一、ATM对DNA损伤后细胞反应信号传导通路的调控作用（论文文献综述）
李阿敏[1]（2021）在《煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化效应及其机制研究》文中指出背景及目的煤炭目前仍然是不可替代的重要能源之一。流行病学研究显示煤矿工人的肺癌发病率高于普通人群,这表明煤炭矿区环境污染物可能会增加罹患肺癌的风险。本课题以人支气管上皮细胞为模型,研究煤尘（coal dust,CD）暴露的潜在致癌效应及毒理机制;为煤尘风险评估和实施暴露控制提供实验证据。研究方法（1）回顾及总结煤尘暴露与肺癌风险之间关系的流行病学证据,以评估煤尘暴露是否与增加的肺癌风险相关。（2）将人支气管上皮细胞（BEAS-2B）暴露于煤尘条件下传代培养,细胞水平利用苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）、噻唑蓝比色法（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）、克隆形成实验、划痕愈合实验、间接免疫荧光、彗星实验、蛋白质免疫印迹和高通量测序技术（Next Generation Sequencing,NGS）检测煤尘暴露后的细胞（BEAS-2BCD）的形态变化、增殖活力、迁移能力、DNA修复能力和基因组稳定性;动物水平将BEAS-2BCD细胞异种移植于BALB/c裸鼠,观察BEAS-2BCD细胞的体内成瘤潜能。综合评估煤尘暴露后的BEAS-2BCD细胞是否发生肿瘤样转化。（3）将煤尘短时暴露BEAS-2B细胞,通过HE染色、线粒体膜电位荧光探针、活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光探针、间接免疫荧光和蛋白质免疫印迹探讨煤尘暴露引起的应激损伤机制;在此损伤机制的研究基础上,利用蛋白质免疫印迹、细胞免疫化学染色、逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）、Annexin V-FITC/PI染色以及流式细胞术探究煤尘慢性暴露诱导BEAS-2BCD细胞肿瘤样转化的可能毒理机制。研究结果（1）Meta分析结果显示煤尘暴露与肺癌的相对风险（relative risk,RR）为1.46（95%CI 1.29-1.66）,表明煤尘暴露者发生肺癌的危险性为非暴露者的1.46倍,提示煤尘暴露与肺癌呈正相关关系,煤尘暴露是肺癌的一个危险因素。（2）煤尘暴露条件下培养30代后的人支气管上皮细胞（BEAS-2BCD）肿瘤样转化相关生物学表征:1)形态表征:BEAS-2BCD细胞体积增大,胞核增大,核质比例失常,核深染,核仁增多,较正常BEAS-2B细胞形态发生了显着异化。2)功能表征:BEAS-2BCD细胞培养24h、48h、72h、96h的平均活力分别为0.64、0.75、0.78、0.85,较正常培养相同代数的 BEAS-2B 细胞（0.46、0.65、0.67、0.73）显着增高（p<0.05）。同时,BEAS-2BCD细胞31.10%的平均克隆形成率较BEAS-2B细胞（10.13%）提高三倍之多（p<0.01）。并且,BEAS-2BCD细胞24h的平均迁移率（50.83%）也显着高于BEAS-2B细胞（17.71%）（p<0.01）。提示BEAS-2BCD细胞的增殖活力及迁移能力显着增强。此外,顺铂处理24h时,BEAS-2BCD细胞内DNA断裂的γ-H2AX焦点均数（18个/细胞）明显少于BEAS-2B细胞（26个/细胞）（p<0.05）;去除顺铂并继续培养12h和24h时,BEAS-2BCD的γ-H2AX焦点均数分别为9个/细胞和4个/细胞,均显着少于BEAS-2B细胞（22个/细胞和15个/细胞）（p<0.05）。彗星实验显示顺铂处理24h及去除顺铂12h和24h时,BEAS-2BCD细胞的DNA损伤率（15%、8%、3%）亦明显低于BEAS-2B细胞（19%、14%、10%）（p<0.05）。同时蛋白质印迹显示BEAS-2BCD细胞内DNA修复酶ATM/ATR和DNA-PKcs磷酸化水平均高于BEAS-2B细胞（p<0.05）。以上结果证实BEAS-2BCD细胞DNA修复能力显着增强,提示其对外界环境的适应性及抗凋亡能力显着提高;3)基因组转录表征:NGS检测结果显示BEAS-2BCD细胞基因组不稳定。促增殖、迁移,抗凋亡相关基因（CXCR4、CASC9、CNPY2、CRNDE、FAM83A、EGFR、BCAT1、HMGA1、NSUN2、ANKHD1、ZNF326 等）表达显着增加;原癌基因（MET、MYC、FYN、ABL2、ATF1、SET、ETS2等）显着高表达,抑癌基因（ADARB1、GLIPR1、CDO1、CTDSPL、DLC1、TOM1L2 等）表达明显降低;细胞跨膜信号转导（整合素、EGFR、VEGF、PDGF等）、胞内信号传导（PI3K/AKT、MAPK、mTOR等）相关通路显着上调。表明煤尘暴露后的BEAS-2BCD细胞较BEAS-2B细胞具有显着增强的新陈代谢活动、自我更新能力、增殖、迁移、血管生成、损伤修复抗凋亡等肿瘤样转化相关生物学活性。4)体内成瘤表征:动物实验结果显示BEAS-2BCD细胞的新生物形成率为20%,终点体积为726.0mm3,肺腺癌细胞株H358阳性对照组的新生物形成率为60%,平均体积为2088.2mm3。新生物组织HE染色显示BEAS-2BCD组细胞呈混合性生长,细胞间伴有较多组织细胞反应,细胞核异型较明显。Ki-67免疫组化可见BEAS-2BCD组Ki-67阳性细胞比例较高,已接近H358阳性对照组,提示BEAS-2BCD细胞的增殖能力较强。BEAS-2BCD细胞荷瘤模型的建立,表明该细胞具有体内成瘤潜能。（3）机制研究结果显示煤尘短时暴露引起了 BEAS-2B细胞线粒体膜去极化（0h:3.79%,6h:6.45%,12h:17.34%,24h:25.03%）。ROS 生成显着增加（0h:4.08;6h:21.13,12h:75.46,24h:30.75）;线粒体凋亡通路蛋白 Caspase-9、Caspase-3和DFF45活化,两者共同诱导DNA断裂效应。煤尘暴露培养10代、20代和30代的BEAS-2B细胞内DNA修复酶ATM/ATR和DNA-PKcs,及相关联的通路蛋白AKT、mTOR、p70S6K、4E-BP1、EGFR和ERK磷酸化水平较正常BEAS-2B细胞显着增高,提示DNA断裂损伤激活了煤尘暴露细胞内同源重组（Homologous recombination,HR）和非同源末端连接（Non-homologous end-joining,NHEJ）两条DNA修复途径及其相关联的信号通路AKT/mTOR和EGFR/ERK。AKT、EGFR、ERK 抑制剂（MK-2206 2HC1、Gefitinib、LY3214996）的应用能显着降低BEAS-2BCD细胞的增殖活力、迁移能力,抑制细胞的周期进展并促进细胞的凋亡效应。其中ERK抑制剂（LY3214996）还显着降低了下游原癌基因转录因子MYC、ATF1和ETS2的磷酸化水平。以上结果表明AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路的异常活化在BEAS-2BCD细胞肿瘤样转化相关生物学活性中可能发挥重要作用。结论及意义（1）煤尘暴露可增加肺癌风险,是肺癌的危险因素之一。（2）煤尘暴露能诱导人支气管上皮细胞过度增殖、迁移、抗凋亡、基因组不稳定以及体内成瘤潜能等肿瘤样转化。（3）煤尘暴露可通过线粒体膜去极化,ROS生成和线粒体凋亡通路活化,驱动DNA损伤,激活DNA修复途径及其相关联的信号通路AKT/mTOR和EGFR/ERK等,可能是诱发人支气管上皮细胞肿瘤样转化重要的毒理机制之一。本研究结果为煤尘暴露的潜在致肺癌作用提供了新的实验证据,为进一步阐明相关肺癌致病机理提供了研究思路,具有一定的职业危害防控价值。图26表13参214
严俊芳[2]（2021）在《电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究》文中研究指明肺癌作为全球第一大癌症,是威胁人类健康的凶险癌症类型。放射治疗作为疗效明确的肺癌治疗手段,被应用于肺癌治疗的各个阶段。放射治疗的辐射效应主要引起核基因组的损伤和细胞质损伤比如线粒体功能紊乱。重离子治癌作为先进的放射治疗手段,因其独特的物理优势,能诱发显着的生物学效应,明显提高肺癌病人的治愈率,但其机理仍不清楚。本文以非小细胞肺癌为研究对象,首先探究了X射线和碳离子以及两者联合博来霉素诱导的复杂DNA损伤的动态应答机制。其次,围绕碳离子单独或协同替加环素诱导线粒体功能紊乱展开研究,并对DNA损伤应答与线粒体功能紊乱的相互作用机制做了初步探究,重点阐述重离子治癌的生物学效应机理,使其治癌优势发挥更大。首先,本文对比X射线发现肺癌细胞对碳离子辐照更加敏感,且碳离子诱导的复杂DSB损伤频率较X射线增加。两种射线联合博来霉素后复杂DSB损伤频率为X射线<X射线联合博来霉素<碳离子<碳离子联合博来霉素。随着损伤频率的增加,识别因子γH2AX和53BP1更难募集到损伤位点,募集出现滞后现象。通过修复蛋白的差异表达分析发现,除X射线辐照外,其余各组非同源末端连接（NHEJ）修复因子Ku70的表达上调,而同源重组（HR）修复因子Rad51表达没有显着性差异,表明复杂DSB损伤修复可能以NHEJ为主。碳离子组和碳离子联合博来霉素组中单链损伤识别蛋白XRCC1的表达均下调,说明DNA单链断裂（SSB）逐渐被修复。下一步,对比抗肿瘤药物替加环素发现碳离子、替加环素及两者联合能够抑制A549和H1299细胞增殖并诱导线粒体功能紊乱,且联合作用诱导的毒性作用和线粒体功能紊乱最显着。线粒体功能紊乱体现在ATP产生降低,线粒体膜电势降低和线粒体Ca2+摄入量增加。在A549细胞中,碳离子、替加环素及两者联合作用诱导细胞凋亡。而在H1299细胞中,碳离子及两者联合作用诱导凋亡和自噬水平增加。在分子水平上,对比于替加环素的应答通路AMPK/mTOR,碳离子及联合作用通过Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白影响线粒体翻译,从而调控线粒体功能,且P53缺陷株H1299细胞对线粒体翻译抑制敏感。最后,初步探究发现ATM/p53/mTOR信号通路是DNA损伤和线粒体功能紊乱的共同调控通路。ATM抑制增加了A549细胞对碳离子的辐射敏感性,主要表现在ATM抑制能够下调碳离子辐照后DSB修复因子Ku70和γH2AX的表达,降低DNA损伤修复能力,同时增加线粒体对Ca2+的摄取,导致线粒体功能紊乱。另外,抑制ATM能够降低辐照后p53磷酸化水平,增加mTOR的磷酸化。进一步发现p53磷酸化抑制后可通过降低AMPK磷酸化水平和激活Akt,从而上调mTOR活性。以上结果表明ATM不仅参与DSB修复,还可通过p53调控mTOR通路,进而调控线粒体功能。碳离子辐照24小时后,LC3-II/I比值发生下调,caspase-3活性增加,ATM抑制则能够下调LC3-II/I比值。因此,自噬水平的降低和细胞凋亡的增加共同决定了细胞的命运,ATM抑制则加重了这一现象。综上所述,本研究对比了X射线和重离子诱导的DNA损伤识别修复的动态应答过程,同时为重离子诱导线粒体功能紊乱提供了新的见解。最后,探究了DNA损伤修复和线粒体功能紊乱的的共同调控机制,连接了碳离子辐射后细胞核和线粒体的直接的双向信号,为重离子治癌提供了直接的生物学依据。
杨娟[3]（2021）在《Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL）在成人初治非霍金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）中占比最高,具有高度侵袭性和异质性。近几十年来,随着以抗CD20的利妥昔单抗（Rituximab）为代表的新型靶向治疗药物的应用,DLBCL患者的疗效得到了明显改善,然而仍有约30%——40%的DLBCL患者出现初始治疗耐药或完全缓解后早期复发,最终因疾病进展而难以获得长期生存。基于此,亟待临床医生及科研人员探究DLBCL发生发展相关的生物分子异常表达及信号通路异常传导,精准诊疗,进而有效改善患者预后。Sirtuin6（Sirt6）衍生自哺乳动物Sirtuins（Sirts）家族,是高度保守的ADP-核糖基化酶和NAD+依赖性脱酰基酶,涉及广泛的细胞学过程,例如调控衰老,DNA修复,葡萄糖代谢,以及转录调节等。Sirt6作为细胞途径检查点控制器,负责细胞增殖和存活的调节,因而它的异常表达与多种癌症相关。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中,Sirt6敲除导致与癌基因激活无关的肿瘤发生,这表明它可能起抑癌作用。临床样品分析显示,Sirt6在包括直肠癌在内的几种恶性肿瘤中下调,主要通过抑制厌氧糖酵解和共抑制MYC来抑制癌症的发生发展。然而,与之相反的是,Sirt6在乳腺癌,前列腺癌,肝细胞癌和皮肤癌中具有致癌性,敲除Sirt6基因可导致DNA损伤水平增加和对化疗药物的敏感性增强。在血液系统疾病中,Michele Cea.等人报道Sirt6在多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）细胞中高表达,并且与对DNA损伤剂的抗性密切相关,这一作用归因于MAPK/ERK2/p90RSK信号传导抑制。Cagnetta等人报道了急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞中Sirt6 mRNA表达上调相关的生物学相关性,基因组不稳定性和不良预后。在人类AML的体外和鼠异种移植模型中,Sirt6表达的下调会促进基因组不稳定性,增加药物敏感性。如上所述,Sirt6在癌症中发挥双刃剑的作用,是肿瘤治疗的潜在靶点。精准治疗时代,小分子靶向药已取得良好的临床获益,其应用在癌症治疗中愈显重要。OSS＿128167是靶向Sirt6的新型特异性抑制剂,对Sirt6,Sirtl和Sirt2的IC50值分别为89、1578和751μM。它能够渗透细胞膜,在培养的细胞中具有生物学活性,增加H3K9的乙酰化和GLUT-1的表达。鉴于其研发不久,针对它的研究仍处于早期阶段。Michele Cea.等人的研究提示OSS＿128167能够使原代MM细胞以及对阿霉素和美法仑耐药的MM细胞系敏感,增加对化疗反应的敏感性,具有一定的临床应用前景。然而,Sirt6在DLBCL中的作用及其分子机制目前仍不甚清楚,OSS＿128167在DLBCL是否具有调控作用和治疗潜力也有待探究。本研究旨在探讨Sirt6在DLBCL中的表达模式,功能机制和潜在的临床相关性,并进一步研究其靶向小分子抑制剂OSS＿128167在DLBCL中的调控作用,寻找DLBCL诊断治疗的新靶点。第一部分 Sirt6在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达、生物学作用及临床意义目的:弥漫大B细胞淋巴瘤是临床,病理和分子异质性疾病,目前已相应开发出各种临床、病理及分子标志物来表征该疾病。DLBCL患者的治疗是一个活跃的研究领域,使用标准一线治疗的5年总生存率约为60-70%。多达三分之一的DLBCL患者最终对R-CHOP方案产生耐药性,而其余的治疗选择受到限制。针对特定分子发现的精准医疗,靶向药物的发明和免疫疗法为改善DLBCL的治疗打开了新大门。Sirt6的酶促活性多样,可以调节葡萄糖/脂质代谢,DNA修复,转录调控和端粒维护等生物学过程。Sirt6充当细胞途径检查点控制器,并负责细胞增殖和存活的调节。它的异常表达与多种疾病密切相关,如糖尿病、心脏病以及癌症等。在MEF中,Sirt6敲除导致肿瘤发生,而与癌基因的激活无关,这表明该分子可能起抑癌作用。临床样品分析也显示,Sirt6在几种恶性肿瘤（如直肠癌）中下调。相反,据报道,Sirt6在乳腺癌,前列腺癌,肝细胞癌和皮肤癌中具有致癌性。敲除Sirt6导致DNA损伤水平增加,且对化学疗法的敏感性增强。Sirt6在MM细胞中高表达,并且与对DNA破坏剂的抗性密切相关。目前尚无Sirt6在DLBCL中的表达水平和生物学功能的文献报道,因此本部分主要探讨Sirt6在DLBCL中的表达水平,生物学功能和临床意义。材料与方法:1.使用GEO数据分析Sirt6在DLBCL中的表达情况及预后意义;2.DLBCL/反应性淋巴结炎（reactive hyperplasia lymphoid,RHL）病例选择及标本收集;3.免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）;4.DLBCL细胞培养;5.PBMCs（peripheral blood mononuclear cells,外周血单个核细胞）提取;6.实时荧光定量 PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）;7.蛋白质免疫印迹分析（Western Blot,WB）;8.慢病毒载体介导Sirt6基因的敲减及过表达;9.RNA 测序（RNA-sequencing,RNA-seq）检测 shSirt6 与 shControl 组的差异表达基因;10.Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测细胞增殖;11.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡;12.PI检测细胞周期;13.DLBCL异种移植小鼠模型体内检测Sirt6对DLBCL生长的影响;14.统计学分析。结果:1.在GEO数据库中分析Sirt6在DLBCL患者和正常对照中的表达水平,发现Sirt6在DLBCL中的表达水平显着上调（p<0.001）。qPCR和WB结果表明,在DLBCL细胞系（LY1,LY8,LY3,Val）中,Sirt6的mRNA和蛋白水平均高于健康对照细胞。免疫组化染色显示,DLBCL中Sirt6表达显着高于对照组,且Sirt6蛋白表达水平与DLBCL患者的年龄（p=0.009）,Ann Arbor分期（p=0.036）和国际预后指标（IPI,p=0.045）得分呈正相关。2.GEO数据集GSE32918的Kaplan-Meier生存曲线分析表明,DLBCL中Sirt6表达较高患者的总生存时间（Overall survival,OS）相对较短（p=0.0023）。基于免疫组化结果的生存分析亦表明,Sirt6染色阳性的DLBCL患者较染色阴性的DLBCL患者OS缩短（p=0.039）。3.采用 GeneChem 公司构建的 Sirt6 敲减慢病毒（shSirt6#1,shSirt6#2,shSirt6#3）,Sirt6过表达慢病毒（lvSirt6）以及阴性对照慢病毒（shControl）转染DLBCL细胞（LY1,LY8,Val）。3种敲减慢病毒介导的RNA干扰载体在人DLBCL细胞中均显示出敲低作用,其中shSirt6#1敲减效率最高。转染lvSirt6的细胞显示出明显升高的Sirt6表达。与带有空载体的细胞相比,shSirt6组的DLBCL细胞表现出明显的生长抑制作用（p<0.01）,而lvSirt6对细胞的增殖能力没有影响（p>0.05）。在体内实验中,接种稳定转染shSirt6组的小鼠与shControl组相比,皮下肿瘤生长受到明显抑制（p<0.01）,且伴有Sirt6低表达的小鼠DLBCL组织显示出较低的Ki-67阳性率。提示Sirt6对DLBCL细胞增殖发挥了正调控的作用。4.RNA测序分析显示,Sirt6似乎与细胞凋亡、周期,DNA损伤修复（DNA damage response,DDR）密切相关。Annexin V-PE/7AAD 细胞凋亡试验表明,shSirt6促进DLBCL细胞的凋亡。相反,Sirt6过表达抑制细胞凋亡。此外,Sirt6敲减可促进cleaved-PARP的表达增加。PI染色检测细胞周期,结果表明与转染shControl的细胞相比,Sirt6敲减后发生G2/M期细胞阻滞,p27和CDK2的蛋白表达也随之变化。提示Sirt6可以通过加速细胞周期的G2/M期并降低细胞凋亡率来促进DLBCL细胞存活。5.通过细胞毒性试验研究了 Sirt6在对阿霉素和苯达莫司汀的药物反应中的作用。将shSirt6细胞和对照细胞暴露于预定浓度的阿霉素或苯达莫西汀48小时检测细胞增殖,发现联合shSirt6后DLBCL细胞增殖明显减少（p<0.05）。ATM-Chk2和ATR-Chkl信号级联反应调节DDR和细胞周期检查点,我们的蛋白质印迹实验表明,转染shSirt6的细胞中,磷酸化的ATR和磷酸化的Chk1的表达降低,这可能揭示了 Sirt6敲减可以使DLBCL细胞对化疗药物敏感的机制。这些结果与我们RNA测序分析的结果也是一致的。结论:1.Sirt6在DLBCL病理组织中及细胞系中表达水平显着增高,且Sirt6蛋白表达增高与DLBCL患者的疾病进展及较短的OS相关。2.Sirt6促进DLBCL的增殖;3.Sirt6抑制DLBCL的细胞凋亡,促进细胞周期G2/M期进展;4.Sirt6抑制可增强DLBCL对化疗药物的敏感性。第二部分 Sirt6特异性抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学作用目的:近年来,小分子靶向治疗在癌症治疗,包括恶性血液系统疾病的治疗中已取得良好的临床获益。OSS＿128167是一种Sirt6特异性小分子抑制剂,可渗透细胞膜并在培养的细胞中具有生物活性,能够增加H3K9乙酰化和GLUT-1表达。哈佛大学研究团队发现,OSS＿128167能够增加MM细胞对化疗反应的敏感性,具有一定的临床应用前景。但是,目前针对Sirt6及其抑制剂OSS＿128167的研究仍处于早期阶段,因此我们旨在探究Sirt6抑制剂在DLBCL中是否具有调控作用和治疗潜力。材料与方法:1.DLBCL原代细胞及细胞系培养;2.CCK-8实验检测细胞增殖和药物增敏;3.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡;4.PI检测细胞周期;5.DLBCL异种移植小鼠模型体内检测OSS＿128167对DLBCL生长的影响;6.免疫组织化学染色;7.统计学分析。结果:1.不同浓度的OSS＿128167作用于原代DLBLC细胞和DLBCL细胞系（LY1,LY8）24-72小时,与对照组相比,OSS＿128167降低了原代DLBCL细胞的细胞活力,在DLBCL细胞系中,细胞增殖亦出现明显抑制,且抑制显示出时间和剂量依赖性。2.与80μM OSS＿128167孵育48小时后,与对照组相比,原代DLBCL细胞和DLBCL细胞系（LY1,LY8）中早期凋亡的细胞数显着升高。3.逐渐增加的OSS＿128167浓度也影响DLBCL细胞的细胞周期进程。随着OSS＿128167浓度逐渐增高,G2/M期细胞计数也逐渐升高。这与先前研究中Sirt6抑制后引起G2/M期细胞阻滞一致。4.在SCID小鼠的异种移植模型中,用OSS＿128167处理的小鼠肿瘤与PBS处理组相比,生长受到明显抑制,且小鼠皮下肿瘤组织中Sirt6、Ki-67表达水平降低。结论:OSS＿128167在DLBCL细胞中抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,诱导周期阻滞。说明OSS＿128167在DLBCL中发挥抗淋巴瘤作用,有望成为DLBCL新的靶向治疗药物。第三部分 Sirt6通过激活PI3K/Akt信号通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤的生长目的:我们通过前期实验发现Sirt6在DLBCL中表达水平增高,与预后相关,且可参与调节DLBCL细胞的多种生物学功能,如细胞增殖、凋亡、细胞周期、DNA损伤修复等,而Sirt6调节DLBCL细胞的机制尚不清楚。本研究旨在探讨Sirt6对DLBCL细胞调控的作用机制,为寻找DLBCL的新的治疗靶点提供理论依据。材料与方法:1.细胞培养;2.慢病毒载体介导Sirt6基因的敲减;3.RNA 测序的差异基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）;4.蛋白提取和Western Blot;5.CCK-8法检测细胞增殖;6.DLBCL异种移植小鼠模型建立,小鼠肿瘤组织提蛋白WB;7.统计学分析。结果:1.筛选稳定低表达Sirt6的细胞以及对照细胞行RNA测序,使用GSEA探索了Sirt6调控的潜在机制,发现Sirt6在PI3K/Akt和FOXO信号传导途径中功能丰富。WB提示,与对照细胞相比,在shSirt6细胞中PI3Kpll0α及其下游靶分子Akt（Ser473）和mTOR蛋白的活化水平显着降低,PTEN、p-4EBP1和FoxO1蛋白的表达水平增加。2.在DLBCL细胞的异种移植小鼠肿瘤组织中,shSir6组与shControl组相比,Sirt6表达降低,并且PI3Kp110α、Akt、mTOR磷酸化水平降低,PTEN表达增高,与体外实验相一致。3.使用PI3K信号激活剂胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）来进一步研究Sirt6修饰DLBCL细胞中PI3K信号的能力。与shControl相比,未接受IGF-1处理的shSirt6细胞显示出较低的LY1和LY8细胞增殖,接受IGF-1处理的细胞的增殖能力有部分恢复。IGF-1处理shSirt6细胞后,部分逆转了 PI3K、Akt和mTOR磷酸化蛋白表达的降低。结论:Sirt6可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来促进DLBCL细胞的生长,从而促进DLBCL的发生发展。这些发现为Sirt6在DLBCL中的致癌活性提供了机制方面的见解,并为DLBCL的预后评估及靶向治疗提供了新的实验基础和理论依据。
陈媛媛[4]（2021）在《长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制》文中指出一、背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球第三大最常见的癌症,尽管早期诊断和干预方面的技术进步已经有效改善了结直肠癌的总体生存率,但鉴于结直肠癌高复发率、高转移性及抗癌治疗的耐受性,晚期结直肠癌患者的预后仍然较差。术前放疗是晚期结直肠癌的常规治疗方法之一,但是近三分之一的结直肠癌患者对放疗表现出低敏感性或者完全抵抗。因此,放疗抵抗仍是治疗结直肠癌面临的主要挑战。在“精准医疗”的时代,探索克服放疗抵抗的新靶点或新分子,是个体化治疗结直肠癌患者的重要工具,对于提高结直肠癌患者的总体生存率有十分重要的意义。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是一种精确的信号级联系统,可以检测DNA损伤并决定受损细胞的命运,是肿瘤生物学研究的重要领域之一,尤其在肿瘤的放疗敏感性调控中起关键作用。肿瘤细胞产生放疗抗性的重要原因是,癌细胞可以识别电离辐射诱导的DNA损伤,并通过激活各种途径修复这些损伤,癌细胞对DNA损伤具有较高的修复活性,因此对放疗产生高度抵抗。结直肠癌的发生也与癌基因、抑癌基因和DNA修复相关基因突变有关,如KRAS、TP53和BRCA1/2突变等,这些突变会引起基因组不稳定性,促进癌变过程。研究显示,靶向DNA损伤修复可以有效提高结直肠癌对放疗的敏感性,但关于DNA损伤修复的调控机制仍不清楚,研究发现了很多新的调控分子在DDR中发挥关键作用。因此,进一步寻找肿瘤中DNA损伤修复异常激活的新靶点或新分子,对于克服放疗抵抗、提高癌症治愈率具有重要意义。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）可以调节多种生物学过程,如细胞周期、细胞分化、X染色体失活、m RNA选择性剪接、RNA转录和翻译等。多项研究表明,lnc RNA失调是结直肠癌发生的主要因素之一,它通过调控其靶基因的表达,影响结直肠癌中的信号通路、癌细胞转移以及对放疗的敏感性。lnc RNA在DNA损伤修复中具有重要作用,它可以通过直接或间接的转录方式与蛋白质、DNA或RNA相互作用,调控DNA损伤修复。因此lnc RNA通过DNA修复通路调控结直肠癌对放疗的敏感性已经成为临床研究的一个重要领域,探索能够通过DDR通路调节结直肠癌放疗抗性的候选lnc RNA及其分子机制,对于改善结直肠癌患者的临床疗效意义重大。但是,目前大多数lnc RNA在DDR中的功能在很大程度上尚未阐明。ATR是检查点信号通路的中心转导因子,它可被DNA损伤和复制应激激活,在DNA损伤修复、细胞周期调节和细胞凋亡中具有广泛的功能和重要的生理意义。基于我们前期发现DNA损伤修复关键分子ATR具有结合lnc RNA能力的认知前提,本课题以此为切入点,利用RNA免疫共沉淀与高通量测序（RIP-seq）筛选出与ATR结合的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR验证,筛选出与ATR结合丰度最高的SCARNA2,从DNA损伤修复角度,全面探索了它调控结直肠癌放疗敏感性的具体效应及分子机制,为开发潜在的、预测结直肠癌放疗敏感性的标志物和治疗靶点提供了新的科学依据。二、研究内容及方法（一）Lnc RNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨1、RIP-seq筛选ATR结合的lnc RNA首先选用ATR抗体通过RNA免疫共沉淀方法（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）富集与ATR结合的RNA,通过高通量二代测序筛选与ATR结合的lnc RNA,选取排名前30位的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR的方法验证它们与ATR的相互作用关系,发现SCARNA2与ATR的结合丰度最高,因此将目标靶分子确定为SCARNA2。通过探究SCARNA2在15种细胞系的基础表达量,确定研究细胞系为结肠癌细胞系HCT116和HT29。2、DNA损伤对SCARNA2表达水平的影响将HCT116和HT29细胞经电离辐射（Ionizing radiation,IR）、DNA损伤诱导剂喜树碱（Camptothecin,CPT）或依托泊苷（Etoposide,ETO）处理后,在不同时间点分别提取细胞的RNA,经反转录和RT-PCR检测SCARNA2转录水平的变化。将HCT116和HT29细胞分别与DDR通路抑制剂（DNA-PKcs抑制剂Nu7441、ATM抑制剂Ku-55933、ATR抑制剂VE-821）孵育后,再分别用IR、CPT或ETO处理细胞后,在SCARNA2响应DNA损伤最明显的时间点提取RNA,RT-PCR检测DDR通路抑制剂对SCARNA2转录水平的影响。3、SCARNA2对DNA损伤修复通路的影响通过慢病毒包装质粒系统构建SCARNA2敲低（sh-SCARNA2）、CRISPR Cas9敲除（sg-SCARNA2）和过表达（SCARNA2-OE）稳转细胞系,通过RT-PCR测定下调和过表达效率。通过彗星电泳检测SCARNA2下调细胞照后的DNA损伤程度;通过免疫荧光的方法检测SCARNA2干扰细胞在照后0、0.5、4、8、12和24 h形成γH2AX和53BP1 foci的动态变化情况。最后通过蛋白凝胶电泳（Western Blot,WB）的方法检测SCARNA2下调细胞经IR、CPT或ETO处理后,DDR通路相关蛋白分子的表达水平变化情况。（二）Lnc RNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径的调控作用及机制1、下调SCARNA2对细胞照后基因转录组的影响取对照组和SCARNA2敲除组细胞,通过RNA-seq检测下调SCARNA2对照后基因转录组的影响。2、SCARNA2对非同源末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）和同源重组（Homologous recombination,HR）修复方式的影响通过构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统测定SCARNA2下调细胞中NHEJ或HR的修复效率。通过免疫荧光检测下调SCARNA2对细胞核中形成RAD51和RPA2 foci的动态变化过程的影响。3、SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定通过RNA pull down实验筛选HCT116细胞中与SCARNA2结合的蛋白复合物,然后通过质谱检测,筛选与SCARNA2结合的蛋白。4、SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作情况的影响通过免疫共沉淀的方法探讨SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作及蛋白修饰的影响。（三）Lnc RNA SCARNA2促进DNA损伤修复调控结直肠癌放疗敏感性1、SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的影响采用SCARNA2下调和过表达细胞系,经IR、CPT、ETO等处理后,通过克隆形成率、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以及Western Blot检测SCARNA2对结肠癌细胞存活率、增殖能力和细胞活力、细胞凋亡率及细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响,进而探究SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用。通过流式细胞术和Western Blot检测结肠癌细胞经IR、CPT、ETO等处理后,SCARNA2对细胞周期进程以及周期通路相关蛋白水平变化的影响。2、SCARNA2对裸鼠荷瘤（CDX）模型放射敏感性的影响构建人源肿瘤细胞系裸鼠皮下荷瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）,通过测量照后裸鼠皮下荷瘤肿瘤的体积,探究SCARNA2对瘤体细胞增殖能力的影响;通过对肿瘤组织进行TUNEL染色,检测SCARNA2肿瘤细胞的凋亡情况;通过对肿瘤组织进行免疫组化染色,探究SCARNA2对HR通路相关分子蛋白表达水平的影响。通过以上体内实验,探究SCARNA2对裸鼠皮下肿瘤放疗敏感性的调控作用。3、SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结肠癌组织中的表达差异通过组织芯片荧光原位杂交（Florescence In-Situ Hybridization,FISH）的方法分别检测临床结直肠癌病人放疗敏感和抵抗的肿瘤组织中,SCARNA2、ATR的表达以及二者共定位情况。具体研究内容及方法见技术路线图（图1）图1.技术路线图三、研究结果:（一）Lnc RNA SCARNA2可以促进结肠癌细胞的DNA损伤修复1、通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,它在结肠癌细胞中的基础表达量相对较高,并且以时间依赖性的方式响应由IR、CPT和ETO诱导的DNA损伤应答;当使用ATM和ATR抑制剂后,显着抑制了SCARNA2对DNA损伤的响应,说明DNA损伤诱导的SCARNA2上调受ATM/ATR激酶调控。2、下调SCARNA2会显着加重电离辐射导致的DNA损伤,同时延缓了DNA损伤的修复过程;并且抑制了由IR、CPT或ETO诱导的ATR-Chk1通路的激活。（二）Lnc RNA SCARNA2通过HR通路调控DNA损伤修复1、SCARNA2通过HR通路促进DNA损伤修复,下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2在损伤位点的募集,进而延缓了DNA损伤修复过程。2、SCARNA2结合蛋白主要富集在细胞周期、DNA损伤修复、DNA复制与合成、RNA转录及翻译等通路。SCARNA2的缺失会对细胞周期、细胞凋亡以及DNA损伤刺激反应的相关基因转录组产生影响。此外,下调SCARNA2可以抑制ATR与HR通路相关蛋白如Top BP1、NBS1、Mre11、Chk1等的相互作用。3、SCARNA2的缺失抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化,其机制可能与Chk1甲基化或泛素化的修饰方式有关。（三）Lnc RNA SCARNA2通过促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌的放疗敏感性1、照射和DNA损伤剂处理后,下调SCARNA2可以降低结肠癌细胞的存活能力、增殖能力和细胞活力;促进细胞凋亡,抑制G2/M周期阻滞。2、通过移植瘤内多点注射sg-SCARNA2慢病毒载体,成功下调了瘤体细胞内SCARNA2的表达水平,发现下调SCARNA2可以抑制照后肿瘤的生长速度、促进肿瘤细胞的凋亡,并抑制照后肿瘤细胞的HR修复通路。3、相较放疗敏感的结直肠癌组织,SCARNA2在放疗抵抗的结直肠癌组织中的表达水平高了80%左右（p<0.00001）。四、结论:本研究通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,通过一系列的体内外生物学实验发现SCARNA2与结肠癌细胞的DNA损伤修复和放射敏感性密切相关,SCARNA2的缺失可以抑制结肠癌细胞的DNA损伤修复能力。与DNA损伤诱导剂或IR联合使用,可以促进肿瘤细胞凋亡,增加了结肠癌细胞对放射的敏感性。通过对其具体机制的探讨,发现SCARNA2通过HR修复方式参与DNA损伤修复。缺失SCARNA2抑制了ATR下游靶点Chk1的磷酸化,其机制可能与Chk1发生了甲基化或泛素化修饰有关。同时,下调SCARNA2抑制了CDC25C的磷酸酶活性和Wee1的激活,进而通过影响Cyclin B/CDC2复合物的活性抑制G2/M期阻滞,由此明确SCARNA2通过激活ATR-Chk1-CDC25C/Wee1通路调控细胞周期进程。综上所述,SCARNA2有潜力成为结直肠癌的放疗增敏新靶点。此外,SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着,也有望作为潜在的结直肠癌放疗预后生物标志物。
马淑云[5]（2021）在《DNA-PK-AKT信号通路通过增强微管动态变化促进DNA损伤修复》文中指出基因组的不稳定性与发育缺陷、过早衰老、慢性病、癌症以及抗感染能力下降均具有密切的关系。因此,保证基因组的稳定性对于维持人类健康具有重要的作用。人体内或者所生存的外部环境中存在着各种各样的不利因素使细胞内基因组DNA发生不同类型的损伤,比如双链和单链断裂、碱基损伤等,进而导致基因组不稳定。DNA断裂位点精准、高效的修复对于保证基因组稳定性具有非常重要的作用。在生物体内,DNA双链断裂（DSBs）是最常见的DNA损伤方式。DSBs主要由非同源末端连接（c-NHEJ）和同源重组（HR）两种方式进行修复。当DNA损伤发生之后,DSBs位点以及其周围染色体的移动性会增加,保证两个断裂末端之间能够快速的相遇以及被修复。因此,DNA双链断裂末端的高效移动性对于DSBs能够被快速高效的修复具有至关重要的作用。尽管目前的研究表明,微管的动态变化可以调控DNA断裂末端的运动,但是,当DNA双链断裂发生之后,DSB是通过什么途径诱导微管的动态变化进而反过来调控DNA双链断裂损伤的修复仍然是个未解之谜。通过大量的实验探索,我们发现了一种新的DNA双链断裂诱导的微管应激机制（DMSR）—DSBs诱导中心体成熟以及微管成核和延伸能力增强,进而促进DSBs运动性和c-NHEJ修复。DNA双链断裂导致中心体对中心粒外周蛋白（PCM）的募集,特别是PCNT（Pericentrin）,γ-tubulin,NEDD1等。随着PCM的募集,中心体成熟,中心体成核能力增强,从而促进DSBs运动性的增加以及c-NHEJ修复过程的发生。此外,DNA双链断裂促进的中心体成熟主要发生在细胞静止期（G1）和间期（G0）,并且依赖于DNA-PK-AKT信号通路,而不是传统的有丝分裂细胞时期中促进中心体成熟的PLK1蛋白激酶。当敲除中心体蛋白之后,DMSR和DSBs运动性会极大的减弱,进而导致c-NHEJ修复进程延迟。而且DMSR仅仅持续6-8h左右。当敲除c-NHEJ关键蛋白DNA-PK或者53BP1之后,DMSR现象则会消失。综上所述,我们的研究揭示了一种新的正向调控DNA损伤修复机制:在G1或者G0期的细胞中,DSBs可以促进中心体和微管的动态变化进而促进c-NHEJ修复途径。
刘婷[6]（2021）在《芒果苷促进恶性胶质瘤放疗增敏的机制研究及体内验证》文中研究表明目的:由于胶质母细胞瘤（GBM）的高侵袭性和高复发性,GBM患者预后极差,且放疗效果欠佳。DNA双链断裂的修复（DDR）是GBM产生放疗抗性的主要原因。DDR包括同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两个修复途径,其中NHEJ为肿瘤细胞放疗后修复的主要途径。课题组前期研究结果表明,中药单体芒果苷联合放疗可显着抑制GBM细胞增殖,并抑制DDR。基于此,本论文旨在研究芒果苷通过抑制NHEJ途径从而提高放疗敏感性的分子机制,为以芒果苷为先导化合物的抗GBM靶向药物研发提供理论指导和科学依据。方法:（1）芒果苷处理后,用电离辐射（IR）照射胶质瘤U-87 MG、U-118 MG细胞,对NHEJ修复途径的关键蛋白（53BP1、p-ATM、p-53BP1、γ-H2AX）进行Western Blot检测。（2）通过免疫荧光染色的方法,分析U-87 MG、U-118 MG细胞中DSBs标志蛋白γ-H2AX焦点的聚集情况。（3）芒果苷处理后,用IR照射大鼠永生化施万细胞,免疫荧光分析γ-H2AX焦点的聚集情况,并用ELISA检测施万细胞DNA损伤百分比。（4）构建GBM荷瘤鼠模型,分组进行DMSO、IR、芒果苷、IR+芒果苷处理。测量20天内荷瘤鼠体重,移植瘤体积和重量,以及100天内生存曲线。结果:（1）Western Blot结果显示,芒果苷处理后,调控NHEJ修复途径的关键蛋白ATM、53BP1、H2AX的磷酸化水平明显降低（P<0.01）。这说明芒果苷通过抑制NHEJ途径,阻止DNA损伤修复。（2）免疫荧光染色结果显示,芒果苷给药后,γ-H2AX阳性GBM细胞和细胞核内γ-H2AX焦点显着减少（P<0.01）,揭示了芒果苷能够有效抑制DNA损伤修复,提高GBM放疗敏感性。（3）芒果苷给药后,γ-H2AX阳性施万细胞数与对照组相比无显着性差异（P>0.05）,并且芒果苷对施万细胞的DNA损伤修复水平无影响。（4）芒果苷联合IR治疗可有效增加GBM荷瘤鼠的体重、延长生存时间（n=10,P<0.05）。（5）芒果苷联合IR治疗可显着降低肿瘤体积和重量,抑制肿瘤生长（n=10,P<0.05）。结论:芒果苷对GBM放射治疗具有明显的增敏作用,这可能是芒果苷抑制DNA损伤NHEJ修复途径所介导的,因此,芒果苷可有望研发为改善GBM的放疗敏感性的新型靶向治疗药物。
张志[7]（2021）在《拟南芥蛋白磷酸酶PP7L调控基因组稳定性及发育的功能研究》文中进行了进一步梳理基因组储存了生长发育所需的全部遗传信息,因此,为了应对生长发育过程中产生的DNA损伤,植物建立了精细而有效的DNA损伤响应机制。丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶（PPPs）在所有真核生物中普遍存在,在已有的文献报道中,PPPs可参与DNA损伤修复,但在高等植物中它们的调控功能很大程度上是未知的。PP7L是植物所特有的没有去磷酸化酶功能的PP7亚家族蛋白。前期通过突变体筛选,发现拟南芥蛋白磷酸酶突变体pp7l具有根长显着变短,根尖分生区细胞大量死亡的DNA损伤相关表型以及生长周期延迟、植株矮小、花序减少等一系列发育缺陷表型,从而确定了PP7L在植物的生长发育中发挥不可或缺的作用。本研究利用酵母双杂交技术筛选与PP7L互作的蛋白,结合基因表达量检测、蛋白免疫印迹分析、根尖分生组织干细胞染色观察和全激素测定等方法研究其表达调控模式和生物学功能,从而解析PP7L在维持植物基因组稳定性与发育中的作用。主要研究结果如下:（1）PP7L的T-DNA插入突变体发育缺陷表型鉴定通过对pp7l突变体进行表型分析,发现PP7L的两个T-DNA插入突变体均具有根短、植株矮弱、茎细、叶绿素含量低等表型。q RT-PCR分析结果显示pp7l突变体中的细胞周期调控基因、静止中心细胞分裂调控基因以及DNA损伤应答基因表达量均升高,这一现象可能是由于DNA损伤反应造成的,并可能导致根尖分生组织和静止中心细胞的发育缺陷。（2）通过酵母双杂交筛选获得了DNA损伤修复蛋白SAV6利用酵母双杂交系统筛选PP7L的互作蛋白,通过对阳性克隆PCR产物进行检测,经测序和NCBI数据库Blast比对分析获得了一系列候选互作蛋白。其中互作蛋白SAV6参与DNA损伤修复,在维持植物基因组稳定性与发育中具有重要作用。为了进一步确定初筛得到的SAV6蛋白与PP7L的互作关系,我们依次通过酵母双杂交验证、烟草双分子荧光互补实验、Pull-down实验以及co-IP实验确认了PP7L与SAV6蛋白在植物体内、体外均存在相互作用。通过Cell-free实验和原生质体转化实验,4发现SAV6蛋白的降解程度不受PP7L蛋白的影响,即PP7L不参与调控SAV6蛋白的稳定性。（3）PP7L和SAV6维持根部细胞的正常发育形态通过观察pp7l和sav6突变体幼苗的根尖分生组织干细胞,发现两突变体均存在静止中心细胞发育缺失现象,分生区形态及功能受损严重。由此表明,PP7L与SAV6是拟南芥维持干细胞的正常发育形态所必需的。sav6和pp7l突变体的RNA-Seq结果显示,SAV6和PP7L在调控植物与病原互作、糖代谢、多种氨基酸代谢等通路中具有较高的一致性。（4）SAV6可能通过水杨酸（SA）信号途径调控植株的根长发育对sav6突变体进行激素代谢分析,发现SA和JA含量分别较野生型增加了2.0倍和3.1倍,推测SAV6可以通过SA信号途径影响植株的根长发育。综上所述,当PP7L和SAV6基因功能缺失时,植株表现为根长变短、植株矮弱、叶绿素含量低等一系列生长发育缺陷表型。pp7l和sav6突变体的细胞周期调控基因、静止中心细胞分裂调控基因和DNA损伤应答基因表达量升高,根尖分生组织细胞发育受损,SA含量升高。PP7L与SAV6这一DNA损伤修复蛋白互作,共同参与植物与病原互作,糖代谢等代谢途径,表明PP7L在维持基因组稳定性与植物发育过程中发挥重要作用。
李跃先[8]（2021）在《ITGB1通过调节DNA损伤反应和YAP1诱导的上皮-间质转化调控人非小细胞肺癌放射抵抗的机制研究》文中提出目的:肺癌是第二常见癌症,是导致癌症死亡的主要原因。2020年,全球肺癌死亡人数高达180万例,远高于其他癌症。肺癌可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）两大类,其中NSCLC占肺癌总发生率的80-85%。待临床确诊时有34%为Ⅰ和Ⅱ期,28%为Ⅲ期,38%为Ⅳ期,在各临床分期NSCLC患者治疗中,放射治疗为其重要的局部治疗手段,约（64.3±4.7）%患者在治疗的不同时期需要接受放射治疗。然而,NSCLC放射治疗后仍有较高的局部区域复发率及远处转移率,目前认为,NSCLC对放射治疗的抵抗是导致这一结果的主要原因。肿瘤细胞对放射治疗产生抵抗性的机制是非常复杂的,目前研究表明,相关基因改变、肿瘤微环境、缺氧、代谢改变、肿瘤干细胞、肿瘤异质性、micro RNA、细胞周期以及DNA损伤和修复等多种因素导致肿瘤的放射抵抗。但NSCLC放射抵抗的具体分子机制仍不完全清楚。因此,研究肺癌放疗抵抗机制,并寻找有效的措施减少放疗抵抗,提高放疗敏感性是肺癌放射治疗中亟待解决的问题。研究方法:第一部分:基于课题组前期对NSCLC放射抵抗细胞系与其亲代细胞系测序结果,对差异表达m RNA进行进一步生物信息学分析。结合KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析,以及查阅文献,发现细胞粘附在放射抵抗中起到了重要的作用,因此对富集于粘附及相关通路的基因进行差异分析。运用STRING数据库对粘附相关差异表达基因进行蛋白互作网络图构建,Cytoscape软件筛选hub基因,在非小细胞肺癌中,对排名前十的hub基因进行表达及预后分析。第二部分:采用流式细胞术细胞凋亡和细胞克隆形成实验,对经10次传代后放射抵抗细胞系的抵抗性进行了重新验证。运用PCR（Polymerase chain reaction）及Western Blot对ITGB1差异表达进行验证。应用R语言对TCGA非小细胞肺癌患者进行ITGB1的肺癌组织中的表达以及其表达与临床相关性分析。采用PCR和Western Blot技术检测1株人支气管上皮细胞和5株非小细胞肺癌细胞系ITGB1m RNA和蛋白水平的表达情况。运用流式细胞术细胞凋亡和细胞克隆形成实验对A549和H522进行放射敏感性的探索。运用慢病毒技术构建H522 ITGB1稳定过表达细胞株以及A549与H460R ITGB1稳定敲除细胞株。应用CCK8和细胞克隆形成实验探索ITGB1对放射后各细胞系增殖及敏感性影响。运用流式细胞术细胞凋亡和细胞周期实验探索ITGB1对放射后各细胞系细胞凋亡和细胞周期的影响。应用免疫荧光技术以及Western Blot检测DNA损伤标志性指标γH2AX,探索ITGB1对放射后各细胞系DNA损伤的影响。采用STRING在线工具构建ITGB1与DNA损伤修复通路蛋白互作网络（Protein-Protein Interaction,PPI）分析,探索潜在的相互作用,并运用Western Blot技术进行了DNA损伤修复通路的检测。运用Western Blot实验检测过表达或敲除ITGB1后EMT相关指标E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin及Zeb1表达变化。使用GEPIA2中的“相关分析”,探索ITGB1与YAP1的Spearman相关系数;使用GEPAI2数据库中的“生存分析”,探索ITGB1与YAP1基因共表达对非小细胞肺癌患者总生存期和无病生存期的影响。运用Western Blot实验探索ITGB1对胞浆及胞核中YAP1蛋白表达,以及其总蛋白表达的影响。结果:第一部分:1.前期课题组成功建立NSCLC放射抵抗细胞系H460R,二代测序分析差异表达m RNA,与亲代细胞相比,抵抗细胞系H460R细胞中有508个m RNA上调,330个m RNA下调。KEGG通路富集分析发现主要富集于细胞粘附相关通路:细胞外基质-受体相互作用通路,焦点粘附及细胞粘附分子信号通路。2.STRING及Cytoscape筛选出Hub基因:ITGB1、ITGA1、ITGB4、ITGA3、ITGA2、LAMA5、COL4A5、LAMB1、LAMA1和COL4A6,排名第一的Hub基因ITGB1在非小细胞肺癌中表达升高,且其表达与预后相关,将对其进行后续研究。第二部分:1.对来自TCGA的NSCLC数据集（1,102例,包括103个正常组织和999个肿瘤组织）的分析显示,ITGB1在NSCLC中高表达,ITGB1表达与临床分期,T分类和M分类显着相关。通过敏感性验证,经过10代后,抵抗细胞系仍能够维持其放射抵抗性,q RT-PCR及Western Blot检测结果证实,与亲代细胞系相比,ITGB1在抵抗细胞系呈高表达。2.ITGB1在各非小细胞肺癌细胞系中不同程度表达,选取ITGB1本体高表达A549和本体低表达H522细胞系进行后续实验,与H522细胞相比,A549细胞照射后的凋亡率更低,集落形成能力及存活率更高。3.我们应用慢病毒构建了A549-sh ITGB1和H460R-sh ITGB1稳定敲除细胞系,构建了H522-ITGB1稳定过表达细胞系,照射后,A549-sh ITGB1和H460R-sh ITGB1的存活率比对照组低,H522-ITGB1细胞的存活率高于对照组。4.流式细胞仪的细胞凋亡分析表明,照射后48h,A549-sh ITGB1和H460R-sh ITGB1组的凋亡细胞比例明显高于对照组,相反,H522-ITGB1细胞中放射线诱导的凋亡发生率明显低于阴性对照细胞,流式细胞术评估细胞周期分布,与阴性对照相比,照射后24h,A549-sh ITGB1和H460R-sh ITGB1细胞中G2/M期的细胞比例较高,而S期中的比例较低,G2/M期的H522-ITGB1细胞比例显着低于阴性对照组,而S期的比例较高。5.我们进行了免疫荧光检测,以检测照射后或未照射时γH2AX的表达,与未照射的细胞相比,A549-sh ITGB1和对照细胞在照射后30分钟时的γH2AX阳性细胞核明显更多,但是,H522-ITGB1细胞阳性核数少于对照组,在两组中,γH2AX阳性细胞核的数量均随电离辐射时间的延长而减少,并在24 h后恢复至基础水平,我们通过蛋白质印迹检测了γH2AX蛋白水平进行了验证,与免疫荧光实验结果相一致。通过ITGB1与DNA损伤修复通路蛋白互作分析,ITGB1可能与ATM/CHK2通路有关,ITGB1沉默后ATM（p-ATM）、CHK2（p-CHK2）和CDC25c（p-CDC25c）的表达降低,而ITGB1的过表达导致这些蛋白在H522细胞中更高的表达。6.敲除ITGB1后,N-cadherin、Vimentin、Snail和Zeb1表达显着下调,E-cadherin表达上调,相反,ITGB1的过表达下调了H522细胞中E-cadherin的表达,并上调了N-cadherin、Vimentin、Snail和Zeb1的表达。7.我们使用GEPIA2研究了LUAD、LUSC和正常组织样品中ITGB1和YAP1之间表达的相关性,在LUAD（Cor=0.37,P<0.01）和LUSC（Cor=0.41,P<0.01）样本中,ITGB1表达与YAP1表达呈正相关。此外,GEPIA2中对NSCLC患者的生存分析表明,这两个基因共同高表达患者总体生存期及无病生存期显着缩短。蛋白质印迹分析显示,当在A549细胞中敲除ITGB1时,YAP1被下调,同时抑制其入核,而在H522-ITGB1组中,YAP1的表达被上调,且细胞核YAP1中表达显着增加。结论:1.二代测序方法筛选出放射抵抗细胞系与亲代细胞系差异表达的m RNA,基于KEGG通路富集分析,进行了深入的挖掘,为后续放射抵抗机制研究提供了有利的线索。2.粘附相关通路对NSCLC细胞放射抵抗的形成具有重要作用,ITGB1是粘附相关通路中关键基因,ITGB1高表达与临床病理特征、预后及放射抵抗形成相关。3.沉默ITGB1可能通过抑制NSCLC细胞DNA修复能力,调节YAP1诱导的EMT,进而逆转NSCLC放射抵抗。
王鹤潼,贾春云,张延召,赵强,李晓军,巩宗强,刘宛[9]（2021）在《植物DNA错配修复系统响应Cd胁迫的研究进展》文中研究表明Cd胁迫下植物细胞内会出现不同形式的DNA损伤（如碱基错配、DNA单/双链断裂和甲基化）,DNA损伤会迅速诱导DNA损伤响应（DDR）信号,如ATM、ATR及其下游的信号通路包括细胞周期阻滞、细胞内复制、细胞凋亡以及不同形式的DNA修复途径（如同源重组修复HR、DNA错配修复MMR）。植物细胞DNA MMR系统中的异源二聚体MutSα（MSH2/MSH6）、MutSβ（MSH2/MSH3）、MutSg（MSH2/MSH7）、MutLα（MLH1/PMS1）与有关酶如增殖细胞核抗原（PCNA）、DNA复制因子C（RFC）、DNA核酸外切酶1（EXO1）、单链结合蛋白（RPA）、核酸内切酶FEN1、DNA聚合酶delta（d）和DNA连接酶相互作用,启动DNA MMR反应,从而在感知Cd诱导的DNA损伤、修复DNA损伤、激活细胞周期检验点、确保基因组DNA的稳定性和DNA复制的精确性等方面发挥关键作用。然而,MutS缺失的植物细胞会绕过DNA MMR系统参与的细胞周期阻滞,从而严重影响植物的耐Cd性能。本文重点介绍了植物DNA MMR系统对Cd胁迫的响应以及表观遗传对DNA MMR系统的调控作用机理。
刘飞[10]（2021）在《极光激酶A调控肠癌放射敏感性的研究》文中研究指明目的:据我国2018年癌症统计数据显示,结直肠癌（colorectal cancer,CRC）发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中分别位居第3位和第5位,其中新发病例37.6万,死亡病例19.1万。近年来,我国结直肠癌的发病率和死亡率均呈现上升趋势,已成为严重危害我国居民健康的恶性肿瘤之一。值得注意的是,我国直肠癌发病率占全部结直肠癌的30～60%,显着高于西方国家。目前,局部晚期直肠癌的标准治疗方案为直肠癌术前新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiation therapy,n CRT）。然而,不同的直肠癌患者放疗的敏感性具有显着差异,总体病理完全缓解（Pathological complete remission,PCR）率仅为20%左右。因此,早期预测患者放疗敏感性以及寻找增强患者放射治疗敏感性的新靶点和新策略具有重要的临床意义。极光激酶A（Aurora kinase A,AURKA）又称BTAK（breast tumor activated kinase）或STK15（serine threonine kinase 15）于1995年由Glover博士在研究黑腹果蝇纺锤体组织缺陷相关等位基因突变的过程中首次发现,属于Ser/Thr蛋白激酶家族。AURKA主要调控中心体和微管的功能,在细胞有丝分裂过程中扮演重要角色。同时,AURKA通过介导多种信号传导通路,如:MDM2/p53信号通路;PI3K/AKT信号通路;NF-κB信号通路;JAK2/STAT3信号通路;ATM/CHK2/p53（DNA损伤修复反应途径）通路;BRCA1/2信号通路等。进而调控多种细胞生物学行为,包括细胞周期,细胞凋亡和细胞衰老等。目前,直肠癌患者肿瘤组织中AURKA表达水平与患者放疗敏感性及不良预后之间的关系未有报道,AURKA对直肠癌放射治疗敏感性的影响尚不清楚。因此,在本研究中我们将探讨直肠癌患者肿瘤组织极光激酶A表达水平与直肠癌患者放射敏感性及不良预后之间的关系;明确极光激酶A在结直肠癌细胞恶性表型,包括细胞增殖、迁移与侵袭、细胞周期、细胞凋亡以及结直肠癌细胞对电离辐射敏感性的影响,并深入阐明极光激酶A通过靶向调控c-Myc/CDK1/cyclin B1信号通路参与结直肠癌细胞对电离辐射的敏感性,为AURKA作为放疗增敏的潜在分子靶点及作为预测直肠癌放疗预后指标提供实验基础与临床依据。研究方法:1、收集自2013年3月至2018年6月在辽宁省肿瘤医院接受术前新辅助放化疗的直肠癌患者130例,所有患者均术前经电子肠镜检查取得明确病理学诊断。采用免疫组化（IHC）方法检测AURKA在局部晚期直肠癌患者组织中的表达水平,进而分析AURKA表达水平与临床病理因素及放射治疗预后的相关性。2、采用Western blot方法检测结直肠癌细胞HCT116、HT-29、SW480、Lo Vo,COLO205和RKO细胞中AURKA蛋白的表达水平。通过慢病毒包装的AURKA-shRNA感染HCT116和HT-29细胞,加入嘌呤霉素进行筛选并采用RT-PCR和Western blot分别检测AURKA m RNA和蛋白质的表达水平,筛选出AURKA稳定敲减的HT-29-shR-A和HCT116-shR-A细胞株。CCK8法评估下调AURKA对结肠癌细胞HCT116和HT-29细胞增殖能力的影响。采用克隆形成实验考察下调ARUKA对结肠癌细胞放射敏感性的影响。采用细胞划痕愈合实验、Transwell迁移及侵袭实验评价下调AURKA对结肠癌细胞HCT116和HT-29迁移和侵袭能力的影响。采用Annexin V-PE/7AAD双染流式细胞仪检测下调AURKA对细胞凋亡的影响。采用PI单染流式细胞仪检测AURKA对细胞周期的影响。采用脂质体瞬时转染质粒载体上调结肠癌细胞中c-myc的表达。采用Western blot法检测AURKA下游相关信号通路节点蛋白表达变化。3、统计分析采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析。使用χ2检验比较计数资料,使用Kaplan-Meier法估算生存率,log-rank法进行单因素分析,COX回归模型进行多因素分析。实验结果以平均数±标准差（mean±SD）的形式表示,两组之间比较采用t检验或单因素方差分析（One-way ANOVA）,p<0.05具有统计学差异。统计图表由Graphpad prism8版本软件绘制。结果:1、极光激酶A表达水平与直肠癌患者放射敏感性及不良预后之间的相关因素分析在130例接受术前同步放化疗的局部晚期直肠癌患者肠镜组织标本中极光激酶A高表达64.62%（84/130）,低表达为35.38%（46/130）。与患者临床病理因素及的相关性分析中发现极光激酶A表达水平与直肠癌位置（肿瘤距肛门≦5cm或>5cm）（p<0.0108）和复发转移（p<0.0358）密切相关,具有统计学意义。全组患者放疗后达到病理完全缓解（PCR）的有23例（17.69%）,按TRG分级将TRG1+2分为近期疗效良好组,TRG3+4分为近期疗效不佳组进行统计分析差异具有统计学意义（p<0.0317）,即AURKA高表达患者放射治疗疗效相对较差。同时对其他可能与近期疗效相关的因素进行分析显示T分期较晚（p<0.0211）和术前有淋巴结转移（p<0.0173）近期疗效不佳。全组患者1、2年RFS分别为90.70%和82.17%;1、2年OS分别是和98.44%和89.84%。对RFS进行生存分析,单因素分析显示极光激酶A表达水平（p<0.014）、TRG分级（p<0.028）,术后淋巴结转移（p<0.008）和中性粒细胞-淋巴细胞比值（NLR）（p<0.042）影响无复发生存。将单因素分析有意义的指标纳入Cox回归多因素分析,结果显示AURKA表达水平和术后淋巴结转移情况是RFS的独立预后因素。极光激酶A表达情况对复发转移预后的相对危险度为2.766,表明极光激酶A高表达的复发转移风险是低表达患者的2.766倍。术后淋巴结转移情况对复发转移预后的相对危险度为2.153,表明术后淋巴结转移阳性（yp N+）的患者的复发转移风险是阴性患者的2.153倍。2、沉默AURKA基因表达后增强结肠癌细胞对放射治疗的敏感性我们采用通过CCK8法检测HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞的增殖能力,结果显示下调AURKA的HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞较亲本细胞HCT116、HCT116-NC和HT-29、HT-29-NC的增值活性明显下降（p<0.05）。同时,采用克隆形成实验,多靶单击模型拟合出细胞存活曲线,并计算相关放射生物学参数。HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞的D0值分别为2.047和1.891,较对应HCT116-NC和HT-29-NC细胞的3.246和2.205下降,由此而计算的SER分别为1.166和1.585。并且准阈剂量Dq也明显降低,表明下调AURKA表达的HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞放射敏感性明显升高。3、下调AURKA表达抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力细胞划痕愈合实验显示:与空白对照及空载病毒组细胞相比,下调AURKA的HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞划痕愈合速度明显下降,差异具有统计学意义（p<0.05）。可见,下调AURKA表达可以显着降低HCT116和HT-29细胞的迁移能力。同时,采用Transwell实验检测下调AURKA后结肠癌细胞侵袭能力的变化,研究结果显示HCT116-shR-AURKA和HT-29-shR-AURKA细胞较HCT116、HCT116-NC和HT-29、HT-29-NC细胞进入到下室的细胞数明显减少,说明下调AURKA表达后细胞侵袭能力下降（p<0.01）。4、下调AURKA表达水平增强电离辐射诱导HCT116和HT-29细胞的凋亡基于细胞凋亡实验考察AURKA表达对电离辐射诱导条件下HCT116和HT-29细胞凋亡的影响,采用Annexin V-PE/7AAD凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡情况。实验结果显示HCT116-shR-AURKA和HT-29-shR-AURKA细胞较HCT116-sh Control和HT-29-sh Control细胞在电离辐射诱导条件下发生早期凋亡和晚期凋亡的细胞数均明显增多,表明细胞凋亡水平增加。以上结果说明,下调AURKA表达水平能促进电离辐射诱导的HCT116和HT-29细胞的凋亡能力（p<0.05）5、下调AURKA表达对电离辐射诱导条件下HCT116和HT-29细胞周期分布的影响采用细胞周期检测试剂盒检测下调AURKA后对电离辐射诱导条件下HCT116和HT-29细胞周期的影响,使用流式细胞仪检测细胞的周期分布。实验结果显示HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞较亲本细胞HCT116-sh Control和HT-29-sh Control在电离辐射诱导情况下增加细胞G2/M期阻滞。结果说明下调AURKA表达水平促进电离辐射诱导的HCT116和HT-29细胞阻滞于G2/M期,从而抑制细胞的有丝分裂。6、下调AURKA表达水平对凋亡通路的影响通过上述的实验结果,我们已经明确AURKA在电离辐射诱导的结肠癌细胞的生物学功能方面的重要作用。在此,我们将揭示AURKA影响电离辐射诱导的结肠癌细胞的分子机制。我们的研究结果发现,靶向敲除AURKA后结肠癌细胞对电离辐射诱导较单独电离辐射（4Gy）处理组或AURKA抑制组,cleaved PARP及Bim水平显着增加,结果提示靶向抑制AURKA能增强电离辐射诱导结肠癌细胞凋亡。7、下调AURKA表达水平对c-Myc信号传导通路的影响我们的实验结果表明,敲低AURKA蛋白表达水平,会降低c-Myc的蛋白表达,同时CDK1,Cyclin B1,Ac H4的蛋白水平也显着降低。AURKA和Myc可以形成AURKA-c-Myc反馈回路,抑制AURKA可降低c-Myc直接和间接介导靶基因的表达。c-Myc可以通过TIP60/MOF介导的Ac H4调控cyclin B1和CDK1依赖性的G2/M细胞周期。处于G2/M期的细胞对辐射敏感,是影响放射敏感性的主要因素之一。因此AURKA可能通过靶向c-Myc作用于CDK1/cyclin B1信号通路进而参与G2/M细胞周期的调控。结论:1、AURKA表达水平与直肠癌患者的放射治疗敏感性和不良预后密切相关,高AURKA表达患者的放疗敏感性低且放射治疗的预后较差。AURKA表达水平可作为直肠癌患者放射治疗的独立预后因素。2、下调AURKA表达能显着增强结肠癌细胞的放射敏感性,抑制癌细胞的迁移与侵袭能力。3、下调AURKA蛋白表达协同放射增强Bim和cleaved PARP表达,增加电离辐射诱导的结直肠癌细胞凋亡能力。4、下调AURKA通过降低c-Myc表达,抑制CDK1/cyclin B1信号传导通路,阻滞细胞周期于G2/M期,从而增强结肠癌细胞HT-29及HCT116的放射敏感性。
二、ATM对DNA损伤后细胞反应信号传导通路的调控作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ATM对DNA损伤后细胞反应信号传导通路的调控作用（论文提纲范文）
（1）煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化效应及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一. 研究背景与意义 |
| 二. 国内外煤尘致病现状与存在问题 |
| 1. 煤尘致呼吸系统疾病现状 |
| 2. 煤尘暴露与肺癌 |
| 3. 煤尘致病机制研究进展 |
| 4. 煤尘致肺组织的遗传物质不稳定 |
| 三. 研究内容、技术路线及研究意义 |
| 1. 主要研究内容 |
| 2. 研究的技术路线 |
| 3. 主要研究意义 |
| 四. 参考文献 |
| 第一部分 煤尘暴露与肺癌风险的Meta分析 |
| 一. 材料与方法 |
| 1. 文献检索 |
| 2. 文献筛选与数据提取 |
| 3. 文献质量评价 |
| 4. 统计学分析 |
| 二. 结果 |
| 1. 文献纳入结果 |
| 2. 纳入研究的基本信息与质量评价 |
| 3. 综合分析 |
| 4. 敏感度分析和发表偏倚评价 |
| 5. 亚组分析 |
| 三. 讨论 |
| 四. 结论 |
| 五. 参考文献 |
| 第二部分: 煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化效应研究 |
| 一. 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二. 结果 |
| 1. 煤尘的理化性质 |
| 2. 煤尘暴露致BEAS-2B~(CD)细胞形态学异常 |
| 3. 煤尘暴露致BEAS-2B~(CD)细胞增殖活力、迁移及DNA修复能力显着增强 |
| 4. 煤尘暴露致BEAS-2B~(CD)细胞基因组不稳定 |
| 5. 煤尘暴露致BEAS-2B~(CD)细胞内病理性信号通路显着上调 |
| 6. 煤尘暴露赋予BEAS-2B~(CD)细胞体内成瘤潜能 |
| 三. 讨论 |
| 四. 结论 |
| 五. 参考文献 |
| 第三部分 煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化机制研究 |
| 一. 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二. 结果 |
| 1. 煤尘暴露BEAS-2B细胞触发线粒体损伤 |
| 2. 线粒体损伤诱导DNA断裂 |
| 3. DNA断裂激活HR/NHEJ修复酶及其相关联的AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路 |
| 4. AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路增强BEAS-2B~(CD)细胞增殖活力、迁移能力并激活原癌基因转录因子 |
| 5. 抑制AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路降低BEAS-2B~(CD)细胞增殖活力、周期进展、迁移能力并促进细胞凋亡 |
| 三. 讨论 |
| 四. 结论 |
| 五. 参考文献 |
| 结论 |
| 主要创新点 |
| 综述 线粒体功能异常与肿瘤的发生与发展 |
| 1. 线粒体代谢与肿瘤 |
| 2. 线粒体动力学与肿瘤 |
| 3. 线粒体凋亡与肿瘤 |
| 4. 线粒体基因组不稳定与肿瘤 |
| 5. 线粒体ROS与肿瘤 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
（2）电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肺癌现状与放射治疗 |
| 1.1.1 肺癌现状 |
| 1.1.2 肺癌放射治疗及综合治疗进展 |
| 1.2 DNA损伤形成及应答 |
| 1.2.1 DNA损伤在放射治疗中的形成 |
| 1.2.2 DNA损伤监督 |
| 1.2.3 DNA损伤识别修复 |
| 1.2.4 DNA损伤诱导的细胞死亡 |
| 1.3 线粒体功能紊乱 |
| 1.3.1 线粒体功能紊乱与癌症的形成和发展 |
| 1.3.2 线粒体与辐射抗拒性 |
| 1.3.3 Ras/PI3K/Akt/mTOR通路 |
| 1.3.4 线粒体翻译 |
| 1.4 DNA损伤应答和线粒体功能紊乱的相互作用 |
| 1.4.1 细胞核与线粒体之间的双向信号 |
| 1.4.2 DNA损伤应答与线粒体功能的共同调控通路 |
| 1.5 本文研究目的及意义 |
| 第2章 重离子诱导非小细胞肺癌复杂性DNA损伤的识别及修复 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 细胞来源 |
| 2.2.2 试剂及药品 |
| 2.2.3 主要使用仪器 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 细胞培养传代 |
| 2.3.2 辐照与博来霉素处理 |
| 2.3.2.1 X射线辐照 |
| 2.3.2.2 碳离子辐照 |
| 2.3.2.3 博来霉素处理 |
| 2.3.3 细胞增殖检测CCK-8 实验 |
| 2.3.4 克隆形成实验 |
| 2.3.5 DNA凝胶电泳及DNA损伤频率的计算 |
| 2.3.6 免疫荧光试验 |
| 2.3.7 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 2.3.8 数据统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 非小细胞肺癌对X射线和碳离子的辐射敏感性具有差异 |
| 2.4.2 X射线辐照及联合博来霉素对A549 细胞活性的影响 |
| 2.4.3 碳离子联合博来霉素诱导最明显的复杂DSB损伤 |
| 2.4.4 复杂DSA损伤的动态识别 |
| 2.4.5 复杂DNA损伤的主要修复方式可能为非同源末端连接(NHEJ) |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 重离子联合替加环素诱导非小细胞肺癌线粒体功能紊乱的机理研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 细胞来源 |
| 3.2.2 试剂及药品 |
| 3.2.3 主要使用仪器 |
| 3.3 实验方法与步骤 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 辐照与替加环素处理 |
| 3.3.2.1 碳离子辐照 |
| 3.3.2.2 替加环素处理 |
| 3.3.3 克隆形成实验 |
| 3.3.4 免疫荧光实验 |
| 3.3.5 细胞凋亡实验 |
| 3.3.6 细胞内ATP检测 |
| 3.3.7 线粒体膜电势检测 |
| 3.3.8 线粒体内Ca~(2+)水平检测 |
| 3.3.9 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 3.3.10 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 碳离子、替加环素以及两者联合作用均能显着抑制肺癌细胞增殖 |
| 3.4.2 碳离子、替加环素以及两者联合作用均诱导线粒体功能紊乱 |
| 3.4.3 碳离子、替加环素及两者联合作用诱导细胞凋亡 |
| 3.4.4 碳离子、替加环素及两者联合作用在H1299 细胞中诱导自噬 |
| 3.4.5 碳离子通过Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白 |
| 3.4.6 碳离子通过p53和Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白 |
| 3.4.7 P53 缺失的H1299 细胞对线粒体翻译抑制更加敏感 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 DNA损伤与线粒体功能紊乱的共同应答通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 细胞来源 |
| 4.2.2 试剂及药品 |
| 4.2.3 主要使用仪器 |
| 4.3 实验方法与步骤 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 辐照与抑制剂处理 |
| 4.3.2.1 辐照 |
| 4.3.2.2 抑制剂处理 |
| 4.3.3 克隆形成实验 |
| 4.3.4 线粒体内Ca~(2+)水平检测 |
| 4.3.5 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 4.3.6 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ATM抑制剂KU-55933 增加A549 细胞对碳离子的辐射敏感性 |
| 4.4.2 抑制ATM下调碳离子辐照后DSB损伤修复蛋白的表达 |
| 4.4.3 KU-55933 增加碳离子辐照后线粒体Ca~(2+)水平 |
| 4.4.4 ATM调控p53和mTOR参与碳离子辐照应答 |
| 4.4.5 自噬受ATM通路的调控参与碳离子应答 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文及研究成果 |
（3）Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一部分 Sirt6在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达、生物学作用及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分 Sirt6特异性抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学作用前 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第三部分 Sirt6通过激活PI3K/Akt信号通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤的生长 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 中文综述 Sirt6在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English article Ⅰ |
| English article Ⅱ |
（4）长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、~(60)Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、总RNA的提取、纯化及质量评估 |
| 4、RNA的反转录 |
| 5、实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 6、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 7、RIP-seq生信分析 |
| 8、SCARNA2下调(敲低/敲除)和过表达细胞系的构建 |
| 9、蛋白凝胶电泳(Western Blot) |
| 10、中性彗星电泳(Comet Assay) |
| 11、免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 12、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| 1、RNA免疫共沉淀及高通量测序 |
| 2、ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| (二)SCARNA2的染色体定位及二级结构预测 |
| (三)SCARNA2在不同肿瘤细胞系中表达 |
| (四)结肠癌细胞在应答IR和 DNA损伤诱导剂时SCARNA2转录水平的变化 |
| 1、SCARNA2可以响应IR诱导的DNA损伤 |
| 2、SCARNA2可以响应CPT和 ETO诱导的DNA损伤 |
| (五)DDR通路抑制剂对SCARNA2表达水平的影响 |
| (六)SCARNA2下调和过表达细胞系的构建与验证 |
| (七)下调SCARNA2显着增加结肠癌细胞受到照射后的DNA损伤程度 |
| (八)下调SCARNA2显着抑制照后结肠癌细胞的DNA损伤修复过程 |
| (九)SCARNA2对DNA损伤修复信号通路的影响 |
| 1、下调SCARNA2可以抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 2、下调SCARNA2可以抑制由CPT和 ETO诱导的DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 LncRNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、真核RNA-seq测序 |
| 2、构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统 |
| 3、RNA pull down-MS |
| 4、蛋白免疫共沉淀(IP) |
| 5、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)敲除SCARNA2对照后基因转录组的影响 |
| 1、文库质检 |
| 2、基因表达相关性分析 |
| 3、基因差异表达分析 |
| 4、差异表达基因的GO富集分析 |
| 5、差异表达基因的KEGG富集分析 |
| (二)SCARNA2主要通过HR通路修复DNA损伤 |
| (三)下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2 的募集 |
| (四)SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定 |
| (五)下调SCARNA2可以影响ATR与 HR通路相关蛋白的互作 |
| (六)下调SCARNA2抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 LncRNA SCARNA2促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌放疗敏感性 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、实验动物 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、SABER-ISH探针信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、克隆形成率 |
| 2、细胞凋亡 |
| 3、细胞增殖/细胞活力 |
| 4、细胞周期 |
| 5、构建裸鼠皮下荷瘤(CDX)模型 |
| 6、移植瘤体内注射慢病毒载体方法 |
| 7、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 8、石蜡切片制作实验 |
| 9、石蜡切片免疫组化实验 |
| 10、石蜡切片荧光TUNEL实验 |
| 11、组织芯片荧光原位杂交(FISH) |
| 12、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)下调SCARNA2可以降低由IR和 DNA损伤剂诱导的细胞存活率 |
| (二)下调SCARNA2可以增加照射和DNA损伤剂诱导的细胞凋亡 |
| (三)下调SCARNA2可以降低照射后结肠癌细胞的增殖能力和细胞活力 |
| (四)下调SCARNA2可以显着抑制结肠癌细胞经照射和DNA损伤剂诱导的G2/M期阻滞 |
| (五)SCARNA2对结直肠癌荷瘤模型放射敏感性的影响 |
| 1、构建裸鼠皮下荷瘤模型 |
| 2、移植瘤内多点注射慢病毒模型构建成功 |
| 3、下调SCARNA2可以抑制照后裸鼠皮下肿瘤细胞的增殖 |
| 4、下调SCARNA2可以促进照后结肠癌肿瘤细胞的凋亡 |
| 5、下调SCARNA2可以抑制照后结直肠癌肿瘤组织的HR修复 |
| (六)SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着 |
| 三、讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 附表一、RIP-seq数据分析软件及参数列表 |
| 附表二、RIP-seq数据库信息 |
| 附表三、RNA-seq测序质量预处理结果 |
| 附表四、ATR结合相关lncRNA列表(前100 位) |
| 附表五、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表六、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表七、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表八、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表九、RNA pulldown-MS鉴定的差异蛋白列表 |
| 文献综述 lncRNA在DNA损伤诱导的细胞周期检查点激活中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）DNA-PK-AKT信号通路通过增强微管动态变化促进DNA损伤修复（论文提纲范文）
| 本论文主要创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 DNA的损伤与修复 |
| 1.1.1 诱导DNA损伤产生的因素 |
| 1.1.2 DNA损伤修复途径简介 |
| 1.2 中心体与微管 |
| 1.2.1 中心体 |
| 1.2.2 微管 |
| 1.3 AKT背景简介 |
| 1.4 论文立题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 常用细胞系及菌株 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.1.3 主要试验耗材 |
| 2.1.4 常用试剂盒 |
| 2.1.5 常用试剂 |
| 2.1.6 化学药物 |
| 2.1.7 抗体 |
| 2.1.8 siRNA和shRNA序列 |
| 2.1.9 荧光定量PCR引物 |
| 2.1.10 数据分析软件 |
| 2.2 实验相关试剂溶液的配制 |
| 2.2.1 常用实验试剂 |
| 2.2.2 免疫荧光相关试剂的配制 |
| 2.2.3 Western Blot相关溶液的配制 |
| 2.2.4 染色体核型分析相关试剂 |
| 2.2.5 细菌培养和核酸检测相关试剂的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养,冻存与复苏 |
| 2.3.2 sh RNA载体的构建 |
| 2.3.3 感受态细胞的制备 |
| 2.3.4 慢病毒的包装和感染 |
| 2.3.5 si RNA转染,RNA的提取,荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.6 细胞周期的阻滞和分析 |
| 2.3.7 微管重生长实验 |
| 2.3.8 免疫荧光及荧光强度的定量分析 |
| 2.3.9 染色体核型分析 |
| 2.3.10 GFP-EB3微管动态分析 |
| 2.3.11 DNA双链断裂(DSBs)位点的移动性分析 |
| 2.3.12 核蛋白和细胞质蛋白的提取和蛋白免疫印迹 |
| 2.3.13 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 DSBs促进G1期细胞微管的组装 |
| 3.1.1 DNA损伤促进微管的组装速度 |
| 3.1.2 DSBs促进微管的组装速度并且具有剂量和时间依赖性 |
| 3.2 DMSR促进G1期细胞中心体依赖的微管成核能力和组装能力 |
| 3.2.1 DMSR促进中心体依赖的微管数量增加 |
| 3.2.2 通过GFP-EB3定量分析DSBs诱导的微管成核和组装能力 |
| 3.3 DMSR只发生在G0和G1细胞时期 |
| 3.3.1 DMSR发生在G0期细胞中 |
| 3.3.2 DMSR不发生在S/G2期的细胞中 |
| 3.4 c-NHEJ损伤修复通路调控DMSR |
| 3.4.1 阻碍快速c-NHEJ途径的激活抑制DMSR的发生 |
| 3.4.2 c-NHEJ途径的持续活化导致DMSR持续发生 |
| 3.5 DSBs通过c-NHEJ途径中的信号通路诱导间期中心体的成熟 |
| 3.5.1 DMSR的发生依赖于DSBs诱导的间期中心体成熟 |
| 3.5.2 DMSR和间期中心体成熟不依赖PLK1和p38/MAPK |
| 3.5.3 DNA-PK调控DSBs诱导的间期中心体成熟 |
| 3.6 DMSR需要pT308AKT定位在中心体上 |
| 3.6.1 AKT调控间期中心体的成熟以及DMSR的发生 |
| 3.6.2 DSBs诱导细胞质中pT308AKT水平上调并且依赖于DNA-PK |
| 3.6.3 pT308AKT定位于中心体上 |
| 3.6.4 53BP1调控DNA-PK和pS2056DNA-PK在细胞质中的分布 |
| 3.7 DMSR和完整的中心体结构对c-NHEJ修复至关重要 |
| 3.7.1 DMSR促进DSBs末端的移动 |
| 3.7.2 DMSR促进c-NHEJ修复效率 |
| 3.7.3 干涉中心体蛋白影响基因组稳定性 |
| 第四章 实验总结与展望 |
| 4.1 实验总结 |
| 4.2 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 博士期间已发表论文 |
| 致谢 |
（6）芒果苷促进恶性胶质瘤放疗增敏的机制研究及体内验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英汉缩略语名词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 恶性胶质母细胞瘤治疗现状 |
| 1.3 恶性胶质母细胞瘤放疗抵抗的分子机制 |
| 1.3.1 DNA损伤应答 |
| 1.3.2 胶质瘤干细胞与放疗抵抗 |
| 1.3.3 氧环境与放疗抵抗 |
| 1.3.4 其他放疗抵抗机制学说 |
| 1.4 胶质瘤放疗增敏策略 |
| 1.5 芒果苷研究进展 |
| 1.6 课题组在芒果苷提高胶质母细胞瘤增敏的前期研究结果 |
| 1.7 本论文的主要创新与贡献 |
| 1.8 本论文的主要工作 |
| 第二章 芒果苷抑制U-87MG细胞非同源末端连接修复的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞系 |
| 2.1.2 药品与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 U-87MG细胞培养 |
| 2.2.2 给药处理及细胞照射 |
| 2.2.3 Western Blot检测 |
| 2.2.4 免疫荧光染色 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 芒果苷抑制U-87MG细胞非同源末端连接修复的信号通路 |
| 2.3.2 芒果苷对U-87MG细胞γ-H2AX焦点具有抑制作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 芒果苷抑制U-118MG细胞非同源末端连接修复的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞系 |
| 3.1.2 药品与试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 芒果苷抑制U-118MG细胞非同源末端连接修复的信号通路 |
| 3.3.2 芒果苷抑制U-118MG细胞γ-H2AX焦点的形成 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 芒果苷对正常神经胶质细胞DNA损伤修复的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞系 |
| 4.1.2 药品与试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 施万细胞培养 |
| 4.2.2 给药处理及细胞照射 |
| 4.2.3 免疫荧光染色 |
| 4.2.4 ELISA检测 |
| 4.2.5 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 芒果苷不影响正常神经胶质细胞γ-H2AX焦点的形成 |
| 4.3.2 芒果苷不影响正常神经胶质细胞的DNA损伤修复 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 芒果苷提高胶质母细胞瘤放疗敏感性的体内研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 药品与试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 U-118MG细胞培养 |
| 5.2.2 荷瘤鼠模型的构建 |
| 5.2.3 实验分组 |
| 5.2.4 荷瘤鼠处理 |
| 5.2.5 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 芒果苷联合IR对荷瘤鼠体重的影响 |
| 5.3.2 芒果苷联合IR对荷瘤鼠生存率的影响 |
| 5.3.3 芒果苷联合IR对荷瘤鼠体内移植瘤体积的影响 |
| 5.3.4 芒果苷联合IR对荷瘤鼠体内移植瘤重量的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（7）拟南芥蛋白磷酸酶PP7L调控基因组稳定性及发育的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引发DNA损伤的因素 |
| 1.1 外在因素 |
| 1.2 内在因素 |
| 2 DNA损伤修复机制 |
| 2.1 光修复 |
| 2.2 暗修复 |
| 3 参与DNA修复的植物特异性调控因子 |
| 3.1 植物SOG1 转录因子 |
| 3.2 细胞器DNA结合蛋白 |
| 3.3 DNA修复蛋白 |
| 3.4 核糖核酸还原酶 |
| 3.5 SMC5/6 复合物 |
| 3.6 植物蛋白磷酸酶/激酶与DNA损伤信号传导 |
| 4 DNA损伤对植物生长发育的影响 |
| 4.1 影响植物初生根的发育 |
| 4.2 影响叶片发育 |
| 4.3 影响种子发育 |
| 5 研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 载体与菌株 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 拟南芥的种植与培养 |
| 2.2 载体构建 |
| 2.3 实时荧光定量(qRT-PCR)技术 |
| 2.4 酵母双杂交 |
| 2.5 烟草的瞬时表达技术 |
| 2.6 蛋白原核表达与纯化 |
| 2.7 co-IP蛋白复合体的提取与纯化 |
| 2.8 蛋白质免疫印迹分析 |
| 2.9 拟南芥原生质体转化实验 |
| 2.10 Dual-Luciferase报告基因的检测 |
| 2.11 碘化丙啶染色 |
| 2.12 拟南芥幼苗根尖GUS染色 |
| 2.13 根透明试剂处理制片观察 |
| 2.14 UV-C紫外辐射实验及叶绿素含量测定 |
| 2.15 植物激素的提取 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 pp7l突变体发育缺陷表型观察 |
| 2 PP7L酵母双杂交筛库及互作验证 |
| 2.1 通过文库筛选获得候选蛋白 |
| 2.2 PP7L与 SAV6 蛋白互作验证 |
| 3 PP7L不参与调控SAV6 蛋白的稳定性 |
| 4 PP7L和 SAV6 维持根部细胞的正常发育形态 |
| 4.1 pp7l和 sav6 突变体碘化丙啶染色及相关基因表达量检测 |
| 4.2 pp7l和 sav6 突变体GUS染色观察 |
| 4.3 pp7l和 sav6 突变体紫外辐射处理及叶绿素含量测定 |
| 4.4 DNA毒性试剂诱导pp7l和 sav6 突变体 |
| 5 sav6 突变体中的SA含量显着升高 |
| 6 pp7l和 sav6 植株RNA-Seq分析 |
| 第四章 讨论 |
| 1 高等植物特有的蛋白磷酸酶PP7L功能分析 |
| 2 酵母双杂交筛选鉴定到DNA损伤修复蛋白SAV6 |
| 3 PP7L和 SAV6 维持根尖分生组织干细胞发育形态 |
| 4 探讨PP7L和 SAV6 协同作用的分子机制 |
| 5 结果与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 抗生素的配置 |
| 1.1 水溶剂抗生素 |
| 1.2 有机溶剂抗生素 |
| 2 常用培养基的配置 |
| 2.1 1/2 MS培养基 |
| 2.2 SD培养基 |
| 2.3 LB培养基 |
| 2.4 TB培养基 |
| 3 本研究的引物序列 |
| 致谢 |
（8）ITGB1通过调节DNA损伤反应和YAP1诱导的上皮-间质转化调控人非小细胞肺癌放射抵抗的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于转录组学筛选非小细胞肺癌放射抵抗细胞系H460R与其亲代细胞系H460 差异表达m RNA及其相关机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 数据来源 |
| 2.2 数据处理与分析 |
| 2.3 GO富集分析与KEGG富集分析 |
| 2.4 粘附相关信号通路的基因筛选与分析 |
| 2.4.1 粘附相关信号通路的基因筛选 |
| 2.4.2 蛋白互作网络分析与关键基因筛选 |
| 3 结果 |
| 3.1 非小细胞肺癌放射抵抗细胞系 H460R与其亲代细胞系 H460 差异表达m RNA筛选与生物信息学分析 |
| 3.2 细胞粘附相关通路的深度生物信息学挖掘 |
| 3.3 关键基因在NSCLC中的表达及预后分析 |
| 3.3.1 关键基因在NSCLC组织中的表达 |
| 3.3.2 关键基因生存分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:ITGB1 通过调节DNA损伤反应和YAP1 诱导的上皮-间质转化调控人非小细胞肺癌放射抵抗的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 数据来源与分析 |
| 2.2.1 cBioPortal数据库分析 |
| 2.2.2 HPA数据库分析 |
| 2.2.3 GEPIA2 数据库分析 |
| 2.2.4 Path Cards数据库 |
| 2.2.5 STRING数据库 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养、复苏、换液、传代、冻存 |
| 2.3.1.1 细胞培养 |
| 2.3.1.2 细胞复苏 |
| 2.3.1.3 细胞换液 |
| 2.3.1.4 细胞传代 |
| 2.3.1.5 细胞冻存 |
| 2.3.2 细胞照射 |
| 2.3.3 慢病毒构建稳转细胞株 |
| 2.3.3.1 慢病毒转染 |
| 2.3.3.2 嘌呤霉素筛选细胞稳定株 |
| 2.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡实验 |
| 2.3.5 流式细胞术检测细胞周期实验 |
| 2.3.6 细胞克隆形成实验 |
| 2.3.7 CCK-8 细胞增殖试验 |
| 2.3.8 Real-Time PCR 实验 |
| 1.样品收集 |
| 2.RNA提取 |
| 3.反转录PCR(两步法) |
| 4.实时荧光定量PCR |
| 2.3.9 Western Blot 实验 |
| 1.溶液配制 |
| 2.总蛋白提取 |
| 3.浆、核蛋白提取 |
| 4.蛋白定量 |
| 5.蛋白变性和SDS-PAGE |
| 6.蛋白转膜 |
| 7.封闭 |
| 8.一抗与二抗的孵育 |
| 9.ECL底物显像 |
| 2.3.10 细胞免疫荧光实验 |
| 2.3.11 siRNA 转染 |
| 2.3.12 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NSCLC放射抵抗细胞系H460R的重新验证 |
| 3.2 放射抵抗细胞系 H460R与其亲代细胞系 H460 之间差异表达m RNA验证 |
| 3.3 ITGB1 的表达与NSCLC细胞放射敏感性相关 |
| 3.3.1 检测支气管上皮细胞和各NSCLC细胞系中ITGB1 的表达水平 |
| 3.3.2 检测电离辐射对ITGB1 的表达影响 |
| 3.3.3 检测A549 和H522 对放射线敏感性 |
| 3.4 ITGB1 表达与NSCLC患者临床病理特征相关。 |
| 3.4.1 ITGB1 m RNA和蛋白水平在NSCLC肿瘤组织中均呈高表达,ITGB1 高表达NSCLC患者预后较差 |
| 3.4.2 ITGB1 m RNA表达水平与NSCLC患者临床病理特征的关系 |
| 3.4.3 NSCLC患者中ITGB1 表达水平与总生存期之间相关性的单因素与多因素分析 |
| 3.5 ITGB1 沉默可恢复内在和获得性放射抗性的NSCLC细胞系的放射敏感性,而ITGB1 过表达会诱导肿瘤细胞放射抵抗 |
| 3.5.1 慢病毒构建 ITGB1 沉默稳转细胞株H460R和 A549,构建 ITGB1 过表达稳转细胞株H522 |
| 3.5.2 CCK-8 细胞增殖实验检测干扰ITGB1 表达对放射后NSCLC细胞系的增殖影响 |
| 3.5.3 细胞克隆形成实验检测干扰ITGB1 表达对NSCLC放射敏感性影响 |
| 3.6 干扰ITGB1 表达改变放射线照射后NSCLC细胞周期分布,并影响放射线诱导的NSCLC细胞凋亡 |
| 3.7 ITGB1 与放射线诱导的DNA双链断裂(DNA-DSB)相关 |
| 3.8 ITGB1 可以通过调节 EMT 来促进 NSCLC 细胞的放射抵抗 |
| 3.9 YAP1 参与了ITGB1 介导的NSCLC细胞放射抵抗 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ITGB1 与肿瘤治疗抵抗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）植物DNA错配修复系统响应Cd胁迫的研究进展（论文提纲范文）
| 1 Cd胁迫诱导植物细胞中的DNA损伤反应 |
| 1.1 感知Cd胁迫诱导的DNA损伤 |
| 1.2 Cd胁迫下DNA损伤激活ATR和ATM |
| 1.3 Cd胁迫下ATR和ATM的下游信号转导 |
| 1.3.1 Cd胁迫诱导的G2/M期阻滞 |
| 1.3.2 Cd胁迫诱导的植物细胞内复制和细胞死亡 |
| 1.3.3 Cd胁迫下HR和DNA MMR系统的激活 |
| 2 植物DNA MMR系统在Cd诱导DDR信号通路中的多重功能 |
| 2.1 DNA MMR系统的主要作用 |
| 2.2 DNA MMR系统招募和促进HR修复 |
| 2.3 MLH1以依赖于ATM的方式参与MAPK信号 |
| 3 DDR信号通路中表观遗传对DNA MMR系统的调控作用 |
| 3.1 DNA甲基化 |
| 3.2 组蛋白修饰 |
| 3.3 miRNA对植物DNA MMR系统的调控作用 |
| 3.4 lncRNAs对植物DNA MMR系统的调控作用 |
| 4 结论 |
（10）极光激酶A调控肠癌放射敏感性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:直肠癌组织中极光激酶A表达水平与其放射敏感性及预后相关性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 病理活检、免疫组化染色及结果判读 |
| 2.2.2 治疗方法 |
| 2.2.3 近期疗效评估标准 |
| 2.3 随访 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 直肠腺癌组织中极光激酶A的表达情况与患者临床病理因素的相关性分析 |
| 3.2 直肠癌术前新辅助放化疗近期疗效相关因素分析 |
| 3.3 极光激酶A表达与患者RFS与 OS的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:极光激酶A对肠癌细胞HCT-116和HT-29 放射敏感性影响及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养和冻存 |
| 2.2.2 结直肠癌细胞中AURKA的表达 |
| 2.2.3 构建shRNA表达慢病毒及稳定沉默AURKA的结直肠癌细胞系 |
| 2.2.4 照射方法 |
| 2.2.5 CCK8 法检测细胞的增殖 |
| 2.2.6 克隆形成实验检测细胞的放射敏感性 |
| 2.2.7 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 2.2.8 Transwell实验检测细胞侵袭 |
| 2.2.9 Annexin V-PE/7AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.10 PI单染流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.11 Western blotting法检测通路蛋白表达 |
| 2.2.12 瞬时转染上调c-myc基因 |
| 2.3 数据统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 结直肠癌细胞中AURKA的表达情况 |
| 3.2 稳定沉默AURKA基因的结直肠癌细胞株的建立 |
| 3.3 下调AURKA表达水平对HCT116和HT-29 细胞放射敏感性的影响 |
| 3.4 下调AURKA表达水平对HCT116和HT-29 细胞系迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.5 下调AURKA表达水平对电离辐射诱导条件下诱导HCT116和HT-29 细胞凋亡的影响 |
| 3.6 下调AURKA表达水平对电离辐射诱导条件下HCT116和HT-29 细胞周期分布的影响 |
| 3.7 下调AURKA表达水平对凋亡通路的影响 |
| 3.8 下调AURKA表达水平对c-Myc信号传导通路的影响 |
| 3.9 过表达c-Myc减弱靶向抑制AURKA介导细胞周期调控及对相关下游信号通路节点蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 基于极光激酶A作为抗肿瘤药物靶点的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、ATM对DNA损伤后细胞反应信号传导通路的调控作用（论文参考文献）
- [1]煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化效应及其机制研究[D]. 李阿敏. 安徽理工大学, 2021(02)
- [2]电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究[D]. 严俊芳. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2021(01)
- [3]Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究[D]. 杨娟. 山东大学, 2021(11)
- [4]长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制[D]. 陈媛媛. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [5]DNA-PK-AKT信号通路通过增强微管动态变化促进DNA损伤修复[D]. 马淑云. 武汉大学, 2021(02)
- [6]芒果苷促进恶性胶质瘤放疗增敏的机制研究及体内验证[D]. 刘婷. 电子科技大学, 2021(01)
- [7]拟南芥蛋白磷酸酶PP7L调控基因组稳定性及发育的功能研究[D]. 张志. 浙江师范大学, 2021(02)
- [8]ITGB1通过调节DNA损伤反应和YAP1诱导的上皮-间质转化调控人非小细胞肺癌放射抵抗的机制研究[D]. 李跃先. 中国医科大学, 2021(02)
- [9]植物DNA错配修复系统响应Cd胁迫的研究进展[J]. 王鹤潼,贾春云,张延召,赵强,李晓军,巩宗强,刘宛. 农业环境科学学报, 2021(04)
- [10]极光激酶A调控肠癌放射敏感性的研究[D]. 刘飞. 中国医科大学, 2021(02)