一、不同来源成骨细胞生物学特性的比较研究（论文文献综述）
崔帅帅[1]（2021）在《miRNA-3077-5p对绝经后骨质疏松小鼠颌骨BMSCs分化的影响》文中指出目的:分析绝经后骨质疏松（Postmenopausal osteoporosis,POP）小鼠微环境对颌骨骨髓间充质干细胞（mandibular bone marrow mesenchymal stem cells,MBMSCs）生物学特性的影响,探讨miRNA-3077-5p对MBMSCs分化能力的影响。方法:1、建立绝经后骨质疏松小鼠模型,无菌条件下取出小鼠下颌骨,去净附着的肌肉筋膜,剪掉前后牙,采用全骨髓法和组织块法培养MBMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型。2、对第3代假手术（sham surgery,SHAM）组小鼠MBMSCs（S-MBMSCs）和卵巢切除（ovariectomy,OVX）组小鼠的MBMSCs（O-MBMSCs）进行成骨、成脂诱导后,通过茜素红染色及定量、油红O染色及定量和成骨、成脂相关基因的Quantitative Real-time PCR（RT-qPCR）和Western blot（WB）等技术分析POP小鼠微环境对MBMSCs生物学特性的影响。3、RT-qPCR检测第3代S-MBMSCs和O-MBMSCs中miRNA-3077-5p的内源性表达量;诱导S-MBMSCs成骨成脂分化0、3、7天,RT-qPCR检测各诱导时间点S-MBMSCs中miRNA-3077-5p的相对表达量;利用人工合成的miRNA-3077-5p模拟物/抑制物,正性和负性调控miRNA-3077-5p在S-MBMSCs中的表达,成骨、成脂诱导后,通过茜素红染色及定量、油红O染色及定量,WB技术检测转染后S-MBMSCs成骨、成脂分化相关基因的表达量,观察其成骨、成脂分化能力的差异。结果:1、Micro-CT扫描,骨组织形态计量学指标分析和骨组织切片HE染色结果均证明POP小鼠模型建立成功,全骨髓法和组织块法培养MBMSCs至第3代时纯度较高,细胞呈梭形、多角形贴壁生长,流式细胞术鉴定所培养的细胞为MBMSCs,MBMSCs表面抗原SCA-1、CD29、CD106高表达,CD34、CD45低表达。2、两组MBMSCs在成骨诱导后,S-MBMSCs所形成钙化结节的数目及形态均强于O-MBMSCs,S-MBMSCs成骨相关基因RUNX2、OCN的m RNA及蛋白的相对表达量均高于O-MBMSCs组;两组MBMSCs在成脂诱导后,O-MBMSCs所形成脂滴的数目及形态均强于S-MBMSCs,O-MBMSCs成脂相关基因LPL、PPAR-γ的m RNA及蛋白的相对表达量均高于S-MBMSCs组。3、miRNA-3077-5p在O-MBMSCs中的表达明显高于S-MBMSCs。对S-MBMSCs成骨成脂诱导0、3、7天,在成骨诱导过程中,miRNA-3077-5p的表达水平随着时间延长逐渐降低;在成脂诱导过程中,miRNA-3077-5p的表达水平随着时间延长逐渐升高。化学合成miRNA-3077-5p模拟物（mimics）/抑制物（inhibitor）,正性和负性调控miRNA-3077-5p在S-MBMSCs中的表达后,进行成骨诱导,S-MBMSCs/inhibitor组茜素红染色后所呈现的钙化结节数目最多、体积大,并且成骨相关基因RNUX2、OCN的蛋白的相对表达量最多,S-MBMSCs/control组次之,S-MBMSCs/mimics组最少;进行成脂诱导后,S-MBMSCs/inhibitor组油红O染色后所呈现的脂滴数目最少、体积小,并且成脂相关基因LPL、PPAR-γ的蛋白的相对表达量最少,而S-MBMSCs/control组强于S-MBMSCs/inhibitor组,S-MBMSCs/mimics组则最多。结论:1、雌激素缺乏所导致的POP中,MBMSCs的成骨、成脂分化的能力发生改变,成骨能力减弱,成脂能力增强。2、POP小鼠的MBMSCs中,miRNA-3077-5p过表达,打破了MBMSCs的成骨成脂分化的平衡,降低了它的成骨分化能力,增强了它的成脂分化能力。
马一行[2]（2021）在《双相磷酸钙相组成的调控及其对磷酸钙/PLGA复合材料生物学性能影响的研究》文中研究说明背景:据统计,全世界每年因各种原因造成骨组织缺损,需要进行骨移植手术治疗的患者可达数百万例,其应用频率仅次于输血位列所有移植手术的第二位。临床实践中对于骨缺损移植物的要求不仅要达到植骨融合的效果,还要易于使用和操作,具有可靠的安全性,以及应对各种临床需要的适应性。从最初广泛使用的自体骨,到目前应用最多的同种异体骨,其自身都存在无法规避的问题。而现阶段人工合成的骨移植物中无论是陶瓷、金属、骨水泥以及高分子聚合物材料,其功能的单一化都不足以满足缺损修复的需要,将其中人工合成材料的功能复合是我们立项研究的初衷。而骨组织工程即可以通过一种简单有效的方式完成骨缺损修复,从组织工程的三要素分析,生长因子成本高,且可能出现不可预测的并发症及排斥反应;而种子细胞的提取过程复杂,保存和运输的过程均需耗费人力物力,同时又不排除疾病传播的可能;支架材料是前两者使用的基础,如何能提高材料自身的使用性能和生物学性能是本研究关注的重点。方法:本研究利用化学合成法调控磷酸钙的物相组成,以NMP为溶剂将高分子材料与合成的磷酸钙预混,通过相分离的方式制备出不同物相组成的CaPcs/PLGA复合材料,通过实验筛选出一种理化性质最适且成骨性能最优的CaPcs/PLGA复合材料应用于骨缺损修复。首先对制备的单双相CaPcs的物相组成进行分析,并观察颗粒的微观形貌特征,随后观察各组复合材料支架的微观形貌及孔道结构,计算支架的孔隙率,再比较复合材料的亲水性差异;又对复合材料的降解规律进行研究,比较了各组支架在不同时间点的宏观形貌、微观结构、降解液酸碱度变化、失重率变化;随后又对比了不同相组成复合支架的体外生物矿化性能差异,其中包括各组支架的质量变化、亲水性变化、微观形貌以及沉积物性质;利用小鼠胚胎成骨前体细胞在不同复合材料表面进行培养,比较了细胞黏附、增殖、分化的效果差异,并且在基因层面加以分析;最后将不同物相组成的CaPcs/PLGA复合材料支架植入大鼠胫骨缺损处,在不同时间点观察骨修复的形态学和组织学变化。本研究对单双相CaPcs/PLGA复合材料进行体系完整、内容丰富的实验研究,证明通过调控磷酸钙的物相组成可以影响复合材料生物学性能。结果:第一部分:不同相组成磷酸钙陶瓷（CaPcs）的制备及CaPcs/PLGA复合支架的构建。在计算确定Ca/P的前提下,通过调整反应酸碱度制备了磷酸钙陶瓷前驱体,并多次调整煅烧温度,最终在850℃下成功制备出了物相组成准确,且均匀分散的单双相CaPcs颗粒。又通过相分离法制备出不同相组成的CaPcs/PLGA复合材料支架,支架内部孔隙结构呈现的典型“指状”联通孔形态,内径大于100μm,且从高倍镜视野中可以看出支架的微观结构上都有丰富的微孔孔隙。从Micro-CT图像中可以清楚地发现CaPcs颗粒在支架内部分散均匀,并没有出现明显的团聚现象。经计算各组支架开孔孔隙率基本一致,均超过50%。通过对复合材料的接触角测量,可见复合材料有效地提升了高分子材料表面的亲水性,有助于细胞在材料上的黏附及增殖。第二部分:不同相组成CaPcs/PLGA复合材料支架的体外降解规律研究。随着支架降解进行,支架的体积逐渐变小且形态变得不规则,最终发生崩解。支架的质量因降解而变小,其中不同组分的复合支架其失重率存在差异,总体上复合材料支架的降解速率慢于高分子支架。从溶液酸碱度的变化中可以看出复合支架在降解过程中溶液p H变化幅度较小,其中以β-TCP相占比越多的复合材料p H值总体变化越小,说明磷酸钙陶瓷的同步降解可以在复合材料的降解中起到一定的“自缓冲”作用。从支架的微观结构上看,随着降解时间延长,支架内部的孔道孔径增大,孔隙率明显增加,有利于周围细胞组织完成替代修复。复合材料孔壁结构的维持还在一定程度上为组织长入提供框架结构,使成骨活动在材料表面进行,起到骨传导性的作用。第三部分:不同相组成CaPcs/PLGA复合材料支架的生物矿化性能研究。整个矿化过程中材料的总质量并不是一直上升,而是伴随着材料降解,总质量有升有降,其最终质量变化由降解进程和矿化进程协同作用。从矿化后的接触角测试结果看出矿化后材料的亲水性均比未矿化时明显提升（p<0.05）,即使是纯PLGA材料也在钙磷盐沉积的帮助下改善了原有的疏水特点,而复合材料的矿化效果要明显优于PLGA材料（p<0.05）,说明磷酸钙陶瓷可以帮助复合材料在模拟体液中形成类骨磷灰石层。通过SEM和EDS结果更为直观地看到材料表面矿物质沉积的形貌特征,并对沉积物的元素加以分析,结果证实了钙磷等元素的存在以及计算出沉积物的钙磷比,提示复合材料沉积物可能为类骨磷灰石及其衍生物。第四部分:不同相组成CaPcs/PLGA复合材料的体外细胞生物学评价。细胞黏附实验结果表明含有CaPcs的复合材料对细胞的黏附起到促进作用,提示复合材料具有良好的生物相容性。从细胞增殖实验比较,复合材料对细胞增殖的效果明显优于PLGA高分子材料,而在复合材料中含有β-TCP相的复合材料细胞增殖效果明显优于HA/PLGA,说明磷酸钙降解释放出的离子有助于成骨细胞的增殖。而细胞在BCP2/PLGA、BCP3/PLGA及β-TCP/PLGA材料表面的胞内钙离子浓度明显高于对照组,提示β-TCP相降解释放出的钙离子可以通过钙内流形式增加胞内钙离子积聚。在分别代表前中期分化标志的ALP活性和后期分化标志的钙结节沉积实验中,BCP3/PLGA表面的成骨细胞ALP活性最高,且钙结节沉积量最多,各组复合材料的诱导成骨细胞分化的能力均明显优于对照组（p<0.05）。通过实时定量PCR分析可见含有CaPcs的复合材料可以显着提高成骨相关基因的表达,而分析各时间点标志性基因的表达差异,可以得出结论富β-TCP相的复合材料（BCP3/PLGA）在成骨细胞分化进程中可以起到更好的持续促进作用。第五部分:不同相组成CaPcs/PLGA复合支架的体内骨缺损修复研究。通过Micro-CT对标本形态学进行表征和分析,复合材料在骨体积分数、骨表面积密度及骨小梁数量上均优于对照组,其中以BCP3/PLGA组修复效果最佳。组织学染色观察可见对照组新生骨组织仅存在于材料表面,内部仅有少量纤维组织,未见明显骨长入,而复合材料组均有不同程度的新骨长入,且材料内部可见肉芽组织和纤维性骨痂。其中BCP3/PLGA组不仅可以看到支架材料周围的新生密质骨,同时材料内部还可见疏松的编织骨,骨密度相对较高,但形态不规则。通过免疫荧光染色可以验证体外实验的结果,在所有组分中BCP3/PLGA组缺损区域荧光强度和覆盖面积均最佳,提示此材料可以有效促进OCN分泌,加速新骨生成。综上,在所有实验组中BCP3/PLGA组修复效果最为理想。结论:本研究通过化学合成法制备了不同物相组成的CaPcs,又利用相分离法合成了CaPcs/PLGA复合材料。通过对不同物相组成的复合材料降解性能、矿化性能、细胞功能及骨缺损修复的评价,结果证明复合材料对于骨缺损的修复能力并不是由某一性质决定,而是由材料降解、矿化、离子释放、骨结合力等多项指标共同作用。综上,BCP3/PLGA复合材料的性能可以更好地满足骨组织工程的需要,促进骨缺损的修复。
王佳[3]（2021）在《富血小板纤维蛋白对施耐德膜间充质干细胞成骨分化影响的机制研究》文中研究指明可用骨量不足是上颌后牙区牙列缺损的主要特点,常常给种植体常规植入带来困难。解决这一问题的主要方法是上颌窦底提升术,其原理是采用外科手术方法将上颌窦黏膜从窦底剥离后抬高,在黏膜与窦底骨壁之间植入骨移植材料。然而上颌窦内骨形成的模式一直存在争议,部分学者认为上颌窦内成骨方向是从上颌窦底壁向施耐德膜,而另有部分学者认为施耐德膜也具有成骨潜能,骨形成也可自施耐德膜向上颌窦骨壁发生,理由是上颌窦内牙齿摘除术或上颌窦囊肿摘除术后,可见施耐德膜附近新生的骨质;上颌窦底提升术术中不植入骨移植材料,术后随访仍可见种植体顶端有新骨形成。因此对于施耐德膜的成骨潜能的研究有助于人们了解上颌窦内的成骨模式,为临床中上颌窦底提升术应用新术式提供理论基础。施耐德膜因其固有层存在丰富的毛细血管及结缔组织,可作为间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）的来源。MSC具有自我更新和多向分化的能力,其作为种子细胞被广泛应用于组织工程中。在一定条件下,MSC可被诱导向成骨细胞分化,最终在一定的微环境中形成骨质。富血小板纤维蛋白（Platelet Rich Fibrin,PRF）富含大量促进骨组织再生愈合的生长因子,其致密的三维纤维网结构更是为细胞的长入提供了支架结构。但目前为止,从施耐德膜中分离培养并鉴定间充质干细胞,并以PRF刺激诱导其成骨分化的研究鲜有报道。因此,本研究拟分离培养鉴定施耐德膜间充质干细胞（Sinus Membrane derived Mesenchymal Stem Cells,SMMSCs）,并以PRF刺激诱导其成骨分化,深入探究成骨机制,而后将研究结果应用于临床中,以期为临床工作提供新的思路方法。本研究内容分为4部分实验展开:实验1 SMMSCs的分离培养与鉴定以酶消化法分离培养施耐德膜来源间充质干细胞,流式细胞术鉴定其表面标记物,碱性磷酸酶染色和活力检测,茜素红染色判断其成骨分化能力;油红O染色判断其成脂分化能力;3D悬浮培养,阿利辛蓝染色判断其成软骨分化能力。实验2 PRF对SMMSCs生物学行为的影响对PRF进行扫描电镜观察超微结构,分析其生长因子释放规律。采用CCK-8,RTCA,和细胞荧光染色评价PRF对SMMSCs增殖的影响;细胞划痕实验和Transwell实验评价PRF对SMMSCs迁移的影响;碱性磷酸酶染色和活力检测,茜素红染色,及q PCR评价PRF对SMMSCs成骨诱导分化的影响。通过Western Blot分析PRF对抑制和非抑制状态的ERK 1/2信号通路的调节作用,及其下游的成骨关键因子RUNX2的表达情况。实验3 PRF促进上颌窦内成骨的体内研究构建兔上颌窦底提升术模型,将不同骨移植材料植入上颌窦内,分别于术后第8,12周获取样本,Micro-CT进行影像学评估,判断新生骨量,骨体积分数,骨小梁数量,厚度和离散度。荧光双标记,HE染色,Masson染色,甲苯胺蓝染色等方法评价不同实验组的成骨效果。实验4以PRF为唯一植骨材料进行经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术的临床研究通过前瞻性临床研究,评价内窥镜辅助下以PRF为唯一植骨材料进行经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术（endoscope-assisted maxillary sinus floor elevation with platelet rich fibrin grafting and simultaneous implant placement,PESS）的临床效果,成功率,窦内骨生成量,边缘骨吸收量及骨密度。通过上述实验,得出以下结果:1.成功分离培养SMMSCs,其体外扩增能力强,细胞表面标记物阳性表达间充质干细胞标记物CD90,CD105,阴性表达CD34,CD45,SMMSCs具有成骨、成脂、成软骨多向分化的能力;符合MSC鉴定标准,可被定义为间充质干细胞。2.PRF为致密的三维网状结构,靠近血清侧细胞成分少,靠近红细胞侧,白细胞、血小板含量极为丰富,PRF缓释生长因子血小板衍生生长因子（Platelet-derived Growth Factor,PDGF）,转化生长因子（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）,血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）,并可持续释放长达14天;PRF内的生长因子能够刺激SMMSCs的增殖,迁移和成骨分化。PRF可通过上调ERK 1/2信号通路而促进SMMSCs成骨分化。3.PRF能够加速上颌窦内骨组织的形成,并能够增加新骨的形成量,骨移植区成骨标志因子表达明显升高。上颌窦内的成骨方向并不是单纯地自上颌窦底至施耐德膜下,施耐德膜的成骨潜能在此过程中具有一定的作用。4.在1年随访中,通过“PESS”可获得可观的窦内骨增量,种植体生存率高,边缘骨吸收量少,种植体周围骨密度随时间逐渐增加。“PESS”是一种微创、安全、有效的促进窦内新骨形成、缩短治疗周期、扩大经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术治疗适应症的临床方法。
刘鹏[4]（2021）在《含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究》文中提出由口腔颌面部肿瘤、创伤、先天性疾病以及炎症导致的骨组织缺损是口腔诊疗中的常见问题,同时也是口腔医生修复骨缺损时所面临的难题之一。颌骨缺损严重影响咀嚼、吞咽、语言等重要生理功能,骨缺损治疗效果不佳或骨缺损修复失败都会直接影响患者的生活质量。口腔种植修复是目前牙列缺失和牙列缺损的主要治疗方式。充足的骨量是保证种植成功的关键之一,但在复杂的咬合关系及不同的口腔环境影响下,牙齿缺失患者往往伴有不同程度的缺牙区牙槽骨萎缩,易引发种植失败的问题。自体骨虽被临床认为是骨移植的“金标准”,但第二术区的开辟造成的创伤较为严重,来源限制,无法随意塑形,且自体骨移植后会发生一定的并发症。异体骨也受限于原料需求和排异反应等造成价格昂贵,并且存在修复风险。“骨组织工程”概念的提出即是针对以上问题,提出的以种子细胞、细胞因子、支架为媒介代替传统的骨移植的治疗方法。利用骨修复材料与种子细胞及细胞因子的相互配合,实现骨缺损的高水平修复是针对较大骨缺损量的骨缺损治疗的必由之路。近年来随着细胞工程和基因编辑技术的发展,组织工程中种子细胞和细胞因子的研究取得了很大进展,骨组织工程里可选用的支架体系种类繁多,但其各自存在的无法避免的问题使得其应用仍然非常受限。例如,金属支架的生物惰性、力学不匹配、高分子材料降解速率可控性差、引发排异反应、传统陶瓷支架的脆性、较差的骨传导性等问题。寻找合适的材料体系,设计并制备出符合不同成骨需求的个性化支架,是骨组织工程在口腔颌骨修复从理念走向临床应用的关键。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是骨骼和牙齿组织中天然存在的无机矿物成份,由HA制备成的支架一直被骨组织工程修复领域所推崇。然而,实验室中常用的HA主要是Ca10（PO4）6（OH）2及其它形式的磷酸钙材料,这与骨组织中的HA结晶性差、存在多种离子的梯度取代、在不同骨位置的成份差异等的实际需求相差较大。在文献里已报道的应用中,未掺杂的纯HA存在脆性大、降解效果差、与新生骨组织存在界面等问题,仍然是限制其作为骨组织工程支架的瓶颈之一。如何设计并制备出具有与人体骨组织中的矿物相类似的仿生HA骨粉材料,并且根据不同部位的骨缺损需求,个性化订制骨修复材料,是推动骨组织工程在临床应用的关键。在骨骼和牙齿中的HA主要为存在金属离子梯度掺杂的碳酸根取代的HA,碳酸根的质量分数为3-8wt%,其中碳酸根主要取代磷酸根的晶体学位置,称为B-型羟基磷灰石。碳酸根取代可以使HA结晶度变差,结构更松散,从而有利于破骨和骨重建,其松散的结构更利于与胶原及其它蛋白的结合从而降低材料的脆性,使之具有更强的塑性。因此,开发出碳酸根取代的HA材料,实现碳酸根的浓度可控取代,对于从支架方面推动骨组织工程应用于口腔临床骨缺损治疗具有重要意义。稀土元素由于其特征的光谱性质,可作为生物材料的荧光标记物,尤其是其离子半径与Ca2+离子接近,有很多文献已将其应用于骨植入材料在体内演化情况的荧光标记。另外,也有文献报道低剂量的稀土离子掺杂不但可以调节HA的结晶度,而且还能通过缓释的稀土离子激活钙通道,从而促进间充质细胞向成骨细胞的分化。基于以上关于HA应用于骨组织工程支架的研究现状,我们提出以碳酸根的可控取代和稀土的可控掺杂为源头,制备出系列具有不通碳酸根和稀土离子含量的B-型羟基磷灰石仿生骨粉材料,采用3D打印的方式,将其制备成支架,在细胞和动物水平上评价其促成骨效果,为骨组织工程研究提供更接近于骨组织的可个性化订制的支架体系,从而推动解决口腔颌骨修复所面临的的复杂的成骨环境和特异性成骨需求的问题。本论文主要分为（1）材料设计与可控制备,（2）细胞水平评价小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化与关键蛋白表达,（3）动物水平评价新生骨组织形成、钙化及新骨在支架中的生长等三个部分,分别简述如下:（1）碳酸化及稀土掺杂的HA仿生骨粉的制备根据在生理环境下的钙离子、磷酸根离子、碳酸根离子的热力学平衡条件,利用Pourbaix计算并得到了B-型羟基磷灰石的矿化条件及调节参数,制备出了系列碳酸根取代的羟基磷灰石（carbonated hydroxyapatite,CHA）纳米材料,通过控制反应条件和初始碳酸根浓度,可调节产物HA中碳酸根的比例。在此基础上,将与Ca2+离子具有相近离子半径但是不同电荷的稀土离子掺杂进入HA及CHA晶格中,从而制备出系列稀土离子掺杂的HA及CHA材料。结构分析表明具有三角形构象的碳酸根阴离子在取代具有四面体构象的磷酸根离子时,以相对于c-轴呈30 o角的方式扭曲叠加在磷酸根四面体的一个较长P-O键参与的面上。随着碳酸化程度的增加,纳米棒的长径比从3.6降为2.9。稀土离子的种类可以影响B-型羟基磷灰石纳米棒的形貌,并且碳酸化并不会影响稀土在HA中的配位环境及发光性质。采用该方法得到的B-型羟基磷灰石材料与人体骨组织中的矿化成份接近,并且稀土元素可以均匀地掺杂在材料的晶格中,既可以利用其特征荧光光谱标记其在体内的变化过程,又可以作为潜在的成骨细胞分化促进剂来激活成骨过程,以实现更好的促成骨效果。（2）细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的HA材料的生物学性能选取HA、1mol%铕（europium,Eu）掺杂的HA（Eu-HA）、1mol%铽（terbium,Tb）掺杂的HA（Tb-HA）、碳酸根取代度为3.3wt%的羟基磷灰石（CHA）、1mol%Eu-掺杂的CHA（Eu-CHA）、1mol%Tb-掺杂的CHA（Tb-CHA）六组材料为代表,研究了它们对于MC3T3-E1细胞的形态、增殖及成骨分化的影响。采用三维打印机将以上材料打印成支架,通过系统的细胞增殖、分化及蛋白表达测试,评价其作为骨修复材料应用于骨组织工程的潜力。六组材料都是潜在的骨修复材料,其中Tb的掺入可促进MC3T3-E1细胞的黏附增殖,尤其是Tb-CHA,在ALP染色和定量、茜素红染色、成骨相关蛋白表达实验结果中,表现出了最佳的促成骨效果,明显优于Tb-HA、HA和CHA;Eu的掺入减缓了MC3T3-E1细胞的增殖、黏附及成骨分化。（3）稀土掺杂及碳酸根取代的HA支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究通过以上研究,我们发现在体外促进成骨细胞增殖、黏附和成骨分化方面,掺杂Tb的材料优于掺杂Eu的材料,CHA优于HA,故我们采用大鼠颅骨缺损模型,分别植入HA支架、Tb-HA支架、CHA支架和Tb-CHA支架材料,评价骨缺损的修复。经影像学及HE染色分析结果可知,术后4周,各组对骨缺损的修复均不明显。术后8周,空白对照组缺损处仅表现为少量的新骨形成,HA组未见明显愈合,Tb-HA可见缺损部位实现了一部分修复,HE染色切片可见新生骨;与HA组相比,CHA组对骨缺损进行了一定程度的修复;Tb-CHA组显示出最强的成骨效果,且可降低局部炎症反应。综上所述,本论文从应用于骨组织工程修复骨缺损支架的源头出发,通过对HA材料矿化机制的深入分析,设计并制备出了系列与人体骨组织成份最为接近的CHA材料,并且将稀土离子选择性地标记在HA结构的Ca1晶体学位置;采用3D打印技术,将模型材料打印成支架,分别在细胞水平上和动物水平上,通过系列实验手段检测了材料对MC3T3-E1细胞的增殖、分化能力、蛋白表达水平和新骨生长情况的影响,发现了碳酸根取代和稀土Tb3+离子掺杂都可促进HA材料的骨缺损修复效果。本论文的研究将从源头上把以HA为主的骨组织工程支架材料引导为碳酸根取代的HA和异价金属离子掺杂HA,利用这种碳酸根和稀土离子调控的成骨性能差异,借助3D打印设备,根据不同位置的成骨需要个性化的设计支架,订制具有不同成骨需求的支架材料,从而为像口腔颌面部骨组织这种复杂的骨缺损疾病提供个性化的修复植入材料。
林斌[5]（2021）在《3D打印多孔β-磷酸三钙掺镧支架用于骨组织修复的体外研究》文中进行了进一步梳理【目的】由肿瘤,炎症,外伤和手术引起的骨缺损严重影响患者的生活质量。直到今天,自体骨移植仍是治疗骨缺损的金标准。然而,由于供体来源以及免疫排斥的原因,其使用受到了限制,因而骨修复材料领域一直是骨移植治疗的热点。本人利用3D打印技术,并结合钙磷基生物陶瓷和镧元素的生物学效应,构建具备仿生结构的人工骨修复支架,期望赋予其骨诱导性、调控炎症微环境和抑制破骨细胞前体细胞分化的性能,从而具有重要潜力和研究价值,有望成为一种理想的人工骨修复支架。【方法】1.La-β-TCP支架的制备、物理表征、体外模拟降解实验及细胞毒性实验使用固相烧结法及3D打印方式制备x La-β-TCP支架,（x=0,1,3,5,x为La掺入的物质的量百分比,简称La-β-TCP）。对复合材料行X射线衍射（XRD）分析复合材料的物相构成及晶体结构,拉曼光谱分析的化学基团,扫描电镜观察（SEM）材料的表面形貌。材料浸泡于降解液中模拟体外降解,测量降解液中p H值,SEM观察表面结构变化,了解支架矿化能力,MTT实验进行支架细胞毒性检测。2.La-β-TCP支架对骨髓间充质干细胞成骨分化、巨噬细胞极化、破骨细胞分化的影响La-β-TCP支架浸提液与大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）共培养,1天和3天后使用CCK-8,活/死染色检测其对BMSCs增值活性的影响;浸提液处理BMSCs 7天和14天后,对成骨标志基因（Runx-2,Col I,OCN）的表达量进行检测;浸提液处理BMSCs 7天,10天后,使用ALP染色,ALP检测实验对成骨标志蛋白碱性磷酸酶表达量进行检测,浸提液处理14天后,使用茜素红染色了解支架浸提液对BMSCs矿化功能的影响;使用La-β-TCP支架浸提液处理RAW264.7细胞系,在第三天采用CCK-8试剂盒检测支架对RAW264.7细胞系增殖活性的影响;支架浸提液处理3天后对炎症相关基因（IL1,CD206,TNF-α,ARG-1）的表达量进行检测,使用ELISA试剂盒检测促炎因子（TNF-α）和抑炎因子（IL-4）的释放,使用流式细胞仪检测其表面抗原（CD86、CD206）;支架浸提液对RAW264.7细胞系干预5天后,对破骨细胞表型基因（TRAP）的表达量进行检测,使用抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒对破骨细胞特异性蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）进行检测。【结果】1.利用固相烧结法成功将La引入β-TCP的结构中,均引起相应的晶格膨胀,并应用3D打印技术成功制备孔隙大小基本一致,形态大小均一的La-β-TCP支架（x La-β-TCP,x=0,1,3,5）,且该支架体外模拟显示矿化良好,无隐藏毒性。2.通过全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs,在传代至第三代时,显微镜下细胞形态呈长梭形或三角形,集落成鱼群状分布,且流式分析提示细胞纯度较高,成骨、成脂诱导实验提示其具备定向分化能力。3.扫描电镜结果显示BMSCs可以很好地粘附在支架表面。4.利用支架浸提液对BMSCs和RAW264.7细胞进行干预后,CKK-8实验和活/死染色提示其生物相容性良好;ALP检测、ALP染色、茜素红染色以及RT-PCR实验表明La-β-TCP支架具有较好的成骨性能。5.利用支架浸提液对RAW264.7细胞进行干预后,RT-PCR、ELISA和流式细胞仪检测显示,随着La的掺入,La-β-TCP支架具备抑制RAW264.7细胞向M1表型极化,并促进其向M2表型同时抑制其释放炎症因子TNF-α的生物学性能。6.利用支架浸提液对RAW264.7细胞进行干预后,RT-PCR和TRAP检测实验提示掺La的β-TCP支架具备调控巨噬细胞向破骨细胞分化的能力。【结论】利用3D打印技术结合固相烧结法成功制备La-β-TCP支架（x La-β-TCP,x=0,1,3,5）,该支架生物相容性良好,不仅具有较高的诱导大鼠BMSCs成骨分化能力,且其具备一定的抑制炎症和抑制破骨细胞生成的作用。
李俊刚[6]（2021）在《3D打印掺钴生物陶瓷支架介导成骨-成血管偶联促进骨修复的作用研究》文中研究表明第一章Co（0、1、2.5、5、10）支架的制备、表征及细胞毒性检测目的:制备不同掺钴量CLP多孔生物陶瓷支架Co（0、1、2.5、5、10）,研究不同掺钴量对CLP结构、物理特性及化学特性影响,检测五种支架细胞毒性进行生物相容性的初步筛查。方法:（1）利用固相烧结法合成不同掺钴量的生物陶瓷粉体,使其满足Ca（10-x）CoxLi（PO4）7（x=0、0.1、0.25、0.50、1）;利用三维打印技术（SE-3DP）制备多孔生物陶瓷支架Co0、Co1、Co2.5、Co5、Co10;（2）通过XRD检测、Raman检测和SEM观察对Co（0、1、2.5、5、10）支架进行表征;（3）万能实验机进行Co（0、1、2.5、5、10）支架的抗压强度测试;（4）SEM和XRD分析Co（0、1、2.5、5、10）支架浸泡入模拟体液后的体外矿化性能;（5）对比Co（0、1、2.5、5、10）支架浸泡入Tris-HCL前后质量和Tris-HCL溶液pH值变化评价支架的体外降解性能;（6）MTT法检测Co（0、1、2.5、5、10）支架的细胞毒性。结果:（1）钴掺杂使CLP的颜色由白色变为紫色。当钴掺杂量为1 mol%时,Co10支架颜色发生明显的突变;（2）XRD分析示:随着钴离子掺杂量的增加,CLP特征衍射峰逐渐向右发生了整体偏移;Raman光谱分析示,随着钴离子掺杂量的增加,Raman偏移向右移动,晶格常数变小;SEM观察示:Co（0、1、2.5、5）支架表面的晶粒大小随着钴离子掺杂量的增加而逐渐变小,而Co10支架表面没有晶粒形貌出现,出现了微裂纹;（3）随着钴离子掺杂量的增加,Co（0、1、2.5、5、10）支架的抗压强度呈现出逐渐降低的趋势,当钴离子掺杂浓度为1 mol%时,Co10支架抗压强度急剧降低,与Co（0、1、2.5、5）支架相比,差异有统计学意义（P<0.05）;（4）Co（0、1、2.5、5）支架在体外都发生了矿化,XRD检测示羟基磷灰石相,而Co10支架未发生矿化;（5）随着钴掺杂量的增加,Co（0、1、2.5、5、10）支架的失重总体成上升趋势;各组Tris-HCL溶液pH值随着降解时间的延长,总体表现为增长趋势;（6）Co（0、1、2.5、5）支架对L929细胞无毒性,而Co10支架对L929细胞有明显的细胞毒性。结论:（1）Co2+成功的掺杂进入CLP晶体结构中,取代了部分Ca2+。Co2+的掺杂对CLP结构带来明显影响,掺杂量越大,影响越明显,尤其钴掺杂量为1 mol%时,Co10支架结构发生明显突变;（2）Co（1、2.5、5）支架的抗压强度虽然有所降低,但仍在人类骨小梁抗压强度范围内,可以承受外部压力,抵抗断裂;（3）Co（0、1、2.5、5、10）支架体外都可以发生一定程度的降解;（4）Co（0、1、2.5、5）支架体外发生矿化,而Co10支架体外未发生矿化;（5）Co（0、1、2.5、5）支架无细胞毒性,而Co10支架有细胞毒性。第二章Co（0、1、2.5、5）支架生物相容性的研究目的:研究Co（0、1、2.5、5）支架及浸提液对rBMSCs粘附、增殖的影响。方法:（1）采用全骨髓贴壁法分离、培养SD大鼠原代BMSCs,并传代培养,通过细胞形态观察、细胞表面分子CD44、CD45、CD20和CD90流式检测及多向分化对所提取的原代BMSCs进行鉴定;（2）制备Co（0、1、2.5、5、10）浸提液,ICP-OES检测各组浸提液中离子组成及浓度;（3）Co（0、1、2.5、5）浸提液与rBMSCs共培养,在预设时间点行CCK-8检测和活/死细胞染色检测;（4）Co（0、1、2.5、5）支架与rBMSCs共培养,在预设时间点行CCK-8检测、SEM和CLSM检测。结果:（1）P0-P7 rBMSCs呈长梭形、成纤维样细胞形态,细胞排列呈“旋涡”状,P7rBMSCs细胞形态未见明显改变,仍保持良好的生长状态。细胞表面分子CD29、CD90、CD44和CD45经流式细胞仪检测阳性率依次为99.77%、99.36%、99.77%、0.88%。rBMSCs经体外成骨诱导后ALP染色、茜素红染色阳性,经成脂诱导后,油红O染色阳性;（2）Co（0、1、2.5、5、10）浸提液分析:Co（1、2.5、5、10）浸提液中都释放了一定量的Co2+,且Co2+的释放量随着Co2+掺杂量的增加而增加,而Co0浸提中未检测到Co2+。此外,Co（0、1、2.5、5、10）浸提液中都保持相对稳定的Ca2+和Li+释放量。（3）随着培养时间的延长,各组浸提液均可促进rBMSCs的增殖,其中Co2.5浸提液促rBMSCs增殖趋势显着,而Co5组在每个时间点其增殖趋势均低于Co（0、1、2.5）组,差异有统计学意义（P<0.05）。Co（0、1、2.5、5）在各个时间点以绿色活细胞为主,而红色死细胞数量极少。随着Co（0、1、2.5、5）浸提液培养rBMSCs时间的延长,各组死细胞视野稍增多,Co5组最多;（4）随着培养时间的延长,各组支架均可促进rBMSCs的增殖,在共培养5 d和7 d时,Co（0、1、2.5、5）四种支架中,Co2.5支架促rBMSCs增殖显着,与Co（0、1）支架表面的细胞形态无明显差异,呈典型的成纤维状,丝状伪足丰富,而Co5支架表面rBMSCs细胞数量相对较少,伸出伪足少;CLSM观察示:rBMSCs在Co（0、1、2.5、5）支架上细胞形态规则,呈典型的长梭形,胞体伸展,伸出长短不一的伪足与周围邻近细胞相连。结论:（1）采用全骨髓贴壁法成功分离、培养出了rBMSCs;（2）随着共培养时间的延长,Co2.5浸提液及支架显着促进了rBMSCs粘附、伸展及增殖,显示出良好的生物相容性。第三章Co（0、1、2.5、5）支架体外促成骨性能的研究目的:探讨Co（0、1、2.5、5）支架促rBMSCs成骨分化的能力。方法:（1）制备培养rBMSCs的Co（0、1、2.5、5）浸提液;（2）在不同预设时间点通过ALP染色和ALP活性检测,茜素红染色和钙含量检测,western blot检测ALP、BMP-2、RUNX2及OCN成骨分化相关蛋白的相对表达水平,评估Co（0、1、2.5、5）支架促rBMSCs成骨分化能力。结果:（1）Co（0、1、2.5、5）各组浸提液诱导rBMSCs 7 d时,各组细胞均被染成深蓝色。随着各组浸提液诱导时间延长,各组在第14 d的ALP染色强度要显着高于第7 d,呈蓝黑色,其中,Co2.5组的染色强度明显强于其他组;诱导7d时,Co（0、1、2.5、5）各组ALP活性均低于OM组,差异有统计学意义（P<0.05）,诱导14 d后,Co2.5组ALP活性显着增加,与其它组相比差异有统计学意义（P<0.05）;（2）在诱导21 d后,Co（0、1、2.5、5）各组浸提液均可见较多的红色或橘红色钙化结节形成。Co2.5组的钙含量要显着高于Co（0、1、5）组,差异有统计学意义（P<0.05）,稍低于OM组的钙含量,两者之间差异无统计学意义（P>0.05）;（3）在诱导14 d时,Co2.5组ALP蛋白和BMP-2蛋白的表达量最高,与Co（0、1、5）组相比差异有统计学意义（P<0.05）。虽然不同掺钴水平组间OCN表达差异不显着,但Co2.5组OCN蛋白表达显着高于Co0组,差异有统计学意义（P<0.05）。RUNX2蛋白在Co2.5组表达量高于Co（0、5）组,略低于Co1组,但两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:Co（0、1、2.5、5）浸提液均可促进rBMSCs成骨分化、分泌细胞外基质,并使分泌的细胞外基质发生钙化,Co2.5组促rBMSCs成骨分化性能最优。第四章Co（0、1、2.5、5）支架体外诱导血管形成性能的研究目的:探讨Co（0、1、2.5、5）支架模拟低氧环境的生物学功能及促进HUVECs增殖和成管效果。方法:（1）制备培养HUVECs的浸提液;（2）CCK-8法检测Co（0、1、2.5、5）浸提液对HUVECs增殖的影响;（3）体外成管实验检测Co（0、1、2.5、5）浸提液促HUVECs迁移、成管的效果;（4）Western blot检测Co（0、1、2.5、5）浸提液对HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达水平的影响。结果:（1）随着培养时间的延长,Co（0、1、2.5、5）浸提液均可促进HUVECs的增殖,培养7d时,Co2.5组显着的促进了HUVECs增殖,紧接着依次为Co1组,Co0组和Co5组,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Co2.5组比Co（0、1、5）组保持了较好的管状结构。从分支总长度和分支数量的定量分析可以看出,在每个时间点,Co（1、2.5、5）组的数值均高于Co组,尤其是Co2.5组,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）与Co0组相比,Co（1、2.5、5）组HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达量均显着上调,差异有统计学意义（P<0.05）。在Co（1、2.5、5）之间,Co2.5组显着提高了HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的表达量。结论:Co（0、1、2.5、5）浸提液均可促进HUVECs增殖、迁移及出芽形成血管样结构,Co2.5组比Co（0、1、5）组形成的血管样结构数目相对较多,结构形态完整;与Co0组相比,Co（1、2.5、5）稳定了rBMSCs表达HIF-1α蛋白水平,模拟低氧环境,进而上调VEGF蛋白表达,促进血管形成,其中Co2.5组诱导血管形成性能最优。第五章Co2.5支架修复颅骨缺损的研究目的:探讨Co2.5支架修复大鼠颅骨缺损的可行性,评价其体内促新骨生成和血管形成能力。方法:（1）18只SD大鼠制备单个直径5 mm颅骨缺损模型;随机分为三组:空白组、Co0组和Co2.5组,每组6个颅骨缺损（n=6）;术后8 w取颅骨标本;（2）通过大体观察颅骨缺损情况,micro-CT分析BV、TV和BMD,以及HE染色、Masson染色和免疫组化染色（Col-Ⅰ和CD31）评价Co2.5支架促进新骨生成及血管形成的程度。结果:（1）术后Co0组有1只SD大鼠因麻醉药过量致死,立即给予补足;所有SD大鼠的切口愈合良好,无红肿、渗出、流脓及皮肤破溃和坏死;（2）Micro-CT分析示:Co2.5组的BV/TV大于Co0组和空白组,组间差异有统计学意义（P<0.05）。各组BMD由高到低依次为Co2.5组、Co0组及空白组,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（3）HE染色分析示:各组新骨形成面积百分比由高到低依次为Co2.5组、Co0组以及空白组,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;Masson染色示:在空白组缺损边缘可见少量未成熟新生骨组织,Co0组和Co2.5组以成熟的新生骨组织为主,并且Co2.5的新生骨量要明显多于Co0组;（4）CD31免疫组化分析示:Co0组和Co2.5组血管数目多于空白组,差异有统计学意义（P<0.05）;Co2.5组血管数多于Co0组,差异有统计学意义（P<0.05）;Col-Ⅰ免疫组化分析示:空白组Col-Ⅰ为阴性表达;Co0组Col-Ⅰ为阳性表达;Co2.5组Col-Ⅰ为强阳性表达。结论:Co2.5支架可显着促进体内新骨生成和血管形成,促进大鼠颅骨缺损骨修复的能力显着优于Co0支架和空白组。
刘家川[7]（2021）在《锌离子刺激巨噬细胞分泌的外泌体对内皮和成骨细胞功能的影响》文中研究指明新骨和血管生成对于植入体骨整合都至关重要,且二者均受到巨噬细胞的免疫调控。纯锌（Zn）及其合金是一种新型的可降解生物材料,其腐蚀产物Zn离子可调节巨噬细胞的功能。外泌体是细胞内通讯的新型载体,然而巨噬细胞源性外泌体是否参与Zn离子介导的巨噬细胞免疫调节过程仍不明确。本课题首先采用不同浓度的Zn离子刺激巨噬细胞,并通过超速离心法提取相应上清液中的巨噬细胞外泌体。之后利用扫描电子显微镜和蛋白质印迹（Western blot）两种方式对外泌体进行了鉴定。最后将提取的不同组别的外泌体孵育内皮与成骨细胞,评估了Zn离子作用下巨噬细胞源外泌体对两种细胞形态、骨架、黏附能力等,以及对内皮成血管和成骨分化能力的影响。综合本论文工作,所取得的研究结果如下:（1）低浓度的Zn离子对巨噬细胞的增殖有促进作用,但各组间无显着差异。当Zn离子浓度达到500μM及以上时表现出细胞毒性。Zn离子刺激对巨噬细胞形态无显着影响,但会下调巨噬细胞M1和M2表型相关基因的表达。（2）通过SEM形貌观察和蛋白质免疫印迹检测手段确认从Zn离子刺激巨噬细胞所提取的细胞外囊泡为外泌体。外泌体在SEM下呈圆球型,其尺寸主要分布在30～150nm之间。外泌体EDS检测结果显示Zn离子对巨噬细胞外泌体的分泌无显着影响,但会增加外泌体中的Zn含量。（3）巨噬细胞源性外泌体可被内皮细胞摄取。无Zn离子刺激的巨噬细胞分泌的外泌体对抑制内皮细胞的迁移能力无显着性影响,而Zn离子刺激巨噬细胞后分泌的外泌体会促进其成血管能力,对内皮细胞的黏附、NO合成和VEGF的分泌有促进作用,其中Exo-Zn20组效果最为明显。（4）巨噬细胞源性外泌体可被成骨细胞摄取。外泌体可以促进成骨细胞活性,上调碱性磷酸酶的活性,同时对成骨细胞的Ⅰ型胶原分泌有促进作用,其中Exo-Zn4组效果最为明显。本研究表明,Zn离子刺激巨噬细胞分泌的外泌体可促进内皮细胞迁移（血管生成的关键步骤）并上调成骨细胞分化的早期标志物成骨细胞ALP活性,促进Ⅰ型胶原分泌,从而丰富了巨噬细胞的免疫调节机制。
孙嘉阳[8]（2021）在《生物矿化技术修饰的磺化聚醚醚酮材料对骨缺损修复的研究》文中研究指明骨缺损是骨科常见疾病,当骨缺损长度达到损伤骨直径的2-2.5倍时去,缺损骨组织很难自行愈合,这种大块骨缺损称之为临界骨缺损（CDS）。骨肿瘤、先天性骨质畸形、创伤或病理性骨折、感染等一些常见骨科疾病都可能导致CSD的发生,甚至进一步导致骨关节炎或其他疾病损害人体正常的肌肉骨骼系统。当临界骨缺损发生时,临床最常用的治疗方式就是通过骨移植治疗。骨移植的金标准是自体骨移植,只有自体骨移植才能达到骨移植材料最理想的性能,包括骨传导、骨诱导和成骨三方面。然而,自体骨移植需要对患者造成额外的手术创伤,这种创伤不仅对患者造成不亚于骨移植手术本身的痛苦感受,还存在手术部位出血、感染等手术并发症,并且我们能够取得的自体骨数量也极为有限,这使得骨缺损的形态和功能重建仍然面临着巨大的挑战。全世界每年有超过200多万患者接受骨科骨移植手术,如何避免骨缺损的发生和选择适合的骨缺损填充物成为了我们骨科医生临床和科研的重要课题,而骨组织工程学也应运而生。传统骨缺损修复材料与现代骨缺损修复材料不断在过去的几十年工作中不断被研究发展,但依然有着各自的优势与劣势。而新兴的组织工程骨与复合材料也有着需要不断改进与探索的必要。聚醚醚酮是一种具有良好热塑性的线性芳香族高分子化合物,具备耐辐射、耐磨、耐疲劳等优势。聚醚醚酮材料的透光性、耐磨性及与人体骨相近似的力学特性早已被骨科、神经外科、口腔医学科广泛关注,其制作的材料也已经应用于临床工作中。然而聚醚醚酮的生物惰性不利于细胞粘附,导致其骨传导与骨整合能力极差。而理想的人体骨缺损修复材料在植入体内后不仅是简单的占位与支持作用,还能够调控细胞行为向成骨方向分化诱导,促进骨缺损的本体修复。聚醚醚酮的生物惰性也就成了制约其成为理想骨缺损修复材料的最大限制。因此,如何提高PEEK的生物活性,提高其骨整合性已成为PEEK作为骨缺损修复材料的研究热点。本实验通过持续三氧化硫熏蒸法获得可控磺化程度的磺化聚醚醚酮,并应用SBF生物矿化液选择不同矿化pH值、矿化时间与SBF矿化液浓度进行生物矿化,成功制备出表面含有复合了多种CaP矿化层的磺化PEEK材料。首先对由三氧化硫持续熏蒸法得到的磺化PEEK进行材料本体表征、磺化程度、力学性能、细胞增殖、细胞粘附、细胞外基质测定;然后对获得的生物矿化后的磺化PEEK进行材料形貌电镜扫描、力学性能评定、细胞增殖、粘附能力测定、成骨相关染色测定及成骨基因表达测定;最后应用大鼠颅骨缺损模型,验证材料的生物相容性及对骨缺损区域成骨的效果进行评估。通过上述研究,证明了通过生物矿化技术修饰的磺化PEEK具有良好的生物相容性、力学性能及成骨诱导能力。为骨修复材料提供了新的研究方向。第一部分:拥有拓扑形貌的磺化聚醚醚酮的制备与体外生物学研究本章通过在85℃条件下,应用缓慢滴加浓硫酸与过量五氧化二磷反应持续生成三氧化硫蒸汽熏蒸获得拥有表面孔隙结构的磺化PEEK,通过控制熏蒸时间控制磺化程度,将反应时间分为15分钟、30分钟、60分钟、90分,对应的磺化PEEK也分为SPEEK15、SPEEK30、SPEEK60、SPEEK90四组。其拉伸强度较磺化前无明显统计学差异,说明熏蒸法处理并不影响材料的力学强度;细胞增殖与粘附能力较未处理的空白组PEEK有所改善。经过脱细胞处理后的细胞外基质对细胞增殖与粘附有明显改善作用,这也说明磺化处理后的材料表面有利于细胞外基质等物质的附着,对细胞的生长与增殖起到积极作用。其中熏蒸30分钟组在体外生物学实验中表现最优。第二部分:生物矿化技术修饰的磺化聚醚醚酮的制备与体外生物学性质研究通过不同生物矿化液浓度（1倍、5倍、10倍）、pH值（5.4、6.4、7.4、8.4）及矿化时间（2h、4h、6h、12h、24h、2d、7d、14d、21d）的分组制备,获得了不同矿化程度共计108组。现进行电镜扫描明确矿化程度后,保留矿化液5倍pH为6.4、7.4时间为14d的2组及矿化液10倍pH为6.4、7.4时间为14d的2组共计4组为矿化程度良好。然后进行EDX测定明确材料表面Ca/P比;对其进行力学研究及细胞粘附、成骨诱导、染色等测定。结果表明,通过生物矿化技术修饰的磺化PEEK具有良好的生物相容性、力学性能及成骨诱导能力,其性能较单纯磺化处理的PEEK明显增强。其中pH值7.4时多得到的矿化物质对细胞的促进作用最佳。第三部分:生物矿化技术修饰的磺化聚醚醚酮体内骨修复研究本章将第一部分的空白组PEEK、单纯磺化30分钟组、第二部分的2个pH值为7.4的分组用于体内骨修复研究。将各组材料修剪为直径5mm,完全填充于大鼠颅骨缺损模型中,通过Micro-CT三维重建及组织学分析,评价各组在骨修复过程中的成骨效果。结果表明,新生骨组织沿PEEK片表面延伸爬行。8周后,经生物矿化修饰的4组磺化PEEK均有较好的成骨表现,其中矿化液pH值7.4、矿化时间14d时的两组骨修复效果最佳,与体外细胞实验结果一致。这种两次修饰方法获得明显生物相容性提高的制备方法为骨修复材料提供了一个新的方向。
胡海峰[9]（2021）在《骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制研究》文中研究表明目的:骨折是常见的创伤性疾病,并且随着老龄化程度的加深,骨折的患病率逐渐上升,大约10%的骨折病例中会出现骨延迟愈合甚至骨不连等并发症。临床上对于此类并发症早有治疗手段,但是并没有统一的标准并且治疗效果个体差异很大。自体和血管化骨移植已被用于治疗骨折延迟愈合以及骨不连,但是治疗成本高在很大程度上限制了其应用,并且治疗效果因人而异。同时这类治疗方式恢复时间长、治疗成本高也是其临床广泛应用受限的因素。目前,骨组织修复及自愈的机制尚未得到完全的揭示,越来越多的研究重点转向有促进组织修复及再生能力的干细胞来源的囊泡上,囊泡是细胞内储存、运输以及消化产物及代谢废物的中间体,其中的miRNA作为一种良好的生物标志物在疾病进展及疾病治疗中发挥了巨大的作用,引起了极大的关注,本研究的目的首先培养骨髓间充质干细胞、分离鉴定其胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）、采用小鼠作为研究动物构建骨折模型用于后续研究,然后探讨骨折动物模型在来源于骨髓间充质干细胞分泌的囊泡（bone extracellular vesicles,B-EVs）刺激下差异表达的miRNA,并对其在骨折中的作用机制展开研究,以期为骨折的愈合及治疗提供更多帮助。方法:一、胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）的分离鉴定及骨折小鼠模型的构建:1.研究使用C57BL/6小鼠以及实验室改造完成并正常繁育饲养的C57BL/6 CD9-/-遗传型小鼠进行构建骨折模型;所用细胞为小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）。2.从培养4-6代的BMSCs中提取B-EVs,通过透射电镜、Western Blot以及纳米粒径分析仪鉴定E-BVs的形态、特异性蛋白（CD11b、CD 45、CD29以及CD90）的表达情况以及粒径大小;3.野生型（wild type,WT）和CD9-/-C57BL/6小鼠中使用C形工具施加三点弯曲产生横向股骨干骨折,在建模结束后的0、1、2、3、4周,对小鼠骨折模型骨愈合情况进行分析,通过高分辨SKYSCAN进行活体显微影像学分析、计算机断层扫描骨密度等进行分析,验证小鼠骨折模型。二、EVs干预下骨折小鼠模型中差异miRNA的鉴定:1.分组:使用第一章构建的小鼠模型进行研究,对小鼠进行进一步的分组,分别为WT+NC组（GW4869干预后,EV-NC注射的WT小鼠）、WT+EVs组（注射B-EVs的WT小鼠）、WT+EVs-Mock组（注射B-EVs的WT小鼠预先转染miR-335抑制剂NC）、WT+EVs-Inhibitor组（WT小鼠注射B-EVs预先转染miR-335 Inhibitor）;CD9-/-小鼠分别分为:CD9-/-+NC组（CD9-/-小鼠注射GW4869干预后的EV-NC）、CD9-/-+B-EVs组（CD9-/-小鼠注射B-EVs）、CD9-/-+EVs-Mock组（CD9-/-小鼠注射B-EVs预先转染miR-335 Inhibitor NC）、CD9-/-+EVs-Inhibitor组（CD9-/-小鼠注射B-EVs前转染miR-335抑制剂）。2.EVs的注射时间及剂量:各组小鼠均于骨折后第1天和第8天在骨折部位注射EVs 100μL或外泌体抑制剂GW4869作用下的EV-NC 100μL;3.使用p CDH质粒通过慢病毒转染建立过表达miR-335-inhibtor和EVs-Inhibitor的稳定骨细胞系;4.骨折建模后2周切取WT小鼠和CD9-/-小鼠股骨,将组织在4%缓冲多聚甲醛中固定48 h,随后用缓冲EDTA进行脱钙处理。5.免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2,BMP2）;6.RT-q PCR检测差异表达miRNA的表达水平;7.放射免疫沉淀试验分析提取总蛋白;8.微阵列检测差异表达3只WT+PBS治疗的小鼠和3只WT+B-EV治疗的小鼠miRNA;9.通过SPSS21.0进行统计分析。Kolmogorov—Smirnov检验数据是否呈正态分布。测量数据以平均值±标准差表示。两组间比较应用t检验,多组采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）,ANOVA分析后成对比较采用Tukey多重比较检验。三、microRNA-335通过囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）和典型Wnt/β-catenin通路（Canonical Wnt/β-catenin pathway,Wnt/β-catenin）促进骨折恢复:1.MTT检测成骨细胞样细胞MC3T3和MG63的活力;2.Tunel及Alizarin red检测成骨细胞样细胞MC3T3和MG63细胞凋亡,未分化的ADSCs（无细胞外钙沉积）呈微红色,而ADSC来源的成骨细胞（有细胞外沉积）呈亮橙红色;3.碱性磷酸酶染色检测培养小鼠骨细胞,使用AP染色液进行染色,使用光学显微镜对红染细胞集落与无色集落进行计数,荧光显微镜下观察细胞;4.依据Lipofectamine 2000的说明书,将质粒分别与mimic NC或mimic miR-335共转染HEK293T细胞。使用Dual-Glo?双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-335和Vapb之间的结合关系;5.RNA pull down检测蛋白作用关系,使用识别RBP的一抗来检测目标RBP与适当的第二抗体一起孵育以识别第一抗体,并使用增强型化学发光检测信号;结果:一、EV的分离鉴定及骨折小鼠模型的构建:1.首先我们对购买的鼠BMSCs细胞进行鉴定,荧光显微镜分析成骨细胞标志酶及流式细胞分析特异性抗体均证实了细胞的正确性;2.BM-MSCs细胞中提取EVs,通过纳米粒径分析、透射电镜分析及Western Blot分析结果证明分离得到的B-EVs的正确性,可以用于本研究;3.两组小鼠在建模前即可检测时,野生型小鼠的体重和骨密度无显着差异,CD9-/-小鼠胫骨生长板的宽度显着减少,野生型小鼠在骨折后2周通过骨痂形成表现出软骨内骨化,3周时骨愈合明显,与野生型小鼠相比,CD9-/-小鼠表现出骨折愈合的显着延迟。骨折后3周CD9-/-小鼠骨愈合率为25%,明显低于野生型小鼠,表明与野生型小鼠相比,CD9-/-小鼠的愈合能力下降;二、EVs干预下骨折小鼠模型中差异miRNA的鉴定:1.HE染色显示B-EV处理促进了骨组织的形成,甲苯胺蓝染色显示B-EV处理增加了软骨组织,BMP2免疫组化显示B-EV处理促进了成骨细胞的分化和骨折的恢复;EVs对CD9-/-小鼠的治疗作用明显低于WT小鼠;2.与WT小鼠相比,EV处理后的CD9-/-小鼠软骨组织中73个miRNA下调,104个miRNA上调,挑选差异表达最显着的miR-335、miR-136、miR-125a、miR-217、miR-487a、miR-339、miR-298和miR-133a进行后续实验;3.EvimiRNA在线预测网站上分析miR-335的分布,结果发现,miR-335在骨髓间充质干细胞中含量丰富,我们推测miR-335可能在骨折的修复中发挥作用。4.外泌体抑制剂GW4869对B-EVs的分泌无明显影响;5.HE染色、甲苯胺蓝染色及BMP2免疫组化结果显示B-EV中miR-335对小鼠骨折恢复具有促进作用;三、microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复:1.MTT方法检测了成骨细胞MC3T3和MG63细胞的增殖率,结果发现EVs的处理促进了细胞增殖。TUNEL染色结果显示,EV处理可抑制细胞凋亡;2.F-actin的免疫荧光染色观察了MC3T3和MG63细胞的细胞粘附,发现B-EV处理对细胞粘附无明显影响;3.人I型胶原蛋白（Human type I collagen,ColⅠ）的免疫荧光染色证明B-EVs促进ColⅠ表达,与茜素红染色结果一致。RT-q PCR和western blot分析验证B-EV处理可增加α-SMA、OCN、GDF-10和FGF-2的水平;4.RT-q PCR显示EVs-Inhibitor处理后miR-335表达明显下降,并伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加。而且,ALP、茜素红和ColⅠ免疫荧光染色发现,B-EVs携带的miR-335的干预部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用;5.囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）能促进破骨细胞的生长,因此我们重点研究了Vapb,HEK293T细胞中的双荧光素酶报告基因检测显示miR-335可以靶向Vapb;6.RT-q PCR和western blot分析检测小鼠和细胞中Vapb水平。结果显示,EV处理抑制了Vapb水平,而miR-335抑制可以缓解Vapb的抑制;7.miRwalk、Target Scan、EvimcrRNA和Starbase的网站上预测并筛选了miR-335的7个靶基因（SMARCA2、Vapb、NAA25、KLHL28、NUCKS1、RCC2和RBFOX2）,通过文献调研,我们发现囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）能促进破骨细胞的生长。使用RT-PCR和western blot鉴定过表达Vapb细胞的构建情况,RT-q PCR显示,转染后细胞中Vapb mRNA的表达明显增加,使用western blot在蛋白中观测到了相似结果;MTT检测细胞活力及TUNEL染色检测细胞凋亡的结果表明,过表达Vapb细胞的细胞伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加,表明Vapb过表达诱导细胞凋亡;Vapb过表达部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用。8.过表达Vapb可逆转EVs对Wnt和β-catenin蛋白表达的促进。提示EVs中靶向Vapb的miR-335可能与Wnt和β-catenin通路有关。结论:1.本研究成功的构建野生型小鼠及CD-9-小鼠骨折模型并从骨髓间充质干细胞中成功分离得到囊泡,其有助于小鼠骨折的愈合。2.骨髓间充质干细胞来源囊泡中miR-335促进成骨细胞分化及骨组织生成。3.miR-335靶向Vapb,囊泡干预组的细胞中过表达Vapb抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,减弱了囊泡促进成骨细胞分化作用。4.髓间充质干细胞来源囊泡中的miR-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折愈合。本研究可能为骨折治疗提供见解。
贾凌璐[10]（2021）在《PSAT1对牙周膜干细胞成骨分化的促进作用及机制研究》文中研究指明背景与目的先天畸形、外伤、肿瘤、牙周病等都可能造成口腔骨组织缺损,给患者带来极大的痛苦。近年来,口腔骨组织工程技术飞速发展,它将种子细胞、支架材料、生长因子三大要素有机结合,尽量避免了传统治疗方法的痛苦大、疗程长、治疗效果有限等弊端,促使已丧失的口腔骨组织进行修复与再生,是极具潜力的骨组织再生新方法。具有自我更新与多向分化能力的干细胞是口腔骨组织工程种子细胞的主要候选细胞。近年来,口腔组织来源的间充质干细胞如牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）、牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）、牙龈间充质干细胞（gingivalmesenchymal stemcells,GMSCs）等,因可以在医疗废物中获取、具有较强的成骨分化能力而备受关注。特别是PDLSCs,被证实具有优良的增殖、成骨分化、抗凋亡、免疫调控等能力,且在组织来源上与牙槽骨、颌骨联系更加紧密,因而在口腔骨组织工程中更具有应用优势。目前,基于PDLSCs开展的骨再生研究已经在犬、猪、鼠等动物的口腔骨缺损模型及人牙槽骨缺损病例中取得了一定的新骨形成效果,但不可否认的是其距临床期望仍有一定差距。因此,进一步增强PDLSCs的成骨分化能力、提高PDLSCs介导的骨组织再生效果,是口腔骨组织工程研究的关键问题。阐明PDLSCs成骨分化的内在分子调控机制,可以为深入理解干细胞的生命活动特征、靶向增强PDLSCs的成骨分化能力提供理论基础。除了经典的成骨分化调控因子外,越来越多的新蛋白、长链非编码RNA、microRNA等被证实参与了成骨分化调控网络;还有学者指出口腔组织来源的干细胞由于其发育的特殊性,可能存在与其他部位来源的干细胞不同的成骨分化调控机制。总之,目前人们对干细胞成骨分化调控网络的了解依然有限,有必要进一步深入探究PDLSCs成骨分化的分子调控机制,从而为靶向增强PDLSCs介导的骨组织再生效果提供新思路。为此,本研究前期利用基因芯片技术和生物信息学分析手段,对PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化前后差异表达的基因进行了综合分析及比较,再经过初步的功能验证后,筛选出可能在PDLSCs的成骨分化过程中发挥调控作用的基因 PSAT1。基因PSAT1编码的蛋白为磷酸丝氨酸转氨酶1（phosphoserinetransaminase 1,PSAT1）,是一种具有酶活性的蛋白质,催化丝氨酸的生物合成反应。近年来的研究发现,除了影响丝氨酸合成外,PSAT1还参与了机体多项生命活动的调控,如影响小鼠体细胞胰岛素敏感性、影响肺细胞的胶原合成、调控肿瘤细胞的增殖与侵袭等。近期的几项研究证实了 PSAT1与小鼠胚胎干细胞的分化时机调控和小鼠成骨细胞的生物矿化有关,这提示PSAT1可能对干细胞这一特殊细胞类群有调控作用。然而,目前关于PSAT1对干细胞成骨分化调控作用及机制的报道寥寥无几。基于以上事实及前期基因芯片的结果,本研究推测PSAT1可能对PDLSCs的成骨分化有调节作用,拟对该问题进行深入的探究及验证。综上所述,本研究前期利用基因芯片技术及生物信息学手段,分析、筛选可能参与口腔来源的PDLSCs、DPSCs、GMSCs的成骨分化调控的基因;在此基础之上,深入探究PSAT1对PDLSCs的增殖、迁移、成骨分化等与骨组织工程密切相关的生物学行为的影响,重点阐释PSAT1对PDLSCs成骨分化的调控作用及调控机制,以期为阐明间充质干细胞成骨分化的分子生物学调控机制提供理论基础,也为靶向提升PDLSCs成骨分化能力、增强PDLSCs介导的骨组织再生效果提供新思路。研究方法1、PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化调控基因的生物信息学分析分离、培养、鉴定PDLSCs、DPSCs及GMSCs;收集经普通培养基培养7 d及成骨诱导液培养7d的PDLSCs、DPSCs及GMSCs（每种细胞三个样本重复）用于基因芯片检测;利用qRT-PCR技术验证基因芯片结果;使用GO分析、KEGG分析等生物信息学手段预测差异表达基因的潜在功能及相互关系;基于所有基因芯片及生物信息学分析结果,筛选出多个可能调控成骨分化的候选基因;使用siRNA在PDLSCs中沉默候选基因的表达,而后检测成骨诱导后PDLSCs碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）活性的变化,以初步选择最有可能调控成骨分化的基因用于后续研究。2、探究PSAT1对PDLSCs在体外培养环境中增殖、迁移、分化能力的调控通过慢病毒感染技术在PDLSCs中稳定过表达及敲减PSAT1,并检测过表达及敲减效率;通过CCK-8实验、EdU实验、细胞周期检测等分析过表达及敲减PSAT1后PDLSCs增殖能力的变化;通过划痕实验分析PDLSCs的迁移能力;通过ALP活性分析、ALP染色、茜素红染色、矿化结节定量分析、成骨相关因子COL1、ALP、RUNX2的蛋白及mRNA表达检测等分析PDLSCs的成骨分化能力;通过油红O染色及成脂相关因子表达检测分析PDLSCs的成脂分化能力。3、探究PSAT1对PDLSCs介导的体内骨组织再生的调控构建大鼠下颌骨骨缺损模型,将过表达及敲减PSAT1的PDLSCs与Bio-Oss骨粉混合后移植于骨缺损处,覆盖屏障膜;8w后,通过micro-CT分析骨缺损处新骨生成情况,通过石蜡切片苏木素-伊红染色及Masson染色分析新生骨组织形态学特征,通过免疫组化染色分析新生骨的成骨相关因子ALP、RUNX2的表达情况。构建裸鼠皮下移植模型,将过表达及敲减PSAT1的PDLSCs与骨粉混合后移植于裸鼠皮下;6 w后,通过石蜡切片苏木素-伊红染色及Masson染色分析移植组织的形态学特征。4、探究PSAT1促进PDLSCs成骨分化的分子机制从两个角度探究PSAT1调控PDLSCs成骨分化的分子机制:（1）探究PSAT1是否通过影响Akt-GSK3β-β-catenin信号通路调控成骨分化:通过Western Blot检测过表达及敲减PSAT1后Akt-GSK3β-β-catenin信号通路中关键因子的磷酸化水平及蛋白量变化;使用抑制剂LY294002处理过表达PSAT1的细胞,或用激活剂SC79处理敲减PSAT1的细胞,而后通过Western Blot检测Akt-GSK-3β-β-catenin信号通路中关键因子的磷酸化水平及蛋白量变化,通过ALP活性分析、ALP染色、茜素红染色、矿化结节定量分析、成骨相关因子的蛋白及mRNA表达检测等方法检测细胞成骨分化能力的变化。（2）探究PSAT1是否通过影响其催化的代谢反应的下游产物丝氨酸或α酮戊二酸调控成骨分化:使用siRNA分别沉默丝氨酸生物合成反应中的上游酶PHGDH和下游酶PSPH,或用丝氨酸处理敲减PSAT1的细胞,而后检测成骨诱导后PDLSCs的ALP活性;检测过表达及敲减PSAT1后细胞内α酮戊二酸的含量;通过CCK-8实验分析一定浓度梯度的外源性α酮戊二酸二甲酯（dm-αKG）处理对PDLSCs增殖活性的影响;通过ALP活性分析、ALP染色、茜素红染色、矿化结节定量分析、成骨相关因子的蛋白及mRNA表达检测等方法分析一定浓度梯度的dm-αKG对PDLSCs成骨分化的影响;使用dm-αKG处理敲减PSAT1的PDLSCs,而后检测成骨诱导后PDLSCs成骨分化能力的变化;通过Western Blot检测dm-αKG对PDLSCs中Akt-GSK3β-β-catenin信号通路关键因子的磷酸化水平及蛋白量的影响。5、探究PDLSCs成骨分化过程中转录因子ATF4对PSAT1的调控通过qRT-PCR及Western Blot检测ATF4及PSAT1在PDLSCs成骨分化后的mRNA及蛋白表达水平变化;构建过表达质粒及siRNA,对PDLSCs中的ATF4进行过表达及沉默,而后检测PSAT1的表达变化;使用JASPAR数据库、GTRD数据库分析ATF4与基因PSAT1启动子区域的潜在结合位点;使用Ch1P-PCR实验,验证ATF4与基因PSAT1启动子预测位点的结合。结果1、PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化调控基因的生物信息学分析成功分离、培养及鉴定PDLSCs、DPSCs及GMSCs;基因芯片分析获得了成骨诱导后113个在PDLSCs、DPSCs及GMSCs三种细胞中均差异表达的基因,及188、94、144个分别仅在PDLSCs、DPSCs、GMSCs中差异表达的基因;qRT-PCR实验证实基因芯片结果可信;通过GO分析及KEGG分析对差异基因进行了功能分析;使用siRNA沉默初步选出的8个候选基因,证实沉默基因PSAT1导致成骨诱导后PDLSCs的ALP活性下降最显着,因而确定PSAT1为后续实验的研究对象。2、PSAT1对体外培养环境中PDLSCs在增殖、迁移、分化能力的调控使用慢病毒成功在PDLSCs中稳定过表达及敲减PSAT1;CCK-8实验、EdU实验、细胞周期分析实验的结果表明过表达PSAT1促进PDLSCs的增殖,而敲减PSAT1抑制PDLSCs的增殖;划痕实验结果显示过表达及敲减PSAT1对PDLSCs的迁移能力没有显着影响;成骨分化检测结果显示,过表达PSAT1促进了 PDLSCs的成骨分化,而敲减PSAT1抑制了 PDLSCs的成骨分化;成脂分化检测结果表明,过表达PSAT1促进了 PDLSCs的成脂分化,而敲减PSAT1抑制了 PDLSCs的成脂分化。3、PSAT1对PDLSCs介导的体内骨组织再生的调控构建大鼠下颌骨骨缺损模型后,micro-CT结果显示过表达PSAT1组与对照组相比形成的新骨的骨量更多,而敲减PSAT1组的新骨骨量减少、骨小梁相对稀疏;石蜡切片苏木素-伊红染色及Masson染色显示,过表达PSAT1组形成的新骨比对照组骨量多、矿化程度高,敲减PSAT1组的新骨骨量少、矿化程度低;免疫组化染色结果表明,过表达PSAT1组的成骨相关因子ALP、RUNX2的表达量更高,而敲减PSAT1组的表达量降低。构建裸鼠皮下移植模型后,石蜡切片苏木素-伊红染色及Masson染色结果显示,PDLSCs在裸鼠皮下形成了类牙周膜/骨样组织,过表达PSAT1组与对照组相比形成的胶原更致密、局部骨基质沉积增加,而敲减PSAT1组形成的胶原变得稀疏、局部骨基质沉积减少。4、PSAT1促进PDLSCs成骨分化的分子机制研究实验结果显示PSAT1通过两条途径调控PDLSCs的成骨分化:第一,过表达及敲减PSAT1后PDLSCs中Akt-GSK3 β-β-catenin信号通路关键因子的激活水平相应升高及降低;LY294002抑制了 Akt的磷酸化激活,并逆转了过表达PSAT1对Akt-GSK3β-β-catenin信号通路的活化作用,且逆转了过表达PSAT1对PDLSCs成骨分化的促进作用;激活剂SC79促进了 Akt的磷酸化激活,逆转了敲减PSAT1对Akt-GSK3β-β-catenin信号通路的抑制作用,挽救了敲减PSAT1造成的PDLSCs成骨分化水平降低。上述结果表明,PSAT1可以通过Akt-GSK3β-β-catenin信号通路调控PDLSCs的成骨分化。第二,siRNA沉默PHGDH后PDLSCs的ALP活性下降,而沉默PSPH后PDLSCs的ALP活性不变;向培养基中添加丝氨酸没有逆转敲减PSAT1造成的PDLSCs的ALP活性下降,如此初步排除了丝氨酸的调控作用;过表达及敲减PSAT1后细胞内α酮戊二酸的水平相应升高及降低;浓度小于等于3mM的dm-αKG对PDLSCs的增殖能力没有显着影响,对PDLSCs的成骨分化有显着促进作用;3 mM dm-αKG处理挽救了敲减PSAT1后PDLSCs成骨分化能力的降低;3 mM dm-αKG对PDLSCs中Akt-GSK3β-β-catenin信号通路关键因子的磷酸化水平没有显着影响。上述结果表明,PSAT1可以通过影响其催化的代谢反应的下游产物α酮戊二酸调控PDLSCs的成骨分化。5、PDLSCs成骨分化过程中PSAT1的表达受转录因子ATF4调控qRT-PCR及Western Blot结果显示,PDLSCs成骨分化后ATF4和PSAT1的mRNA及蛋白表达水平皆下降;在PDLSCs中过表达及沉默ATF4后,PSAT1的mRNA及蛋白表达水平相应升高及降低;过表达ATF4后,成骨诱导后原本降低的PSAT1表达水平被提升;JASPAR数据库预测了 ATF4与基因PSAT1启动子区域的潜在结合位点为Ch9:78296092-78296101;ChIP-PCR实验表明ATF4可以与预测位点结合;GTRD数据库分析验证了 ATF4与基因PSAT1启动子区域存在结合峰。结论1、PSAT1可以正向调控PDLSCs在体外培养环境中的增殖和成骨分化能力,并促进PDLSCs在体内环境中介导的骨组织再生。2、PSAT1可能通过两条途径调控PDLSCs的成骨分化:一是PSAT1可以影响成骨相关信号通路Akt-GSK3β-β-catenin活性,二是PSAT1通过影响细胞中重要化合物α酮戊二酸的水平来调控成骨分化。3、PDLSCs成骨分化过程中PSAT1的表达受转录因子ATF4调控。
二、不同来源成骨细胞生物学特性的比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同来源成骨细胞生物学特性的比较研究（论文提纲范文）
（1）miRNA-3077-5p对绝经后骨质疏松小鼠颌骨BMSCs分化的影响（论文提纲范文）
| 中英文词缩略表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 m6ARNA 甲基化在骨发育中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 病例一 |
| 病例二 |
| 病例三 |
| 病例四 |
| 病例五 |
（2）双相磷酸钙相组成的调控及其对磷酸钙/PLGA复合材料生物学性能影响的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 自然骨移植物的分类及特点 |
| 1.2.1 自体移植物 |
| 1.2.2 同种异体移植物 |
| 1.2.3 异种移植物 |
| 1.3 人工合成骨修复材料的分类及特点 |
| 1.3.1 生物活性陶瓷 |
| 1.3.2 骨水泥 |
| 1.3.3 金属材料 |
| 1.3.4 人工高分子材料 |
| 1.4 磷酸钙生物陶瓷/高分子复合材料研究进展 |
| 1.5 本论文的研究目标、内容及意义 |
| 1.5.1 研究目标 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 研究意义 |
| 第2章 单双相磷酸钙陶瓷(CaPcs)颗粒的制备及CaPcs/PLGA复合支架的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和仪器设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 CaPcs颗粒的合成 |
| 2.3.2 CaPcs的物相组成分析 |
| 2.3.3 CaPcs的微观形貌观察 |
| 2.3.4 CaPcs/PLGA复合支架的制备 |
| 2.3.5 CaPcs/PLGA支架的形态与微观结构 |
| 2.3.6 CaPcs/PLGA支架亲水性研究 |
| 2.3.7 统计分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 不同CaPcs颗粒物相组成分析 |
| 2.4.2 CaPcs微观形貌 |
| 2.4.3 CaPcs/PLGA支架的形态与微观结构 |
| 2.4.4 CaPcs/PLGA支架亲水性评价 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 单双相CaPCS/PLGA复合支架的体外降解研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和仪器设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 CaPcs/PLGA复合支架的制备与消毒 |
| 3.3.2 体外降解 |
| 3.3.3 支架失重率分析 |
| 3.3.4 pH变化分析 |
| 3.3.5 支架形态与微观结构分析 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 支架大体观变化 |
| 3.4.2 支架质量损失 |
| 3.4.3 pH变化 |
| 3.4.4 支架内部微观结构变化 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 单双相CaPCS/PLGA复合支架的生物矿化研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和仪器设备 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 CaPcs/PLGA复合支架的制备与消毒 |
| 4.3.2 体外模拟生物矿化 |
| 4.3.3 支架质量变化分析 |
| 4.3.4 支架表面亲水性变化分析 |
| 4.3.5 支架表面微观结构分析 |
| 4.3.6 支架表面能谱分析 |
| 4.3.7 统计分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 支架质量变化 |
| 4.4.2 支架表面接触角测定 |
| 4.4.3 支架表面微观结构变化 |
| 4.4.4 支架表面能谱分析 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 单双相CaPCS/PLGA复合材料的体外细胞生物学评价 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和仪器设备 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.2.2 实验仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实验细胞(MC3T3-E1)培养与传代 |
| 5.3.2 细胞黏附实验 |
| 5.3.3 细胞增殖实验 |
| 5.3.4 细胞内Ca~(2+)测定 |
| 5.3.5 碱性磷酸酶活性检测实验 |
| 5.3.6 钙沉积检测实验 |
| 5.3.7 成骨相关基因表达检测 |
| 5.3.8 统计分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 细胞黏附 |
| 5.4.2 细胞增殖 |
| 5.4.3 细胞内Ca~(2+)变化 |
| 5.4.4 碱性磷酸酶活性 |
| 5.4.5 钙沉积能力 |
| 5.4.6 成骨相关基因表达 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 单双相CaPCS/PLGA复合支架的体内骨缺损修复研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料和仪器设备 |
| 6.2.1 实验材料与试剂 |
| 6.2.2 实验仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 骨缺损修复支架的制备与消毒 |
| 6.3.2 大鼠胫骨近端缺损模型的建立 |
| 6.3.3 Micro-CT三维重建形态学分析 |
| 6.3.4 组织学染色 |
| 6.3.5 统计分析 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 标本大体观 |
| 6.4.2 Micro-CT三维重建及定量 |
| 6.4.3 组织学分析 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）富血小板纤维蛋白对施耐德膜间充质干细胞成骨分化影响的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 施耐德膜间充质干细胞的研究进展 |
| 1.2 富血小板纤维蛋白的研究进展 |
| 1.3 成骨相关信号通路的调控 |
| 1.4 课题研究意义 |
| 第2章 施耐德膜间充质干细胞的分离培养与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器设备和主要试剂 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 SMMSCs的形态和增殖规律分析 |
| 2.4.2 SMMSCs表面标记物鉴定 |
| 2.4.3 SMMSCs成骨诱导分化能力检测 |
| 2.4.4 SMMSCs成脂诱导分化能力检测 |
| 2.4.5 SMMSCs成软骨诱导分化能力检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 PRF对施耐德膜间充质干细胞生物学行为的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 仪器设备和主要试剂 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 PRF的结构及生长因子释放规律 |
| 3.4.2 PRF条件培养基对SMMSCs及 BMSCs增殖的影响 |
| 3.4.3 PRF条件培养基对SMMSCs及 BMSCs迁移的影响 |
| 3.4.4 PRF条件培养基对SMMSCs及 BMSCs成骨分化的影响 |
| 3.4.5 PRF对 BMSCs和 SMMSCs ERK 1/2及p-ERK 1/2 蛋白表达水平的影响 |
| 3.4.6 抑制ERK 1/2 信号通路后PRF对 BMSCs和 SMMSCs ERK 1/2 及p-ERK 1/2 蛋白表达水平的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 PRF促进上颌窦内成骨的体内研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 仪器设备和主要试剂 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 影像学结果 |
| 4.4.2 新骨成骨标志基因的表达水平 |
| 4.4.3 双荧光染色分析 |
| 4.4.4 HE,Masson,甲苯胺蓝染色分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 以PRF为唯一植骨材料进行经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术的临床研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要仪器设备 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口腔颌面部骨的形成和缺损修复 |
| 1.1.1 口腔颌面部骨的形成与自修复过程 |
| 1.1.2 口腔颌面部骨缺损疾病的治疗方法 |
| 1.2 口腔颌面部骨组织工程概述 |
| 1.2.1 骨组织工程中的种子细胞 |
| 1.2.2 骨组织工程中常用的生长因子及其功能简介 |
| 1.2.3 骨组织工程中常用的支架体系 |
| 1.3 骨缺损修复材料简介 |
| 1.3.1 骨修复材料的研究现状及性能要求 |
| 1.3.2 天然及人工合成的骨修复材料 |
| 1.3.3 骨组织中的羟基磷灰石 |
| 1.3.4 用于骨再生的支架材料 |
| 1.3.5 稀土在生物医学材料中的作用 |
| 1.4 本论文的设计思路和技术路线 |
| 1.4.1 设计思路 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 碳酸化及稀土掺杂的羟基磷灰石仿生骨粉的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 钙-磷-碳酸体系的热力学平衡相图计算 |
| 2.3.2 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的制备 |
| 2.3.3 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的结构表征 |
| 2.3.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.3.5 形貌与化学组成分析 |
| 2.3.6 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的稀土荧光标记检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 模拟生物矿化环境下的钙-磷-碳酸根热力学平衡相图与矿化因素 |
| 2.4.2 碳酸化羟基磷灰石材料的结构 |
| 2.4.3 碳酸化及矿化环境调控对羟基磷灰石形貌的影响 |
| 2.4.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.4.5 稀土离子标记的碳酸化羟基磷灰石可控制备及光谱性质 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石材料的生物学性能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MC3T3-E1 细胞培养 |
| 3.3.2 使用荧光染色观察细胞形态 |
| 3.3.3 使用CCK-8 法检测细胞增殖 |
| 3.3.4 使用活细胞/死细胞染色检测细胞的生长活性 |
| 3.3.5 使用碱性磷酸酶染色检测ALP活性 |
| 3.3.6 使用ALP定量检测试剂盒检测ALP活性 |
| 3.3.7 茜素红染色检测细胞形成的钙结节 |
| 3.3.8 Western blot检测各组材料对细胞成骨分化的影响 |
| 3.3.9 使用三维打印机打印支架 |
| 3.3.10 支架的形貌及成份表征 |
| 3.3.11 扫描电镜检测细胞在支架上的黏附 |
| 3.3.12 使用CCK-8 检测细胞在支架上的增殖 |
| 3.3.13 使用活细胞/死细胞染色检测细胞在支架上的生长活性 |
| 3.3.14 使用ALP染色检测支架上细胞的ALP活性 |
| 3.3.15 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 MC3T3-E1 细胞的培养 |
| 3.4.2 各组材料浸提液对细胞形态的影响 |
| 3.4.3 各组材料浸提液对细胞增殖的影响 |
| 3.4.4 各组材料浸提液对细胞生长活性的影响 |
| 3.4.5 各组材料浸提液对细胞ALP染色的影响 |
| 3.4.6 各组材料浸提液对细胞ALP活性影响的定量分析 |
| 3.4.7 各组材料浸提液对细胞体外矿化的影响 |
| 3.4.8 各组材料浸提液对细胞分泌成骨特异性蛋白的影响 |
| 3.4.9 三维打印支架的宏观外形 |
| 3.4.10 三维打印支架的微观形貌、组分表征 |
| 3.4.11 细胞在各组三维打印支架上的黏附 |
| 3.4.12 细胞在各组三维打印支架上的增殖 |
| 3.4.13 细胞在各组三维打印支架上的生长活性 |
| 3.4.14 细胞在各组三维打印支架上的ALP活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠颅骨缺损模型建立及分组 |
| 4.3.2 术后大体观察 |
| 4.3.3 术后影像学观察 |
| 4.3.4 组织学观察染色 |
| 4.3.5 Masson染色 |
| 4.3.6 体内生物安全性评价 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 大鼠临界骨缺损模型的建立 |
| 4.4.2 动物处死后标本的获取 |
| 4.4.3 动态Micro-CT观察缺损颅骨的修复 |
| 4.4.4 术后组织学检测 |
| 4.4.5 Masson染色表征 |
| 4.4.6 支架促血管再生 |
| 4.4.7 支架的体内安全性结果分析 |
| 4.4.8 支架促成骨性能讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要创新点 |
| 5.2 全文结论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（5）3D打印多孔β-磷酸三钙掺镧支架用于骨组织修复的体外研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 La-β-TCP支架的制备、物理表征、体外模拟降解实验及细胞毒性实验 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法步骤 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 La-β-TCP支架对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,巨噬细胞极化,破骨细胞分化的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法步骤 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 磷酸钙陶瓷材料在骨组织修复的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）3D打印掺钴生物陶瓷支架介导成骨-成血管偶联促进骨修复的作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 Co(0、1、2.5、5、10)支架的制备及表征 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 Co(0、1、2.5、5)支架体外生物相容性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 Co(0、1、2.5、5)支架体外促成骨性能的研究 |
| 1 实验器材 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 Co(0、1、2.5、5)支架体外诱导血管形成性能的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 Co2.5 支架修复颅骨缺损的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 本研究不足及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 功能元素在生物陶瓷改性中的功能及应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表及撰写的文章 |
| 致谢 |
（7）锌离子刺激巨噬细胞分泌的外泌体对内皮和成骨细胞功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 外泌体概述 |
| 1.1.1 外泌体形成与特征 |
| 1.1.2 外泌体与受体细胞相互作用 |
| 1.2 外泌体的生物学功能 |
| 1.2.1 外泌体的组成 |
| 1.2.2 外泌体的生物学功能 |
| 1.3 外泌体提取和鉴定 |
| 1.3.1 外泌体提取方法 |
| 1.3.2 外泌体的鉴定方法 |
| 1.4 巨噬细胞对骨整合的调节 |
| 1.5 巨噬细胞源性外泌体 |
| 1.6 锌离子的生物学特性 |
| 1.7 课题的研究内容和意义 |
| 1.7.1 本课题研究内容 |
| 1.7.2 本课题的研究意义 |
| 第2章 Zn离子对巨噬细胞功能的影响 |
| 2.1 主要实验设备 |
| 2.2 主要实验试剂耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养基配制 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 Zn对巨噬细胞毒性 |
| 2.3.4 细胞增殖 |
| 2.3.5 巨噬细胞形态 |
| 2.3.6 巨噬细胞黏附及骨架 |
| 2.3.7 巨噬细胞相关基因表达 |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 Zn离子刺激巨噬细胞源性外泌体表征与分析 |
| 3.1 实验主要设备 |
| 3.2 实验试剂及耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 巨噬细胞源性外泌体的提取 |
| 3.3.2 巨噬细胞源外泌体蛋白定量检测 |
| 3.3.3 巨噬细胞源外泌体扫描电子显微镜观察 |
| 3.3.4 Zn离子浓度对巨噬细胞外泌体分泌的影响 |
| 3.3.5 巨噬细胞源外泌体标志蛋白检测 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 巨噬细胞源性外泌体对内皮细胞功能作用 |
| 4.1 主要实验设备 |
| 4.2 实验试剂及耗材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 配制内皮细胞培养基 |
| 4.3.2 内皮细胞复苏培养 |
| 4.3.3 内皮细胞对巨噬细胞源外泌体摄取 |
| 4.3.4 内皮细胞黏附及骨架 |
| 4.3.5 内皮细胞形态 |
| 4.3.6 内皮细胞VEGF测定 |
| 4.3.7 内皮细胞NO测定 |
| 4.3.8 细胞迁移实验 |
| 4.3.9 内皮细胞体外成血管能力 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 内皮细胞对巨噬细胞源外泌体摄取 |
| 4.4.2 内皮细胞的黏附 |
| 4.4.3 内皮细胞形态和骨架 |
| 4.4.4 内皮细胞VEGF因子分泌与NO合成 |
| 4.4.5 内皮细胞的迁移结果 |
| 4.4.6 内皮细胞的体外成血管能力 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 巨噬细胞源性外泌体对成骨细胞功能影响 |
| 5.1 主要实验设备 |
| 5.2 实验试剂及耗材 |
| 5.3 成骨培养基配制及细胞复苏 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 细胞黏附与骨架 |
| 5.4.2 成骨细胞形态 |
| 5.4.3 成骨细胞ALP活性 |
| 5.4.4 胶原分泌 |
| 5.4.5 成骨细胞摄取外泌体 |
| 5.4.6 统计分析 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 成骨细胞黏附结果 |
| 5.5.2 成骨细胞形态与骨架 |
| 5.5.3 成骨细胞ALP结果 |
| 5.5.4 胶原分泌结果 |
| 5.5.5 成骨细胞摄取外泌体结果 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 本章小结 |
| 第6章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）生物矿化技术修饰的磺化聚醚醚酮材料对骨缺损修复的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词对照 |
| 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 骨的结构 |
| 1.2.1 骨的宏观到纳米结构 |
| 1.2.2 骨的成分构成 |
| 1.2.3 骨的生物力学特性 |
| 1.3 骨移植物的分类 |
| 1.3.1 传统骨缺损修复材料 |
| 1.3.2 现代骨缺损修复材料 |
| 1.4 聚醚醚酮(PEEK)材料 |
| 1.4.1 聚醚醚酮基本介绍 |
| 1.4.2 聚醚醚酮的医学应用 |
| 1.4.3 聚醚醚酮的生物惰性及表面改性 |
| 1.5 本论文的设计思路及技术路线 |
| 1.5.1 设计思路 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 拥有表面多孔拓扑形貌的磺化聚醚醚酮的制备与体外生物学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 拥有多孔拓扑形貌的磺化聚醚醚酮的制备及表征 |
| 2.3.2 力学性能测试 |
| 2.3.3 接触角测定 |
| 2.3.4 磺化基团分析 |
| 2.3.5 浸提液细胞毒性检测 |
| 2.3.6 人脐带间充质干细胞的培养 |
| 2.3.7 细胞黏附实验 |
| 2.3.8 细胞增殖实验 |
| 2.3.9 I型胶原染色及活性检测 |
| 2.3.10 茜素红S染色实验 |
| 2.3.11 脱细胞处理及细胞再种植 |
| 2.3.12 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 磺化PEEK材料的表征 |
| 2.4.2 力学性能 |
| 2.4.3 接触角测定 |
| 2.4.4 磺化基团分析 |
| 2.4.5 浸提液细胞毒性检测 |
| 2.4.6 细胞黏附实验 |
| 2.4.7 细胞增殖实验 |
| 2.4.8 I型胶原染色及活性检测 |
| 2.4.9 茜素红S染色实验 |
| 2.4.10 脱细胞处理及细胞再种植 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 生物矿化技术修饰的磺化聚醚醚酮的制备与体外生物学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 生物矿化修饰的磺化PEEK的制备及表征 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 浸提液细胞毒性检测 |
| 3.3.4 细胞黏附实验 |
| 3.3.5 细胞增殖实验 |
| 3.3.6 碱性磷酸酶活性测定 |
| 3.3.7 茜素红S染色及定量实验 |
| 3.3.8 I型胶原染色及定量实验 |
| 3.3.9 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 电镜观察及理化表征 |
| 3.4.2 力学性能 |
| 3.4.3 接触角测定 |
| 3.4.4 X射线衍射结果 |
| 3.4.5 浸提液细胞毒性检测 |
| 3.4.6 细胞黏附实验 |
| 3.4.7 细胞增殖实验 |
| 3.4.8 碱性磷酸酶活性 |
| 3.4.9 茜素红S染色及定量实验 |
| 3.4.10 I型胶原染色及定量实验 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 生物矿化技术修饰的磺化聚醚醚酮体内骨修复研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠颅骨缺损模型的建立 |
| 4.3.2 Micro-CT三维重建 |
| 4.3.3 病理组织学染色 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 Mirco-CT评估 |
| 4.4.2 组织学分析 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 特色与创新之处 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（9）骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词一览表 |
| 前言 |
| 第一部分:EV的分离鉴定及骨折小鼠模型的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究动物及饲养 |
| 1.2 研究材料 |
| 1.3 研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鼠BMSCs的鉴定 |
| 2.2 EVs的鉴定 |
| 2.3 野生型和CD9-/-小鼠的骨折愈合情况分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分:囊泡干预下骨折小鼠模型中差异表达miRNA的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 B-EV促进骨折小鼠的恢复 |
| 2.2 微阵列分析差异表达miRNA |
| 2.3 筛选差异表达miRNA |
| 2.4 miR-355 的分布预测 |
| 2.5 miR-355 在EV中的表达分析 |
| 2.6 沉默miR-335 可部分降低B-EVs对骨折恢复的促进作用 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分:microRNA-335 通过Vapb和 Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 MTT检测细胞活力 |
| 1.2.2 TUNEL染色检测细胞的凋亡情况 |
| 1.2.3 Alizarin red染色检测细胞凋亡 |
| 1.2.4 碱性磷酸酶染色检测 |
| 1.2.5 免疫荧光染色 |
| 1.2.6 双荧光素报告基因检测miR-355与Vapb之间的结合位点 |
| 1.2.7 RNA pull down检测 |
| 1.2.8 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 B-EV促进成骨细胞增殖及凋亡 |
| 2.2 B-EV对成骨细胞粘附无作用 |
| 2.3 B-EV促进成骨细胞分化 |
| 2.4 沉默miR-335 可逆转B-EVs对成骨细胞分化的促进作用 |
| 2.5 miR-335 靶向作用基因的筛选 |
| 2.6 miR-335 靶向作用Vapb |
| 2.7 Vapb过表达可逆转B-EVs对成骨细胞分化的促进作用 |
| 2.8 携带B-EVs的 miR-335 靶向Vapb激活Wnt/β-catenin通路 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 主要结果与结论 |
| 第五部分 创新性与不足 |
| 参考文献 |
| 综述 囊泡来源microRNA在骨折中应用的研究进展 |
| 胞外囊泡在骨再生中的调控 |
| 骨髓间充质干细胞来源外泌体与骨骼再生 |
| MiRNA 在骨折中的作用 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 一、基本情况 |
| 二、学习工作经历(从大学起) |
| 三、研究成果 |
| (一)科研项目 |
| (二)发表文章 |
| 第一作者文章 |
（10）PSAT1对牙周膜干细胞成骨分化的促进作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、骨组织工程技术是实现口腔骨组织再生的重要方法 |
| 二、口腔来源的牙周膜千细胞是口腔骨组织工程研宄的优势种子细胞 |
| 三、深入阐释牙周膜干细胞成骨分化的内在分子调控机制有助于促进其介导的骨再生 |
| 四、PSAT1可能对牙周膜干细胞的成骨分化有调控作用 |
| 课题相关文献回顾 |
| 一、现阶段常用口腔骨纲修复摊 |
| 二、口腔杂织工触 |
| 三、干细胞概述 |
| 四、口腔组织来海干细胞在口腔骨组织工程中的应用 |
| 五、干细胞成骨分化调控基因及信号通路 |
| 六、PSAT1研宄现状 |
| 第一部分 PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化调控基因的生物信息学分析 |
| 1.1背景 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 PSAT1对体外培养环境中PDLSCs增殖、迁移、分化能力的调控 |
| 2.1背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 PSAT1对PDLSCs介导的体内骨组织再生的调控 |
| 3.1背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四部分 PSAT1促进PDLSCs成骨分化的分子机制研究 |
| 4.1背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五部分 PDLSCs成骨分化过程中PSAT1的表达受转录因子ATF4调控 |
| 5.1背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文目录 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、不同来源成骨细胞生物学特性的比较研究（论文参考文献）
- [1]miRNA-3077-5p对绝经后骨质疏松小鼠颌骨BMSCs分化的影响[D]. 崔帅帅. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]双相磷酸钙相组成的调控及其对磷酸钙/PLGA复合材料生物学性能影响的研究[D]. 马一行. 吉林大学, 2021(01)
- [3]富血小板纤维蛋白对施耐德膜间充质干细胞成骨分化影响的机制研究[D]. 王佳. 吉林大学, 2021(01)
- [4]含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究[D]. 刘鹏. 吉林大学, 2021(01)
- [5]3D打印多孔β-磷酸三钙掺镧支架用于骨组织修复的体外研究[D]. 林斌. 福建医科大学, 2021(02)
- [6]3D打印掺钴生物陶瓷支架介导成骨-成血管偶联促进骨修复的作用研究[D]. 李俊刚. 福建医科大学, 2021(02)
- [7]锌离子刺激巨噬细胞分泌的外泌体对内皮和成骨细胞功能的影响[D]. 刘家川. 太原理工大学, 2021(01)
- [8]生物矿化技术修饰的磺化聚醚醚酮材料对骨缺损修复的研究[D]. 孙嘉阳. 吉林大学, 2021(01)
- [9]骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制研究[D]. 胡海峰. 山西医科大学, 2021(01)
- [10]PSAT1对牙周膜干细胞成骨分化的促进作用及机制研究[D]. 贾凌璐. 山东大学, 2021(12)