛选的平板上随机选取噬菌体蓝斑,以E.coli ER2738为宿主菌经扩增得到噬菌体原种上清,用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体,以NaI/乙醇溶液提取出ssDNA。测序后,参照M-13噬菌体的基因序列,找到外插片段的位置,对照噬菌体展示12肽库试剂盒说明书的“遗传密码表”推导出其对应的氨基酸序列。（5）哇巴因竞争性抑制试验:以钠泵α1亚基M1-M2膜外区多肽（ATEEEPQN DNLGGGS）包被96孔板,浓度为80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml的哇巴因溶液与噬菌体上清1:1混合后,加入96孔板,测定OD值,计算抑制率,观察噬菌体展示肽对哇巴因的竞争性抑制作用。结果:（1）噬菌体展示12肽库筛选结果:通过每轮筛选的产出量和投入量之比,可以看出噬菌体的回收率逐渐升高,有较明显的富集效果。（2）双夹心ELISA实验:通过对比实验孔和阴性孔的OD值,从随机挑取的噬菌体单克隆中鉴定出9个符合要求的噬菌体阳性克隆。（3）浓度依赖性试验:对双夹心ELISA实验筛选出的9个噬菌体克隆进行亲合力的浓度依赖性试验,以稀释倍数对吸光度作图。结果显示,只有4个噬菌体克隆符合要求。（4）提取噬菌体阳性克隆的ssDNA,进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,目的条带与M-13噬菌体DNA大小相符。序列测定结果表明,4个阳性噬菌体克隆展示肽的氨基酸序列完全一致,均为:WHWRNPDFWYLK。（5）哇巴因竞争性抑制试验:结果显示,随着哇巴因的减少,其对噬菌体展示肽的抑制率也随之降低。说明获得的噬菌体展示肽可以和M1-M2膜外区蛋白特异性结合,并且对哇巴因有竞争性拮抗作用。结论:利用人工合成的M1-M2膜外区多肽,从噬菌体随机十二肽库中成功获得了能够与其特异性结合,并竞争性抑制哇巴因与钠泵结合的噬菌体展示多肽（WHWRNPDFWYLK）。为进一步探讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制及高血压的治疗奠定了基础。
刘思远,许向云[9]（2009）在《噬菌体展示技术的应用及其进展》文中进行了进一步梳理1985年Smith首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造,将EcoRⅠ内切酶的部分基因片段（171 bp和132 bp）与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别。1988年Parmley等将已知抗原决定簇与pⅢ的N端融合呈现在表面,可特异性地被抗体选择出来,并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的
刘晓东[10]（2009）在《噬菌体展示技术鉴定hSAMP32与hPH20抗原表位》文中研究指明背景与目的抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子抗原性的基础。正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义。噬菌体展示技术作为近年来新兴起的研究蛋白质抗原表位的有利工具,已经成功地鉴定出了多种病原微生物的抗原表位。这就为揭示一些病原体未知的抗原表位,从而进一步达到预防和控制疾病的发生提供了条件。抗精子抗体（anti-sperm antibodies,ASAB）是男性体内的一种自身抗体,对于女性属于同种异体抗体,9%～36%的不育夫妇体内含有ASAB（男性占8%-21%,女性占6%-23%）。已证明ASAB是免疫不育的病因,同时ASAB抗体又可以用于人类避孕疫苗的研究,理想的CV精子抗原特异性表达于精子表面,涉及精子卵透明带结合,并且和人类免疫不育有关。比较显着的有受精抗原（fertilization antigen,FA-1）、透明质酸酶PH20、精子蛋白10（sperm protein,SP-10）、人精子顶体膜相关蛋白32（Human Sperm Acrosomal Membrane-AssociatedProtein32,hSAMP32）等。PH20和SAMP32都是GPI锚定的精子特异性的膜蛋白。虽然对hPH20和hSAMP32在免疫性不孕中的作用也有报道,但迄今为止,对于hPH20和hSAMP32的抗原表位还没有报道。为深入了解hSAMP32和hPH20的抗原结构,便于设计科学合理的疫苗和诊断,我们对hPH20和hSAMP32进行了抗原表位的鉴定。材料与方法1本研究利用分子生物学方法将hPH20和hSAMP32基因从本课题组保存的菌株中提取质粒DNA,BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定并DNA测序,将质粒DNA纯化作为模板保存。利用生物学软件Primer premier 5.0软件分别设计hSAMP32,hPH20基因的分段引物,分为Sa,Sb,Sc;Pa,Pb,Pc,Pd。所有引物上游酶切位点是EcoRI,下游是HindⅢ所用载体为T7select10-3b,各个片段经PCR扩增后与T载体连接,转化,测序。2各个片段酶切纯化后与T7噬菌体载体相连,经体外包装后展示在T7噬菌体表面,构建了hPH20和hSAMP32基因特异性肽库。3利用ASAB阳性血清进行了5轮筛选,淘选出5段基因片断,结合TMHMM在线分析结果。4在Pa,Sa抗原表位所在区,经蛋白质抗原表位生物学软件分析设计合成表位肽。5 ELISA鉴定表位肽的生物反应性,SPSS统计分析。结果1 Sa,Sb,Sc;Pa,Pb,Pc,Pd经测序为目的基因,分别为343bp,343bp,352bp,400bp,403bp,397bp,367bp。2 hPH20和hSAMP32基因特异性肽库构建成功,库容为2×105pfu/mL。3 Pa,Sa为抗原表位所在区。4表位肽SAMP32:6 AVQDAGL A H E G E G E E E T E;37 E T E D V S N R N V V K E V E FG M;76 E S K C V V R V E E C R G P T DC;95 G K P I S E S L E S V R L A C I H T S;PH20:82 KISLQDHLDKAKDITFY。5 ELISA鉴定结果表明6号肽,37号肽,76号肽,82号肽4条表位肽的生物反应性良好。结论本研究初步鉴定了hPH20和hSAMP32的表位所在区,为避孕疫苗和多肽药物的开发提供了一定的理论基础。
二、HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建与筛选（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建与筛选（论文提纲范文）
（1）牛病毒性腹泻病毒抗原表位的筛选及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) |
| 1.1 BVDV的研究背景 |
| 1.2 BVDV的发现及流行现状 |
| 2 BVDV的分子生物学特性 |
| 2.1 病原特性 |
| 2.2 病原生物分型 |
| 2.3 病毒基因组结构 |
| 2.4 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 2.5 BVDV编码的非结构蛋白及功能 |
| 3 噬菌体展示技术 |
| 3.1 噬菌体展示技术的原理 |
| 3.2 噬菌体展示系统的类别 |
| 4 噬菌体展示技术的应用 |
| 4.1 抗原表位定位及抗原筛选 |
| 4.2 疫苗制备 |
| 4.3 抗体制备 |
| 5 BVDV的免疫防控 |
| 6 研究的目的和意义 |
| 第1章 河南省部分地区BVDV流行病学调查 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 样品来源 |
| 1.1.2 主要试剂、仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 血清抗体的检测 |
| 1.2.2 结果判定 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 牛病毒性腹泻抗体检测 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 苯丙酸不适合用于治疗BoHV-1/BVDV混合感染引起BRDC的治疗 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 抗体和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒复制抑制实验 |
| 2.2.2 荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.3 Western Blotting |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HDAC抑制剂PB对BoHV-1感染具有抗病毒活性 |
| 2.3.2 PB主要影响后期病毒感染 |
| 2.3.3 PB影响某些IE基因的转录 |
| 2.3.4 PB增强了BoHV-1感染刺激的Erk1/2和p38MAPK信号的激活 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 BVDV模拟表位的筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 肽库和抗体 |
| 3.1.2 试剂和仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 噬菌体随机肽库的生物淘选 |
| 3.2.2 特异性噬菌体的扩增和纯化 |
| 3.2.3 噬菌体的滴度测定 |
| 3.2.4 重复筛选 |
| 3.2.5 噬菌体原液的制备 |
| 3.2.6 测序模板的快速纯化 |
| 3.2.7 噬菌体短肽序列的测序分析与表位序列分析 |
| 3.2.8 噬菌体展示模拟表位的鉴定 |
| 3.2.9 多肽的合成及鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BVDV抗原模拟表位的亲和淘选 |
| 3.3.2 噬菌体DNA模板的测序结果分析与抗原表位预测 |
| 3.3.3 噬菌体展示模拟表位的Dot-blot鉴定结果 |
| 3.3.4 多肽与BSA偶联的Westen-blot鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 BVDV模拟表位及其病毒表位免疫小鼠的鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒株和实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 抗原的制备 |
| 4.2.2 多肽与KLH偶联的Dot-blot鉴定 |
| 4.2.3 BVDV病毒的增殖 |
| 4.2.4 动物免疫 |
| 4.2.5 Dot-blot测定小鼠免疫效果 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 多肽与KLH偶联的Dot-blot鉴定结果 |
| 4.3.2 小鼠血清的Dot-blot鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 BVDV病毒表位单克隆抗体的筛选及鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞和实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂、材料 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞融合 |
| 5.2.2 阳性杂交瘤细胞的初次筛选(Dot-blot in well ECL) |
| 5.2.3 阳性杂交瘤细胞的第二、三轮筛选 |
| 5.2.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 5.2.5 单抗腹水的制备 |
| 5.2.6 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 5.2.7 Dot-blot鉴定单克隆抗体11G9D10 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 5.3.2 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 5.3.3 单克隆抗体11G9D10的Dot-blot鉴定结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）9R-P201与DOX联合用药对肝癌细胞的抑制作用及抗耐药机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝癌研究进展 |
| 1.1.1 肝癌致病因素与现状 |
| 1.1.2 肝癌的治疗 |
| 1.2 FOX基因家族与肿瘤 |
| 1.2.1 Fox基因家族与肿瘤 |
| 1.2.2 FoxM基因亚族与肿瘤研究 |
| 1.2.3 FoxM1与肝癌 |
| 1.3 肝癌与分子靶向治疗 |
| 1.3.1 肝癌靶向药物介绍 |
| 1.3.2 肝癌与联合治疗 |
| 1.3.3 靶向FoxM1 与噬菌体表面展示技术 |
| 1.3.4 过表达FoxM1 与慢病毒载体 |
| 1.4 课题研究目的、意义和内容 |
| 1.4.1 本课题的研究目的和意义 |
| 1.4.2 本课题主要研究内容 |
| 1.4.3 本课题创新点 |
| 第2章 9R-P201与DOX联用促进肝癌HepG2-C3A 凋亡及抗耐药性机制初步研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 主要试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 多肽9R-P201 与阿霉素(DOX)单独/联和使用对肝癌HepG2-C3A细胞活力的影响 |
| 2.3.3 AO/EB双染 |
| 2.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 qRT-PCR检测耐药相关mRNA |
| 2.3.6 WB法检测耐药相关蛋白 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 9R-P201有效增强阿霉素DOX对肝癌HepG2-C3A细胞毒性作用 |
| 2.4.2 9R-P201与DOX联合使用促进肝癌HepG2-C3A细胞凋亡 |
| 2.4.3 9R-P201与DOX联合使用降低肝癌HepG2-C3A细胞对DOX的耐药性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 过表达FOXM1-C慢病毒载体构建以及转染HEPG2-C3A稳定细胞株筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 慢病毒载体、细菌菌株以及细胞株来源 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 慢病毒载体质粒转化 |
| 3.3.2 慢病毒载体质粒提取、鉴定 |
| 3.3.3 过表达FoxM1-c慢病毒重组载体构建 |
| 3.3.4 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.3.5 重组慢病毒载体转染HepG2-C3A细胞及稳定细胞株筛选 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 过表达FoxM1-c慢病毒载体构建与鉴定 |
| 3.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.4.3 稳定过表达FoxM1-c的 HepG2-C3A细胞株筛选及初步鉴定 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 肿瘤靶向FOXM1-DBDP蛋白的噬菌体随机肽库筛选与分子模拟 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 4.3.2 噬菌体随机十二肽库亲和筛选 |
| 4.3.3 噬菌体克隆亲和力反筛测定 |
| 4.3.4 DS3.0 分子模拟与对接 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 FoxM1-DBDp重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 4.4.2 靶向FoxM1-DBDp蛋白的噬菌体随机肽库筛选与单克隆反筛测定 |
| 4.4.3 筛选多肽的DS3.0 分子模拟与对接 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 参考文献 |
（3）阻断水貂肠炎细小病毒感染F81细胞的多肽筛选与验证（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 水貂细小病毒性肠炎的研究进展 |
| 1.1 水貂肠炎细小病毒的生物学特性 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状与组织病理变化 |
| 1.4 疾病的诊断 |
| 1.5 疾病的预防 |
| 1.6 疾病的治疗 |
| 第2章 噬菌体展示技术在抗病毒药物筛选方面的应用 |
| 2.1 噬菌体展示技术简介 |
| 2.2 噬菌体肽库的构建以及筛选方法 |
| 2.3 在抗病毒药物筛选上的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 水貂肠炎细小病毒的分离鉴定与浓缩纯化 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 噬菌体随机肽库筛选抗病毒肽 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 多肽抗 MEV 感染的体外验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察（论文提纲范文）
| 常用英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 生殖支原体MgPa的表达、纯化及其多克隆抗体制备与纯化 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于生殖支原体 MgPa 模拟表位的 MAP 免疫效果观察 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一：PCR 产物 DNA 测序图谱 |
| 附录二：MgPa 测序结果的 BLAST 分析 |
| 附录三：45 个阳性噬菌体 DNA 测序图谱 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要成果目录 |
| 致谢 |
（5）蛋白质在固—液界面的靶向吸附及其特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质界面吸附概述 |
| 1.2 蛋白质界面靶向吸附研究进展 |
| 1.2.1 蛋白A/蛋白G介导的靶向吸附 |
| 1.2.2 生物素介导的靶向吸附 |
| 1.2.3 组氨酸标签肽介导的靶向吸附 |
| 1.2.4 亮氨酸拉链介导的靶向吸附 |
| 1.2.5 亲和淘选标签肽介导的靶向吸附 |
| 1.2.6 其它标签肽介导的靶向吸附 |
| 1.3 蛋白质界面吸附的测定及表征方法 |
| 1.3.1 蛋白质界面吸附的测定方法 |
| 1.3.2 蛋白质界面形貌及构象的表征方法 |
| 1.4 以蛋白质界面吸附为基础的分析检测平台 |
| 1.4.1 检测原理 |
| 1.4.2 检测系统 |
| 1.5 论文选题目的、意义及研究内容 |
| 1.5.1 论文选题目的和意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第2章 亲和标签肽介导的ENV融合抗原靶向吸附及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器、材料和试剂 |
| 2.2.2 亲和标签肽的淘选 |
| 2.2.3 亲和标签肽-ENV融合抗原表达质粒的构建 |
| 2.2.4 亲和标签肽-ENV融合抗原的表达与纯化 |
| 2.2.5 融合抗原的固相化及其酶联免疫检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 噬菌体随机展示肽库淘选结果及亲和标签肽的核苷酸测序 |
| 2.3.2 亲和标签肽-ENV融合抗原的构建及SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.3 亲和标签肽-ENV融合抗原的固相化及其酶联免疫吸附特征 |
| 2.3.4 干扰蛋白共存时对融合抗原吸附性的影响 |
| 2.3.5 亲和标签肽介导的蛋白质靶向吸附在抗HIV-1 ELISA诊断试剂中的应用 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 亲和标签肽介导的HCV融合抗原靶向吸附及其应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂和仪器 |
| 3.2.2 亲和标签肽-HCV融合抗原表达质粒的构建 |
| 3.2.3 亲和标签肽-HCV融合抗原的表达与纯化 |
| 3.2.4 抗原的固相化及XPS、AFM分析 |
| 3.2.5 酶联免疫分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 亲和标签肽-HCV融合抗原的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.3.2 亲和标签肽-HCV融合抗原的酶联免疫吸附特征 |
| 3.3.3 干扰蛋白共存时对融合抗原吸附性的影响 |
| 3.3.4 XPS、AFM表征 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 组氨酸标签肽介导的SPA-IgG复合体三维靶向吸附 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 4.2.2 SPA的准备 |
| 4.2.3 抗体的吸附固定 |
| 4.2.4 酶联免疫法检测HBeAg |
| 4.2.5 蛋白酶酶解 |
| 4.2.6 Pull-down分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 蛋白质三维靶向吸附的设计策略 |
| 4.3.2 ELISA验证 |
| 4.3.3 三维靶向吸附的技术特征 |
| 4.3.4 免疫学活性及蛋白质相互作用鉴定 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 固相基体的表面改性及其在酶联免疫中的应用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 5.2.2 微孔板的UV辐照处理 |
| 5.2.3 微孔板的~(60)Co辐照处理 |
| 5.2.4 包被与封闭 |
| 5.2.5 检测标本的试验步骤 |
| 5.2.6 解吸附实验 |
| 5.2.7 AFM、XPS |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 灵敏度、特异性、均一性、稳定性考察 |
| 5.3.2 吸附行为分析 |
| 5.3.3 AFM、XPS表征 |
| 5.3.4 临床符合率 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 蛋白质界面吸附的热力学动力学研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 6.2.2 蛋白质的吸附实验 |
| 6.2.3 吸附热力学、动力学分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 吸附热力学分析 |
| 6.3.2 吸附动力学分析 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表的相关学术论文及专利 |
| 致谢 |
（6）拟态弧菌OmpU抗原模拟表位的筛选鉴定及其免疫特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 图表目录 |
| 本论文常用中英文缩写词 |
| 文献综述 |
| 1 拟态弧菌的研究进展 |
| 2 抗原表位的研究 |
| 3 噬菌体随机肽库技术的筛选原理、方法与应用 |
| 4 展望 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验菌株与噬菌体随机肽库试剂盒 |
| 1.2 酶类与主要试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要培养基与溶液的配制 |
| 1.4.1 LB 培养基 |
| 1.4.2 蛋白电泳检测所需溶液 |
| 1.4.3 Protein G 亲和层析所需溶液 |
| 1.4.4 噬菌体肽库筛选所需溶液 |
| 1.4.5 ELISA 实验所需溶液 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 兔抗重组 OmpUa 抗体的提纯 |
| 1.6.1 免疫血清硫酸铵分级沉淀 |
| 1.6.2 透析除盐 |
| 1.6.3 IgG 的纯化 |
| 1.6.4 纯化后抗体的浓度、纯度和效价测定 |
| 1.7 OmpU 蛋白模拟表位的筛选与鉴定 |
| 1.7.1 噬菌体的滴度测定 |
| 1.7.2 抗体的包被及封闭 |
| 1.7.3 亲和筛选 |
| 1.7.4 洗脱噬菌体的扩增与纯化 |
| 1.7.5 重复筛选 |
| 1.7.6 噬菌体贮液的制备 |
| 1.7.7 噬菌体阳性克隆的鉴定 |
| 1.8 阳性噬菌体克隆 DNA 测序与序列分析 |
| 1.8.1 阳性噬菌体克隆单链 DNA 的提取 |
| 1.8.2 序列测定与分析 |
| 1.9 模拟表位噬菌体克隆的免疫特性测定 |
| 1.9.1 模拟表位噬菌体克隆的免疫原性测定 |
| 1.9.2 模拟表位噬菌体克隆的免疫保护性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 兔抗重组 OmpUa 抗体的纯化 |
| 2.2 噬菌体肽库的筛选效率 |
| 2.3 多抗筛选克隆的双夹心 ELISA 鉴定结果 |
| 2.4 阳性噬菌体克隆的竞争 ELISA 鉴定结果 |
| 2.5 多抗筛选鉴定的阳性噬菌体克隆的序列分析 |
| 2.6 模拟表位的免疫原性 |
| 2.7 模拟表位的免疫保护性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 影响兔抗重组 OmpUa 多克隆抗体纯化的因素 |
| 3.2 噬菌体肽库筛选的靶分子选择与筛选条件优化 |
| 3.3 阳性噬菌体克隆的鉴定与模拟表位的确定 |
| 3.4 携带模拟表位的噬菌体克隆的免疫特性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）从噬菌体十二肽库中筛选人钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 从噬菌体十二肽库中筛选人钠泵α1 亚基 M1-M2 膜外区特异性结合肽的研究 |
| 引言 |
| 第一部分 钠泵α1 亚基M1-M2 膜外区蛋白的克隆和表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 钠泵α1 亚基M1-M2 膜外区特异性结合肽的筛选 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 噬菌体展示技术的原理及应用 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）噬菌体展示技术鉴定hSAMP32与hPH20抗原表位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文部分 |
| 噬菌体展示技术鉴定hSAMP32与hPH20抗原表位 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 |
| 噬菌体展示技术及其在抗原表位识别中的应用 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
四、HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建与筛选（论文参考文献）
- [1]牛病毒性腹泻病毒抗原表位的筛选及其单克隆抗体的制备[D]. 陈鑫烨. 扬州大学, 2020
- [2]9R-P201与DOX联合用药对肝癌细胞的抑制作用及抗耐药机制研究[D]. 付鹏德. 西南交通大学, 2019(03)
- [3]阻断水貂肠炎细小病毒感染F81细胞的多肽筛选与验证[D]. 张庆明. 吉林大学, 2013(08)
- [4]生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察[D]. 曾燚华. 南华大学, 2012(08)
- [5]蛋白质在固—液界面的靶向吸附及其特征研究[D]. 冯波. 湘潭大学, 2012
- [6]拟态弧菌OmpU抗原模拟表位的筛选鉴定及其免疫特性分析[D]. 岑峻宇. 安徽农业大学, 2012(07)
- [7]噬菌体展示肽库技术及其在分子病原细菌学研究中的应用[J]. 赵红蕾,刁昱文,冯新,高宇,刘珊珊,顾敬敏,雷连成,韩文瑜. 河北科技师范学院学报, 2011(01)
- [8]从噬菌体十二肽库中筛选人钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽的研究[D]. 刘志文. 河北医科大学, 2010(04)
- [9]噬菌体展示技术的应用及其进展[J]. 刘思远,许向云. 内蒙古医学杂志, 2009(S8)
- [10]噬菌体展示技术鉴定hSAMP32与hPH20抗原表位[D]. 刘晓东. 郑州大学, 2009(03)