一、重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究（论文文献综述）
张丽华[1]（2021）在《重组毕赤酵母中10-HDA的生物合成研究》文中研究说明10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）作为蜂王浆的质量指标,兼具不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸和中链脂肪酸的可聚合、抗菌、降低血糖、提高免疫力等各种优良性能。近年来,人们生活水平不断提升,对个人健康及相关健康产业也更加重视,对具有多种生理活性的10-HDA也越来越关注,但10-HDA生物合成的研究仍相对较少。在研究室前期利用大肠杆菌合成10-HDA的工作基础上,通过分子生物学的途径构建技术,探索在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris GS115）中进行10-HDA的生物合成,实验结果如下:1.探索10-HDA前体物2-癸烯酸的毕赤酵母细胞内合成区位,首先设计定位在细胞质中的合成途径,将乙酰-Co A脱氢酶基因fadA与酯酰-Co A硫酯酶基因ydiI通过连接肽基因融合连接在质粒pGAPZaA上,然后转入P.pastoris GS115中,得到菌株GS115-pGAPZaA-ydiI-fadA。融合基因利用组成型启动子p GAP在P.pastoris基因组上整合表达,并通过底物癸酸生成2-癸烯酸的量来验证两种关键酶脱氢氧化能力。结果显示,发酵24 h,2-癸烯酸的最高生成量为2.6 mg/L,经实验结果分析,ydiI和fadA基因在2-癸烯酸形成的过程中起到重要作用。2.其次设计定位在过氧化酶体中的合成途径,因过氧化酶体中含有脱氢酶,所以硫酯酶基因只要在过氧化酶体定位信号（Pts）的引导下,在过氧化酶体中催化表达,即可共同发挥作用。主要操作是将硫酯酶基因ydiI与定位信号Pts共同连接到P.pastoris常用质粒pPIC9K上,转入P.pastoris GS115中并将重组基因片段整合到其基因组上,使其融合表达,得到重组菌株GS115-pPIC9K-ydiI-Pts。综合探索10-HDA的最佳合成位置的结果显示,硫酯酶在过氧化酶体中表达量较高,2-癸烯酸的最高产量为33.7 mg/L。3.将脂肪酸末端羟基化关键酶细胞色素P450酶基因P450及其NADPH还原酶基因NADPH-P450整合到P.pastoris GS115的常用载体pGAPZaA上,同样以P.pastoris GS115为研究对象,使融合基因利用组成型启动子p GAP在P.pastoris GS115基因组上整合表达,得到的重组工程菌GS115-pGAPZaANADPH-P450通过发酵验证P450及其NADPH还原酶在P.pastoris GS115中的细胞表达活性,通过应用底物癸酸发酵生成10-羟基癸酸的量,证明P450在P.pastoris GS115中的羟基化能力,实验结果显示这两种酶的活性较高,10-羟基癸酸的产量能达到144 mg/L。4.最后,将重组质粒pGAPZaA-NADPH-P450转入工程菌GS115-pPIC9K--ydiI-Pts中,使所有关键酶共表达来生产10-HDA,10-HDA产量为2.4 mg/L,本课题为10-HDA在酵母中的合成及其应用打下基础。
宗文博[2]（2021）在《重组人长效血小板衍生因子的发酵工艺、凝胶剂制备和药效学研究》文中研究说明背景与目的:创伤愈合是机体受到外部因素损伤后发生的愈合过程,涉及各种组织再生、肉芽组织增生和瘢痕形成,是一个复杂而有序的生物学过程。传统的治疗方法包括抗感染、增强机体营养和保护局部创面,对于较小的创伤治疗效果尚好,但对于比较严重的创伤,传统的治疗方法不仅增加治疗费用和周期,而且也不利于病人机体恢复。因此,根据机体创伤愈合的生物学规律,寻找促进创伤愈合的关键活性分子,并实现大规模生产具有重要的临床意义和社会价值。血小板衍生因子（platelet-derived growth factor,PDGF）是由损伤部位的血小板分泌的一种细胞因子,在促进神经再生、血管形成和创伤修复中发挥重要作用。PDGF作为创伤愈合的组织修复因子,可以用于多种创伤创面的治疗,具有广泛的临床应用价值。但是,目前已上市的PDGF类药物因缺乏长效保护功能,体内稳定性较差,半衰期短,容易被蛋白酶降解,导致病人使用后疗效欠佳。因此,研发具有长效功能的PDGF蛋白药物具有重要意义。本研究将PDGF的B链（PDGF-B）与人免疫球蛋白（Ig G）的Fc段融合,使其在毕赤酵母中重组表达,建立中试发酵和纯化工艺,制备外用凝胶剂型,能够提高药物体内半衰期并减少药物用量,缩短伤口愈合时间,为实现大规模生产和产业化开发奠定基础。研究方法:1.构建pPICZɑ-PDGF-B-Fc表达载体,鉴定重组毕赤酵母菌株;2.优化PDGF-BB-Fc重组蛋白的甲醇诱导发酵工艺,包括p H、DO值、罐压、温度和通气量等因素;3.通过切向流过滤技术进行微滤和超滤处理,然后采用Protein A亲和层析纯化目的蛋白,建立蛋白纯化工艺体系;4.采用CCK8检测纯化后的重组PDGF-BB-Fc对NIH3T3细胞的体外促增殖作用;5.制备重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂;6.以皮肤创伤大鼠为动物模型,检测重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂对伤口愈合的促进作用。结果:1.DNA水平和蛋白水平检测显示,目的基因成功整合到酵母基因组上并能够成功表达PDGF-BB-Fc重组蛋白;2.探索最佳发酵条件,最终确定诱导目的蛋白表达最佳条件为温度30℃、培养基初始p H6.0、诱导时间36 h,目的蛋白表达量为50.2 mg/L;3.优化纯化工艺体系,采用Protein A亲和层析纯化目的蛋白,使用柠檬酸洗脱液洗脱,获得纯度超过90%的PDGF-BB-Fc重组蛋白;4.重组PDGF-BB-Fc蛋白对NIH3T3细胞的体外增殖有明显的促进作用,与商品化PDGF-BB相比,作用效果没有统计学上的差异;5.以卡波姆为基质成分,肝素钠和人血白蛋白为保护剂,成功制备理化性质稳定的重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂;6.重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂在伤口愈合进程中能够控制创面感染,加快伤口愈合,PDGF-BB-Fc的浓度和伤口愈合效果正相关。结论:1.构建表达PDGF-BB-Fc的酵母工程菌;2.建立重组PDGF-BB-Fc中试发酵工艺体系;3.成功制备性状稳定且具有较好生物学活性的重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂。
吴元庆[3]（2020）在《代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究》文中认为虾青素和β-胡萝卜素是两种重要的类胡萝卜素,均具有多种生物活性,被广泛用于水产业、畜牧业、医药保健业等。化学合成产品安全性不符合人体要求,直接从生物体提取产率低、成本高。随着生物技术的发展,构建高产微生物细胞工厂受到重视,多种微生物已能异源合成虾青素和β-胡萝卜素,其中大肠杆菌应用最多。本研究即是遗传改造工程大肠杆菌,使其高产这两种类胡萝卜素。首先,筛选不同来源的β-胡萝卜素羟化酶（Crt Z）基因和β-胡萝卜素酮化酶（Crt W）基因,优化设计了九个虾青素人工操纵子,转化入高产β-胡萝卜素的大肠杆菌ZF237T,获得九株重组ZF237T菌株,虾青素的产量从0.49 mg/L到8.07 mg/L。随后,基于产虾青素的操纵子,设计构建了Crt Z和Crt W的融合蛋白质,结果表明Crt Z在融合蛋白质的N-端时更有利于虾青素的生产,将不同的肽linker引入融合蛋白质,这一现象更明显,虾青素的产量也被提高,其中最优菌株ZF237T/Crt ZAs-（GS）1-WBs虾青素产量与菌株ZF237T/Crt ZAs-WBs和ZF237T/crt ZBsWPs相比分别提高了127.6%和40.2%,碳源优化后,该菌株虾青素产量达到26.16 mg/L。其次,在菌株ZF43Δgdh A中敲除zwf,所得菌株ECW1的生物量降低26.2%,β-胡萝卜素产量和胞内含量分别提高5.1%和32.5%。在菌株ECW1中敲除基因簇pts HIcrr,所得菌株ECW2的β-胡萝卜素产量提高61.8%,为197.44 mg/L,但β-胡萝卜素胞内含量降低。胞内辅因子含量测定表明,菌株ECW2胞内NADPH限制了其β-胡萝卜素胞内含量,随即,围绕NADPH的供给,多种组合被实施以提高菌株的β-胡萝卜素胞内含量,获得最优菌株ECW4/p5C-nad K,高细胞密度发酵,β-胡萝卜素最高产量2,579.1 mg/L。对菌株ECW1和ECW2进行了比较转录组学分析。zwf的敲除下调了菌株ECW1的嘌呤从头合成和核糖体大亚基合成途径,上调了菌株的TCA循环和回补途径而下调了糖酵解和磷酸戊糖途径大部分基因的表达,这些因素造成菌株ECW1生物量的下降;另一方面,zwf的敲除上调了ppc、pck、NADPH和异源途径相关基因的表达,这对提高菌株胞内β-胡萝卜素含量有利。zwf和pts HIcrr的双敲除下调了菌株ECW2中心碳代谢、能量代谢、辅因子代谢,使菌株的代谢网络达到一个新的平衡,协调了菌株碳流,有利于菌株的生物量和β-胡萝卜素的生产,而NADPH、MEP途径及异源途径相关基因的表达被显着下调是菌株ECW2的β-胡萝卜素产量下降的主要因素。最后,验证zwf的敲除提高了菌株ECW1的葡萄糖运输蛋白质基因pts G和gal P的相对转录水平后,通过启动子替换在菌株ECW1中过表达这两个基因,调整发酵方式,均提高了β-胡萝卜素产量和胞内含量。随后,将过表达引入菌株ZF43Δgdh A中,过表达pts G时,菌株β-胡萝卜素产量和胞内含量均提高。最后,利用过表达pts G和gal P的菌株生产芳樟醇,过表达pts G时菌株产量最高。证明大肠杆菌中过表达pts G有助于提高萜类化合物的生产。本文采用代谢工程策略,显着提高了工程大肠杆菌类胡萝卜素的产量,探寻了一般规律及菌株对改造的遗传响应,发现了新的可提高大肠杆菌萜类化合物产量的遗传改造位点。研究结果对其他天然产物的异源合成具有一定的指导意义,所得高产菌株具有一定的工业应用潜力。
孙小雯[4]（2020）在《基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化》文中研究指明维生素K2是一类侧链长度不同的异戊烯基化甲萘醌产品的总称,属于衍生脂质。其中四烯甲萘醌（MK-4）在促进凝血和防治骨质疏松症方面具有良好的效果,在临床上具有较高的应用价值。大肠杆菌和毕赤酵母作为两种成熟高效的蛋白表达系统,已被成功地应用于多种异源蛋白的表达。本课题组已经在大肠杆菌中成功实现了 MK-1从无到有的生物合成,而侧链长度更长的MK-4的生物制造将是我们下一步要实现的目标。毕赤酵母表达系统具有繁殖迅速、易于高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后加工修饰,易获得可溶性活性重组蛋白等优点,尽管在毕赤酵母中尚未发现甲萘醌的生物合成途径,但这也可以在一定程度上避免复杂的分支途径和反馈调节机制对重构路径造成的不利影响。因此,为实现MK-4的高效生物制备,本研究运用合成生物学理念,基于多维度的信息整合,将高效的酶和生物合成途径整合到大肠杆菌和毕赤酵母底盘细胞中,构建以廉价的VK1或VK3为原料的MK-4高效生物制备的细胞工厂,并通过分析其优缺点以确定最佳的表达系统。研究工作有效拓展了 VK2生物合成的底盘细胞种类,为VK2等异戊烯基化产品的生物合成途径构建与优化提供了新的思路,具有重要的理论和应用价值。论文首先从物质和能量代谢角度出发在E.coli中重构MK-4代谢途径,通过MBP促溶标签实现古细菌来源的SaGGPPS催化的由IPP直接到GGPP的生物合成,在此基础上通过敲除pgi基因,调控EMP、PPP和EDP三条葡萄糖分解代谢途径的分配,强化胞内还原力NADPH的合成,使重组菌株胞内的MK-4含量达到0.78 mg/L。由于其合成能力未达预期,同时考虑到菌株稳定性和生物安全性等问题,将在毕赤酵母中开展后续的研究工作。通过对KEGG等数据库信息的整合,利用生物合成途径设计软件BioSynther,以VK3和IPP作为底物对MK-4的生物合成途径进行理性设计,并确定催化萘醌骨架与异戊烯基侧链聚合反应的关键酶HsUBIAD1。为了制定更好的蛋白表达策略,对该蛋白的理化性质、结构以及催化活性中心等进行了相关的生物信息学分析。利用生物信息学分析的结果,构建产HsUBIAD1蛋白的重组毕赤酵母,并结合多重筛选机制,获得高产重组毕赤酵母菌株GGU-23。然后在250 mL的摇瓶水平上,对筛选出的高产菌株GGU-23的基本发酵过程参数进行优化,并确定了24℃,初始pH 7.0,培养36h的摇瓶发酵工艺,优化后的GGU-23菌株的生物量达到31.0 g/L,较优化前提高了 6.9%,蛋白表达量提高了 4.8倍。为了表征HsUBIAD1的酶学性质,利用Ni-NTA亲和层析柱和重力型去盐柱从重组GGU-23菌株中获得纯化的HsUBIAD1蛋白,并进行初步的动力学分析,确定了体外的最佳酶促反应体系和条件:初始pH 7.0,31℃,当Mg2+参与的条件下,HsUBIAD1蛋白催化底物VK3异戊烯基化反应的活性最高,较优化前提高了 2.1倍,原因是Mg2+通过与蛋白的活性中心的关键氨基酸发生相互作用,改变其内部构象,使异戊烯基侧链与活性中心氨基酸残基的结合能力增强,进而促进酶促反应的进行。在GGU-23菌株全细胞催化的研究中,发现其具有催化外源VK1和VK3异戊烯基化反应合成MK-4的能力,当以VK3作为全细胞催化体系的底物时,胞内MK-4的含量达到2.03 mg/L,实现了初代重组毕赤酵母菌株从无到有合成MK-4的突破。为了获得新一代的细胞工厂,需要对初代细胞工厂的细胞性能进行优化,提高其MK-4的合成能力。通过构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体,将外源侧链合成途径的关键酶SaGGPPS整合到产MK-4的初代毕赤酵母细胞中,强化侧链合成前体GGPP的供给,使全细胞催化体系中MK-4的含量提高了 62.1%;再通过融合表达策略,将SaGGPPS与其上游的PpIDI蛋白进行融合表达,侧链合成途径得到了进一步的优化,MK-4的含量达到5.86 mg/L,较之前又提高了78.1%。实现了毕赤酵母菌株（GGU-GrIG）目标产物合成性能从低到高的优化。为了进一步挖掘优化后的毕赤酵母细胞工厂的应用潜力,继续对工程菌GGU-GrIG合成MK-4的全细胞催化工艺进行优化,摸索出最合适的工艺参数,即在30℃,250 rpm的条件下,从催化反应开始起每间隔6 h,向催化体系中添加40 mg/L VK3溶液,连续培养18 h最有利于MK-4的生物合成。工程菌经过优化,MK-4产量达到7.55 mg/L,较优化前提高了 28.8%,表现出良好的稳定性和应用潜力。
李鑫[5]（2020）在《重组人EGF、bFGF的高效可溶性表达研究及活性检测》文中提出表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF）都属于细胞生长因子家族中的成员,有广泛的生物学效应。本研究针对人源EGF和bFGF基因序列设计了多个突变体,如:将EGF序列中第4位丝氨酸替换为苏氨酸;在EGF序列中添加亮氨酸和苏氨酸;将bFGF序列中第25位丝氨酸替换为半胱氨酸等。将合成的EGF和bFGF基因序列连接至融合了PLB1结构域或DsbA伴侣标签的pET-28a和pET-42a表达载体中构建重组质粒,将测序结果比对正确的重组质粒转化入E.coli BL21（DE3）感受态细胞中进行表达。实验过程中,在摇瓶小试阶段首先筛选出优势单克隆菌株,并进行建库保存,发酵罐放大培养时考察不同的培养基和培养条件对工程菌发酵密度值的影响,优化EGF和bFGF融合蛋白的表达条件,其次对比不同的破壁缓冲液和洗脱缓冲液对菌体蛋白在层析柱中的分离特性和样品组间分离度的影响,交替使用镍离子亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白。最后采用MTT比色法检测EGF和bFGF蛋白原液的生物学活性,检测结果表明两种蛋白原液均能促进NIH-3T3细胞增殖,且EGF供试品效价为3.829×105IU/mg;bFGF供试品效价为3.518×105IU/mg。本研究在上游设计阶段构建了多种EGF和bFGF突变序列,提高了目的蛋白表达量和可溶性表达占比,在下游制备阶段优化了基因工程菌的发酵培养条件,在分离纯化阶段秉承步骤越少,收率越高的原则,将层析操作降至两步以下,并使目的产物纯度达到90%以上,满足后续特异性鉴定和活性检测等实验的要求,验证阶段,通过Western Blot实验检验蛋白原液结构正确,并根据药典的准则建立了一种科学、严谨、成本低的生物学活性检测方法,应用该方法检测EGF和bFGF两种蛋白原液生物学活性,为EGF和bFGF的产业化生产奠定了基础。
马牧青[6]（2020）在《多聚氨基酸融合对毕赤酵母的甘露聚糖酶ManA表达量及菌体耐盐性的影响》文中研究说明毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速且应用广泛的一种真核表达系统,已有多种外源蛋白在该系统中获得了成功表达。为了进一步提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量,且探究毕赤酵母在高盐环境中应用的可行性,本研究开展了如下工作:（1）为了进一步提高甘露聚糖酶Man A在毕赤酵母中分泌表达的酶活,本研究在Man A的C端融合多种不同的多聚氨基酸,然后分别在毕赤酵母中进行表达,摇瓶发酵的结果显示融合多聚氨基酸中氨基酸的个数和氨基酸的种类均对Man A分泌表达的酶活有不同程度的影响。其中,随着融合多聚精氨酸中氨基酸个数的增加,Man A分泌表达的酶活呈现出先增加后下降的趋势,当Man A的C端融合了6个Arg时,重组菌X33/Man A-R6的上清酶活达到最大值493 U/m L,相较于对照菌株X33/Man A（371 U/m L）提高了33%。此外,在Man A的C端分别融合7种不同种类多聚氨基酸,与对照菌相比,除X33/Man A-E6上清酶活略有下降外,其它各重组菌上清酶活均有不同程度的提高,其中X33/Man A-R6的上清酶活最高（493U/m L）,其次为X33/Man A-K6（431 U/m L）和X33/Man A-D6（435 U/m L）。同时对各重组菌发酵至120 h时胞内酶活也进行了分析,发现与对照菌相比,各重组菌的胞内酶活力均有不同程度的下降。上述结果表明在Man A的C端融合多聚精氨酸、多聚赖氨酸或多聚天冬氨酸时,可减少Man A在胞内的滞留,明显提高Man A分泌表达的酶活力。（2）为提高毕赤酵母在高盐环境中应用的可行性,本研究利用酵母表面展示技术,选择毕赤酵母细胞壁蛋白Gcw51p作为锚定蛋白,将含1-5个Arg的多聚氨基酸分别展示表达在毕赤酵母细胞表面,并将各重组菌分别在含5%、10%和15%Na Cl的培养基中进行摇瓶培养,监测各重组菌的生长情况,结果显示在三种含不同浓度Na Cl的培养基中,展示表达2个Arg的重组菌X33/Gcw51-R2生长情况最好,发酵至120 h时,在含5%、10%和15%Na Cl的培养基中,X33/Gcw51-R2的菌体浓度分别是对照菌X33/Gcw51的1.2倍、1.5倍和1.2倍。上述结果表明在毕赤酵母细胞表面展示表达含2个Arg的多聚氨基酸可提高毕赤酵母的耐盐性,为毕赤酵母在高盐环境中的应用提供一定的依据。
赵鹏[7]（2019）在《肺炎克雷伯氏菌碳代谢流定向调控生产3-羟基丙酸》文中认为3-羟基丙酸（3-Hydroxypropionic acid,3-HP）是一种重要的 C3平台化合物,同时存在的羟基和羧基赋予3-HP活泼的化学性质,使其可轻易地被转化为多种重要化学品或应用于生物可降解新材料的开发。化学法生产3-HP多需要化石原料经酸、碱催化或共热反应制得,成本高且对环境危害大,应用前景受限。利用微生物发酵合成3-HP的过程对环境友好且条件温和,为工业生产提供了另一条可持续发展的路线。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）生长迅速,其3-HP合成途径极短且与维持生长的核心碳代谢密切相关,是非常有潜力的生产3-HP的宿主。目前,提高代谢物产量的方法有很多,而尽可能地将代谢流引入期望的代谢途径是最为重要的目标之一。本研究运用多种策略对K.pneumoniae的碳代谢流进行调控,以平衡细胞生长与3-HP合成之间的资源分配,大幅提升宿主菌的3-HP生产能力。此外,对K.pneumoniae基因组的改造也可以拓展该菌在工业生产中的应用。主要研究内容包括:1、以K.pneumoniae中3-HP生产途径的关键酶醛脱氢酶的编码基因puuC为对象,针对组成型表达体系中醛脱氢酶表达强度弱的问题,设计构建一种以环腺苷酸受体蛋白（CRP）为基础的人工转录因子,通过转录激活域招募RNA聚合酶（RNAP）定向强化puuC基因的转录水平。在质粒中将可以特异性识别DNA序列的蛋白LacI与CRP做融合表达,同时将固定的操纵序列lacO插入到目的基因puuC表达载体的启动子上游区域,由表达出的融合蛋白引导CRP定位到启动子附近,完成对RNAP的招募及转录强化。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及酶活测定结果显示,在人工转录因子的作用下,重组菌醛脱氢酶的蛋白条带比对照组有明显加深,酶活为23.29 U/mg,比不含转录因子的对照组提高45%。qRT-PCR分析显示puuC的转录水平为野生型菌株的558倍。重组菌摇瓶水平3-HP产量达到2.64 g/L,5L发酵罐中则为35.1 g/L,具有较大生产潜力。2、针对K.pneumoniae生产3-HP过程中代谢资源分配不平衡的问题,利用CRISPRi和色氨酸操纵子系统设计代谢开关元件,分段调控与细胞生长密切相关的甘油激酶（glpK基因编码）及与3-HP合成相关的醛脱氢酶（puuC基因编码）的表达水平。通过在发酵过程中诱导代谢开关表达,实现代谢流在细胞生长和代谢物生产之间重新分配。构建了用于基因编辑的自杀载体pfCB101,验证了载体中各元件的功能并成功将CRISPRi系统中的dCas9表达盒整合进入K.pneumoniae基因组,得到平台工程菌Kp-dCas9。之后,将5段功能元件进行拼接得到重组载体p15A-tac-s1-tac-C-tac-tTP-sg2-trp-K（简称p-switch）并用于调控K.pneumoniae生长与生产代谢,结果表明生长代谢弱化后生物量下降约19%,摇瓶水平3-HP产量为2.66 g/L。重组菌上罐发酵显示3-HP最高产量为47.86 g/L,对生长途径的抑制会影响3-HP的积累。3、针对高效的T7表达体系在非模式生物中应用受限的问题,在K.pneumoenia中建立了 T7正交表达系统,利用新的独立的体系表达代谢途径中的醛脱氢酶,将细胞生长与产物合成在同一细胞的同时段区分开来,实现资源再分配。首先在K.pneumoniae中表达了 T7 RNAP,利用荧光蛋白考察T7表达系统在非模式生物中的可行性。结果证明T7表达系统可以很好地与K.pneumoniae中的内源表达系统兼容,但在载体中表达T7 RNAP会占用部分底物资源,影响细胞生长活性,拖慢3-HP的合成进程,重组菌摇瓶水平3-HP产量为1.72 g/L,醛脱氢酶活力为23.26 U/mg。之后通过改造的Red重组系统将T7 RNAP基因敲入K.pneumoniae基因组,构建了平台工程菌K.p-T7。利用平台菌过表达醛脱氢酶生产3-HP的结果显示,重组菌的生长情况有了明显改善,摇瓶水平3-HP最高产量达到2.44 g/L,5 L发酵罐中3-HP产量在48 h后一直维持在60 g/L之上,最高为67.59 g/L。结果证明,在基因组中表达T7系统可以很好地用于代谢产物合成,同时对细胞的生长活力影响较小。4、K.pneumoniae中3-HP的合成途径与维系生长的核心代谢密切相关,为进一步提高3-HP的产量,以RNAP这一代谢网络调控的“源头”为目标,将与K.pneumoenia适配性较好的tac启动子的核心序列进行串联,增加复合启动子对RNAP的招募能力,并以之最大限度地过表达K.pneumoniae内源的puuC基因,同时为促进细胞生长并供给蛋白质合成,优化了培养基中氮源的添加量,大幅提高了3-HP生产过程的时空产率。将串联有不同数量tac核心序列的启动子分别构建到载体上,诱导表达puuC基因。SDS-PAGE结果显示重组菌中的醛脱氢酶均正常表达。酶活测定发现,当tac启动子的串联数量为3个时（K.p（P3tac-puuC））,醛脱氢酶的酶活最高,为50.16 U/mg;qRT-PCR结果表明,此时puuC基因的转录水平为野生型菌株的2069倍。对各重组菌进行发酵发现,K.p（P3tac-puuC）在摇瓶中3-HP产量为3.78 g/L,5 L上罐发酵时3-HP最高产量达到102.61 g/L。此外,Kp（P3tac-puuC）在发酵后期乳酸产量为0,大大减少了工业生产中同分异构体分离的成本。为供给过量表达醛脱氢酶所需要的资源,将发酵培养基中的氮源添加量做了优化,此时,3-HP的产量虽然没有明显提高,但积累更快,在24 h即达到66.32 g/L,时空产率为2.76 g/（L·h）。通过多手段优化,将K.pneumoniae生产3-HP的能力大幅增强,为今后工业化生产提供了基础。
王飞[8]（2019）在《硅结合蛋白Si-tag在解脂耶氏酵母细胞表面的展示研究》文中研究表明二氧化硅（SiO2）作为硅酸盐的主要成分,广泛应用于基础设施建设、房地产等领域。随着中国现代化建设进程加剧,对于二氧化硅的需求越来越大,但由于大量的开采和不合理利用,导致二氧化硅资源短缺并带来了严重的环境污染问题,并且情况不断恶化。针对二氧化硅传统采集方法和使用的局限性,急需一种高效环保的富集二氧化硅的方法。本研究希望通过微生物学方法构建一种表面展示硅结合蛋白Si-tag的酵母工程菌,以期建立一种节能环保且能富集SiO2的方法。主要研究工作如下:（1）研究了Si-tag结合SiO2的生物学功能及结合最适条件。将Si-tag与增强型绿色荧光蛋白EGFP融合,并成功在大肠杆菌BL21（DE）中表达。将纯化的融合蛋白与SiO2颗粒共同孵育后洗涤,于荧光显微镜下观察到SiO2颗粒表面有绿色荧光,验证了Si-tag与SiO2颗粒吸附的功能;同时Si-tag吸附SiO2玻璃片的最适时间为50min,最适温度为30°C,最适pH为8.0。（2）成功将硅结合蛋白Si-tag通过C末端锚定蛋白Ylcwp3展示在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）细胞表面。首先,通过基因工程将Si-tag与Ylcwp3序列融合,并分别克隆到低拷贝载体pINA1296和高拷贝载体pINA1297,通过醋酸锂转化法分别转至Po1g和Po1h中,成功得到重组菌株Po1g/pINA1296F和Po1h/pINA1297F’。FITC免疫荧光染色结果显示,在488nm激发光下对照组均无绿色荧光,工程菌Po1g/pINA1296F#3和Po1h/pINA1297F’#8表面有绿色荧光,并且Po1h/pINA1297F’#8更亮,证明Si-tag已经成功展示在细胞表面,并且高拷贝的Po1h/pINA1297F’#8的表达与展示量更高;（3）SiO2玻璃片吸附实验探索解脂耶氏酵母表面展示Si-tag的生物学功能。结果显示,在同样水流冲刷下,成功展示Si-tag的工程菌吸附在玻璃片上的细胞要多,并且高拷贝的Po1h/pINA1297F’#8吸附数量更多,证明展示在细胞表面的Si-tag具有生物学功能,并且细胞的吸附能力与蛋白展示量成正相关;SEM结果显示,与对照组相比,Po1h/pINA1297F’#8与SiO2颗粒接触面呈现镶嵌和抓捕两种形态,证明展示了Si-tag的工程菌细胞表面结构发生倾向于吸附SiO2颗粒的变化。本研究证明了Si-tag有较强的SiO2吸附能力,提供一种基于表面展示的富集SiO2的方法。
王灿[9]（2017）在《抗肿瘤工程菌Nissle 1917发酵工艺优化及菌粉制剂制备》文中指出近年来,随着肿瘤发病率的逐年升高,对有效治疗肿瘤的新型药物的研究越来越受到重视,其中利用细菌载体靶向肿瘤的治疗成为研究的热点。人体肠道益生菌E.coli Nissle 1917（EcN）对肿瘤细胞具有很强的靶向性,是理想的抗肿瘤药物靶向载体。本文对本室构建的能靶向侵袭肿瘤细胞并分泌抗肿瘤药物天青蛋白（Azurin）的工程菌株EcNA进行发酵条件的研究和菌剂的研制。为了充分发挥EcNA的抗肿瘤活性功能,研究中采用高密度发酵及真空冷冻干燥技术,试图获得高活力抗肿瘤工程菌菌粉。在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman试验筛选出对菌体浓度影响最显着的因素为酵母抽提物和K2HPO4。以发酵后菌体浓度的OD600为响应值,对实验结果进行中心组合试验响应面分析,得到最佳培养基成分组合为可溶性淀粉2 g/L、酵母抽提物50.3 g/L、K2HPO4 14.26g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 0.3 g/L、微量元素母液2 mL/L、接种量3%。发酵后菌液OD600值达到7.602,菌体生物量达到2.96×109CFU/mL,较优化前提高了78.3%。其后,为减小冷冻干燥过程对菌体活力的影响,采用正交设计对复合冻干保护剂进行优化,得到最佳保护剂配方为脱脂乳14.25%、蔗糖3%、抗坏血酸钠3%,优化后菌粉存活率达到86.32%。根据菌粉流动性较差、易潮解的性质,以淀粉浆为辅料,成功将菌粉压制成片剂。同时,以蔗糖为填充物料,将菌粉灌装制成硬胶囊剂。将工程菌菌粉复水并进行SDS-PAGE检测、细胞活性检测和稳定性检测。SDS-PAGE的检测结果显示,EcNA菌剂的活性未受高密度发酵及冷冻干燥的影响,天青蛋白能正常表达且含量较高。细胞活性检测结果表明,复水菌粉破碎上清液对人体正常细胞HUVEC的生长无影响,对小鼠4T1乳腺癌细胞和小鼠B16黑色素瘤细胞的生长有显着抑制作用,菌粉显示出很好的抗肿瘤活性。对菌粉进行稳定性检测实验发现菌粉在4℃条件下保存三个月,菌粉存活率保持在80%以上,这一结果为该抗肿瘤活菌药物的长货架期提供了重要依据。本研究通过响应面优化法大幅提高了抗肿瘤靶向工程菌株EcNA的发酵产量,同时也提高了抗肿瘤活性蛋白天青蛋白的比生产率以及单位体积抗肿瘤活性。通过菌粉制备成胶囊和片剂,有助于简化高活力菌体的保藏与运输条件,有利于货架期的延长,为发展靶向抗肿瘤工程菌药物研制技术提供了重要基础。但对该抗肿瘤工程菌粉剂潜在的临床应用效果与安全性有待进一步研究。
柯崇榕[10]（2016）在《吡咯喹啉醌的高产菌株选育、发酵制备及生物合成途径的研究》文中指出吡咯喹啉醌（PQQ）是一种具有氧化还原活性的芳香三环邻位醌,参与脱氢酶的氧化还原过程,协同COQ完成呼吸链的电子传递,是继核黄素和吡啶核苷酸之后发现的第三种氧化还原酶辅因子。PQQ广泛存在于生物体内,具有促进机体生长、防护肝损伤、维护线粒体功能、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、防止皮肤衰老、防治帕金森病和老年痴呆症等功能,是一种独特的生理活性物质,在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。因此,选育PQQ高产菌株并建立相应的发酵控制及纯化制备工艺具有重要的意义。1、定向驯化选育高产PQQ的甲基营养菌:根据PQQ的吸收光谱特性建立了光谱法结合液相色谱法的PQQ产生菌快速筛选体系,从化工污水中筛选获得蛋白分泌量低而PQQ合成量超过20 mg/L的甲基营养菌FJNU-6,经形态学观察、生理生化测定及系统发生分析命名为脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificans）;利用紫外线和亚硝基胍轮流间隔诱变提高突变率,以高浓度甲醇为拮抗因子进行8轮定向驯化,选育获得高产突变株FJNU-R8;突变株FJNU-R8在不同甲醇浓度下pqq和moxF基因簇的表达量较高且差异较小,但生长速度较慢,甲醇消耗速度快,PQQ产量达到 65.73±1.65 mg/L（132 h）,比出发株FJNU-6（30.61±3.69 mg/L,160h）提高了 1.17倍。2、建立DO-stat结合pH-stat的甲醇分段控制补料分批发酵工艺:通过单因素试验设计、析因设计及中心组合设计对H.denitrificans FJNU-R8产PQQ的摇瓶培养体系进行优化,PQQ产量提高至135.67±2.34 mg/L;5L发酵罐的分批培养数据发现培养液中较低的溶氧和pH有利于PQQ的合成,动力学模型表明FJNU-R8产PQQ属于生长部分偶联型发酵,甲醇是PQQ合成的限制性底物;建立DO-stat和pH-stat相结合的分段甲醇浓度控制补料分批发酵工艺,5L发酵罐中PQQ产量达到1.18 g/L,生产效率为52.17 mg/g DCW;按照单位体积培养液所消耗的搅拌功率相同为准则进行5L-50L-1T发酵参数的逐级放大,1T发酵罐的PQQ产量高达2.05 g/L,生产效率达到77.82 mg/g DCW,比5L发酵罐提高49.17%。3、建立离心结合膜过滤、层析分离耦合色谱纯化的结晶制备工艺:利用离心和膜过滤技术结合添加15%的硫酸铵完全去除发酵液中的菌体和95%的蛋白多肽,防止发酵液变绿,提高了 PQQ的稳定性;通过静态吸附试验,确定大孔树脂DK-6和缓冲液为PQQ富集纯化的分离介质和解析剂;动力学研究表明,树脂DK-6对PQQ的吸附属于优惠型化学吸附,该吸附过程是一个放热过程,吸附速率由内外扩散共同控制;动态吸附试验确定柱层析条件为:样液浓度1.5 g/L（pH 3.0）,以5 BV/h的流速上样6 BV,按体积倍数进行线性放大,PQQ最高可浓缩3.3倍,回收率达到90%;析因设计确定浓度≥3.5 g/L的PQQ母液（pH≤3.0）在4℃条件下结晶5 h,PQQ残留量≤100 mg/L,结晶得率>90%,经过两次结晶,PQQ产品的纯度从90.36%提高至99.32%;根据分离纯化制备参数进行工艺放大,PQQ的最终得率大于70%,纯度高于99%。4、完成H.denitrificans FJNU-R8的基因组测序分析:FJNU-R8的基因组全长3.54M bp,GC含量为60.78%,含有4个CRISPR结构以及1个完整的前噬菌体区域,编码3498个基因,3个rRNA和sRNA以及46个tRNA,与ATCC 51888具有较好的共线性。FJNU-R8基因组只含有I型限制性修饰系统,含有完整的甲醇氧化代谢、硝酸盐还原以及Fe-S簇合成基因,以及丰富的无机盐转运与代谢、信号转导、细胞膜及膜生物合成和转录的相关基因。基因组中还包含由4个独立moxFα基因和1个moxFαβ基因簇组成甲醇脱氢酶体系以及4个独立pqqA基因、1个pqqDE和pqqABCDE基因簇组合的PQQ合成系统。pqq基因簇中各个基因是单独转录的,pqq基因中pqqA3表达量最高,moxF基因中moxFβ表达量最高。5、强化Fe-S的合成和pqqA的表达提高PQQ的合成量:以大肠杆菌为基盘细胞,采用携带阿拉伯糖启动子的表达载体实现pqqABCDE基因簇的异源表达,PQQ产量达到4.09±0.21 mg/L,生产效率为2.16±0.06 mg/g DCW。通过添加30 μM的Fe2+或以IscR缺失菌为宿主,促进铁硫簇的合成,PQQ产量提高到3.13±0.07mg/g DCW;FJNU-R8含有的5个pqqA基因中pqqA3最有利于PQQ的产生,单独表达时PQQ产量达到4.52±0.05 mg/g DCW。当串联表达5个不同pqqA或pqqA3时,PQQ 产量分别为 5.28±0.12 mg/g DCW 和 5.48±0.09 mg/g DCW,而融合 5 个不同的pqqA或pqqA3 时,PQQ 产量仅为 4.89±0.1 mg/g DCW 和 4.78±0.05 mg/g DCW,表明PqqA加工形成PQQ既需要保守结构域还需形成一定的空间结构。综上所述,本论文通过定向驯化选育获得高产PQQ的脱氮生丝微菌,优化了培养体系,建立了分批流加补料生产工艺及色谱分离纯化结晶制备工艺。在此基础上,对高产突变株进行基因组测序分析,以大肠杆菌为基盘细胞分析了铁硫簇的合成和pqqA的表达对PQQ合成量的影响。
二、重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究（论文提纲范文）
（1）重组毕赤酵母中10-HDA的生物合成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脂肪酸概述 |
| 1.2 10-HDA概述 |
| 1.2.1 10-HDA的结构与性质 |
| 1.2.2 10-HDA的应用 |
| 1.2.3 10-HDA的合成现状 |
| 1.3 微生物异源表达系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌的表达系统 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.3 P.pastoris表达系统的应用 |
| 1.4 立题背景及研究内容 |
| 第2章 ydiI基因在GS115 的细胞质中表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和设备 |
| 2.2.1 菌种、质粒、引物 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要培养基 |
| 2.3 实验内容 |
| 2.3.1 大肠杆菌基因组提取 |
| 2.3.2 硫酯酶ydiI基因的扩增 |
| 2.3.3 C.tropicalis菌基因组提取 |
| 2.3.4 脱氢酶fadA基因的获取 |
| 2.3.5 整合型质粒pGAPZaA-ydiI-fadA的构建 |
| 2.3.6 大肠杆菌感受态的转化 |
| 2.3.7 质粒线性化及浓缩 |
| 2.3.8 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.9 电转化 |
| 2.3.10 阳性重组子的筛选与鉴定 |
| 2.3.11 发酵培养 |
| 2.3.12 发酵产物结果分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 获取目的片段 |
| 2.4.2 整合型质粒pGAPZaA-ydiI-fadA的构建与鉴定 |
| 2.4.3 重组菌株的构建 |
| 2.4.4 重组工程菌GS115-pGAPZaA-ydiI-fadA发酵结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 硫酯酶ydiI于 GS115 的过氧化酶体中表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和设备 |
| 3.2.1 菌种、质粒、引物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要设备 |
| 3.2.4 主要培养基 |
| 3.3 实验内容 |
| 3.3.1 整合型质粒p PIC9K-ydiI-Pts的构建 |
| 3.3.2 质粒线性化及浓缩 |
| 3.3.3 GS115 感受态的制备 |
| 3.3.4 电转化 |
| 3.3.5 阳性重组子的筛选及鉴定 |
| 3.3.6 发酵培养 |
| 3.3.7 发酵产物结果分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 整合型质粒p PIC9K-ydiI-Pts的构建 |
| 3.4.2 阳性重组菌株的筛选及鉴定 |
| 3.4.3 重组工程菌GS115-p PIC9K-ydiI-Pts发酵结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 P450 酶和NADPH-P450 酶基因在GS115 中的表达及转化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和设备 |
| 4.2.1 菌种、质粒、引物 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要设备 |
| 4.2.4 主要培养基 |
| 4.3 实验内容 |
| 4.3.1 目的片段的获取 |
| 4.3.2 线性化质粒 |
| 4.3.3 质粒浓缩 |
| 4.3.4 整合型质粒pGAPZaA-NADPH-P450 的构建 |
| 4.3.5 大肠杆菌感受态的转化 |
| 4.3.6 重组质粒pGAPZaA-NADPH-P450 的提取鉴定 |
| 4.3.7 GS1115 细胞感受态的制备 |
| 4.3.8 电转化 |
| 4.3.9 阳性重组子的筛选与鉴定 |
| 4.3.10 发酵培养 |
| 4.3.11 发酵产物结果分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 获取目的片段 |
| 4.4.2 质粒pGAPZaA-NADPH-P450在GS115 中表达与鉴定 |
| 4.4.3 重组菌株的构建 |
| 4.4.4 重组工程菌GS115-pGAPZaA-NADPH-P450 发酵结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 10-HDA合成关键酶在GS115 中共表达的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和设备 |
| 5.2.1 菌种、质粒、引物 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要设备 |
| 5.2.4 主要培养基 |
| 5.3 实验内容 |
| 5.3.1 获取目的片段 |
| 5.3.2 GS115-pPIC9K-ydiI-Pts感受态的制备 |
| 5.3.3 转化 |
| 5.3.4 阳性工程菌的筛选及鉴定 |
| 5.3.5 重组工程菌发酵培养 |
| 5.3.6 重组工程菌的发酵结果分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 重组菌的构建 |
| 5.4.2 融合工程菌GS115-pPIC9K-ydiI-Pts-pGAPZaA-NADPH-P450 的发酵结果 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间主要科研成果 |
（2）重组人长效血小板衍生因子的发酵工艺、凝胶剂制备和药效学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 血小板衍生因子 |
| 1.1.1 血小板衍生因子 |
| 1.1.2 血小板衍生因子的生物学活性 |
| 1.1.3 血小板衍生因子及其受体与肿瘤 |
| 1.1.4 重组人血小板衍生因子表达的研究现状 |
| 1.2 融合蛋白 |
| 1.2.1 融合蛋白 |
| 1.2.2 Fc融合蛋白的发展 |
| 1.3 本课题研究特色 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试剂与材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pPICZɑ-PDGF-B-Fc表达载体的构建 |
| 2.2.2 pPICZɑ-PDGF-B-Fc重组质粒的酵母转化及鉴定 |
| 2.2.3 PDGF-BB-Fc重组蛋白的发酵与鉴定 |
| 2.2.4 发酵液初处理 |
| 2.2.5 PDGF-BB-Fc重组蛋白的纯化与鉴定 |
| 2.2.6 重组PDGF-BB-Fc蛋白活性测定 |
| 2.2.7 重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂的制备与研究 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 pPICZɑ-PDGF-B-Fc表达载体的鉴定 |
| 3.2 重组毕赤酵母菌株鉴定 |
| 3.2.1 重组菌落PCR鉴定 |
| 3.2.2 重组菌株诱导表达蛋白的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.2.3 重组菌株诱导表达蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.3 阳性重组菌株的发酵 |
| 3.3.1 发酵过程中条件探索及参数变化 |
| 3.3.2 发酵液PDGF-BB-Fc的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.3.3 发酵液PDGF-BB-Fc的Western blot鉴定 |
| 3.4 发酵上清纯化的鉴定 |
| 3.4.1 ProteinA亲和层析的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.4.2 ProteinA亲和层析的Western blot鉴定 |
| 3.5 重组PDGF-BB-Fc蛋白生物学活性分析 |
| 3.6 重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂的制备 |
| 3.6.1 重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂性状测定 |
| 3.6.2 重组PDGF-BB-Fc蛋白凝胶剂药效测定 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 萜类化合物的天然生物合成途径 |
| 1.2.1 异戊二烯单元的生物合成途径 |
| 1.2.2 萜类化合物生物合成的下游途径 |
| 1.3 萜类化合物合成的生物技术 |
| 1.3.1 天然宿主萜类化合物的生物合成 |
| 1.3.2 异源微生物合成萜类化合物 |
| 1.3.3 萜类化合物的无细胞体系合成 |
| 1.4 类胡萝卜素 |
| 1.4.1 类胡萝卜素的概述 |
| 1.4.2 β-胡萝卜素 |
| 1.4.3 虾青素 |
| 1.5 选题背景及研究内容 |
| 1.5.1 大肠杆菌中组合生物合成调控虾青素生产 |
| 1.5.2 大肠杆菌碳代谢扰动提高β-胡萝卜素的生产 |
| 第2章 虾青素操作子的构建和表征 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌的CaCl_2转化法感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.2 大肠杆菌电转化感受态的制备和电转化 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.4 DNA片段的PCR扩增 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 DNA片段的纯化和回收 |
| 2.2.7 DNA片段的切胶回收 |
| 2.2.8 DNA片段的酶切反应和连接反应 |
| 2.2.9 菌液PCR |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.2.11 菌株的培养及摇瓶发酵 |
| 2.2.12 AX的定量检测 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 大肠杆菌生产AX初探 |
| 2.3.2 AX操纵子的优化再设计与构建 |
| 2.3.3 优化的AX操纵子发酵表征 |
| 2.3.4 优化的AX操纵子表达分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 β-胡萝卜素羟化酶与β-胡萝卜素酮化酶的融合 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重叠延伸PCR |
| 3.2.2 同源建模 |
| 3.2.3 菌株的碳源优化发酵 |
| 3.2.4 高效液相色谱检测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 融合蛋白质的设计与构建 |
| 3.3.2 融合蛋白质中添加肽linker对AX生产的影响 |
| 3.3.3 菌株ZF237T/Crt Z_(As)-(GS)_1-W_(Bs)发酵碳源的优化 |
| 3.3.4 融合蛋白的同源建模 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 中心碳代谢扰动与NADPH供应提高β-胡萝卜素生产 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 大肠杆菌中I-Sce I介导的λ-red重组系统无痕敲除基因 |
| 4.2.2 大肠杆菌中的MAGE技术 |
| 4.2.3 大肠杆菌生理参数的测定 |
| 4.2.4 辅酶Ⅰ和II胞内含量检测 |
| 4.2.5 菌株ECW4/ p5C-nad K的高细胞密度发酵 |
| 4.2.6 定量测定 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 中心碳代谢途径的阻断对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.2 PTS系统失活对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.3 中心碳代谢扰动菌株的生理参数测定 |
| 4.3.4 菌株ECW1和ECW2 的还原力分析 |
| 4.3.5 增加NADPH的供应对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.6 菌株ECW4/p5C-nad K的高细胞密度发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 菌株ECW1和ECW2 的转录组分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 溶液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 菌株培养 |
| 5.2.2 转录组学 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 基因表达水平相关性分析 |
| 5.3.2 基因差异表达分析 |
| 5.3.3 菌株ECW1与ZF43ΔgdhA的比较转录组学分析 |
| 5.3.4 菌株ECW2转录组学分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 过表达葡萄糖运输蛋白对萜类化合物的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.1.5 溶液 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 大肠杆菌基因组上过表达基因 |
| 6.2.2 β-胡萝卜素的生成 |
| 6.2.3 芳樟醇的生成 |
| 6.2.4 β-胡萝卜素和芳樟醇的测定 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 zwf的敲除对基因ptsG和 galP转录的影响 |
| 6.3.2 菌株ECW1中过表达ptsG、galP对 β-胡萝卜素生产的影响 |
| 6.3.3 在菌株ZF43ΔgdhA中过表达ptsG和 galP |
| 6.3.4 葡萄糖运输蛋白基因的过表达对芳樟醇合成的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 维生素K |
| 1.1.1 维生素K的发现历程 |
| 1.1.2 维生素K的性质 |
| 1.1.3 维生素K2的功能与应用 |
| 1.1.4 维生素K2的生物合成 |
| 1.2 合成生物学及其应用 |
| 1.2.1 合成生物学的概念 |
| 1.2.2 合成生物学的研究内容 |
| 1.2.3 合成生物学的应用 |
| 1.3 蛋白表达系统 |
| 1.3.1 重组蛋白表达系统 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4 本论文研究的内容与意义 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 大肠杆菌四烯甲萘醌生物合成途径的构建与优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 培养基和溶液 |
| 2.2.5 大肠杆菌MK-4生物合成途径的构建 |
| 2.2.6 利用Red重组系统无痕敲除大肠杆菌pgi基因 |
| 2.2.7 胞内产物的提取和检测 |
| 2.2.8 胞内NADPH含量的检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 大肠杆菌MK-4生物合成途径的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌pgi基因缺失菌株的构建 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 毕赤酵母四烯甲萘醌生物合成途径的理性设计 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 理性设计以VK3和IPP为底物的MK-4生物合成途径 |
| 3.2.2 MK-4生物合成途径中关键酶HsUBIAD1的生物信息学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 毕赤酵母MK-4生物合成途径的理性设计 |
| 3.3.2 MK-4生物合成途径中关键酶HsUBIAD1的生物信息学分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 毕赤酵母四烯甲萘醌生物合成途径的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种和质粒 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 培养基和溶液 |
| 4.2.5 HsUBIAD1蛋白表达载体的构建 |
| 4.2.6 构建产HsUBIAD1重组毕赤酵母 |
| 4.2.7 高产HsUBIAD1重组毕赤酵母的筛选 |
| 4.2.8 高产菌株蛋白表达条件的优化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 重组HsUBIAD1表达载体的构建 |
| 4.3.2 高产HsUBIAD1重组毕赤酵母的筛选 |
| 4.3.3 重组HsUBIAD1蛋白表达条件优化 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 重组HsUBIAD1蛋白的纯化和鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种和质粒 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.2.4 培养基和溶液 |
| 5.2.5 重组HsUBIAD1蛋白的纯化 |
| 5.2.6 重组HsUBIAD1蛋白的酶学分析 |
| 5.2.7 重组GGU-23菌株全细胞催化反应 |
| 5.2.8 异戊烯基化产物的提取与检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组HsUBIAD1蛋白的纯化 |
| 5.3.2 重组HsUBIAD1蛋白的催化活性 |
| 5.3.3 异戊烯基化产物的鉴定 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 毕赤酵母四烯甲萘醌侧链生物合成途径的优化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌种和质粒 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器设备 |
| 6.2.4 培养基和溶液 |
| 6.2.5 构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体 |
| 6.2.6 构建PpIDI和SaGGPPS融合表达载体 |
| 6.2.7 构建GGU-GrG和GGU-GrIG重组毕赤酵母 |
| 6.2.8 筛选GGU-GrG和GGU-GrIG重组毕赤酵母 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体 |
| 6.3.2 融合表达SaGGPPS和PpIDI强化侧链前体的供给 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 工程菌全细胞催化合成四烯甲萘醌的工艺优化 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌种和质粒 |
| 7.2.2 主要试剂 |
| 7.2.3 培养基和溶液 |
| 7.2.4 全细胞催化工艺的优化 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 全细胞催化工艺的优化 |
| 7.3.2 工程菌的传代稳定性 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（5）重组人EGF、bFGF的高效可溶性表达研究及活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 生长因子家族简述 |
| 1.2.1 表皮细胞生长因子(EGF) |
| 1.2.2 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) |
| 1.3 重组蛋白技术研究进展 |
| 1.4 研究内容、意义及创新性 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 意义及创新性 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试剂、耗材及仪器设备 |
| 2.1.1 实验试剂及耗材 |
| 2.1.2 实验菌株及细胞 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.2 重组质粒的设计与构建 |
| 2.2.3 转化与初步诱导表达验证 |
| 2.2.4 表达条件优化与线性放大 |
| 2.2.5 目的蛋白的分离纯化 |
| 2.2.6 表达产物特异性鉴定 |
| 2.2.7 生物学活性检测(MTT法) |
| 第3章 重组表皮细胞生长因子的制备及检测 |
| 3.1 构建mPLB1-EGF工程菌 |
| 3.1.1 目的基因的表达设计 |
| 3.1.2 目的基因的重组与转化 |
| 3.2 r-EGF融合蛋白的表达 |
| 3.2.1 优化表达条件 |
| 3.2.2 发酵罐放大培养 |
| 3.3 r-EGF融合蛋白的分离纯化 |
| 3.4 r-EGF蛋白原液的特异性鉴定与活性检测 |
| 3.4.1 Western Blot鉴定 |
| 3.4.2 MTT法检测蛋白原液生物学活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 重组碱性成纤维细胞生长因子的制备及检测 |
| 4.1 构建mPLB1-bFGF-P-9与w-bFGF-RC11 工程菌 |
| 4.1.1 目的基因的表达设计 |
| 4.1.2 目的基因的重组与转化 |
| 4.2 r-bFGF融合蛋白的表达 |
| 4.2.1 优化表达条件 |
| 4.2.2 发酵罐放大培养 |
| 4.3 r-bFGF融合蛋白的分离纯化 |
| 4.4 r-bFGF蛋白原液的特异性鉴定与活性检测 |
| 4.4.1 Western Blot鉴定 |
| 4.4.2 MTT法检测蛋白原液生物学活性 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）多聚氨基酸融合对毕赤酵母的甘露聚糖酶ManA表达量及菌体耐盐性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 部分英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多聚氨基酸的研究进展 |
| 1.1.1 氨基酸 |
| 1.1.2 多聚氨基酸 |
| 1.1.3 多聚氨基酸的应用 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.1 毕赤酵母的简介 |
| 1.2.2 毕赤酵母分泌表达系统 |
| 1.2.3 毕赤酵母展示表达系统 |
| 1.3 甘露聚糖酶及其应用 |
| 1.3.1 甘露聚糖酶的简介 |
| 1.3.2 甘露聚糖酶的应用 |
| 1.4 耐盐菌株的研究进展 |
| 1.4.1 耐盐菌的简介 |
| 1.4.2 耐盐菌的应用 |
| 1.4.3 耐盐工程菌的研究现状 |
| 1.5 本课题的意义及内容 |
| 第二章 多聚氨基酸对ManA在毕赤酵母中分泌表达的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 质粒与菌株 |
| 2.2.2 引物 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要设备 |
| 2.2.5 实验相关培养基 |
| 2.2.6 实验相关溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分泌表达ManA-R(2-8)的重组菌的构建及酶活分析 |
| 2.3.1.1 分泌表达ManA-R(2-8)的重组质粒的构建 |
| 2.3.1.2 分泌表达ManA-R(2-8)的重组酵母的构建 |
| 2.3.1.3 重组酵母的诱导表达及酶活分析 |
| 2.3.2 分泌表达ManA-K6等重组菌的构建及产酶分析 |
| 2.3.2.1 分泌表达ManA-K6等重组质粒的构建 |
| 2.3.2.2 分泌表达ManA-K6等重组酵母的构建 |
| 2.3.2.3 重组酵母的诱导表达及产酶分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 融合表达不同个数R对ManA分泌表达酶活的影响 |
| 2.4.1.1 分泌表达ManA-R(2-8)的重组菌的构建及鉴定 |
| 2.4.1.2 分泌表达ManA-R(2-8)重组菌的诱导表达及酶活分析 |
| 2.4.2 融合表达不同种类多聚氨基酸对ManA分泌表达酶活的影响 |
| 2.4.2.1 分泌表达ManA-K6等重组菌的构建及鉴定 |
| 2.4.2.2 分泌表达ManA-K6等重组菌的诱导表达及酶活分析 |
| 2.4.2.3 各重组菌发酵上清液中蛋白含量的分析 |
| 2.4.2.4 各重组菌发酵上清液的SDS-PAGE分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 多聚氨基酸对毕赤酵母耐盐性的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 质粒和菌株 |
| 3.2.2 引物 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要设备 |
| 3.2.5 培养基与溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 毕赤酵母X33基因组的提取 |
| 3.3.2 展示表达不同个数R的重组质粒的构建 |
| 3.3.3 展示表达不同个数R的重组酵母的构建 |
| 3.3.4 展示表达不同个数R的重组菌生长情况检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 展示表达不同个数R的重组菌的构建及鉴定 |
| 3.4.2 展示表达不同个数R重组菌生长情况的分析 |
| 3.4.3 展示表达不同多聚氨基酸对毕赤酵母耐盐性影响的分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）肺炎克雷伯氏菌碳代谢流定向调控生产3-羟基丙酸（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 3-羟基丙酸概述 |
| 1.2 化学合成法生产3-HP |
| 1.3 微生物发酵法生产3-HP |
| 1.3.1 合成3-HP的天然途径 |
| 1.3.2 合成3-HP的代谢工程途径 |
| 1.4 生物法合成3-HP的研究进展 |
| 1.5 K. pneumoniae及其甘油代谢途径 |
| 1.6 碳代谢流的再分配 |
| 1.7 合成生物学技术改造非模式生物 |
| 1.7.1 微生物信号工程调控细胞表型 |
| 1.7.2 正交表达系统 |
| 1.7.3 CRISPRi系统介导的基因沉默 |
| 1.8 基因定向敲入策略 |
| 1.8.1 自杀载体介导的基因整合 |
| 1.8.2 λRed系统介导的基因整合 |
| 1.9 本课题的立项意义 |
| 第二章 构建环腺苷酸受体蛋白(CRP)介导的人工转录因子定向强化3-HP生产 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株、质粒及引物 |
| 2.2.2 试剂与仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 融合基因设计 |
| 2.3.2 K. pneumoniae及E. coli基因组的提取 |
| 2.3.3 重组质粒载体的提取 |
| 2.3.4 PCR反应扩增目的基因片段与片段的纯化回收 |
| 2.3.5 基因片段与载体的酶切反应 |
| 2.3.6 酶切产物的琼脂糖切胶回收 |
| 2.3.7 基因片段与载体的连接反应 |
| 2.3.8 连接液热转化E.coli感受态细胞 |
| 2.3.9 重组质粒电转化至宿主菌K.pneumoniae |
| 2.3.10 重组K.pneumoniae的发酵 |
| 2.3.11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析醛脱氢酶表达情况 |
| 2.3.12 醛脱氢酶酶活的测定 |
| 2.3.13 实时荧光定量PCR分析基因转录水平 |
| 2.3.14 代谢物的测定方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 K.pneumoniae与E.coli基因组的提取 |
| 2.4.2 crp+linker、lac1+linker、pkan、cm、lac0、puuC基因的克隆 |
| 2.4.3 重组载体pET-pkan-crp-lac1和pET-lac0-pkac-puuC的构建 |
| 2.4.4 SDS-PAGE及酶活分析醛脱氢酶表达情况 |
| 2.4.5 qRT-PCR分析相关基因的转录情况 |
| 2.4.6 摇瓶发酵重组菌产3-HP的研究 |
| 2.4.7 重组菌上罐发酵的研究 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 利用CRISPRi技术构建代谢开关调控K.pneumoniae中3-HP生产 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株、质粒及引物 |
| 3.2.2 仪器、试剂和培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组载体的构建 |
| 3.3.2 自杀载体的功能验证 |
| 3.3.3 两轮重组整合dCas9基因 |
| 3.3.4 平台工程菌K.p-dCas9功能表征 |
| 3.3.5 代谢开关元件在K. pneumoniae生产3-HP中的应用 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 基因的克隆及重组载体构建 |
| 3.4.2 自杀载体功能表征 |
| 3.4.3 dCas9表达盒的基因组整合 |
| 3.4.4 荧光分析K.p-dCas9基因沉默功能 |
| 3.4.5 在K.pneumoniae中利用代谢切换元件生产3-HP |
| 3.4.6 重组菌K.-p-dCas9(p-switch)的上罐发酵 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 在K.pneumoniae中建立依赖T7 RNA聚合酶的正交表达系统生产3-HP |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌种、质粒和引物 |
| 4.2.2 仪器、试剂和培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组载体的构建 |
| 4.3.2 T7正交表达系统的功能表征 |
| 4.3.3 利用载体中的T7正交表达系统调控3-HP生产 |
| 4.3.4 λRed重组整合T7 RNAP |
| 4.3.5 利用平台工程菌K.p-T7表达醛脱氢酶生产3-HP |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 基因的克隆及重组载体构建 |
| 4.4.2 荧光蛋白表征T7系统在K.pneumoniae中的可行性 |
| 4.4.3 利用T7表达系统在K. pneumoniae中表达醛脱氢酶 |
| 4.4.4 T7表达系统调控K. pneumoniae生产3-HP |
| 4.4.5 λRed重组介导的T7 RNAP基因组整合 |
| 4.4.6 平台工程菌K.p-T7表达醛脱氢酶生产3-HP |
| 4.4.7 重组菌K.p-T7 (pET28a-puuC)上罐发酵生产3-HP |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 利用RNA聚合酶作为资源分配器在K.pneumoniae中最大化生产3-HP |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株、质粒及引物 |
| 5.2.2 仪器、试剂和培养基 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 重组载体的构建 |
| 5.3.2 重组K.pneumoniae(Pntac-puuC)的发酵 |
| 5.3.3 模型分析RNAP与复合启动子Pntac之间数量关系 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 基因的克隆及重组载体构建 |
| 5.4.2 SDS-PAGE及酶活分析醛脱氢酶表达情况 |
| 5.4.3 qRT-PCR分析相关基因的转录情况 |
| 5.4.4 重组菌摇瓶发酵探究复合启动子对代谢物合成的影响 |
| 5.4.5 重组菌5L上罐发酵高产3-HP条件探究 |
| 5.4.6 数学模型分析复合启动子转录效率 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 本研究用到的试剂 |
| 附录2 本研究所用到的仪器 |
| 致谢 |
| 已发表的文章 |
| 作者及导师简介 |
| 附件 |
（8）硅结合蛋白Si-tag在解脂耶氏酵母细胞表面的展示研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 硅结合蛋白的概述 |
| 1.2 微生物表面展示概述 |
| 1.3 表面展示技术的应用 |
| 1.4 解脂耶氏酵母表达系统概述 |
| 1.5 研究背景及意义 |
| 2 硅结合蛋白在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论和小结 |
| 3 硅结合蛋白在解脂耶式酵母表面的展示 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论和小结 |
| 4 全文总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 1 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录 2 基因序列 |
| 附录 3 各种仪器和设备 |
（9）抗肿瘤工程菌Nissle 1917发酵工艺优化及菌粉制剂制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 细菌靶向治疗肿瘤的研究 |
| 1.1 细菌靶向治疗肿瘤的机制研究 |
| 1.2 天青蛋白抗肿瘤作用机制研究 |
| 2 发酵工艺研究 |
| 2.1 单因素试验 |
| 2.2 析因设计 |
| 2.3 响应面法 |
| 3 菌粉制剂的的研究 |
| 3.1 冷冻干燥保护剂机理研究 |
| 3.2 冷冻干燥保护剂的种类 |
| 4 立题依据与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 培养基与抗生素 |
| 1.3 常用试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌种保藏 |
| 2.2 种子复壮 |
| 2.3 种子培养 |
| 2.4 发酵培养 |
| 2.5 工程菌菌体浓度的测定 |
| 2.6 菌粉的制备 |
| 2.7 菌体存活率的测定 |
| 3 试验设计 |
| 3.1 高密度发酵单因素试验 |
| 3.2 Plackett-Burman试验设计 |
| 3.3 中心组合试验设计 |
| 3.4 冻干保护剂的单因素试验 |
| 3.5 保护剂优化正交试验设计 |
| 3.6 细胞的培养、增殖与传代 |
| 3.7 抗肿瘤蛋白Azurin的SDS-PAGE检测 |
| 3.8 菌粉稳定性检测 |
| 3.9 片剂及胶囊剂的制备 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 培养基组分单因素试验结果 |
| 1.1 碳源及氮源的筛选结果 |
| 1.2 培养基组分单因素试验结果 |
| 2 Plackett-Burman试验设计结果及回归分析 |
| 3 中心组合试验设计响应面分析 |
| 4 冻干保护剂的优化 |
| 5 冻干保护剂正交试验结果及方差分析 |
| 6 抗肿瘤蛋白Azurin的检测结果 |
| 7 菌粉抗肿瘤活性检测结果 |
| 8 菌粉稳定性检测结果 |
| 9 菌粉片剂和胶囊剂的制备 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略词(中英文对照) |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 |
| 本论文感谢以下项目的资助 |
（10）吡咯喹啉醌的高产菌株选育、发酵制备及生物合成途径的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 绪论 |
| 第一节 吡咯喹啉醌 |
| 1.1 PQQ的理化性质及生理功能 |
| 1.2 PQQ的微生物来源 |
| 1.3 PQQ的微生物合成 |
| 第二节 甲基营养菌 |
| 2.1 甲基营养菌的主要代谢途径 |
| 2.2 生丝微菌的研究概况 |
| 第三节 课题的研究意义与内容 |
| 3.1 课题研究意义 |
| 3.2 课题研究内容 |
| 3.3 技术路线 |
| 第一章 高产PQQ甲基营养菌的选育 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 PQQ产生菌快速筛选方法的建立 |
| 2.2 PQQ产生菌的筛选 |
| 2.3 PQQ产生菌的鉴定 |
| 2.4 甲醇最小致死浓度 |
| 2.5 定向驯化选育PQQ高产突变株 |
| 2.6 甲醇胁迫下的PQQ诱导合成机制 |
| 2.7 高产突变株的生长特性 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第二章 生丝微菌发酵生产PQQ工艺的建立 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 培养条件的优化 |
| 2.2 培养基组分的优化 |
| 2.3 培养体系的验证 |
| 2.4 金属离子对PQQ产量的影响 |
| 2.5 5L发酵罐的分批培养 |
| 2.6 分批培养动力学模型的分析 |
| 2.7 5L发酵罐的分批补料培养 |
| 2.8 分批补料培养工艺的放大 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第三章 PQQ分离纯化制备工艺的建立 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 发酵液静置对PQQ的影响 |
| 2.2 硫酸铵沉淀蛋白质多肽 |
| 2.3 发酵上清液的制备 |
| 2.4 静态吸附条件的优化 |
| 2.5 吸附动力学及热力学参数的解析 |
| 2.6 吸附层析富集纯化PQQ |
| 2.7 高压液相色谱纯化PQQ |
| 2.8 低温等电结晶制备PQQ |
| 2.9 分离纯化制备工艺的放大 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第四章 生丝微菌基因组分析及PQQ合成基因簇研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 基因组的基本特征 |
| 2.2 基因组的功能注释 |
| 2.3 调控与修饰系统 |
| 2.4 转运与趋化体系 |
| 2.5 碳氮代谢途径 |
| 2.6 辅酶合成途径 |
| 2.7 pqqA基因的进化分析 |
| 2.8 生长过程中pqq基因表达的差异 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第五章 PQQ基因簇在大肠杆菌中的表达 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 pqqABCDE基因簇的异源表达 |
| 2.2 不同复制起始位点质粒对PQQ产量的影响 |
| 2.3 强化Fe-S簇合成对PQQ产量的影响 |
| 2.4 双质粒表达pqq基因簇对PQQ产量的影响 |
| 2.5 不同pqqA基因对PQQ产量的影响 |
| 2.6 不同pqqDE基因簇对PQQ产量的影响 |
| 2.7 串联表达pqqA对PQQ产量的影响 |
| 2.8 融合表达pqqA对PQQ产量的影响 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
| 附件 |
四、重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究（论文参考文献）
- [1]重组毕赤酵母中10-HDA的生物合成研究[D]. 张丽华. 齐鲁工业大学, 2021
- [2]重组人长效血小板衍生因子的发酵工艺、凝胶剂制备和药效学研究[D]. 宗文博. 吉林大学, 2021(01)
- [3]代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究[D]. 吴元庆. 天津大学, 2020(01)
- [4]基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化[D]. 孙小雯. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [5]重组人EGF、bFGF的高效可溶性表达研究及活性检测[D]. 李鑫. 河北科技大学, 2020(01)
- [6]多聚氨基酸融合对毕赤酵母的甘露聚糖酶ManA表达量及菌体耐盐性的影响[D]. 马牧青. 中南民族大学, 2020(08)
- [7]肺炎克雷伯氏菌碳代谢流定向调控生产3-羟基丙酸[D]. 赵鹏. 北京化工大学, 2019(06)
- [8]硅结合蛋白Si-tag在解脂耶氏酵母细胞表面的展示研究[D]. 王飞. 华中科技大学, 2019(03)
- [9]抗肿瘤工程菌Nissle 1917发酵工艺优化及菌粉制剂制备[D]. 王灿. 湖南师范大学, 2017
- [10]吡咯喹啉醌的高产菌株选育、发酵制备及生物合成途径的研究[D]. 柯崇榕. 福建师范大学, 2016(05)