一、The role of prostaglandins in regulating vascular smooth muscle cell sur-vival par（论文文献综述）
柴若宁[1]（2021）在《冠心病血瘀证患者血清氧化脂质代谢谱及炎症相关因子研究》文中认为背景:冠心病（Coronary Heart Disease,CHD）又称冠状动脉粥样硬化性心脏病,即冠状动脉血管发生动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）病变而引起血管腔狭窄或阻塞,最终导致心肌缺血、缺氧甚至坏死。损伤反应是CHD主流发病机制学说,即内皮损伤与脂质积聚导致动脉壁慢性炎症反应形成粥样斑块。免疫炎症在AS的起始、进展、斑块破裂及血栓形成中都起到了关键作用,过往的研究大都集中在典型炎症反应的效应细胞,如单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞。然而,除了典型的炎症效应细胞,大量实验和临床研究证据表明,变应性炎症的效应细胞在冠状动脉疾病（Coronary artery disease,CAD）的发病中扮演着重要的角色,嗜酸性粒细胞（Eosinophils,EOS）便是参与其中关键效应细胞,活化后EOS释放多种信号因子对白细胞募集,内皮细胞（Endothelial cells,EC s）受损及血小板活化,血栓形成具有重要的作用。2020年欧洲心脏病学会（ES C）将CHD分为急性冠脉综合征（Acute coronary syndrome,ACS）和慢性冠脉综合征（Chronic coronary syndrome,CCS）两类。CHD目前已成为世界范围内心血管疾病（Cardiovascular diseases,CVD）患者死亡的首要原因。1990年～2016年全球195个国家和地区的333种疾病的负担研究的系统分析报告指出,C AD是全球伤残调整生命年（Disability adjusted life years,DALYs）的三大主要原因之一。2017年,CHD的死亡率占据了美国CVD死亡类型的42.6%,而我国居民CHD患病率与死亡率也逐年增高,农村地区上升更为明显,且男性死亡率高于女性。因此全球对CHD防治依旧刻不容缓。中医学“胸痹”、“心痛”、“厥心痛”等均属于CHD的范畴,临床特点主要表现为发作性的胸闷、胸痛,短气,甚者胸痛彻背,背痛彻心,或伴有濒死感。中医经典论着《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治第九》中认为其病机为“阳微阴弦”,提出了许多行之有效的临床治疗法则,如通阳宣痹法、扶正固本法及温通止痛法等。近年来,CHD中医证候研究文献分析显示,血瘀证素在所有中医证素中所占比例最高,且在所有C HD患者所占比例逐年增高。因此,探讨氧化脂质代谢物及炎症相关因子在CH D及CHD血瘀证发生发展中的作用具有重要的临床及现实意义。目的:研究氧化脂质代谢物及炎症相关因子与CHD及CHD血瘀证的相关性,为其参与CHD及CHD血瘀证提供一定的参考依据。方法:收集2020年6月～2020年12月就诊于中国中医科学院广安门医院心血管科及综合科病房的CHD患者120例,纳入CHD组,并依据《冠心病血瘀证诊断标准》将纳入的CHD患者分为血瘀证组和非血瘀证组。同时收集2020年6月～12月就诊于中国中医科学院广安门医院预防保健科健康体检人员30例,纳入健康组。采集所有入选对象就诊当天或次日清晨空腹状态下的静脉全血样本,运用RT-PCR 技术检测外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBM C）中CCL11 mRNA的表达水平,运用ELISA方法测定CCL11,ECP,TM,LTB4表达水平,运用LC-MS/MS平台进行氧化脂质代谢物检测分析,观察健康组与CHD组之间,CHD血瘀证组与非血瘀证组之间氧化脂质代谢物及炎症相关因子的差异。炎症相关因子实验数据应用SPSS 26.0统计软件进行分析,P<0.05作为统计学显着性差异的判断依据。氧化脂质代谢物采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）在原始数据进行中心化处理,利用R软件中的MetaboAnal ystR包OPLSR.Anal函数进行分析,筛选规则:选取VIP≥1并且fold change≥2或fold change≤0.5的代谢物为最终差异代谢物。结果:1.健康组与CHD组,CHD血瘀证组与非血瘀证组基本资料对比本研究共纳入健康人30例,CHD患者120例,CHD血瘀证患者80例,非血瘀证患者40例。统计学分析结果显示,CHD组与健康组在性别、年龄、BM I、GLU、ALT、AST、sCr等方面无统计学差异;CHD血瘀证组与非血瘀证组在性别、年龄、BMI、GLU、ALT、AST、sCr等方面无统计学差异。2.健康组与CHD组的EOS数量结果与健康组相比,CHD 组的 EOS[（0.13±0.08）×109/L VS（0.10±0.08）×109/L],P=0.04)数量增加,差异具有统计学意义。3.健康组与CHD组CCL11、ECP、TM、LTB4表达水平结果与健康组相比,CHD 组的 CCL11（113.16±55.25 VS 77.74±33.07,P=0.007）、ECP（24.44±5.01 VS 14.66±4.15,P=0.000）、TM（3.11±1.20 VS 2.37± 1.14,P=0.012）、LTB4（113.84±44.27 VS 70.54± 16.15,P=0.000）表达升高,差异均具有统计学意义。4.CHD 患者 CCL11、ECP、TM、LTB4 的二元 Logistic 回归分析采用单因素 Logistic 回归分析提示,CCL11（OR=1.026,95%CI:1.007-1.045,P=0.007）、ECP（OR=1.786,95%CI:1.356-2.351,P=0.000）、TM（OR=1.717,95%CI:1.108-2.662,P=0.016）、LTB4（OR=1.048,95%CI:1.021-1.075,P=0.000）与CHD存在显着相关性。多因素 Logistic 回归分析提示,CCL11（OR=1.059,95%CI:1.011-1.109,P=0.015）、ECP（OR=2.149,95%CI:1.197-3.857,P=0.010）与 CHD 存在显着相关性;TM（OR=1.896,95%CI:0.654-5.499,P=0.239）、LTB4（OR=1.092,95%CI:0.993-1.200,P=0.071）与 CHD 无显着的相关性。5.健康组与CHD组CCL11 mRNA的表达水平结果与健康组比较,CHD 组 PBMC 中 CCL11 mRNA（3.80±2.74 VS 1.48±0.95,P=0.110）表达水平显着升高,差异具有统计学意义。6.CHD患者CCL11 mRNA的二元Logistic回归分析采用单因素 Logistic 回归分析提示,CCL11 mRNA（OR=1.986,95%CI:1.045-3.775,P=0.036）与CHD存在显着相关性。7.CHD 患者 CCL11、ECP、TM、LTB4 的 ROC 曲线分析ROC 曲线分析结果提示,CCL11 的 Area 为 0.7337,Cut-off value 为 62.2pg/ml,Sensitivity 为 95.65%,Specificity 为50%;ECP 的 Area 为 0.9362,Cut-of f value 为 19.58ng/ml,Sensitivity 为 79.66%,Specificity 为 93.33%;TM 的 Area为 0.6777,Cut-off value 为 1.975ng/ml,Sensitivity 为 80.43%,Specificity 为 46.15%;LTB4 的 Area 为 0.8089,Cut-off value 为 81.57pg/ml,Sensitivity 为 73.33%,Specificity 为83.33%。8.CHD血瘀证组与非血瘀证组的EOS数量结果CHD血瘀证组与非血瘀证组的EOS数量[（0.14±0.06）×109/L VS（0.10±0.02）×109/L],P=0.83)差异无统计学意义。9.CHD血瘀证组CCL11、ECP、TM、LTB4表达水平结果与非血瘀证组相比,CHD血瘀证组的TM（3.53±1.15 VS 2.77±1.16,P=0.030）、LTB4（139.64±41.74 VS 96.65±37.56,P=0.001）表达水平升高,差异具有统计学意义;CHD血瘀证组与非血瘀证组的CCL11（113.25±66.49 VS 113.08±45.15,P=0.992）、ECP（24.87±5.14 VS 24.16±4.97,P=0.603）的表达水平差异无统计学意义。10.CHD 血瘀证患者 CCL11、ECP、TM、LTB4 二元 Logistic 回归分析采用单因素 Logistic 回归分析发现,TM（OR=1.778,95%CI:1.039-3.041,P=0.036）、LTB4（OR=1.026,95%CI:1.009-1.043,P=0.003）与 CHD 存在显着相关性;CCL11（OR=1.000,95%CI:0.989-1.011,P=0.992）、ECP（OR=1.029,95%CI:0.926-1.144,P=0.596）与 CHD 无显着相关性。多因素 Logistic 回归分析提示,CCL11（OR=0.987,95%CI:0.966-1.009,P=0.254）、ECP（OR=1.067,95%CI:0.883-1.290,P=0.502）、TM（OR=2.085,95%CI:0.742-5.860,P=0.164）、LTB4（OR=1.013,95%CI:0.988-1.038,P=0.308）与CHD无显着相关性。11.CHD血瘀证组CCL11 mRNA表达水平结果与非血瘀证比较,PBMC 中 CCL11 mRNA（3.93±2.62 VS 3.60±2.99,P=0.703）的表达水平差异无统计学意义。12.CHD血瘀证患者TM、LTB4的ROC曲线分析ROC 曲线分析结果提示,TM 的 Area 为 0.6762,Cut-off value 为 2.915ng/ml,Sensitivity 为 64%,Specificity 为 71.43%;LTB4 的 Area 为 0.7726,Cut-off value 为 123.9pg/ml,Sensitivity 为 85.19%,Specificity 为 66.67%。13.健康组与CHD血瘀证组氧化脂质差异代谢物KEGG富集分析健康组与CHD血瘀证组氧化脂质差异代谢物富集在亚油酸代谢通路及代谢途径。14.健康组与CHD非血瘀证组氧化脂质差异代谢物KEGG富集分析健康组与CHD非血瘀证组的差异代谢物富集在花生四烯酸代谢通路、TRP通道的炎性介质调节通路、代谢途径、PPAR信号通路、亚油酸代谢通路。15.CHD血瘀证与非血瘀证组氧化脂质差异代谢物KEGG富集分析CHD血瘀证与非血瘀证差异代谢物富集在花生四烯酸代谢通路。结论:1.血清CCL11、ECP、LTB4、TM的表达水平与CHD存在显着的相关性。2.PBMC中CCL11 mRNA表达水平与CHD存在显着的相关性。3.血清TM、LTB4的表达水平CHD血瘀证存在显着的相关性,而血清CC L11、ECP与CHD血瘀证无显着的相关性。4.PBMC中CCL11 mRNA表达水平与CHD血瘀证无显着的相关性。5.健康组与CHD血瘀证组差异代谢物富集在亚油酸代谢通路及代谢途径。6.健康组与CHD非血瘀证组的差异代谢物富集在花生四烯酸代谢通路、T RP通道的炎性介质调节通路、代谢途径、PPAR信号通路、亚油酸代谢通路。7.CHD血瘀证与非血瘀证差异代谢物富集在花生四烯酸代谢通路。
王野[2]（2021）在《前列腺素类物质参与了肾内动脉平滑肌细胞内向整流K+通道的调节》文中进行了进一步梳理第一部分影响BaCl2收缩大鼠肾内动脉的因素目的:1.研究不同类型的钾通道阻滞剂对离体大鼠肾内动脉（rat intrarenal arteries,RIRAs）血管环张力的影响:观察内向整流性钾通道（inward rectifier potassium channels,Kir）抑制剂BaCl2、电压依赖性钾通道（voltage-dependent K+channels,KV）抑制剂4-氨基吡啶（4-aminopyridine,4-AP）、钙激活钾通道(calcium-activated K+channels,KCa)抑制剂四乙胺（tetraethylamine,TEA）、ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive K+channels,KATP)抑制剂格列本脲（glibenclamide,GLI）对RIRAs肌张力的影响。2.观察内皮及各种抑制剂对BaCl2收缩RIRAs的影响:分别观察内皮剥脱、一氧化氮合酶（nitricoxide synthase,NOS）抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲基酯（NG-nitro-L-arginine methylester ester,L-NAME）、环氧化酶（cycloxygenase,COX）非选择性抑制剂吲哚美辛（indometacin,INDO）、COX1抑制剂S2064和COX2抑制剂N194及血栓素-前列腺素受体（thromboxane-prostanoid receptor,TPR）拮抗剂S18886和L-655240对BaCl2收缩RIRAs的影响。3.观察各种缩血管剂对BaCl2收缩RIRAs的影响:首先利用氯化钾（KCl,30m M）、血栓素A2类似物（U46619,0.03（?）M）或苯肾上腺素（PE,0.1（?）M）使血管产生轻微的预收缩（相当于最大收缩的5～20%）,然后在预收缩的基础上观察BaCl2对RIRAs血管环肌张力的影响。方法:1.雄性成年SD大鼠（280～320 g）经腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后断头放血处死,立即打开腹腔取出肾脏组织,并将其放入4℃、p H=7.40的HEPES液中。在显微镜下分离出第二、三级肾内动脉血管,血管内径约为150～280（?）m,将分离出的血管分割成长度为2 mm的血管环,之后用两根直径为40（?）m的不锈钢钢丝（长度为2 cm）轻柔穿过血管环,尽量避免碰到血管壁,减少内皮的损伤,然后将其固定在微血管环张力记录仪（DMT）的浴槽内（用钢丝紧贴管壁反复轻轻摩擦血管可达到去除内皮的目的）,之后调节两根钢丝间的距离对血管环进行标准化,使血管环达到相当于在体血压为80 mm Hg时的前负荷。浴槽中的血管孵育在37℃、p H=7.40、含95%O2+5%CO2饱和的正常生理盐水（PSS）中稳定30 min,用60m M KCl连续刺激血管2次,若前后两次血管收缩强度差异小于10%,且收缩强度大于2 m N,说明血管活性良好,可以正式进行实验。2.待血管稳定后,向血管浴槽内依次分别累加BaCl2（0.03、0.1、0.3、1.0 m M）、4-AP（0.03、0.1、0.3、1.0 m M）、TEA（0.03、0.1、0.3、1.0 m M）、GLI（3、10、30、100（?）M）并记录张力变化。当上一浓度的收缩达坪台后方可进行下一浓度的累加。实验结果以60 m M KCl引起的最大收缩为100%构建浓度-收缩曲线,观察这4种类型的钾通道阻滞剂对血管张力产生的影响。3.分别观察有内皮和去内皮的RIRAs对BaCl2浓度-收缩量效曲线的影响,以BaCl2的最大收缩为100%制作浓度-收缩曲线,计算各浓度使血管收缩的百分比,观察内皮对BaCl2收缩肾内动脉血管的影响。4.血管在浴槽中稳定30 min中后,重复构建BaCl2（0.03、0.1、0.3、1.0 m M）的浓度-收缩曲线,当收缩曲线可重复时,在下次构建BaCl2浓度-收缩曲线前10 min分别在浴槽PSS中加入抑制剂INDO（0.01 m M）、L-NAME（0.01 m M）、S2064（10（?）M）、N194（0.1（?）M）或收缩剂PE（0.1（?）M）、KCl（30 m M）、U46619（0.03（?）M）或INDO+PE、L-NAME+PE。结果以预孵抑制剂或收缩剂前BaCl2引起的最大收缩为100%来计算抑制剂和收缩剂或它们的组合对0.1 m M BaCl2诱导的收缩造成的影响。5.在浴槽PSS中分别加入U46619（0.03、0.1、0.3、1.0（?）M）、PE（0.03、0.1、0.3、1.0（?）M）、KCl（20、40、60、80 m M）、BaCl2（0.03、0.1、0.3、1.0 m M）、PE（0.1（?）M）+BaCl2（0.03、0.1、0.3、1.0 m M）,当血管收缩曲线可重复时,用正常PSS液冲洗血管使其恢复基础张力,之后让血管预孵在含TPR拮抗剂L-655240（1.0（?）M）和S18886（10（?）M）的PSS中,10 min后重新构建上述浓度-收缩曲线。以预孵L-655240和S18886前各种收缩剂所引起的最大收缩为100%,观察预孵L-655240和S18886后不同的收缩剂对血管张力变化影响。结果:1.0.03～1.0 m M BaCl2、4-AP、TEA均可浓度依赖性地收缩RIRAs,而GLI在100（?）M时对血管张力没有明显影响。BaCl2（1 m M）、4-AP（1 m M）、TEA（1m M）、GLI（0.1 m M）引起的收缩分别为6.75±0.86 m N、1.03±0.54 m N、1.87±0.75 m N、0.35±0.21m N,分别相当于60 m M KCl引起最大收缩的70.5%、10.7%、18.2%、3.6%（P<0.05）,与4-AP、TEA、GLI相比,BaCl2诱导RIRAs收缩的能力更强。2.内皮剥脱使0.1 m M BaCl2引起的收缩从1.07±0.42 m N增加到2.01±0.03m N（P<0.05）。L-NAME（0.01 m M）预孵使BaCl2收缩曲线上移,使0.1 m M BaCl2诱导的收缩增加到3.15±0.24 m N（P<0.05）。INDO（0.01 m M）使BaCl2收缩曲线右移,并使0.1 m M BaCl2诱导的收缩降低到0.21±0.08 m N（P<0.05）。S2064（0.01 m M）、N194（0.1（?）M）分别使0.1m M BaCl2诱导的RIRAs的收缩降低到0.27±0.11 m N、0.39±0.24 m N（P<0.05）。3.血管收缩剂PE（0.1（?）M）、KCl（30 m M）、U46619（0.03（?）M）的轻度预刺激使0.1m M BaCl2诱导的收缩分别增加到2.47±0.84 m N、2.37±0.11 m N、3.10±1.13 m N（P<0.05）。PE+L-NAME使0.1 m M BaCl2诱导的收缩增加到3.99±1.19 m N,PE+INDO将0.1 m M BaCl2诱导的收缩降低到1.24±0.34 m N（P<0.05）。4.TPR拮抗剂显着性抑制了TPR激动剂U46619引起的收缩,但对PE或KCl诱导的收缩抑制作用较弱。在静息状态下,L-655240和S18886分别使1 m M BaCl2诱导的收缩从6.03±1.78 m N减少到3.14±0.67 m N和3.89±1.15 m N（P<0.05）。此外,在PE轻度预刺激的情况下,L-655240和S18886分别使0.1 m M BaCl2诱导的收缩从2.48±1.09 m N降低到0.78±0.54 m N和1.56±0.63 m N（P<0.05）。结论:1.0.03～1.0 m M BaCl2可以浓度依赖性地收缩RIRAs。2.不同的血管收缩剂在低浓度的情况下显着增强了BaCl2阻断Kir通道所诱导的RIRAs的收缩。3.在静止或受刺激的RIRAs中,COX抑制剂和TPR拮抗剂均可显着性抑制BaCl2诱导的RIRAs收缩,而NOS抑制剂和内皮剥脱则增强这种收缩。第二部分Kir通道在大鼠肾内动脉平滑肌细胞中的表达及功能目的:1.观察BaCl2对急性分离的大鼠肾内动脉平滑肌细胞（rat intrarenal arteries smooth muscle cells,RIASMCs）细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响。2.观察BaCl2、TPR激动剂U46619、NO供体硝普钠（sodium nitroprusside,nitro）、Kir2.1 antibody（Kir2.1-Ab）对急性分离的RIASMCs Kir电流的影响。3.通过Western blotting来观察RIRAs中Kir通道的表达。方法:1.RIASMCs的分离:将分离好的RIRAs放入含有0.5 mg/ml木瓜酶,1 mg/ml胎牛血清和1 mg/ml苏糖醇的1 ml酶解液Ⅰ中,并将其放在37℃恒温浴槽内,在持续供氧的条件下孵育28～30 min,后将血管转入含有1 mg/ml胎牛血清,0.5 mg/ml胶原酶F和0.5 mg/ml胶原酶H的0.7 ml酶解液Ⅱ中,同样在37℃,持续供氧的条件下孵育3 min,然后在酶解液Ⅱ中加入37℃的分离液将体积稀释至1 ml继续孵育2 min后终止酶解反应,将所得的细胞悬浊液离心2次,每次6 min,转速为800 r/min,最后弃上清液,留取1 ml用于细胞实验。2.[Ca2+]i的测定:用滴管将新鲜分离的RIASMCs滴入规格为1 ml的玻璃底部细胞培养皿中,并加入灌流液,在37℃下静置30 min后用灌流液冲洗5 min,去除死细胞和组织碎片,然后用滴管轻轻吸出灌流液至培养皿中剩余0.5 ml为宜,然后加入0.5 ml浓度为5（?）M的Fluo4-AM进行负荷,60 min后用灌流液冲洗多余的Fluo4-AM,并打开恒温加热泵,用共聚焦显微镜以10帧/分钟的频率获取ASMCs图像,用固态二极管激光器产生488 nm的激发光束。在波长516～530 nm的区域测量荧光强度,并用NIS-Elements Ar进行分析,计算荧光比（F/F0,处理后的荧光强度与处理前的基础荧光强度的比值）。2.全细胞膜片钳Kir电流的记录:用滴管吸取2滴新鲜分离的RIASMCs滴于细胞培养皿底部的载玻片上并加入1 ml的Kir灌流液。在灌流液中缺乏或存在BaCl2、U46619或硝普钠的情况下记录全细胞电流;在电极内液中加入Kir2.1抗体（1:500）观察Kir2.1-Ab对Kir电流的影响。3.Western blotting:准备两组去内皮的直径为150～200μm和200～280μm RIRAs作为样本,每组20 mg。用RIPA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物在4°C下将样本裂解30 min。裂解后的匀浆在4°C,13,000×g下离心20 min,留取上清液,以BSA为标准,用BCA蛋白测定液测定蛋白质浓度。总蛋白（24μg）在15%Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶上分离后转移到硝酸纤维素膜上。转移后的膜用0.05%TBST洗涤3次,共15 min,5%的脱脂牛奶在室温下封闭2 h。然后将膜在含Kir2.1抗体（1:5000）的营养液中4°C过夜孵育。与一抗孵育后,用0.05%TBST洗涤3次,每次10 min,之后用含辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔Ig G（1:5000）孵育1 h,同样用0.05%TBST洗3次,每次10 min,最后用超敏ECL化学发光试剂用化学发光检测系统（Bio-Rad）检测。结果:1.0.03～1.0 m M BaCl2浓度-依赖性地增加[Ca2+]i敏感的荧光强度。以BaCl2处理前的细胞荧光强度为1.0（对照）,细胞暴露在1.0 m M BaCl2时的最大荧光强度是对照组的2.27±0.48倍（P<0.05）。2.在-140 m V时,正常Kir电流密度为8.81±0.19 p A/p F。100μM BaCl2和3μM TPR激动剂U46619使电流密度分别减小到2.62±0.15 p A/p F和4.48±0.21 p A/p F,而NO供体硝普钠10μM使电流密度增加到10.93±0.62 p A/p F,Kir2.1-Ab使电流密度降低到5.61±0.42 p A/p F（P<0.05）。蛋白印迹实验结果显示Kir2.1在RIRAs中表达,并且在较小的RIRAs（直径<200μm）中表达更丰富。结论:1.0.03～1.0 m M BaCl2浓度-依赖性地增加了RIASMCs[Ca2+]i。2.在直径较小的RIRAs中,Kir2.1的表达明显更丰富。TPR激动剂U46619抑制Ba2+敏感的Kir电流,而NO供体硝普钠增强了Kir电流。
康丽丽[3]（2021）在《西地那非通过Notch3/Hes1通路抑制新生大鼠持续性肺动脉高压的机制研究》文中研究指明研究背景新生儿持续肺动脉高压（Persistent pulmonary hypertension in neonates,PPHN）是指新生儿出生后由于各种原因导致的肺血管阻力持续性增高,肺动脉压超过体循环动脉压,使从胎儿型血液循环过渡到正常（成人）型血液循环发生障碍,导致在心房水平或未闭动脉导管水平发生右向左分流,临床出现不同程度的紫绀和/或难以纠正的低氧血症。PPHN如果治疗不及时或不充分,死亡率和致残率会显着增加。患有PPHN的婴儿可能会发生严重呼吸衰竭,需要重症监护,约10%的病例可能死亡。在存活的患者中,PPHN可能会引起神经损伤、脑瘫、失明等严重的并发症。结构性肺血管重构在PPHN的发病过程中起着重要作用。肺血管重构包括血管内膜、中膜和外膜增厚,导致肺动脉管腔狭窄,肺动脉压力升高。其病理基础主要是肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）、血管内皮细胞和成纤维细胞发生增殖、迁移和表型转化等改变。Notch3是四种Notch蛋白家族的成员之一,是介导细胞间信号传递的细胞膜受体,在细胞间通信中发挥着重要作用[1]。不同Notch受体可介导不同的细胞效应,Notch3在血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）中的表达最多见[2]。Notch3 信号通路异常通常与肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension,PAH）引起的VSMC过度增殖和血管重构有关。此外,Notch3被认为是肺动脉高压中VSMC去分化和增殖的一个重要介质[3]。Hes/Hey家族是Notch信号传导的关键下游基因[4],研究证实,Notch3过表达导致大鼠PASMCs增殖,同时Hes1转录因子表达上调[5]。Hes1转录因子可能是PASMCs中Notch3信号的重要转录靶点。因此阻断Notch3/Hes1通路,可能是治疗PPHN有价值的途径之一。西地那非是一种磷酸二酯酶-5（Phosphodiesterase-5,PDE5）抑制剂,通过抑制环鸟苷单磷酸（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）的水解从而诱导血管舒张。吸入一氧化氮（inhaled nitric oxide,iNO）通过选择性的扩张肺部血管被广泛用于治疗PPHN,但有部分PPHN患者使用iNO治疗无效,尤其是肺实质病变和肺发育不全的患者。而西地那非能改善新生儿局部微循环,有效抑制和预防肺损伤,降低肺动脉压力,改善右心室功能。因此,当iNO无效时,西地那非可能是治疗PPHN最佳选择。目前对于Notch3/Hes1信号通路在PPHN大鼠及PASMCs中的变化和影响,未见相关报道,西地那非抗PPHN作用是否与Notch3/Hes1信号通路相关也未见报道,因此我们进行了以下研究:第一部分西地那非对PPHN大鼠肺血管重构及低氧诱导的PASMC细胞功能的影响研究目的:通过低氧（Hypoxia,Hypo）和吲哚美辛（Indometacin,Indom）诱导孕鼠建立PPHN新生大鼠模型,并且体外培养低氧诱导的新生大鼠来源的PASMCs,探讨西地那非对PPHN的作用和PPHN形成过程中对Notch3/Hes1表达的变化,揭示西地那非可以抑制PASMC增殖,降低PPHN大鼠肺血管重构及右心室肥厚指数的增加;西地那非可以降低PPHN大鼠肺组织Notch3/Hes1通路基因和蛋白表达。研究方法:1.建立Hypo+Indom诱导的PPHN大鼠模型及给药8周龄的SD大鼠,雄鼠20只,雌鼠46只,分组合笼24小时后,取雌鼠阴栓涂片检测,以在显微镜下看到精子计为孕鼠,共36只孕鼠,在大鼠妊娠第11天,选取30只随机分配为对照组、模型组、西地那非低剂量组（50mg/kg）、西地那非中剂量组（100mg/kg）、西地那非高剂量组（200mg/kg）,每组6只。对照组的孕鼠放在常氧的环境下,腹腔注射同体积的0.9%NaCl2溶液。模型组在大鼠妊娠的第19天,放于12%O2的低氧箱中饲养,箱内温度与湿度与外面环境相同,且孕鼠可自由活动,并通过腹腔注射0.5mg/kg的吲哚美辛,每天两次,连续3天。西地那非实验组在大鼠妊娠的第11天,腹腔注射不同浓度的西地那非（50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg）,1天1次,连续10天,并于妊娠第19天后与模型组接受相同处理。2.PPHN新生大鼠模型鉴定（1）右心室肥厚指数（RVHI）测定:将大鼠开胸迅速游离心脏,去除心房组织,沿心室边缘剪下右心室（RV）,分别称取右心室重量和室间隔+左心室（LV+IVS）的重量,二者重量相比RV/（LV+IVS）（mg/mg）,估测右心室肥厚指数。（2）肺血管重构评价:肺组织苏木精-伊红染色,观察肺血管形态学变化。选取各组每只新生大鼠的肺组织苏木精-伊红染色片子,分别选择直径50-200μm的肺动脉和肺小动脉,测量肺血管内外径,依照以下公式计算PAWT百分比:PAWT（%）=（外径-内径）/外径×100%3.原代PASMCs鉴定采用原代培养方法培养新生大鼠PASMCs,对细胞进行鉴定,采用α-SMA免疫荧光染色的方法。4.西地那非对培养的Hypo-PASMC增殖、迁移和凋亡的影响（1）PASMC细胞增殖和凋亡检测:MTT,流式细胞凋亡实验检测西地那非对PASMCs增殖和凋亡情况。（2）细胞周期检测:流式细胞周期实验检测西地那非对PASMCs细胞周期影响。（3）细胞迁移和侵袭检测:划痕和Transwell实验用于西地那非对PASMCs的迁移和侵袭影响的检测。5.肺组织及培养PASMC中Notch3和Hes1 mRNA表达测定通过qRT-PCR检测肺组织和Hypo-PASMCs中Notch3和Hes1 mRNA表达变化。6.大鼠肺组织及培养PASMC中Notch3和Hes1蛋白表达测定通过Western blot检测PPHN大鼠肺组织和培养Hypo-PASMCs中Notch3和Hes1蛋白表达变化。研究结果:1.PPHN动物模型鉴定及西地那非对新生PPHN大鼠肺血管重构及Notch3/Hes1通路表达的影响（1）RVHI检测结果与对照组相比,模型组RVHI显着增高,（0.23±0.03）vs（0.49±0.05）,P<0.001。与模型组相比,西地那非组显着降低了 RVHI,（0.40±0.04）or（0.36±0.03）vs（0.49±0.05）,P<0.001。（2）HE肺组织染色及PAWT结果对照组血管平滑肌细胞排列规则,内膜光滑,管腔大;模型组肺动脉的血管中膜显着增厚,PASMC肥大、增生,管腔变狭窄;与模型组相比,西地那非组,肺组织形态均有改观,肺血管中层明显变薄,血管平滑肌细胞排列规则,管腔明显变大;与对照组相比,模型组PAWT明显增加（0.30±0.04）vs（0.52±0.04）,P<0.001,西地那非可显着降低 PAWT,（0.42±0.03）or（0.38±0.06）vs（0.52±0.04）,P<0.001。（3）西地那非对新生PPHN大鼠肺组织中的Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达影响的检测结果与对照组相比,模型组中的Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达水平明显增加（P<0.001）;给予西地那非干预后,Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达低于模型组（P<0.05,P<0.001）。2.原代PASMCs鉴定结果培养细胞α-SMA表达率高于97%,成功培养了原代 PASMCs。3.西地那非对培养新生大鼠Hypo-PASMCs增殖、凋亡、迁移、侵袭及Notch3/Hes1通路表达的影响。（1）培养PASMCs增殖和凋亡与对照组相比,模型组PASMCs增殖明显增强（P<0.001）,西地那非能明显抑制PASMCs增殖;模型组的PASMC凋亡比例显着减少（P<0.001）,给予西地那非干预后,凋亡细胞比例明显增多（P<0.05,P<0.01）。（2）培养PASMCs周期结果表明与对照组相比,模型组S期细胞比例增加（P<0.001）,给予西地那非干预后,S期细胞比例明显下降（P<0.05,P<0.001）。（3）PASMCs迁移和侵袭结果显示与对照组相比,模型组迁移距离、迁移面积百分比和迁移数量明显增加（P<0.001）;给予西地那非后,迁移距离、迁移面积百分比和迁移数量都较模型组减少（P<0.05,P<0.001）。（4）西地那非对PASMCs中Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达影响的检测结果显示与对照组相比,模型组中的Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达水平明显增加（P<0.001）;给予西地那非干预后,Notch3和Hesl蛋白和mRNA表达低于模型组（P<0.05,P<0.001）。研究结论:1.西地那非能够改善Hypo+Indom诱导的PPHN大鼠RVHI增加和肺血管重构。2.西地那非可抑制Hypo-PASMCs增殖、迁移和侵袭,促进Hypo-PASMCs凋亡。3.西地那非可以抑制体内PPHN模型中的肺组织和体外Hypo-PASMCs中的Notch3和Hes1 mRNA和蛋白的表达。第二部分西地那非通过Notch3/Hes1通路抑制低氧诱导的PASMC增殖和侵袭研究目的:采用论文第一部分原代培养由低氧诱导的新生大鼠PASMC,探讨西地那非是否通过Notch3/Hes1通路发挥抑制Hypo-PASMC增殖,从而发挥抑制肺血管重构的作用。研究方法:1.沉默Notch3通过慢病毒转染短发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）到培养的Hypo-PASMCs中,敲低Notch3,检测Notch3对大鼠PASMC表达的影响。2.过表达Notch3构建Notch3过表达质粒,通过慢病毒转染到Hypo-PASMCs中,通过过表达Notch3探讨西地那非是否通过Notch3通路影响Hypo-PASMC表达。3.PASMC中Notch3和Hes1 mRNA和蛋白含量测定通过实时荧光定量RT-PCR检测和免疫印迹分析检测培养的Hypo-PASMCs中的Notch3和Hes1 mRNA和蛋白的表达。4.细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭检测MTT,流式细胞凋亡实验检测PASMC增殖和凋亡;流式细胞周期实验检测PASMC增殖周期影响;划痕和Transwell实验检测PASMCs的迁移和侵袭变化。研究结果:1.西地那非对Notch3/Hes1信号通路的影响在PASMCs中,与对照组相比,模型组中的Notch3/Hes1蛋白和mRNA表达水平明显增加（P<0.001）;给予西地那非干预后,Notch3/Hes1蛋白和mRNA表达明显低于模型组（P<0.01,P<0.001）,提示Notch3/Hes1信号通路参与了西地那非对PASMC抑制作用。2.西地那非通过Notch3/Hes1通路对PASMCs增殖、迁移、侵袭和PASMCs凋亡等的影响（1）培养PASMCs增殖和凋亡实验结果在转染Notch3 shRNA序列后,由低氧诱导的大鼠PASMCs增殖被抑制,凋亡增加,与西地那非组作用相同（P<0.001,P<0.001）:而Notch3过表达反转西地那非的抑制细胞增殖和促进凋亡作用（P<0.001）:（2）培养PASMCs流式细胞周期实验结果西地那非与Notch3 shRNA组都能够显着降低由低氧诱导的细胞S期比例升高（P<0.001）,使细胞停留在G0/G1期,而Notch3过表达组能够逆转西地那非与Notch3 shRNA的这一作用（P<0.001）;（3）PASMCs迁移和侵袭实验结果Notch3沉默组与西地那非均具有抑制PASMCs迁移和侵袭的作用（P<0.001,P<0.01）,而Notch3过表达明显减弱西地那非抑制PASMCs迁移和侵袭的作用（P<0.05）。研究结论:1.Notch3/Hes1信号通路参与了西地那非抑制低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和肺血管重构。2.西地那非通过调节Notch3/Hes1信号通路抑制PASMC增殖、迁移和侵袭,促进PASMC凋亡,从而抑制PPHN大鼠肺血管重构。
刘晓琳[4]（2021）在《DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用》文中认为研究背景心血管疾病是人类死亡的主要原因,各种危险因素导致的血管重构和动脉粥样硬化是常见的病理基础。临床和病理研究表明,动脉粥样硬化病变主要发生在血管分叉、弯曲以及狭窄区域,高血压可引起血管壁细胞增殖、血管壁增厚,介入治疗术后异常血流可引起血管增生和再狭窄。这些因素提示血管力学因素是血管重塑和动脉粥样硬化形成的重要诱因。血管重塑主要表现为血管平滑肌细胞（VSMCs）的异常增殖、凋亡和迁移。血管内皮细胞能够直接感受血流剪切力的刺激,通过细胞间的相互作用影响平滑肌细胞的功能。研究病理剪切力诱导血管重塑的分子机制以及内皮细胞和血管平滑肌细胞之间的相互作用有助于更好地理解心血管疾病的发病机制。近年来研究表明生物力学在新生内膜增生方面发挥了重要作用。DKK1蛋白,又称Dickkopf1,是一种分泌性糖蛋白,可通过旁分泌与自分泌发挥作用。一方面,DKK1通过与LRP6结合,从而拮抗下游Wnt通路发挥作用。另一方面,DKK1可以结合受体CKAP4,进而胞内段募集PI3K,激活Akt,促进增殖。既往研究中发现DKK1可通过调控CKAP4/PI3K/Akt、非经典Wnt/PCP/JNK以及β-catenin/MMP7通路促进肿瘤细胞增殖迁移及肿瘤存活。近年来,DKK1在心血管疾病中的作用受到关注,以DKK1为靶点的药物开发已进行到Ⅱ期临床试验。研究发现,DKK1与颈动脉内膜中层厚度呈正相关;接受双联抗血小板治疗的急性冠脉综合征患者中,DKK1水平与心血管事件和单独心血管死亡有独立相关性,内皮细胞与血小板来源的DKK1可通过抑制Wnt/β-catenin通路、活化NF-κB促进内皮细胞炎症反应,促进动脉粥样硬化。我们课题组前期研究发现,血清DKK1水平升高可作为急性冠脉综合征再发不良心血管事件的独立预测指标,联合危险因素显着提高预测价值。DKK1能够影响血管内皮细胞的功能。ox-LDL与病理剪切力均可上调血管内皮细胞DKK1表达,通过拮抗经典Wnt通路、激活JNK、促进脐静脉内皮细胞内质网应激,诱导凋亡,促进血流中单核细胞与内皮细胞黏附,并抑制内皮细胞间紧密连接分子的表达,从而促进动脉粥样硬化发生。在ApoE-/-小鼠中慢病毒过表达及沉默DKK1进一步证实,DKK1促进内皮细胞功能紊乱,促进斑块发生,增加斑块不稳定性。然而,DKK1对血管新生内膜形成的作用及机制尚未深入研究,DKK1受剪切力调节,剪切力干预下内皮细胞分泌的DKK1是否影响平滑肌细胞的功能,亦未见报道。本研究旨在研究剪切力-DKK1在内皮细胞-平滑肌细胞中对平滑肌增殖、迁移和新生内膜形成的影响及其潜在机制。研究目的1.探讨病理剪切力作用于内皮细胞分泌的DKK1是否影响平滑肌细胞的功能;2.检测内皮细胞DKK1蛋白缺失在低剪切力区域对血管新生内膜形成的影响;3.探索内皮细胞DKK1对血管新生内膜形成影响的潜在机制。研究方法1.采用CRISPR/Cas9法建立Tek-Cre-ERT/+/DKK1fl/fl条敲小鼠模型鉴于目前DKK1-/-小鼠胚胎致死,本课题采用CRISPR/Cas9法建立Tek-Cre-ERT/+/DKK1fl/fl（DKK1ECKO）条敲小鼠模型。2.小鼠颈动脉结扎模型的构建8-10周DKK1ECKO条敲小鼠及同窝对照DKK1fl/fl雄性小鼠行左侧颈动脉结扎制备血管低剪切力模型,21天后取材。3.动物取材小鼠麻醉,称量体重,固定。用1ml注射器于心尖取血,后续实验中检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平。使用提前预冷的生理盐水充分灌流,留取小鼠心肝脾肺肾,仔细剥离主动脉及两侧颈动脉,根据后续实验分别置于组织固定液或液氮中保存。固定24小时后置于流水下冲洗6-8小时,程序脱水后石蜡包埋,然后做连续切片。4.细胞及组织蛋白提取（全程冰上操作）根据细胞密度每孔加入80-120μl细胞及组织裂解液（RIPA）,每20mg组织加入200μl含PMSF的RIPA（1:100）,充分剪碎组织,冰上静置10min,14000rpm 4℃条件下离心5min,上清加入5×Loading Buffer,99℃10min煮蛋白使其变性,然后置于-20℃冰箱中保存。5.蛋白质印迹法（Western Blot,WB）细胞或组织蛋白上样每孔10-15ul,电泳,转膜,一抗目的分子4℃摇床上孵育过夜,洗膜,根据种属来源孵育相应二抗后ECL化学显影,然后分析条带灰度值。6.组织切片染色颈动脉石蜡切片分别进行H&E染色、免疫组织化学染色及免疫荧光染色。测量结扎处颈动脉新生内膜面积、检测DKK1表达水平、检测PCNA及Ki67等增殖指标的表达水平。7.小鼠原代内皮细胞提取与培养4-5周大小的DKK1ECKO基因敲除小鼠及同窝对照DKK1fl/fl雄鼠用于提取小鼠主动脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞。8.人原代平滑肌细胞HASMC以及脐静脉内皮HUVECs的培养内皮细胞和平滑肌细胞均购买于美国ScienCell公司,培养传代。9.细胞共培养本实验中细胞共培养下的剪切力加载系统由3个部分组成:（1）用于内皮细胞-平滑肌细胞联合培养的平行平板流动腔;（2）培养基灌流循环系统;（3）细胞培养箱。给予内皮细胞加载生理剪切力（12dyne/cm2）和病理性低剪切力（4dyne/cm2）。静止状态下的共培养采用Transwell小室,上层接种转染Lenti-GFP-DKK1慢病毒过表达DKK1的内皮细胞,下室接种平滑肌细胞。10.VSMC细胞迁移的检测采用细胞划痕实验评价rDKK1对平滑肌细胞迁移的影响。11.VSMC细胞增殖的检测采用EdU试剂盒检测rDKK1对平滑肌细胞增殖的影响。12.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 17.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,P<0.05为具有显着统计学差异。研究结果1.病理性低剪切力上调小鼠血管壁细胞中DKK1的表达小鼠体内在血管的平直段,单向的生理性脉冲剪切力起到血管保护作用;主动脉弓小弯侧等处主要为病理性的低剪切力及震荡剪切力,容易导致炎症、氧化应激反应和血栓形成。Western Blot结果显示主动脉弓小弯侧血管组织中DKK1的表达含量较胸主动脉直段显着升高（P<0.05）。说明在体内,自然状态下病理性低剪切力能够促进血管壁细胞中DKK1的表达。为进一步观察病理剪切力对血管壁细胞DKK1表达的影响,对小鼠行左侧颈总动脉结扎建立病理性低剪切力模型。结扎后48小时,通过Western Blot以及免疫荧光双染检测DKK1在血管壁细胞中的表达情况,结果均显示结扎组颈总动脉血管壁细胞中DKK1表达高于假手术组。以上结果说明,在体内病理剪切力能够上调血管壁细胞中DKK1的表达。2.病理性低剪切力干预下内皮细胞DKK1具有旁分泌作用在时间效应实验中,给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力刺激0、1、3、6、12、24h。与对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,内皮细胞中DKK1的mRNA表达上调（p<0.05）,而平滑肌细胞中DKK1的mRNA水平下调（p<0.05）。内皮细胞以及PET膜对侧平滑肌细胞中DKK1蛋白表达均上调（p<0.05）。两种细胞的培养上清中DKK1分泌量增多（p<0.05）。在强度-效应实验中,给予内皮细胞大小为12dyne/cm2的生理剪切力（Normal shear stress,NSS）以及大小为 4dyne/cm2 的病理性低剪切力（Low shear stress,LSS）刺激12小时。结果显示,与对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,内皮细胞中DKK1的mRNA表达上调（p<0.05）,而平滑肌细胞中DKK1的mRNA水平下调（p<0.05）。内皮细胞以及PET膜对侧平滑肌细胞中DKK1蛋白表达均上调（p<0.05）。两种细胞的培养上清中DKK1分泌量增多（p<0.05）。构建带有GFP标签的DKK1过表达慢病毒,转染内皮细胞并构建稳转株。Lenti-DKK1病毒转染的内皮细胞（上室）与平滑肌细胞（下室）共培养,24h后观察下室细胞荧光表达;发现共培养的平滑肌细胞内出现GFP荧光,提示内皮细胞分泌的DKK1可被共培养的平滑肌细胞摄取。3.病理性低剪切力干预下内皮细胞DKK1通过旁分泌作用对平滑肌细胞功能的影响在时间效应实验中,给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力刺激0、1、3、6、12、24h。Western blot检测平滑肌细胞中PCNA的表达水平。结果显示,与0h相比,病理性低剪切力促进平滑肌细胞PCNA的表达,3h开始升高,12h达峰,并持续至24h（p<0.05）。在强度-效应实验中,给予联合培养的内皮细胞大小为12dyne/cm2的生理剪切力（Normal shear stress,NSS）以及大小为4dyne/cm2的病理性低剪切力（Low shear stress,LSS）刺激12小时。结果显示,生理对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,平滑肌细胞中PCNA表达上调（p<0.05）。将前期实验获得的DKK1干扰稳转株内皮细胞与平滑肌细胞联合培养,给予内皮细胞病理性低剪切力刺激12h。Western blot检测平滑肌细胞中PCNA的表达水平。结果提示:干扰内皮细胞的DKK1,病理性低剪切力对平滑肌细胞增殖的促进作用被抑制（p<0.05）。中和抗体封闭实验:在进行剪切力加载前3h,在平滑肌细胞的培养液中加入10μg/ml DKK1的中和抗体。然后给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力12h。结果显示:使用DKK1中和抗体,病理性低剪切力对平滑肌细胞增殖的促进作用被抑制（p<0.05）。重组蛋白刺激实验:用不同浓度的rDKK1（0,25,50,100,150,200ng/ml）对平滑肌细胞进行刺激不同时间（0,1,3,6,12,24h）,增殖的标志物PCNA表达上调（P<0.05）。免疫荧光显示,与Con组相比,rDKK1组Ki67以及PCNA阳性细胞的比率增加。EdU结果:与Con组相比,rDKK1组EdU阳性细胞量升高。结果提示外源性DKK1具有促进平滑肌细胞的增殖作用。4.DKK1内皮条件性敲基因小鼠一般情况检测DKK1ECKO基因敲除小鼠及DKK1fl/fl对照组小鼠的TC、TG、LDL-C及HDL-C的血清水平,均无统计学差异,说明DKK1不影响敲基因小鼠的血脂。5.内皮细胞DKK1蛋白不参与维持小鼠的血管形态DKK1不影响小鼠的血管形态。实验选取未造模的5、6、7周龄DKK1ECKO组及对照组小鼠,每周龄组各3只,行颈动脉H&E染色,结果显示2组小鼠血管形态均正常且无显着差异。6.内皮细胞DKK1蛋白缺失抑制小鼠结扎血管的内膜新生HE染色显示,与同窝对照的小鼠相比,内皮细胞条件性敲除DKK1明显抑制了小鼠颈动脉结扎导致的病理性低剪切力区域的新生内膜形成（P<0.05）。7.内皮细胞DKK1蛋白缺失抑制血管平滑肌细胞的增殖体内EdU以及组织免疫荧光染色显示,内皮细胞条件性敲除DKK1明显抑制血管新生内膜中平滑肌细胞的增殖（P<0.05）。8.血管组织全基因组测序分析（RNA-seq）为了确定DKK1影响血管功能所涉及的分子特征和生物学过程,选取同窝生DKK1ECKO雄性小鼠与DKK1fl/fl雄性小鼠各6只,于8周龄时取材主动脉及颈动脉全长,2只同种小鼠血管为1个样本,进行血管组织全基因组测序分析。测序结果显示基因COX2及转录因子MYB的表达水平有明显差异。9.DKK1通过COX2促进平滑肌细胞的增殖测序结果可知DKK1基因的缺失可以下调COX2的表达。利用Real-time RT-PCR、Western Blot验证,得到的结果与测序结果一致。体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激,COX2表达上调。siRNA转染干扰COX2,然后给与rDKK1刺激12h,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,rDKK1干预下HASMCs中PCNA的表达上调被抑制,说明COX2参与DKK1对平滑肌细胞增殖功能的调节。10.COX2是c-myb的靶基因,DKK1通过c-myb/COX2促进平滑肌细胞的增殖测序结果可知DKK1基因的缺失可以下调c-myb的表达。利用Real-time RT-PCR、Western Blot验证,得到的结果与测序结果一致。体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激c-myb表达水平升高。利用siRNA转染干扰c-myb,然后给与rDKK1刺激6h,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,rDKK1干预下HASMCs中COX2的表达上调被抑制,说明DKK1能够通过c-myb调控COX2的表达。11.DKK1主要通过与平滑肌细胞表面的CKAP4受体结合,通过PI3K/AKT通路促进平滑肌细胞的增殖利用siRNA转染干扰DKK1的常见受体LRP6以及CKAP4,然后给予人重组蛋白DKK1干预12h,敲除受体CKAP4可显着抑制DKK1对平滑肌细胞增殖的促进作用（P<0.05）。AKT是受体CKAP4的下游通路,使用AKT通路的抑制剂可阻断外源性DKK1对平滑肌细胞增殖的促进作用,也可阻断DKK1对c-myb的促表达作用（P<0.05）。结论1.病理性低剪切力可增加内皮细胞分泌DKK1并促进平滑肌细胞的增殖;2.内皮细胞DKK1促进小鼠血管结扎导致的低剪切力作用区域新生内膜的形成;3.DKK1可通过c-myb/COX2促进平滑肌细胞的增殖。研究背景心血管疾病是人类死亡的主要原因,高血压是心血管疾病的主要危险因素。高血压常常伴随血管壁的机械力异常,包括牵张力和剪切力,而牵张力增加是主要的力学改变。牵张力的异常可引起血管壁细胞的形态和功能改变,从而造成血管结构和功能异常,促进动脉粥样硬化斑块形成、血管增生、动脉瘤,并加重高血压靶器官损害。因此,进一步研究明确高血压的发生和致病机制,对于减少心血管病事件具有重要意义。肾素-血管紧张素（RAS）系统在心血管疾病的发生发展中发挥重要作用,血管紧张素转化酶2（ACE2）是其关键组分之一。近年来,大量研究研究表明ACE2对心血管具有广泛的保护作用。ACE2是ACE的同源物,但在底物特异性上与ACE不同,ACE2能够裂解AngⅡ并产生血管扩张肽Ang（1-7）。ACE2在多种心血管疾病如心力衰竭、腹主动脉瘤和糖尿病肾病以及心脏纤维化等中发挥重要保护作用。我们实验室前期研究表明在ApoE-/-小鼠中慢病毒过表达及沉默ACE2进一步证实,ACE2能够抑制斑块发生发展,增加斑块稳定性。Dickkopf-1（DKK1）是一种多功能的分泌蛋白,Wnt信号通路抑制剂,最初在肿瘤学研究中发现DKK1在肺癌、结肠癌等肿瘤的发生起重要作用,并作为药物开发靶点进行二期临床研究。近期临床研究表明,DKK1与心血管疾病关系密切。我们课题组前期研究发现,不良心血管事件发生率随DKK1水平升高增加,DKK1联合hs-CRP与GRACE危险评分可以提高对ACS患者再发心血管事件的预测价值;进一步研究证明DKK1能够促进斑块形成,增加斑块不稳定性。近期研究发现DKK1参与牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用,进而参与到牵张力对平滑肌细胞功能的影响和血管壁重构,但机制尚未见报道。关于机械刺激调节血管细胞中ACE2表达的机制尚需深入研究。牵张力是否通过调控平滑肌细胞DKK1从而影响ACE2的表达,进而影响平滑肌细胞的功能,亦未见报道。研究目的1.明确病理性牵张力对平滑肌细胞ACE2、DKK1表达的影响;2.探讨ACE2对病理牵张力诱导的的人主动脉平滑肌细胞功能影响;3.探讨DKK1在牵张力调控平滑肌细胞ACE2表达中的作用。研究方法1.人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）的培养与处理人主动脉平滑肌细胞均购买于美国ScienCell公司,培养传代。2.动物模型的建立与取材对大鼠行腹主动脉缩窄术建立病理牵张力模型,随机分为腹主动脉缩窄组和假手术对照组,造模后3、5及7天后取材。将大鼠麻醉,称量体重后将其固定于泡沫板上。使用提前预冷的生理盐水充分灌流,留取小鼠心肝脾肺肾,仔细剥离主动脉及两侧颈动脉,根据后续实验分别置于组织固定液或液氮中保存。固定24小时后置于流水下冲洗6-8小时,程序脱水后石蜡包埋,然后做连续切片。3.细胞及组织蛋白提取（全程冰上操作）根据细胞密度每孔加入80-120μ1细胞及组织裂解液（RIPA）,每20mg组织加入200μl含PMSF的RIPA（1:100）,充分剪碎组织,冰上静置10min,14000rpm 4℃条件下离心5min,上清加入5×Loading Buffer,99℃ 10min煮蛋白使其变性,然后置于-20℃冰箱中保存。4.蛋白质印迹法（Western Blot）细胞或组织蛋白上样每孔10-15ul,电泳,转膜,一抗目的分子4℃摇床上孵育过夜,洗膜,根据种属来源孵育相应二抗后ECL化学显影,然后分析条带灰度值。5.酶联免疫吸附测定（ELISA）牵张力加载结束后,收集不同组中平滑肌细胞的培养上清液,ELISA法检测上清中DKK1,Ang1-7及Ang Ⅱ的含量。6.EdU检测平滑肌细胞增殖采用EdU试剂盒检测ACE2在调节病理牵张力调节平滑肌细胞增殖中的作用。7.细胞划痕实验用细胞划痕实验检测ACE2在病理牵张力调节平滑肌迁移中的作用。8.流式细胞术检测细胞凋亡采用Annexin V/PI染色,通过流式细胞术检测ACE2在介导病理牵张力调节平滑肌细胞凋亡中的作用。9.细胞转染利用 Invitrogen 公司的 Lipo3000 分别转染DKK1 siRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA,检测ACE2的表达变化,验证DKK1及ATF3是否参与病理牵张力对ACE2的表达调节。10.双荧光素酶报告实验分别构建不同长度的ACE2启动子序列。将ATF3过表达质粒或ATF3 siRNA和ACE2启动子序列共转染HEK293工具细胞,双荧光素酶报告实验检测荧光表达强度。明确ATF3与ACE2基因的启动子结合。11.组织切片染色腹主动脉切片分别进行苏木素-伊红染色（H&E）、免疫组织化学染色。检测DKK1、ACE2表达水平。同时观察人体组织的血管,比较高血压与非高血压血管ACE2与DKK1的表达。12.人体血管组织的获取研究方案由山东大学齐鲁医院科研伦理委员会批准科研伦理号:KYLL-2021-121。13.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 17.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,P<0.05为具有显着统计学差异。结果1.在体大鼠腹主动脉缩窄影响ACE2和DKK1的表达免疫组化与Western Blot结果均显示:与假手术组相比,大鼠腹主动脉缩窄后,血管壁细胞中ACE2表达下降（P<0.01）,DKK1以及ACE表达升高（P<0.01）。2.在高血压患者观察血管壁ACE2、DKK1的表达情况人体血管免疫组化染色显示:高血压患者血管壁平滑肌细胞中的ACE2表达均显着降低,DKK1的表达明显升高。3.病理牵张力调节血管平滑肌细胞中DKK1,ACE2/Ang-（1-7）和ACE/AngⅡ的表达给予平滑肌细胞不同时间（0,3,6,12,24h）18%机械牵张力刺激,同0h相比,18%机械牵张力能够抑制ACE2的表达（p<0.05）;促进ACE以及DKK1的表达（p<0.05）。18%机械牵张力促进AngⅡ及DKK1分泌（P<0.01）,抑制Ang（1-7）分泌（P<0.01）。4.ACE2对病理牵张力诱导的的人主动脉平滑肌细胞功能影响通过EdU检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞增殖的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的增殖（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞增殖（P<0.05）;通过细胞划痕实验检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞迁移能力的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的迁移（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞迁移（P<0.05）;通过流式细胞术检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞凋亡的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的凋亡（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞凋亡（P<0.05）;通过Western Blot检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞胶原合成的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞胶原Ⅰ,胶原Ⅲ的表达（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞胶原Ⅰ,胶原Ⅲ的合成（P<0.05）:5.病理牵张力通过p38/DKK1调控ACE2的表达为了探讨DKK1是否参与病理牵张力对人主动脉平滑肌细胞中ACE2的调节作用,利用小干扰转染干扰DKK1表达,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,病理牵张力干预下HASMCs中ACE2的下调被抑制（p<0.05）。给予平滑肌细胞抗DKK1中和抗体处理,也可抑制病理性牵张力对平滑肌细胞中ACE2的下调。以上结果提示,DKK1参与介导病理牵张力对平滑肌细胞中ACE2的表达调节（p<0.05）。病理牵张力诱导p38 MAPK、JNK和ERK1/2磷酸化（P<0.05）。p38 MAPK抑制剂SB203580显着减弱了病理牵张力诱导的ACE2下调（P<0.05）。给予平滑肌细胞病理牵张力刺激时,DKK1表达增加,SB203580阻断了病理牵张力对DKK1的上调作用（P<0.05）。以上结果提示,病理牵张力通过p38 MAPK促进DKK1的表达与分泌,进而调控ACE2的表达。6.病理牵张力通过ATF3调控ACE2的表达给予平滑肌细胞病理牵张力刺激时,ATF3表达增加,免疫荧光染色显示18%病理牵张力促进ATF3的核转位。利用小干扰转染干扰ATF3的表达,发现ATF3的敲低逆转了病理牵张力下调的 ACE2 水平（P<0.05）。以上结果提示,病理牵张力促进ATF3的表达增高,并促进转位进入细胞核来调控ACE2的表达。7.外源性DKK1可通过ATF3调控ACE2的表达使用体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组 DKK1 蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激。与 0h 相比,rDKK1 刺激 6h 后 ACE2蛋白表达水平即明显下调,持续至24h（p<0.05）。使用体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、15、30、60、120、180min）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激。由于ATF3是一种快速反应蛋白,因此我们使用较短的时间梯度。与0h相比,rDKK1刺激15min即可明显促进ATF3的表达,30min达到高峰（p<0.05）。然后,利用小干扰转染干扰ATF3的表达,发现ATF3的敲低逆转了 DKK1下调的ACE2水平（P<0.05）。8.ACE2是ATF3的靶基因为了进一步确定ATF3是否直接能够调节ACE2的表达,我们利用JASPAR数据库（jaspar.genereg.net）分析了 ACE2启动子序列区域中ATF3潜在的结合位点。双荧光素酶基因报告实验证实,ATF3可调控ACE2的转录活性。ChIP实验结果进一步验证了 ATF3与ACE2基因的这个转录区域结合。结论1.病理性牵张力促进血管平滑肌细胞DKK1表达,抑制ACE2表达;2.ACE2参与病理性牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移等功能的作用;3.病理性牵张力可通过促进平滑肌细胞DKK1的分泌进而抑制ACE2的表达;4.病理牵张力通过p38/DKK1/ATF3调控ACE2的表达,ACE2是转录因子ATF3的靶基因。
杨绍忠[5]（2021）在《七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节血管平滑肌收缩》文中研究说明血管张力由机体的内在机制和外在机制共同调节。吸入性麻醉药可直接作用于各种血管床的血管平滑肌和内皮细胞,影响血管阻力,从而导致器官血流改变。在维持血管张力方面,血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）中的钾离子（K+）通道起着重要作用。氯化钾（Potassium chloride,KCl）刺激血管平滑肌（Vascular smooth muscle,VSM）收缩的机制可能涉及Ca2+依赖和Ca2+敏化途径。KCl膜去极化通过电压依赖性Ca2+通道受体增加VSM细胞Ca2+内流,导致胞浆游离Ca2+（[Ca2+]i）增加。[Ca2+]i的增加激活Ca2+-钙调蛋白（Ca2+-calmodulin,CaM）依赖的肌球蛋白轻链激酶（Myosin light chain kinase,MLCK）,导致肌球蛋白轻链（Myosin light chain,MLC）磷酸化和血管收缩。除Ca2+依赖途径外,Ca2+诱导的Ca2+敏化途径还可通过调节Ⅱ类磷酸酰肌醇3-激酶α 亚基（Class Ⅱphosphoinositide 3-kinase α-isoform,PI3K-C2α）和 Rho 激酶活性来抑制MLC磷酸酶（MLC phosphatase,MLCP）,从而导致血管收缩。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase,PI3K）是一个广泛表达的酶家族,可以磷酸化膜肌醇脂类并发挥多种生物活性。根据其结构、分布、活化机制和功能不同,PI3K可分为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ三类。Ⅰ类PI3K根据不同类型的偶联受体和调节激活剂可进一步分为IA类和IB类,介导细胞增殖、存活和迁移。Ⅱ类PI3K分为 PI3K-C2α,PI3K-C2β,和 PI3K-C2γ 三种。研究表明 PI3K-C2α 和 PI3K-C2β均参与Rho的激活和Rho激酶依赖性MLCP抑制。Ⅲ类存在于酵母中,是由Vps34蛋白（磷酸酰肌醇3-激酶囊泡分选蛋白34）组成的。已知VSM表达多种PI3Ks,包括Ⅰ类酶p110α和 p110β,Ⅱ类酶 PI3K-C2α 和 C2β。PI3Ks已被证明与糖尿病（diabetes mellitus,DM）及其并发症密切相关,是葡萄糖稳态的关键分子。PI3Ks对DM患者的重要性不仅限于对糖代谢的调节,还与DM引起的靶器官损害密切相关,如血管、心脏和大脑。研究证实,DM可导致中枢神经系统中PI3K活性的降低。大脑中PI3K信号的上调,可以逆转DM的病理后果,而使用PI3K抑制剂则可减轻甚至恢复DM相关的损伤。蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）又称Akt,是PI3K途径的关键下游底物,在细胞凋亡、增殖、迁移和转录及葡萄糖代谢等多种细胞过程中发挥关键作用。PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中,可以激活并调控众多激酶靶点,是生理和病理条件下调节血管张力的关键因子。PI3K/Akt信号通路参与内皮细胞的典型功能,如调节血管平滑肌张力和血管生成等。Rho激酶在VSMC收缩机制中起重要作用。体内Rho-Rho激酶的激活可改变Ca2+的敏感性,磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1（Myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1）,抑制MLCP引起血管收缩。体内血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,Ang Ⅱ）、凝血酶和内皮细胞或平滑肌细胞中高血糖等因素,均可触发Rho激酶的激活。最新研究表明,DM患者外周循环白细胞的Rho激酶活性显着增加,抑制Rho激酶活性可以改善DM的疗效及预后。目前,临床常用的吸入性麻醉药为七氟醚（sevoflurane,SEVO）和异氟醚（isoflurane,ISO）,通常表现为浓度依赖性的心肌抑制和血管舒张,引起低血压。既往研究表明,SEVO和ISO可以通过PI3K/Akt途径对心肌和脑缺血再灌注损伤提供保护作用。PI3K/Akt通路通过L型Ca2+通道的调控以及Rho激酶、磷酸二酯酶5（phosphodiesterase 5,PDE5）的激活,导致血管收缩。研究表明,抑制PI3K信号通路是一种潜在的抗高血压和血管保护疗法。可能机制与细胞内信号转导直接作用于VSM有关,但确切机制尚未完全清楚。我们前期研究发现SEVO通过抑制蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）磷酸化降低Ang Ⅱ诱导的血管收缩,而不影响VSM中[Ca2+]i。最近研究表明,SEVO抑制 MLC、蛋白激酶 C 增强抑制蛋白（PKC-Potentiated inhibitory protein,CPI-17）和肌球蛋白磷酸酶靶向亚基 1/Thr853（Myosin phosphatase target subunit/Thr853,MYPT1/Thr853）对AngⅡ的磷酸化反应。ISO也抑制MLC对Ang Ⅱ的磷酸化反应,与MYPT1/Thr853的降低有关,但与CPI-17的磷酸化无关。SEVO和ISO均不影响Ang Ⅱ诱导的肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1/Thr696（Myosin phosphatase target subunit/Thr696,MYPT1/Thr696）磷酸化。上述研究表明两种吸入性麻醉药对Ang Ⅱ诱导的血管收缩和MLC磷酸化有相似的抑制作用,但其抑制MLCP活性的机制却不同。PI3K参与Rho的激活和由此产生的Rho激酶依赖性MLCP抑制,可诱导血管平滑肌收缩,但与其细胞内Ca2+浓度升高无关,表明该激酶参与了细胞内Ca2+敏化途径。研究表明,临床浓度的SEVO可显着抑制非DM大鼠对去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）的反应,但对DM大鼠无此作用。临床研究证实,用ISO或SEVO麻醉诱导,非DM患者的足部皮肤温度比DM患者更高,提示由交感神经系统控制的体温调节在DM患者中受损。这些发现表明DM血管对吸入性麻醉药的反应性发生了改变。但DM血管对吸入性麻醉药反应性的差异及其机制尚未确定,尤其是对血管病变较严重的老年DM研究较少。目前,关于SEVO和ISO对Ca2+诱导的Ca2+敏化途径在调节VSM收缩中的作用所知甚少。本研究分为三部分,第一部分研究对象为正常大鼠主动脉血管,旨在探讨吸入性麻醉药通过调节PI3K亚基和Rho激酶活性,对正常大鼠主动脉血管平滑肌收缩的影响。第二部分研究对象为老龄DM血管,通过与幼龄和老龄正常大鼠血管对比,旨在探讨吸入性麻醉药对DM大鼠主动脉血管平滑肌收缩的影响,并探讨年龄和DM对吸入性麻醉药血管舒张反应的特异性影响。主动脉为弹性储器血管,而决定外周血管阻力的主要是阻力血管,因此第三部分研究对象选择胃癌患者手术切除的大网膜动脉,旨在探讨吸入性麻醉药通过调节PI3K亚基和Rho激酶活性,对阻力血管平滑肌收缩的影响。本研究将为临床合理应用吸入性麻醉药提供更多理论依据,有助于改善患者预后。第一部分:七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2 α/Rho激酶调节大鼠主动脉血管平滑肌收缩目的探讨SEVO和ISO通过调节正常大鼠离体主动脉血管平滑肌中PI3K亚基和Rho激酶活性对KCl所致血管平滑肌收缩的影响。方法1.血管平滑肌组织制备。雄性Wistar大鼠（250-350g）用氟烷麻醉,通过颈总动脉放血实施安乐死。仔细解剖降主动脉,去除附着的脂肪和连接组织,切成3-4mm的动脉环。用不锈钢针轻轻摩擦内表面,去除内皮细胞。动脉环垂直安装在两个挂钩之间,上挂钩连接到等张力传感器的杠杆上。2.等张肌力收缩测量。用KCl（60mM）培养主动脉环,观察平滑肌细胞完整性其整体收缩反应性,并确认动脉环内皮细胞已去除。在加入KCl前先将每只大鼠（n=7）的6个主动脉环随机暴露于SEVO和ISO的0、1、2和3最小肺泡浓度（MAC）或 1mM LY294002（PI3K 抑制剂）或1μM Y27632（Rho 激酶抑制剂）环境中培养15min。使用等张肌力传感器测量KCl诱发的血管收缩张力。SEVO、ISO、LY294002和Y27632对KCl诱导的大鼠主动脉平滑肌收缩的等张力变化以相对于KCl（60mM）诱导的最大等张力的百分比表示。3.MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化测定。从每只大鼠的降主动脉取一条去除内皮细胞的动脉条带（约3.5cm）,在实验开始前将其浸泡在含氧的KBS溶液中平衡60min。主动脉条分别在0（对照）、60 mM KCl、1 MAC-SEVO（1.7%）、2 MAC-SEVO（3.5%）、1 mM LY294002 和 1μM Y27632 或 0（对照）、60mM KCl、1MAC-ISO、2MAC-ISO、1mM LY294002 和 1μM Y27632 中培养。在有 KCl 的情况下培养15min,无KCl的情况下培养5min,用液氮快速冷冻,匀浆离心后使用Western blot分析测定MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化程度。实验中用化学发光法检测免疫反应带的密度,用图像分析软件评估。磷酸化与总CPI-17、MLC和MYPT1的比值用作每种酶的活化指标,并表示为相对于基线对照水平的百分比。4.PI3K和Rho激酶（Rock Ⅱ）转膜活化测定。为测定SEVO、ISO和激酶抑制剂对KCl刺激的PI3K和Rock Ⅱ转膜活化的剂量效应,主动脉条分别先用1.7%SEVO、3.5%SEVO、1.2%ISO、2.3%ISO、1 mM LY294002 和 1μM Y27632处理15min后,用KCl培养5min。使用Western blot分析测定PI3K和Rho激酶（RockII）转膜活化水平。实验中用化学发光法检测免疫反应带的密度,用图像分析软件评估。PI3K-p85α、PI3K-C2 α和Rock Ⅱ的含量以总值的百分比表示（膜中含量/膜和胞质中总量）。结果1.等张肌力收缩测量。KCl诱导大鼠主动脉平滑肌快速而持续收缩,在约5min后达到最大水平,并在大鼠主动脉环中持续超过30min。SEVO和ISO均以浓度依赖的方式减弱KCl诱导的动脉平滑肌收缩,并且LY294002（1mM）和Y27632（1μM）对平滑肌收缩也起抑制作用。SEVO对KCl诱导的血管平滑肌收缩抑制作用与等效浓度的ISO 比较,无显着性差异。2.MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化测定。KCl诱导MLC磷酸化迅速增加,且在暴露于KCl约5min后达到峰值水平。SEVO和ISO也以浓度依赖的方式抑制 KCl 诱导的 MLC 磷酸化,LY294002（1mM）和 Y27632（1μM）对 MLC磷酸化也起到抑制作用。SEVO和ISO均以浓度依赖的方式抑制KCl引起的MYPT1/Thr853磷酸化,但均不影响MYPT1/Thr696和CPI-17/Thr38的磷酸化。3.PI3K 和 Rho 激酶（Rock Ⅱ）转膜活化测定。LY294002（1mM）抑制 KCl诱导的PI3K-p85和PI3K-C2α转膜活化（分别为P<0.05和P<0.01）。Y27632（1uM）和LY294002（1mM）均能抑制KCl诱导的Rock Ⅱ转膜活化（P<0.01）。SEVO和ISO均抑制大鼠主动脉血管平滑肌中PI3K-C2α和Rock Ⅱ转膜活化,但对PI3K-p85转膜活化无影响。结论1.SEVO和ISO均能通过抑制正常大鼠主动脉血管平滑肌中PI3K-C2α和Rho激酶活性及MLC磷酸化,抑制血管收缩。2.LY294002可通过抑制MLC磷酸化和PI3K活性抑制血管收缩。3.吸入性麻醉药发挥抑制作用的细胞机制是通过PI3K-C2α/Rho激酶/MYPT1/MLC途径介导。意义SEVO和ISO可通过调节大鼠主动脉血管平滑肌中PI3K-C2α和Rho激酶活性抑制血管平滑肌收缩。临床浓度的吸入性麻醉药与PI3K抑制剂合用可增强血管舒张作用。研究为使用PI3K抑制剂进行抗癌治疗的患者使用吸入性麻醉药时的循环管理提供一定临床指导。第二部分:七氟烷和异氟烷通过PI3K/Rho激酶调节糖尿病血管平滑肌收缩目的探讨SEVO和ISO对PI3K和Rho激酶参与的老年2型糖尿病大鼠血管平滑肌收缩的影响。方法1.实验动物。选择老年雄性OLETF大鼠（65～70周龄）和年龄匹配的非糖尿病LETO大鼠及幼年Wistar大鼠（6～8周龄）作为研究对象。OLETF大鼠是一种自发性的2型糖尿病（type 2 diabetesmellitus,T2DM）动物模型,具有先天性多食、轻度肥胖、迟发性高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症的特点,与人类T2DM的病理生理过程相似。2.口服糖耐量试验。实验前对各组大鼠进行口服糖耐量试验（Oral glucose tolerance test,OGTT）。大鼠禁食8～14h,取尾静脉血测定空腹血糖。然后葡萄糖（2g/kg）灌胃,30、60、90、120min时分别测定负荷后血糖。各组大鼠符合入组标准后用于后续实验。3.血管平滑肌制备。三组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后,颈总动脉放血实施安乐死。仔细解剖降主动脉,切成3～4mm长的动脉环。用不锈钢针轻轻摩擦内表面,去除内皮细胞。动脉环垂直安装在两个挂钩之间,上挂钩连接到等张力传感器的杠杆上。4.等张肌力测量。等张力传感器测量KCl诱导的三组大鼠主动脉血管收缩张力。用KCl诱导动脉环后,将各组动脉环随机分别暴露于SEVO或ISO（MAC值为 0、1、2、3）、10μM LY294002 和 1μMY27632 的环境中培养 15min。SEVO和ISO通过校准的汽化器以2L/min的新鲜气流流量通入到气体混合物中,使用气相色谱仪监测和调整KBS溶液中的SEVO浓度。SEVO、ISO、LY294002和Y27632对KCl（60mM）诱导的三组大鼠动脉平滑肌收缩的等张力变化以相对于KCl（60mM）诱导的最大等张力的百分比表示。结果1.葡萄糖耐量曲线变化。大鼠OGTT曲线变化表明,老年OLETF大鼠餐后血糖明显高于对照组同龄LETO大鼠及幼年Wistar大鼠,有显着差异（P<0.01）且在30min达到最高值。LETO大鼠及Wistar大鼠血糖峰值在10mmol/L以下,但峰值出现时间不同,老年LETO大鼠峰值在进食后30min,幼年Wistar大鼠峰值在餐后60min。2.KCl（60mM）对大鼠主动脉血管平滑肌收缩的影响。KCl诱导三组大鼠主动脉平滑肌快速而持续收缩,与LETO组及Wistar组相比,OLETF组大鼠主动脉收缩更明显,有显着性差异（P<0.05）,LETO组与Wistar组无显着性差异。3.SEVO和ISO对KCl诱导的大鼠主动脉平滑肌收缩的影响。SEVO和ISO对幼年和老年大鼠血管反应存在显着性差异,SEVO对幼年大鼠血管抑制作用较等效浓度ISO更强,其中2MAC和3MAC SEVO较等效浓度ISO有显着性差异（P<0.05）。老年大鼠组中,ISO 比等效浓度SEVO抑制作用更显着,且OLETF组比LETO组更明显,但两者没有显着性差异。三组间比较,1MAC SEVO对KCl诱导的幼年Wistar大鼠主动脉血管收缩抑制作用最强,且与OLETF组和LETO组相比,有显着差异（P<0.05）。2MAC SEVO对三组大鼠无显着性差异。3MAC SEVO对KCl诱导的OLETF组血管收缩抑制作用最强,与LETO组和Wistar组相比,有显着差异（P<0.05）。与SEVO不同,相比较OLETF组和LETO组,各浓度ISO对幼年Wistar大鼠主动脉血管收缩抑制作用最弱,有显着性差异（P<0.05）。4.LY294002（10μM）和Y27632（1μM）对KCl诱导的大鼠主动脉血管收缩的影响。LY294002和Y27632对三组大鼠主动脉血管收缩均有抑制作用。三组间LY294002和Y27632抑制程度比较,Wistar组与LETO组没有统计学差异（P>0.05）,OLETF大鼠组主动脉舒张程度明显高于LETO组和Wistar组,有显着性差异（P<0.01）。结论1.与正常血管相比,KCl诱导糖尿病血管平滑肌收缩显着增强。2.SEVO和ISO对幼年和老年大鼠主动脉血管平滑肌收缩抑制有显着差异,SEVO对幼龄血管抑制作用更明显,尤其是高浓度时。ISO对老年血管抑制作用更强。3.吸入性麻醉药对正常血管和糖尿病血管反应明显不同,提示糖尿病血管PI3K和Rho激酶活性异常。4.PI3K抑制剂LY294002和Rho激酶抑制剂Y27632对糖尿病血管收缩抑制作用更强,进一步提示糖尿病血管PI3K和Rho激酶活性异常。意义探明吸入性麻醉药调控糖尿病血管舒张的特异性反应,为糖尿病患者围术期合理选择麻醉药物,实现麻醉学向围术期医学转变,预防围术期急性心脑血管事件的发生提供理论依据。第三部分:七氟烷通过PI3K-C2 α/Rho激酶调节大网膜动脉血管平滑肌收缩目的研究SEVO通过调控PI3K-C2α和Rho激酶活性对KCl诱导的大网膜动脉血管平滑肌收缩的影响。方法1.组织制备。取患者腹腔镜胃切除后的大网膜动脉为研究样本。仔细解剖大网膜动脉,去除附着的脂肪和连接组织,并将备好的动脉切成3～4mm的动脉环。动脉环用棉签或针头轻轻摩擦,以机械方式去除内皮细胞,避免内皮衍生的血管舒张物质介导的影响。动脉环用苯肾上腺素（10-5mol/L）预收缩,对缓激肽（10-6mol/L）无舒张反应时,表明内皮细胞已完全去除。去除内皮细胞的动脉环垂直安装在两个挂钩之间,上挂钩连接到等张力传感器的杠杆上。2.等张肌力测量。等张力传感器测量KCl诱导的动脉血管收缩张力。在37℃的Krebs碳酸氢盐溶液（KBS）中通入95%（v/v）O2和5%（v/v）CO2的混合气（新鲜气体流量为2L/min）。动脉环在3g的静息张力下平衡60min,每隔20min更换一次培养液。随后用KCl（60mM）培养动脉环,观察平滑肌细胞的完整性及其整体收缩反应性。在加入KCl之前先将动脉环随机暴露于SEVO（MAC值为 0、1、2）或 10μM LY294002（PI3K 抑制剂）或 1μMY27632（Rho 激酶抑制剂）的环境中培养15min。SEVO通过校准的汽化器以2L/min的新鲜气流流量通入到气体混合物中,使用气相色谱仪监测和调整KBS溶液中的SEVO浓度。SEVO、LY294002和Y27632对KCl诱导的大网膜动脉平滑肌收缩的等张力变化以相对于KCl（60mM）诱导的最大等张力收缩的百分比表示。4.MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化测定。在大网膜动脉样本中取一条内皮剥脱的血管条带（约3.5cm）,将其浸泡在含氧的KBS溶液中,平衡60min。将不同大网膜动脉条随机于 0（对照）、60mM KCl、1MAC-SEVO（1.7%）、2 MAC-SEVO（3.4%）、LY294002（10μM）或 Y27632（1μM）中培养。在无 KCl 的情况下培养15min,在KCl存在的情况下培养5min,随后用液氮进行快速冷冻。匀浆离心后使用Western blot分析MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化程度。实验用化学发光法检测免疫反应带的密度,用图像分析软件评估。磷酸化与总CPI-17、MLC和MYPT1的比值用作每种酶的活化指标,并表示为相对于基线对照水平的百分比。5.PI3K和Rho激酶（Rock Ⅱ）转膜活化测定。选取样本中己去除内皮细胞的大网膜动脉条,将其浸泡在含有20ml KBS溶液的器官浴槽中平衡60min,每20min更换一次KBS溶液。将平衡后的动脉条分别置于1MAC-SEVO（1.7%）、2MAC-SEVO（3.4%）、LY294002（10μM）和 Y27632（1μM）的环境中培养 15min。用KCl处理5min后,用液氮快速冷冻样品。使用Western blot方法测定PI3K和Rho激酶（RockⅡ）的转膜活化。实验用化学发光法检测免疫反应带的密度,用图像分析软件评估。PI3K-p85α、PI3K-C2α和Rock Ⅱ的含量以总值的百分比表示（即膜中含量/膜加胞质中总含量）。结果1.等张肌力测量。等张力传感器测量KCl诱导的动脉VSM收缩张力。SEVO、LY294002和Y27632对KCl诱导的大网膜动脉VSM收缩的等张力变化以相对于KCl（60mM）诱导的最大等张力的百分比表示。测量结果显示SEVO以浓度依赖的方式减弱KCl诱导的人离体大网膜动脉VSM收缩,LY294002（10μM）和Y27632（1μM）也可以对其起到抑制作用。2.MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化测定。结果显示KCl诱导MLC磷酸化迅速增加,且在暴露于KCl约5min后达到峰值水平。SEVO以浓度依赖的方式抑制KCl引起的MLC和MYPT1/Thr853磷酸化。与第一部分结果一致,SEVO不影响KCl引起的大网膜动脉MYPT1/Thr696和CPI-17/Thr38磷酸化的增加;此外,LY294002（10μM）和Y27632（1μM）也可以抑制KCl诱导的MLC磷酸化。3.PI3K和Rho激酶（Rock Ⅱ）转膜活化测定。与第一部分结果一致,SEVO以浓度依赖的方式抑制人离体大网膜动脉血管平滑肌PI3K-C2α和Rock Ⅱ的转膜活化,但SEVO不会以浓度依赖的方式抑制PI3K-p85对KCl的反应。LY294002（10μM）可抑制 KCl 诱导的 PI3K-p85 和 PI3K-C2α 转膜活化。Y27632（1uM）和LY294002（10μM）均能抑制KCl诱导的Rock Ⅱ转膜活化。结论1.SEVO可通过调控大网膜动脉血管中PI3K-C2α和Rho激酶活性抑制血管收缩。2.低浓度PI3K抑制剂LY294002（10μM）可有效抑制PI3K活性和MLC磷酸化,舒张血管。3.SEVO对KCl诱导的血管收缩的抑制作用与调节MLCP的上游活化因子PI3K-C2α/Rho激酶活性有关。意义临床常用剂量的SEVO可通过调控大网膜动脉血管平滑肌中PI3K-C2α和Rho激酶活性抑制血管收缩。吸入性麻醉药对弹性储器血管和阻力血管均有浓度依赖性抑制作用。该研究为围术期使用PI3K抑制剂进行抗癌治疗的患者使用吸入性麻醉药时的循环管理提供重要理论依据。
张英展[6]（2021）在《自发性高血压大鼠血压发展过程中血管内皮依赖性收缩的变化及机制研究》文中提出背景和目的血管内皮细胞释放的一系列具有血管活性的小分子物质是调节血管张力和维持心血管稳态的关键。在高血压和衰老等的病理生理状态下,血管内皮细胞功能障碍可损害血管结构和功能。而内皮源性血管活性因子失衡是内皮功能障碍的主要原因之一,其中,环氧合酶催化花生四烯酸代谢所生成的前列腺素类起重要作用。前列环素是花生四烯酸在内皮细胞中代谢的主要产物之一,长期以来被认为是一种内皮依赖性舒张因子,其通过作用于前列环素（I prostaglandin,IP）受体诱发血管舒张效应。然而,越来越多的研究表明,前列环素（prostaglandin I2,PGI2）也可以作为血管内皮依赖性收缩因子,通过作用于血管收缩受体,如血栓素A2（thromboxane-prostaglandin,TP）受体和/或前列腺素E2受体3亚型（E prostaglandin receptor-3,EP3）受体诱发血管收缩效应。同时,在衰老和/或血管疾病状态下血管内皮依赖性收缩（endothelium-dependent contractions,EDCs）可以增强,部分原因是环氧化酶产物的增加和/或其下游受体的表达和/或功能发生改变。自发性高血压大鼠（SHR）作为人类高血压模型一直以来被广泛研究,其在4周龄的血压仍与Wistar-Kyoto大鼠（WKY）相当,而大约在6周龄时可产生高血压,在3-4月龄则为高血压确立期。SHR的血压和血管在幼年到成年的转变中发生了很大的改变,然而EDCs在此期间的变化及其潜在机制目前仍不清楚。髂动脉主要为盆腔器官和腿部输送血液,是一些老年相关疾病的临床干预靶标。因此,本研究主要阐明SHR高血压发展过程中髂动脉及其它血管的EDCs的变化及其内在机制,以期为控制此时期血压的升高提供血管生物学方面的实验依据。此外,舒张血管和/或抑制血管收缩是预防和治疗高血压的方法之一。我们之前的研究表明,拮抗TP受体可以抑制PGI2在某些动脉中诱发的血管收缩作用,从而改善血管舒张效应。并且,进一步阻断EP3受体可以更好地改善血管张力。在大鼠肠系膜动脉等血管中,EP3受体拮抗剂L-798106不仅与TP受体拮抗剂SQ29548有协同作用,而且比TP受体拮抗剂SQ29548更好地抑制PGI2血管张力效应。因此,迫切需要探究L-798106对髂动脉内皮依赖性收缩的影响,以及在体给药后其对SHR高血压发展的影响。本研究通过分离不同年龄段（幼年:4周龄;成年:12-16周龄）的WKY和SHR髂动脉、肾动脉和主动脉进行生化和/或功能分析,以解决上述问题。材料与方法本研究采用4周龄及12-16周龄的雄性无特定病原体（SPF）级的WKY和SHR髂动脉、肾动脉和主动脉进行生化实验和功能分析。无创血压测量系统检测L-798106处理前后SHR的收缩压和心率;血管环张力检测系统检测WKY和SHR离体髂动脉、肾动脉和主动脉的血管反应性;高效液相色谱质谱联用法检测成年WKY和SHR的离体髂动脉PGI2代谢产物6-keto-PGF1α、Tx A2代谢产物Tx B2、PGE2、PGF2α和PGD2的生成;酶联免疫吸附法检测内皮胆碱能受体激动剂乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）在幼年和成年WKY和SHR离体髂动脉中诱导产生的PGI2代谢产物6-keto-PGF1α的水平;免疫印迹法检测幼年和成年WKY及同年龄段的SHR的髂动脉的EP3受体和TP受体的蛋白表达;实时定量PCR法检测幼年和成年WKY和SHR髂动脉的IP受体m RNAs水平;称量L-798106处理前后SHR的体重及心脏的重量并计算心脏体重比。结果1.在有一氧化氮（nitric oxide,NO）合酶抑制剂L-NAME存在的情况下,ACh诱发幼年SHR髂动脉强烈的血管收缩效应,该效应在去内皮处理后基本消失,因此该效应为EDCs。ACh诱发幼年WKY和SHR的髂动脉程度相当的EDCs（P>0.05）,但该EDCs在成年动物血管中减弱（P<0.01）,并且成年SHR的髂动脉的EDCs随年龄增长而减弱的幅度较小（P<0.05）。2.高效液相色谱质谱联用方法检测到成年WKY和SHR的髂动脉主要生成6-keto-PGF1α。与基础状态（仅在PSS,未加入ACh刺激）相比,ACh刺激后的幼年和成年WKY的髂动脉及同年龄段的SHR的髂动脉产生的6-keto-PGF1α均增加（P<0.01）;并且,基础状态下和ACh刺激后的6-keto-PGF1α水平均随年龄的增加而减少（P<0.01）。另外,PGI2、TP受体激动剂U46619或EP3受体激动剂硫前列酮在成年的髂动脉中诱发的血管收缩效应比在幼年的髂动脉中明显减弱（P<0.01）。3.幼年和成年WKY及相应年龄段的SHR髂动脉均表达TP和EP3受体蛋白。其中,幼年WKY和SHR髂动脉的TP受体蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）,其在成年大鼠中均下调（P<0.01）,并且成年SHR髂动脉的TP受体蛋白表达水平高于同年龄段的WKY髂动脉（P<0.05）。与此不同,幼年WKY髂动脉的EP3受体蛋白表达水平高于幼年SHR髂动脉（P<0.05）,并且EP3受体的蛋白表达在成年中均下调（P<0.01）,然而成年WKY和SHR髂动脉的EP3受体蛋白表达无差异（P>0.05）。不同年龄段的WKY髂动脉的IP受体m RNA水平无明显差异（P>0.05）,而成年SHR髂动脉的IP受体m RNA水平高于幼年髂动脉（P<0.01）。4.在有L-NAME存在的情况下,ACh、PGI2诱发幼年SHR髂动脉血管收缩效应,其可被SQ29548或L-798106减弱（P<0.01）。并且,L-798106的抑制作用比SQ29548更大（P<0.01）。同时,PE收缩后,ACh诱发幼年SHR髂动脉的血管舒张效应被一双相收缩反应所减弱。给予SQ29548预处理后,该双相收缩反应有减弱的趋势（P>0.05）。而L-79810预6处理能够消除ACh诱发的这一双相收缩反应,从而只表现为血管舒张反应,并且舒张程度比SQ29548处理后更强（P<0.01）。与此一致,PE收缩后,PGI2诱发幼年和/或成年SHR髂动脉的血管收缩效应仅在SQ29548预处理后有减弱的趋势（P>0.05）,而L-798106预处理后将其逆转为血管舒张效应（P<0.01）。5.在有L-NAME存在的情况下,TP受体激动剂U46619可引起幼年SHR髂动脉强烈的浓度依赖性血管收缩效应,而L-798106处理明显减弱该收缩效应（P<0.01）。6.在有L-NAME存在的情况下,ACh诱发幼年SHR肾动脉或主动脉EDCs,该效应在成年SHR肾动脉中明显减弱（P<0.01）。与此一致,与幼年相比,成年WKY肾动脉或主动脉的EDCs亦明显减弱（P<0.01）。7.SHR的收缩压随着年龄的增长而逐渐升高。然而,L-798106给药组可抑制给药期内（15天）血压的上升（P<0.01）;对照组和L-798106给药组的体重、心率和心脏体重比无差异（P>0.05）;此外,在L-798106处理前,两组幼年SHR大鼠体重、心率无差异（P>0.05）。结论1.幼年WKY和SHR髂动脉存在程度相当的EDCs,且其在幼年向成年转变中随年龄的增长及SHR血压的升高而降低。2.与WKY髂动脉相比,由于TP、EP3受体下调程度的不同,SHR髂动脉的EDCs随年龄的增长而降低的幅度较小,从而表现为成年SHR的EDCs比成年WKY的要强。3.在幼年向成年转变过程中,其它血管中的肾动脉与主动脉,EDCs亦存在与髂动脉相类似的变化规律。4.L-798106除可拮抗EP3受体外,还能部分阻断TP受体的功能,但保留具有舒张作用的IP受体功能,从而抑制幼年SHR高血压的发展。
吕佳奇[7]（2021）在《乳酸及TDAG8在HPH中的作用研究》文中指出目的:通过观察乳酸、细胞因子及TDAG8、HIF-1α在临床患者及大鼠表达量的改变,了解乳酸及TDAG8在HPH中的作用。方法:1、临床部分:选取2019年4月至2019年12月在在内蒙古医科大学第三临床医学院呼吸与危重症医学科确诊的低氧性肺动脉高压患者10例为HPH组,选同期健康体检者10例为NC组。在外周血行PCR法检测TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206 m RNA的表达,行Elisa法测PDGF、VEGF的表达。2、动物部分:SD大鼠随机分正常组（NC组）、低氧组（HPH组）、TDAG8基因干扰组（HPH+TDAG8-组）各6只,HPH组采用常压低氧法21天建立低氧性肺动脉高压大鼠模型,HPH+TDAG8-组分别在HPH造模前1天、第7天、第14天向大鼠尾静脉注射TDAG8 sh RNA慢病毒实现基因干扰,持续21天造模成功后,留取血液及心、肺组织标本。通过器官水平评估模型建立情况及慢病毒干扰效果（1）评估右心肥厚指数及病理切片评估肺动脉血管重塑情况;（2）活体荧光示踪法验证大鼠尾静脉TDAG8 sh RNA慢病毒注入大鼠体内情况。细胞水平通过检测慢病毒介导sh RNA干扰TDAG8大鼠肺泡巨噬细胞的表达效果。使用Real-time PCR法检测模型大鼠外周血中TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206 m RNA的表达。Western Blot法检测模型大鼠外周血中TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206蛋白表达。ELisa法检测大鼠外周血血清中PDGF、VEGF的表达及大鼠肺组织匀浆中乳酸含量。细胞水平通过模型大鼠血清刺激肺血管平滑肌细胞,MTT法进行细胞增殖实验通过测OD值反应PASMCs增殖情况。结果:1、临床部分:（1）低氧性肺动脉高压患者及健康体检者一般资料对比HPH组与NC组年龄无差异性（t=2.01,P>0.05）;HPH组FEV1%较NC组低（t=6.92,P<0.0001）;HPH组FEV1%FVC较NC组低（t=7.32,P<0.0001）;HPH组PASP较NC组低（t=7.1,P<0.0001）。（2）PCR法检测外周血中TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206 m RNA在HPH组表达较NC组显着升高（t分别=6.253、6.687、4.945、5.452、6.098,P<0.001）;Elisa法检测外周血中PDGF、VEGF在HPH组表达较NC组显着升高（t分别=6.5、5.3,P<0.0001）,差异均具有统计学意义。（3）在HPH组中,TDAG8与HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206、PDGF、VEGF呈正相关（r值分别为0.764、0.747、0.763、0.703,P值均<0.05）;HIF-1α与PDK1、NDRG3、CD206呈正相关（r值分别为0.694、0.734、0.762,P值均<0.05）;NDRG3与CD206、PDGF、VEGF呈正相关（r值分别为0.753、0.763、0.741,P值均<0.05）。（4）ROC曲线:TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206、PDGF、VEGF的AUC分别为0.96、0.97、0.95、0.93、0.96、0.98和0.97,以上因子对低氧性肺动脉高压均有预测价值,PDGF的AUC最大,故PDGF具有更好的诊断价值。2、动物部分:（1）低氧性肺动脉高压大鼠模型建立成功:（1）21d后大鼠平均体重:HPH组为212±1.45,较NC组明显增加（t=6.435,P<0.0001）;HPH+TDAG8-组为191.9±5.938,较NC组明显增加（t=8.996,P=0.0001）;HPH+TDAG8-组较HPH组明显减轻（t=6.52,P=0.0001）,均具有差异性;（2）右心室肥厚指数（RVHI）:HPH组为0.440±0.0178,较NC组明显增加（t=7.051,P<0.0001）;HPH+TDAG8-组为0.409±0.0150,较NC组明显增加（t=4.265,P<0.01）;HPH+TDAG8-组较HPH组明显减轻（t=3.184,P<0.05）;（3）活体荧光示踪法验证大鼠尾静脉注射TDAG8特异性sh RNA慢病毒成功。（2）PCR法检测大鼠外周血中TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206m RNA在HPH组较NC组显着升高（t分别=10.1、11.4、9.25、10.68、12.96,P均<0.0001）;在HPH+TDAG8-组较NC组显着升高（t分别=10.1、11.4、9.25、10.68、12.96,P均<0.05）;在HPH+TDAG8-组较HPH组显着下降（t分别=4、2.58、3.13、3.477、5.181,P均<0.05）;且三组间存在显着差异性（F分别为30.7、31.1、23.4、31.29、59.09,P均<0.0001）。ELisa法检测大鼠外周血中PDGF、VEGF在HPH组较NC组显着升高（t=7.49、11.8,P均<0.0001）;在HPH+TDAG8-组较NC组显着升高（t=5.22、5.9,P均<0.01）;在HPH+TDAG8-组较HPH组显着下降（t=3.9、6.53,P均<0.01）,三组间具有差异性（F分别为37.1、74.4,P均<0.0001）。Western Blot法大鼠外周血中TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206蛋白在HPH组较NC组显着升高（t分别=9.04、15.1、7.76、7.22、9.76,P均<0.01）;在HPH+TDAG8-组较NC组显着升高（t分别=8.77、10.9、14.3、9.25、7.6,P均<0.001）;在HPH+TDAG8-组较HPH组显着下降（t分别=2.47、5.98、2.5、4.86、3.48,P均<0.05）,三组间具有差异性（F分别为43.2、114、41.6、39.4、47.5,P均<0.001）。Elisa法检测大鼠肺组织匀浆乳酸含量在HPH组中较NC组显着升高（t=7.86,P<0.0001）,在HPH+TDAG8-组较NC组显着升高（t=6,P<0.001）,在HPH+TDAG8-组较HPH组显着下降（t=4.5,P<0.01）,具有差异性（F=41.5,P<0.0001）。MTT法检测大鼠血清刺激大鼠肺血管平滑肌细胞增殖在HPH组中较NC组显着升高（t=6.13,P<0.01）,在HPH+TDAG8-组较NC组显着升高（t=2.46,P<0.05）,在HPH+TDAG8-组较HPH组显着下降（t=4.23,P<0.01）,三组间具有差异性（F=23.6,P=0.0005）。相关性分析示在HPH组中,TDAG8与HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206呈正相关（r值分别为0.899、0.915、0.899、0.890,P均<0.05）,HIF-1α与PDK1、NDRG3、CD206呈正相关（r值分别为0.916、0.899、0.891,P均<0.05）,NDRG3与CD206、PDGF、VEGF呈正相关（r值分别为0.847、0.852、0.830,P均<0.05）。结论:1、临床研究表明,HPH患者TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206、PDGF、VEGF水平明显升高,且TDAG8与HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206呈正相关,HIF-1α与PDK1、NDRG3、CD206呈正相关,NDRG3与CD206、PDGF、VEGF呈正相关。ROC分析显示PDGF对低氧性肺动脉高压最具有诊断价值。2、在HPH模型大鼠中,TDAG8、HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206基因及蛋白表达水平也显着升高,分子水平PDGF、VEGF表达水平也显着升高,相关性分析显示,TDAG8与HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206呈正相关,HIF-1α与PDK1、NDRG3、CD206呈正相关,NDRG3与CD206、PDGF、VEGF呈正相关,CD206与PDGF、VEGF呈正相关,与HPH患者结果相一致。3、通过慢病毒基因干扰技术,干扰HPH模型大鼠TDAG8的表达,可以部分减少HIF-1α、PDK1、NDRG3、CD206、PDGF、VEGF的表达,相关性分析并未发生显着性改变。4、乳酸及TDAG8在HPH中有调节作用,其机制可能涉及TDAG8/HIF-1α/PDK1/乳酸信号通路的活化,最终导致糖酵解增强,乳酸生成增多,NDRG3乳酸化,独立于HIF-1α稳定表达,促进巨噬细胞向M2型极化,PDGF、VEGF等细胞因子分泌增多,诱导肺血管平滑肌细胞增殖,促进肺血管重塑的进程。
王新[8]（2021）在《基于肥大细胞调控肥胖和能量代谢的机制研究白杨素干预高脂饮食相关代谢性疾病的作用》文中研究表明脂肪组织作为主要的储能器官,在维持体内能量稳态过程中发挥重要作用。白色脂肪组织中不仅有典型的白色脂肪细胞,还零星分布着可以诱导产热的浅棕色脂肪细胞。白色脂肪组织基质血管相（stromal vascular faction,SVF）中的肥大细胞（MC）等免疫细胞、前脂肪细胞以及内皮细胞等,通过与脂肪细胞的互作而调控脂肪组织和机体的能量稳态。2009年,本团队报道了MC通过影响白色脂肪组织血管化,关键地控制了高胆固醇的西方饮食（Western diet,WD）所诱导的肥胖和胰岛素抵抗。此后,另一些研究团队报道,对于高脂饮食（High-fat diet,HFD）所诱导的肥胖和胰岛素抵抗,MC没有明确的影响。为进一步明确MC及其食品源稳定剂白杨素调控饮食诱导的肥胖（Diet-induced obesity,DIO）和能量消耗的作用机制,本研究开展了以下三个方面的工作:1)明确了MC在饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗发生中的作用。在WD、HFD和胆固醇补充的高脂饮食（High-fat Diet+cholesterol,HFD+Cho）喂养的小鼠中,我们分别探究了MC稳定剂色甘酸钠（disodium cromoglycate,DSCG）和酮替芬腹腔注射对DIO和胰岛素敏感性的影响。在WD和HFD+Cho等高胆固醇饮食喂养的小鼠中,DSCG和酮替芬显着改善了小鼠的肥胖和胰岛素抵抗;在HFD喂养的小鼠中,酮替芬改善肥胖和胰岛素抵抗的效果相对于高胆固醇饮食喂养的小鼠明显减弱,而DSCG则完全没有作用。DSCG和酮替芬处理,阻止了高胆固醇饮食诱导的血液组胺升高和脂肪组织MC脱颗粒,且血浆中组胺浓度与总胆固醇或低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）呈显着正相关。LDL等处理显着激活MC,DSCG和酮替芬抑制了LDL所诱导的MC活化,而LDL受体缺失则抵消了DSCG或酮替芬对LDL所诱导MC活化的作用。这些结果表明,MC在高胆固醇饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗中发挥关键作用,而食品源胆固醇导致了相关的MC活化。2)揭示了MC调控机体脂肪组织棕色化和能量消耗的作用机制。既然MC在DIO的发生中起着固有的关键作用,我们有必要去揭示其对脂肪细胞棕色化和相关能量消耗的影响。因此,本论文进一步研究了MC功能失活后的能量消耗和脂肪组织棕色化水平的改变。MC的缺失和药物稳定显着增强了去甲肾上腺素诱导的能量代谢,提升了皮下脂肪组织（Subcutaneous adipose tissue,SAT）的棕色化。在MC缺失的Kitw-sh/w-sh小鼠SAT中回复MC则可逆转这些变化。机制研究表明,MC失活促进SAT中血小板生长因子受体（Platelet-derived growth factor receptor,PDGFR）α阳性脂肪细胞祖细胞的增殖和棕色分化。进一步,我们确定了MC是脂肪组织中5-羟色胺的主要来源,而MC分泌的5-羟色胺抑制了SAT的棕色化和系统能量消耗。总之,MC通过释放5-羟色胺,抑制了小鼠SAT的棕色化和系统的能量消耗。3)阐明了食品源MC稳定剂白杨素干预小鼠DIO和能量消耗作用机制。白杨素是一种食品源的MC强稳定剂。我们研究发现白杨素作为饮食补充剂,可改善HFD诱导的小鼠体重获得和脂肪组织重量增加,降低机体胰岛素抵抗。白杨素增加了系统能量消耗,提升了SAT棕色化及浅棕色前脂肪细胞数量和血管生成,升高了SAT中PDGFRα的表达、PDGFRα+脂肪细胞祖细胞的数量和棕色化水平。进一步,我们发现白杨素诱导了SAT的SVF细胞的棕色分化,而PDGFRα特异性抑制剂伊马替尼逆转了这一作用。最后,我们发现,饮食白杨素降低了小鼠SAT中抑制PDGFRα活化或脂肪细胞棕色化的micro RNA表达水平。综上,饮食白杨素通过调控PDGFRα活化及相关micro RNA表达,促进小鼠的SAT的棕色化和系统能量消耗,进而改善DIO和胰岛素抵抗。综上所述,本论文明确了MC在饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗发生中的关键作用;揭示了MC通过释放5-羟色胺抑制SAT棕色化和系统能量消耗的机制;阐明了食品源MC稳定剂白杨素可通过调控PDGFRα活化及相关micro RNA表达,启动小鼠的SAT的棕色化和系统能量消耗,进而改善DIO和胰岛素抵抗。
黄万杰[9]（2021）在《西地那非激活PPARγ下调TRPC治疗新生鼠肺动脉高压的作用和机制研究》文中认为目的:新生儿持续性肺动脉高压（Persistent Pulmonary Hypertension of Newborn,PPHN）是新生儿期最常见的一种严重肺血管疾病,病死率高,临床预后差。目前有关PPHN的治疗是以一氧化氮吸入（i NO）,高频通气以及肺血管扩张剂等综合治疗为主,近年来,西地那非逐渐应用于PPHN治疗并取得一定的效果,但详尽的作用机制尚需进一步研究。本研究旨在建立新生鼠肺动脉高压动物模型和细胞模型的基础上,应用HE染色、免疫荧光、Western blot、PCR、细胞转染等实验手段,探索西地那非除经典作用途径外的可能作用机制。研究方法:第一部分:用10%低氧处理生后48小时新生大鼠建立PPHN模型,利用灌胃给药的方法给予西地那非（25mg/kg.d,日1次）进行干预,14天后检测新生大鼠右室压力（间接反映肺动脉压力）,计算右室肥厚指数（RV/LV+S）,应用HE染色观察肺组织远端肺小动脉重塑情况,利用a-SMA和Ki67免疫荧光染色观察肺组织远端肺小动脉平滑肌细胞的增殖情况。分别应用PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6和a-SMA的免疫荧光双染观察PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6在肺组织的表达情况;应用Western-blot和Real-time PCR检测以上指标在肺组织中的表达。第二部分:1、以HPASMCs为研究对象,建立肺动脉高压体外细胞模型,从细胞水平研究西地那非对PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6等指标的影响,深入研究其分子调控机制。同时利用Ki67和casepase3检测HPASMCs的增殖和凋亡情况;2、同时应用西地那非和PPARγ的药物学抑制剂GW9662干预HPASMCs,检测PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6、Ki67、casepase3的基因和蛋白表达;第三部分:采用小RNA干扰技术沉默PPARγ基因并转染HPASMCs,应用西地那非干预细胞,检测PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6、Ki67、casepase3的基因和蛋白表达。结果:第一部分:1、PPHN组的右心室平均压力明显升高,应用西地那非后右室压力减低,介于PPHN组和对照组之间。2、PPHN组右室肥厚指数（RVHI,RV/LV+S）显着增高,应用西地那非后RVHI明显下降,介于PPHN组和对照组之间。3、HE染色显示PPHN组远端肺小动脉管壁明显增厚,管腔狭窄,应用西地那非后远端肺小动脉管壁增厚及管腔狭窄改善,介于PPHN组和对照组之间。4、a-SMA和Ki67免疫荧光双染显示PPHN组远端肺小动脉平滑肌细胞数量明显增多,14天后细胞仍处于增殖情况;应用西地那非后远端PASMCs数量减少,细胞增殖情况受到抑制。5、PPARγ和a-SMA免疫荧光双染、Western-blot和Real-time PCR显示PPHN组远端肺小动脉平滑肌细胞和肺组织中PPARγ的表达显着下降,应用西地那非后PPARγ的表达出现上调,介于PPHN组和对照组之间。6、TRPC1、TRPC6和a-SMA免疫荧光双染、Western-blot和Real-time PCR显示PPHN组远端肺小动脉平滑肌细胞和肺组织中TRPC1、TRPC6的表达显着升高,应用西地那非后TRPC1、TRPC6的表达出现下降,介于PPHN组和对照组之间。第二部分:1、建立肺动脉高压细胞模型,检测西地那非的最佳药物浓度,发现最佳药物浓度为10m M;利用10m M西地那非处理细胞,Western-blot和Real-time PCR的结果显示PPHN模型组PKG和PPARγ的表达下降,TRPC1和TRPC6的表达上升,西地那非组PKG和PPARγ的表达上调,TRPC1和TRPC6的表达下调,介于PPHN组和对照组之间。2、Western-blot和Real-time PCR的结果显示PPHN模型组Ki67的表达上升,casepese3的表达下降,西地那非组Ki67表达下调,casepase3的表达上调,介于PPHN组和对照组之间。3、引入PPARγ的药物学抑制剂GW9662,检测其最佳药物浓度;同时应用西地那非和GW9662干预细胞,发现应用GW9662后PPARγ的表达下降,同时上调了TRPC1和TRPC6的表达。第三部分:1、小干扰RNA沉默PPARγ基因并转染HPASMCs细胞,PPARγ的蛋白和基因表达均明显下降;2、构建HPASMCs的PPARγ敲减细胞模型后,我们应用低氧条件和西地那非处理细胞。si R-PP组较对照组PPARγ表达下降（P<0.05）,同时加用西地那非的西地那非+Sir-PP组较si R-PP组也并未能将PPARγ的表达上调;此外,si R-PP组TRPC1和TRPC6的表达出现明显升高,西地那非+si R-PP组较si R-PP组未能下调TRPC1和TRPC6的表达。结论:1、口服西地那非可以显着下降低氧所致新生鼠肺动脉高压,并显着改善右心室肥厚,上调PKG、PPARγ表达的同时,下调TRPC1和TRPC6的表达,抑制了远端肺小动脉平滑肌细胞的增殖。2、通过多维度细胞实验（药理学抑制剂和小干扰RNA）表明,西地那非除了经典的NO/c GMP/PKG途径,还能通过PPARγ/TRPC途径,抑制HPASMCs的增殖,为临床PPHN的防治提供实验基础与新的思路。
江涛[10]（2020）在《ALOX12B在宫颈癌肿瘤进展中的作用和机制研究》文中认为目的:宫颈癌是一种恶性疾病,对全世界妇女的健康是一个巨大的威胁。手术切除及同步放化疗是治疗宫颈癌的主要策略。部分晚期肿瘤患者无法从传统治疗中获益,导致临床疗效欠佳。ALOX12B是一个编码脂氧合酶的基因,在肺癌和乳腺癌中检测到ALOX12B突变。此外,ALOX12B对表皮样癌细胞的增殖具有促进作用。然而,其在宫颈癌中的作用目前未见报道,因此有必要研究ALOX12B在宫颈癌中的作用及相关机制。方法:为研究ALOX12B在宫颈癌进展中的功能,通过慢病毒载体降低宫颈癌细胞系Ca-Ski和C33A中ALOX12B的表达,并通过q-PCR检测病毒对ALOX12B的敲低效率。设计CCK-8和克隆形成实验验证ALOX12B敲低后对宫颈癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。PI实验检测ALOX12B敲低后对宫颈癌细胞周期的影响。Transwell和划痕愈合实验检测ALOX12B对肿瘤细胞的迁移和侵袭的影响。此外,设计异种移植瘤模型验证ALOX12B在体内对宫颈癌进展的影响。为进一步阐明ALOX12B在宫颈癌发展中的作用机制,通过文献调研以及数据库分析预测ALOX12B的靶点。Western blot检测ALOX12B能否促进PTGS2的表达。此外,挽救实验检测PTGS2是否能够调控ALOX12B对宫颈癌细胞增殖的促进作用。结果:CCK-8和克隆形成实验发现ALOX12B敲低后宫颈癌细胞增殖和克隆形成能力均受到显着抑制。PI检测显示ALOX12B敲低后宫颈癌细胞周期阻滞于G1期。在异种移植瘤模型中的结果显示ALOX12B敲低能够显着抑制宫颈癌肿瘤的生长。此外,体外Transwell和划痕愈合实验表明ALOX12B对肿瘤细胞的迁移和侵袭无明显影响,而在体内实验中,Western blot分析显示ALOX12B能够调控肿瘤EMT相关蛋白（Vimentin,N-cadherin和E-cadherin）的表达。我们推测,与体外实验不同,宫颈癌肿瘤组织中ALOX12B的功能可能与宫颈癌肿瘤组织的低氧环境相关。通过文献调研以及数据库分析预测PTGS2可能是ALOX12B的主要靶点之一。Western blot检测显示ALOX12B能够显着促进PTGS2的表达。此外,挽救实验表明PTGS2能够调控ALOX12B对宫颈癌细胞增殖的促进作用。结论:综上所述,我们的研究报道了ALOX12B在宫颈癌肿瘤进展中的作用,且ALOX12B可能通过PTGS2调控宫颈癌进展。本研究为探索宫颈癌患者新的治疗方法提供理论指导。
二、The role of prostaglandins in regulating vascular smooth muscle cell sur-vival par（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、The role of prostaglandins in regulating vascular smooth muscle cell sur-vival par（论文提纲范文）
（1）冠心病血瘀证患者血清氧化脂质代谢谱及炎症相关因子研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 花生四烯酸COX代谢途径与冠心病的研究进展 |
| 综述二 嗜酸性粒细胞相关因子及LTB4参与血瘀证的研究进展 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 冠心病患者炎症相关因子表达水平的研究 |
| 材料与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 主要耗材与仪器 |
| 3. 方法 |
| 结果 |
| 1. 健康组与CHD组基本资料对比 |
| 2. 健康组与CHD组的EOS数量对比 |
| 3. 健康组与CHD组CCL11、ECP、TM、LTB4的表达水平 |
| 4. 健康组与CHD组CCL11 mRNA的表达水平 |
| 5. CHD患者CCL11、ECP、TM、LTB4的二元Logistic回归分析 |
| 6. CHD患者CCL11 mRNA的二元Logistic回归分析 |
| 7. CHD患者CCL11、ECP、TM、LTB4的ROC曲线分析 |
| 讨论 |
| 实验二冠心病血瘀证患者炎症相关因子表达水平的研究 |
| 资料与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 主要仪器及耗材 |
| 3. 方法 |
| 结果 |
| 1. CHD血瘀证与非血瘀证组基本资料对比 |
| 2. CHD血瘀证组与非血瘀证组的EOS数量对比 |
| 3. CHD血瘀证患者CCL11、ECP、TM、LTB4的表达水平 |
| 4. CHD血瘀证与非血瘀证组CCL11 mRNA的表达水平 |
| 5. CHD血瘀证患者CCL11、ECP、TM、LTB4二元Logistic回归分析 |
| 6. CHD血瘀证患者TM、LTB4的ROC曲线分析 |
| 讨论 |
| 实验三 冠心病血瘀证患者血清氧化脂质代谢谱研究 |
| 材料与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 主要仪器与材料 |
| 3. 方法 |
| 结果 |
| 1. 样本质控分析 |
| 2. 差异代谢物的筛选 |
| 3. 代谢差异物KEGG富集分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 研究不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）前列腺素类物质参与了肾内动脉平滑肌细胞内向整流K+通道的调节（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 影响BaCl_2收缩大鼠肾内动脉的因素 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同类型的K~+通道阻滞剂对肾内动脉的收缩作用 |
| 2.2 内皮、NOS 和 COX 抑制剂对BaCl_2诱导RIRAs 收缩的影响 |
| 2.3 各种血管收缩剂对BaCl_2诱导的RIRAs 收缩的影响 |
| 2.4 TPR 拮抗剂对 BaCl_2诱导 RIRAs 收缩的影响 |
| 第二部分 Kir通道在大鼠肾内动脉平滑肌细胞中的表达及功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 BaCl_2 对 RIASMCs 钙浓度的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Kir通道在调节血管张力中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）西地那非通过Notch3/Hes1通路抑制新生大鼠持续性肺动脉高压的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 西地那非对PPHN大鼠肺血管重构及低氧诱导的PASMC细胞功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 西地那非通过Notch3/Hes 1通路抑制低氧诱导的PASMC |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述一 西地那非治疗新生儿持续肺动脉高压研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 Notch3信号通路与肺动脉高压血管重构的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附英文论文一 |
| 附英文论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 病理性低剪切力介导的内皮细胞Dickkopf1的调控在内皮-平滑肌细胞中的作用及对血管新生内膜形成的影响 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅰ |
| 符号说明Ⅰ |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 病理牵张力通过DKK1-ACE2对平滑肌细胞增殖、迁移的作用 |
| 中文摘要Ⅱ |
| 英文摘要Ⅱ |
| 符号说明Ⅱ |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（5）七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节血管平滑肌收缩（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节大鼠主动脉血管平滑肌收缩 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 七氟烷和异氟烷通过PI3K/Rho激酶调节糖尿病大鼠主动脉血管平滑肌收缩 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 七氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节大网膜动脉血管平滑肌收缩 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 吸入性麻醉药调控血管平滑肌张力的细胞机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（6）自发性高血压大鼠血压发展过程中血管内皮依赖性收缩的变化及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 花生四烯酸代谢通路 |
| 1.2 环氧化酶代谢通路 |
| 1.3 前列腺素及其受体 |
| 1.4 前列环素与内皮依赖性收缩 |
| 1.5 前列环素与高血压、年龄 |
| 1.6 本课题的目的和研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物购买及饲养 |
| 2.2.2 血管舒缩反应性检测 |
| 2.2.3 高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测不同前列腺素的水平 |
| 2.2.4 酶联免疫法(ELISA)测定环氧化酶代谢产物水平 |
| 2.2.5 蛋白质免疫印迹法检测 |
| 2.2.6 实时定量PCR反应 |
| 2.2.7 尾套法无创血压测量系统检测SHR大鼠血压和心率 |
| 2.2.8 L-798106 口服给药监测幼年SHR血压变化 |
| 2.2.9 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 SHR血压发展过程中髂动脉的EDCs及其变化规律 |
| 3.1.1 乙酰胆碱在髂动脉所引起的血管舒缩反应 |
| 3.1.2 COX抑制剂或NO对乙酰胆碱诱发的血管效应的影响 |
| 3.2 PGI2 的生成及血管舒缩作用 |
| 3.2.1 乙酰胆碱诱导髂动脉PGI_2的生成 |
| 3.2.2 WKY和 SHR髂动脉PGIS的表达 |
| 3.2.3 PGI_2在WKY和 SHR髂动脉所引起的血管舒缩反应 |
| 3.3 TP或EP3 受体对髂动脉的血管舒缩反应的影响 |
| 3.3.1 TP或EP3 受体激动剂诱发髂动脉的血管舒缩反应 |
| 3.3.2 WKY和 SHR髂动脉TP、EP3和IP受体的表达 |
| 3.3.3 TP受体拮抗剂或EP3 受体拮抗剂对乙酰胆碱诱发幼年SHR髂动脉的血管效应的影响 |
| 3.3.4 TP受体拮抗剂或EP3 受体拮抗剂对PGI_2诱发SHR髂动脉的血管效应的影响. |
| 3.3.5 TP受体拮抗剂或EP3 受体拮抗剂对PGI_2诱发幼年SHR肾动脉的血管效应的影响 |
| 3.4 L-798106 处理对U46619 诱发的血管效应的影响 |
| 3.5 其它血管的EDCs效应 |
| 3.5.1 乙酰胆碱在肾动脉所引起的血管舒缩反应 |
| 3.5.2 乙酰胆碱在主动脉所引起的血管舒缩反应 |
| 3.6 L-798106 处理对幼年SHR血压进程的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 SHR血压发展过程中血管EDCs变化 |
| 4.2 PGI_2的生成及血管舒缩功能变化 |
| 4.3 TP、EP3 受体参与血管EDCs作用 |
| 4.4 L-798106 对TP受体的拮抗作用 |
| 4.5 L-798106 处理抑制幼年SHR高血压的发展 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 内皮源性收缩因子调节血管张力的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）乳酸及TDAG8在HPH中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.临床研究 |
| 3.动物实验 |
| 4.统计学分析 |
| 5.实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 乳酸及TDAG8在HPH中的作用 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）基于肥大细胞调控肥胖和能量代谢的机制研究白杨素干预高脂饮食相关代谢性疾病的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肥胖、能量代谢和营养摄入 |
| 1.1.1 肥胖的定义、流行和危害 |
| 1.1.2 能量代谢 |
| 1.1.3 营养摄入 |
| 1.2 能量代谢与脂肪组织棕色化 |
| 1.2.1 脂肪细胞类型和分布 |
| 1.2.2 脂肪细胞的发育起源 |
| 1.2.3 促进脂肪组织棕色化的因素 |
| 1.3 免疫细胞与能量代谢以及肥胖的关系 |
| 1.3.1 免疫细胞与脂肪组织炎性 |
| 1.3.2 免疫细胞与脂肪组织产热 |
| 1.4 MC研究进展 |
| 1.4.1 MC简介 |
| 1.4.2 MC的激活 |
| 1.4.3 MC分泌的介质 |
| 1.4.4 MC参与多种代谢性疾病 |
| 1.5 MC稳定剂及其生物活性 |
| 1.5.1 人工合成的MC稳定剂 |
| 1.5.2 天然MC稳定剂 |
| 1.5.3 食品源MC稳定剂白杨素研究进展 |
| 1.6 研究背景以及拟解决的关键科学问题 |
| 1.6.1 研究背景 |
| 1.6.2 拟解决的关键科学问题 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与实验材料 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 饲料配制 |
| 2.3.2 小鼠饲养和饮食 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 小鼠葡萄糖耐受(GTT)以及胰岛素耐受(ITT)试验 |
| 2.3.5 血浆脂蛋白以及脂肪组织中脂质的检测 |
| 2.3.6 组胺和β-己糖胺酶检测 |
| 2.3.7 组织脱水包埋切片 |
| 2.3.8 甲苯胺蓝染色 |
| 2.3.9 HE染色 |
| 2.3.10 UCP1免疫组化染色 |
| 2.3.11 UCP1与PDGFRα免疫荧光共定位染色 |
| 2.3.12 小鼠能量代谢检测 |
| 2.3.13 小鼠体温的检测 |
| 2.3.14 组织和细胞的总RNA提取及逆转录 |
| 2.3.15 定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.3.16 组织总蛋白提取 |
| 2.3.17 Western blot |
| 2.3.18 脂肪组织中5-羟色胺的提取和检测 |
| 2.3.19 流式细胞仪分析 |
| 2.4 数据处理与分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 MC在饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗发生中的作用 |
| 3.1.1 MC稳定剂DSCG不减少普通高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗 |
| 3.1.2 MC稳定剂DSCG和酮替芬能减少高胆固醇西方饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗 |
| 3.1.3 MC稳定剂DSCG和酮替芬能够减轻高胆固醇高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗 |
| 3.1.4 饮食中摄入的Cho影响MC的激活 |
| 3.1.5 MC稳定剂会抑制LDL诱导的MC脱颗粒 |
| 3.2 MC调控机体脂肪组织棕色化和能量消耗的作用机制 |
| 3.2.1 MC失功能会增强小鼠能量消耗 |
| 3.2.2 Kit~(w-sh/w-sh)小鼠SAT中回复MC会抑制能量消耗降低产热 |
| 3.2.3 MC直接抑制脂肪细胞产热和棕色分化 |
| 3.2.4 MC通过分泌5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)调节SAT棕色化和产热 |
| 3.3 食品源MC稳定剂白杨素干预小鼠DIO和能量消耗作用机制 |
| 3.3.1 白杨素改善HFD诱导的肥胖和胰岛素抵抗 |
| 3.3.2 白杨素减少高脂饮食喂养的小鼠体内脂肪过多 |
| 3.3.3 白杨素增强HFD喂养的小鼠能量消耗激活产热基因的表达 |
| 3.3.4 白杨素通过激活PDGFRα表达促进SAT浅棕色脂肪组织分化 |
| 3.3.5 白杨素激活SAT中PDGFRα的表达 |
| 3.3.6 白杨素影响骨髓来源巨噬细胞极化 |
| 3.3.7 白杨素通过miR调节SAT棕色化 |
| 3.3.8 结论 |
| 第四章 讨论、展望与创新点 |
| 4.1 讨论与展望 |
| 4.1.1 MC在饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗发生中的作用 |
| 4.1.2 MC调控机体脂肪组织棕色化和能量消耗的作用机制 |
| 4.1.3 食品源MC稳定剂白杨素干预小鼠饮食诱导肥胖和能量消耗的作用 |
| 4.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
（9）西地那非激活PPARγ下调TRPC治疗新生鼠肺动脉高压的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:PPHN大鼠模型中PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6的基因及蛋白的动态表达变化 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:西地那非通过PPARγ/TRPC途径对人肺动脉平滑肌细胞的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:西地那非通过PPARγ对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡调控的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 PPARγ在心肺血管系统中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）ALOX12B在宫颈癌肿瘤进展中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 宫颈癌 |
| 1.2 宫颈癌的分子机制 |
| 1.2.1 HPV与宫颈癌 |
| 1.2.2 HPV阴性宫颈癌 |
| 1.3 宫颈癌增殖、侵袭和迁移 |
| 1.3.1 宫颈癌增殖与细胞周期 |
| 1.3.2 宫颈癌迁移、侵袭和EMT |
| 1.4 ALOX12B |
| 1.4.1 ALOX12B的生物学功能 |
| 1.4.2 ALOX12B与肿瘤 |
| 1.5 实验设计和研究意义 |
| 第二章 ALOX12B加速宫颈癌细胞的增殖并促进肿瘤的生长 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验试剂 |
| 2.3.2 实验抗体 |
| 2.4 溶液配制 |
| 2.4.1 细胞培养液的配制 |
| 2.4.2 细胞裂解液 |
| 2.4.3 配制蛋白电泳溶液 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 慢病毒转染 |
| 2.5.3 实时荧光定量PCR(q-PCR) |
| 2.5.4 细胞增殖实验 |
| 2.5.5 克隆形成实验 |
| 2.5.6 划痕愈合实验 |
| 2.5.7 PI染色实验(检测细胞周期) |
| 2.5.8 蛋白免疫印迹染色(Western Blot) |
| 2.5.9 Transwell迁移侵袭实验 |
| 2.5.10 荷瘤小鼠模型 |
| 2.5.11 质粒转染 |
| 2.5.12 统计分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 靶向ALOX12B的shRNA慢病毒载体的构建和验证 |
| 2.6.2 ALOX12B在宫颈癌细胞C33A中有效表达 |
| 2.6.3 ALOX12B基因敲低抑制宫颈癌细胞增殖和克隆形成 |
| 2.6.4 体外ALOX12B对宫颈癌细胞迁移和侵袭不是必需的 |
| 2.6.5 ALOX12B基因敲低抑制宫颈癌细胞周期转换 |
| 2.6.6 ALOX12B基因敲低对抑制异种移植小鼠肿瘤生长 |
| 2.6.7 ALOX12B调控宫颈癌PI3K/ERK1 信号通路 |
| 2.7 讨论 |
| 第三章 ALOX12B调控宫颈癌PTGS2及EMT的机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验试剂 |
| 3.3.2 实验抗体 |
| 3.4 溶液配制 |
| 3.4.1 细胞培养液的配制 |
| 3.4.2 细胞裂解液 |
| 3.4.3 配制蛋白电泳溶液 |
| 3.5 实验方法 |
| 3.5.1 细胞培养 |
| 3.5.2 慢病毒转染 |
| 3.5.3 细胞增殖实验 |
| 3.5.4 蛋白免疫印迹染色(Western Blot) |
| 3.5.5 统计分析 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 ALOX12B调控宫颈癌中PTGS2表达 |
| 3.6.2 ALOX12B通过PTGS2调控宫颈癌发展 |
| 3.6.3 体内抑制ALOX12B抑制宫颈癌EMT相关信号通路 |
| 3.7 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、The role of prostaglandins in regulating vascular smooth muscle cell sur-vival par（论文参考文献）
- [1]冠心病血瘀证患者血清氧化脂质代谢谱及炎症相关因子研究[D]. 柴若宁. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]前列腺素类物质参与了肾内动脉平滑肌细胞内向整流K+通道的调节[D]. 王野. 山西医科大学, 2021(01)
- [3]西地那非通过Notch3/Hes1通路抑制新生大鼠持续性肺动脉高压的机制研究[D]. 康丽丽. 山东大学, 2021(11)
- [4]DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用[D]. 刘晓琳. 山东大学, 2021(10)
- [5]七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节血管平滑肌收缩[D]. 杨绍忠. 山东大学, 2021(11)
- [6]自发性高血压大鼠血压发展过程中血管内皮依赖性收缩的变化及机制研究[D]. 张英展. 汕头大学, 2021
- [7]乳酸及TDAG8在HPH中的作用研究[D]. 吕佳奇. 内蒙古医科大学, 2021(02)
- [8]基于肥大细胞调控肥胖和能量代谢的机制研究白杨素干预高脂饮食相关代谢性疾病的作用[D]. 王新. 合肥工业大学, 2021(02)
- [9]西地那非激活PPARγ下调TRPC治疗新生鼠肺动脉高压的作用和机制研究[D]. 黄万杰. 中国医科大学, 2021(02)
- [10]ALOX12B在宫颈癌肿瘤进展中的作用和机制研究[D]. 江涛. 南昌大学, 2020(08)