体外人脐静脉内皮细胞分泌GM-CSF的研究

一、体外人脐静脉内皮细胞分泌GM-CSF的研究（论文文献综述）

郝艺^[1]（2021）在《TNF-α诱导的脐带间充质干细胞外泌体对修复细胞及创面愈合的影响研究》文中指出目的:间充质干细胞外泌体（Mesenchymal Stromal Cells Derived Exosomes,MSC-Exos）可以有效的促进创面愈合,然而细胞的培养环境以及细胞移植部位的病理性炎症等微环境状况极大的影响着MSCs（Mesenchymal Stromal Cells,MSCs）的旁分泌效应及MSC-Exos的生物学效应,炎症预处理可以提高HUCMSCs（Human umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell,HUCMSC）的免疫抑制功能及修复功能。本研究通过炎症因子肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factorα,TNF-α）预刺激脐带间充质干细胞后提取的外泌体（TNF-Exos）,与正常条件下培养的HUCMSCs提取的外泌体（Nor-Exos）做对比,在体内研究TNF-Exos对创面愈合的作用效应。同时在体外通过用人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC）及成纤维细胞（Human Foreskin Fibroblast,HFF）研究其对创面主要修复细胞的修复相关的生物学效应。方法:（1）HUCMSCs的提取鉴定及HUCMSC-Exos的分离与鉴定:用组织贴壁法提取HUCMSCs,用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）鉴定。运用差速离心法提取脐带间充质干细胞外泌体（Human umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes,HUCMSC-Exos）,用透射电镜观察HUCMSC-Exos形态,用纳米颗粒跟踪分析仪（Nanosight）鉴定HUCMSC-Exos的粒径,用蛋白质印迹法（Western Blot,WB）鉴定HUCMSC-Exos特异性标记CD9、CD63的表达。提取正常培养条件下HUCMSC-Exos,记为正常外泌体（Nor-Exos）;参照相关文献取用20ng/m L的TNF-α刺激HUCMSCs,48h后用相同方法提取外泌体,记为TNF-α外泌体（TNF-Exos）。（2）不同的HUCMSC-Exos对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响:建立直径为1cm2的小鼠全层皮肤缺损创面模型,创面周围注射200μg的Nor-Exos或TNF-Exos,观察统计创面愈合率的变化。（3）不同HUCMSC-Exos对血管内皮细胞的影响:用浓度为10μg/m L、50μg/m L、100μg/m L的Nor-Exos或TNF-Exos,分别刺激HUVEC,研究不同浓度的Nor-Exos和TNF-Exos对HUVEC成管效应的作用。（4）不同HUCMSC-Exos对人皮肤成纤维细胞的影响:用浓度为100μg/m L的Nor-Exos或TNF-Exos作用于人皮肤成纤维细胞中,采用CCK8法、划痕实验、实时荧光定量PCR（RT-q PCR）实验,观察Nor-Exos和TNF-Exos对HFF的增殖、迁移、炎症及修复相关因子m RNA表达的影响。结果:TNF-α刺激的HUCMSCs来源的外泌体（TNF-Exos）,可更好的促进创面愈合,效果好于正常条件下培养的HUCMSCs来源的外泌体（Nor-Exos）（P<0.05）。体外研究表明外泌体表现出一定的剂量依赖性,浓度为100μg/m L时,Nor-Exos和TNF-Exos对HUVEC成管效应的效果最佳。与对照组相比,TNF-Exos可以在体外显着地促进HUVEC的血管的生成（P<0.05）,但与Nor-Exos相比无明显差异（P>0.05）。与对照组相比TNF-Exos能够在体外显着地促进HFF的增殖、迁移、降低炎症因子的表达、下调促纤维化因子的表达来抑制瘢痕的形成（P<0.05）,但与Nor-Exos相比无明显差异（P>0.05）。结论:（1）相比于正常培养条件下提取的HUCMSC-Exos,TNF-α预处理后提取的HUCMSC-Exos可更好地促进促进小鼠全层皮肤缺损创面的愈合。（2）Nor-Exos和TNF-α预处理后提取的HUCMSC-Exos都可以促进血管内皮细胞的成管、促进HFF的迁移、增殖、降低TGF-β、IL-6、Collagen I、α-SMA的m RNA的表达来促进创面愈合、减轻瘢痕的形成。（3）TNF-α预处理后提取的HUCMSC-Exos可以促进创面愈合的主要靶点可能并不是通过直接地作用于血管内皮细胞及人皮肤成纤维细胞上,有可能是通过改变创面中的炎症细胞或者炎症类修复细胞如巨噬细胞,以及创面的炎症微环境等因素来影响创面修复。

覃小珊^[2]（2021）在《苦参素对HepG2细胞条件培养基诱导的人脐静脉内皮细胞血管生成作用的研究》文中提出目的:探讨苦参素对人肝癌Hep G2细胞条件培养基诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）血管生成的作用及其相关分子机制。方法:（1）采用Hep G2细胞条件培养基诱导HUVEC具有肿瘤内皮细胞的特性（TECs）。q PCR检测TEM1、TEM8的表达以明确TECs身份,应用倒置显微镜观察HUVEC在诱导前后的细胞形态。（2）采用ELISA法检测不同细胞培养基中VEGF的含量,并采用q PCR及细胞免疫荧光技术检测诱导前后的HUVEC中VEGFR2、Ets-1的表达。探讨肿瘤条件培养基促使正常ECs向TECs转变的分子机制。（3）采用CCK-8法、细胞划痕实验、体外血管形成实验分别检测浓度分别为0.375mg/m L、0.75mg/m L、1.5mg/m L、3mg/m L、6mg/m L苦参素在不同时间点对TECs增殖、迁移及成管能力的影响。（4）采用q PCR及细胞免疫荧光技术检测苦参素干预TECs前后VEGFR2、Ets-1的表达差异,探讨苦参素抑制TECs血管生成作用可能的分子机制。结果:（1）q PCR结果显示,与阴性对照组相比,经Hep G2细胞条件培养基诱导的HUVEC中TEM1、TEM8、Ets-1、VEGFR2的m RNA表达升高（P<0.05）,说明构建TECs成功。（2）ELISA结果显示,与内皮细胞培养基（endothelial cell medium,ECM）相比,Hep G2细胞条件培养基、混合培养基（含50%Hep G2细胞条件培养基的ECM）中VEGF含量均升高（P<0.001）。（3）细胞免疫荧光技术检测结果显示,与HUVEC相比,TECs中Ets-1、VEGFR2的平均荧光强度增大（P<0.05）。（4）CCK-8法结果显示,苦参素对TECs增殖的抑制作用随浓度增加而增大（P<0.001）;0.375mg/m L、0.75mg/m L、1.5mg/m L、3mg/m L苦参素组对TECs增殖的抑制作用随时间延长而减小,其中3mg/m L苦参素组最明显,差异具有统计学意义（P<0.05）,6 mg/m L苦参素组对TECs增殖的抑制作用随时间延长而增大（P<0.05）,选择0.375 mg/m L、0.75 mg/m L、1.5 mg/m L、3 mg/m L苦参素作为后续实验干预条件,其中3mg/m L浓度组作为后续基因水平及蛋白水平研究的时间效应实验组。细胞划痕实验结果显示,与对照组相比,0.375 mg/m L苦参素组划痕愈合率差异无统计学意义（P>0.05）,其余苦参素组划痕愈合速度随浓度增加而减慢（P<0.05）;苦参素对划痕愈合率的影响随时间延长而越明显（P<0.05）。体外血管形成实验结果显示,细胞在种板3 h后逐渐出现管腔样结构,各组差异无统计学意义（P>0.05）,与对照组相比,0.375 mg/m L苦参素组管形成数量差异无统计学意义（P>0.05）,其余苦参素组管形成数量随浓度增加而减少（P<0.05）;管形成数量随着苦参素干预时间的延长而减少（P<0.05）。（5）q PCR结果显示,与对照组相比,除0.375 mg/m L苦参素组外,不同浓度苦参素作用的细胞中Ets-1、VEGFR2 m RNA表达随苦参素浓度增大而降低（P<0.05）;与对照组相比,3 mg/m L苦参素组细胞中Ets-1、VEGFR2 m RNA表达随作用时间延长而增加（P<0.05）。（6）细胞免疫荧光检测显示,与对照组相比,除0.375 mg/m L苦参素组外,不同浓度苦参素作用的细胞中Ets-1蛋白表达随苦参素浓度增大而降低（P<0.05）;与对照组相比,除0.375 mg/m L、0.75 mg/m L苦参素组外,不同浓度苦参素作用的细胞中VEGFR2蛋白表达随苦参素浓度增大而降低（P<0.05）;与对照组相比,3mg/m L苦参素中Ets-1、VEGFR2蛋白表达随时间延长而增加（P<0.05）。结论:（1）Hep G2细胞条件培养基可以模拟肿瘤微环境诱导正常内皮细胞具备肿瘤内皮细胞的特性,为基于肿瘤内皮细胞的抗肝癌血管生成研究提供了一个细胞模型。（2）苦参素能够抑制Hep G2细胞条件培养基诱导的HUVEC血管生成作用,其机制可能是通过抑制Ets-1的表达进而抑制VEGF/VEGFR2信号转导通路。

陈芳芳^[3]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。

刘晓光^[4]（2020）在《PD-1在调节缺血后小鼠下肢血流恢复和血管新生能力的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的:血管新生在多种生理和病理生理过程中发挥着重要作用。血管新生异常与多种临床疾病,如中风、心脏缺血梗死、肢体缺血性坏死和动脉粥样硬化等密切相关。组织缺血后一般通过激活HIF-1α和VEGF信号通路促进内皮细胞增殖、迁移并最终形成新的血管。另外,组织缺血后常常导致多种炎症细胞浸润,组织内炎症因子堆积。缺血后的组织炎症反应对血管新生过程亦发挥着至关重要的作用。PD-1是一个重要的免疫检查点抑制剂,对维持机体免疫稳态具有重要作用。大量的临床和基础研究表明PD-1是治疗多种肿瘤和自身性免疾病的一个有效药物研究靶点。虽然抑制PD-1信号通路可有效治疗多种肿瘤的发生发展,但抑制PD-1信号通路也导致了部分病人心血管系统的严重毒副作用。鉴于PD-1对机体免疫反应和组织炎症反应的重要作用以及PD-1抑制剂在癌症病人中的广泛应用,本实验的主要目的是研究PD-1在缺血后血管新生能力的作用及作用机制。研究方法:本课题分别采用PD-1基因敲除（PD-1 KO）小鼠以及通过对野生型C57BL/6小鼠进行PD-1阻断抗体（PD-1m Ab）治疗的方法对PD-1进行了特异抑制,并通过流式细胞术分析、免疫荧光分析、HE染色分析、马松染色分析、荧光定量PCR分析和ELISA分析等多种分子生物学手段,综合研究了PD-1对小鼠股动脉结扎缺血后下肢血流灌注、小鼠运动能力、组织内炎症反应、氧化应激及血管新生能力的作用及作用机制。鉴于PD-1基因敲除导致血管新生能力降低及组织内IFN-γ产生增加,我们进一步研究了IFN-γ对血管内皮细胞增殖、迁移、管形成和凋亡的影响。研究结果:1.PD-1基因敲除损害了小鼠缺血后下肢的血流灌注能力、血管新生能力和缺血后运动能力的恢复,并加重了缺血骨骼肌萎缩和纤维化PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠相比,在缺血手术前血流灌注无显着差异。与野生型小鼠相比,PD-1基因敲除小鼠在缺血后第14天和21天血流灌注均显着低于野生型小鼠。提示,PD-1基因敲除抑制了小鼠缺血后下肢的血流灌注能力。因在缺血后第7天PD-1敲除小鼠和野生型小鼠血流灌注无显着差异,而在缺血第14天PD-1基因敲除小鼠血流灌注显着低于野生型小鼠。因此,为了探究造成这种差异的原因是否与血管新生相关,我们对缺血后第7天和14天的毛细血管新生情况进行了检测。结果发现,PD-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,在缺血后第7天新生毛细血管数量无显着差异,在缺血后第14天新生毛细血管数量显着低于野生型小鼠。结果提示,PD-1基因敲除抑制了缺血后下肢骨骼肌的血管新生能力。缺血后运动能力的恢复受血流灌注的调控,因此我们对小鼠运动能力进行了检测。结果发现,PD-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,在缺血手术前两组小鼠之间运动能力（最大运动速度、达到最大运动速度的时间和距离）无显着差异。在缺血后第14天和21天,PD-1基因敲除小鼠的运动能力显着低于野生型小鼠。提示,PD-1基因敲除抑制了小鼠缺血后运动能力的恢复。小鼠缺血骨骼肌的萎缩和纤维化受血流灌注的调控。我们发现,在缺血后第21天,PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌再生肌纤维面积显着低于野生型小鼠,而腓肠肌纤维化面积百分比显着高于野生型小鼠。提示,PD-1基因敲除加重了缺血骨骼肌萎缩和纤维化。2.PD-1基因敲除加重了小鼠缺血后肢骨骼肌炎症反应和氧化应激HE及CD45免疫荧光染色发现,在缺血前PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠腓肠肌中无炎症细胞浸润。在缺血后第3天,两组腓肠肌中炎症细胞浸润均显着增加,且PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌中CD45炎性细胞浸润数量显着高于野生型小鼠。除此之外,我们通过流式细胞术检测缺血骨骼肌中炎性细胞浸润情况。结果发现,在缺血后第3天与野生型小鼠相比,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌中CD45+细胞数量显着增加、CD45+细胞量/骨骼肌质量显着增加、巨噬细胞（F4/80+CD11b+）数量显着增加、巨噬细胞数量/骨骼肌质量显着增加。提示,PD-1基因敲除促进了缺血骨骼肌中炎性细胞浸润。炎症细胞与氧化应激密切相关。通过DHE染色对骨骼肌氧化应激进行检测。发现,PD-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,未缺血腓肠肌中活性氧族含量无显着差异。在缺血后第3天,PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌中ROS阳性细胞数量和荧光强度均显着高于野生型小鼠。通过荧光定量PCR对多种炎症因子检测发现,与未缺血组织相比,缺血后第3天MCP-1、IFN-γ、IL-6和IL-1βm RNA表达均显着增加。在缺血后第3天,与野生型小鼠缺血腓肠肌相比,PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌中IFN-γm RNA表达显着增加,而其它炎症因子m RNA表达无显着变化。此外,ELISA结果显示,PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠未缺血腓肠肌中IFN-γ蛋白表达无显着差异。在缺血后第3天,PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌中IFN-γ蛋白表达显着高于野生型小鼠。提示,PD-1基因敲除增加了缺血骨骼肌中IFN-γ的表达。3.IFN-γ促进了HUVEC凋亡,损害了HUVEC增殖、迁移和管形成我们发现PD-1基因敲除损害了缺血后血管新生并增加了IFN-γ的产生。推测IFN-γ可能通过调节内皮细胞的生长和存活调节缺血后的血管新生。结果发现,与对照组相比,IFN-γ处理组,HUVEC凋亡显着增加,增殖、迁移和管形成受到显着抑制。4.PD-1基因敲除促进了缺血腓肠肌中炎症细胞产生IFN-γ和TNF-α在前面实验中我们发现,PD-1基因敲除增加了缺血骨骼肌中IFN-γ蛋白的表达,但不能明确其细胞来源,因此我们进行了此部分的检测。我们发现缺血第3天,与野生型小鼠缺血骨骼肌相比,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌中IFN-γ阳性细胞占CD45+白细胞百分比显着增加,总IFN-γ阳性白细胞数量显着增加,总IFN-γ阳性白细胞数量/骨骼肌质量显着增加,IFN-γ阳性白细胞平均荧光强度（MFI）也显着高于野生型小鼠。另外,我们同时发现PD-1基因敲除未显着影响缺血骨骼肌中CD45阴性细胞IFN-γ的产生。提示,PD-1基因敲除促进了缺血骨骼肌中白细胞产生IFN-γ。巨噬细胞是缺血骨骼肌中浸润的主要炎性细胞。对巨噬细胞IFN-γ表达进行分析发现,与野生型小鼠缺血骨骼肌相比,在缺血后第3天,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌中IFN-γ阳性细胞占巨噬细胞百分比显着增加,总IFN-γ阳性巨噬细胞数量显着增加,总IFN-γ阳性巨噬细胞数量/骨骼肌质量显着增加,IFN-γ阳性巨噬细胞MFI也显着增加。提示,PD-1基因敲除促进了缺血骨骼肌中巨噬细胞产生IFN-γ。此外,我们对缺血骨骼肌中炎症细胞TNF-α产生进行检测。结果发现,与野生型小鼠相比,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌中CD45+白细胞TNF-α阳性细胞所占比例、总TNF-α阳性CD45+细胞数量和CD45+细胞TNF-αMFI均无显着变化,但总TNF-α阳性的CD45+细胞数量/骨骼肌质量显着增加。我们同时发现PD-1基因敲除未显着影响缺血骨骼肌CD45阴性细胞的TNF-α产生。与野生型小鼠相比,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌巨噬细胞细胞中TNF-α阳性细胞所占比例无显着变化,总TNF-α阳性巨噬细胞数量无显着变化,但总TNF-α阳性的巨噬细胞数量/骨骼肌质量显着增加,而巨噬细胞TNF-αMFI无显着变化。5.PD-1 m Ab抑制了小鼠缺血后肢血流恢复、血管新生和运动能力的恢复并加重了缺血骨骼肌萎缩和纤维化血流灌注分析发现,在手术前,PD-1 m Ab组小鼠和Ig G组相比其血流灌注无显着差异。而缺血后第14天和21天,PD-1 m Ab组小鼠血流灌注显着低于Ig G组小鼠。提示,PD-1 m Ab抑制了小鼠缺血后肢血流恢复。对缺血后第21天血管新生情况进行检测发现,PD-1 m Ab组小鼠后肢缺血腓肠肌中毛细血管数量显着低于Ig G组小鼠。提示,PD-1 m Ab抑制了小鼠缺血后肢血管新生。缺血后运动能力的恢复受血流灌注的调控。对小鼠运动能力检测发现,在缺血手术前PD-1 m Ab小鼠和Ig G小鼠的运动能力无显着差异。而在缺血后第21天,PD-1 m Ab小鼠在跑台上达到的最大运动速度、运动持续时间和运动距离显着低于Ig G组小鼠。提示,PD-1 m Ab抑制了小鼠缺血后运动能力的恢复。缺血后血流灌注情况也会影响缺血骨骼肌的萎缩和纤维化。我们发现在缺血后第21天,PD-1 m Ab组小鼠再生肌纤维面积显着低于Ig G组小鼠,而腓肠肌纤维化面积显着高于Ig G组小鼠。提示,PD-1 m Ab加重了小鼠缺血后肢腓肠肌萎缩和纤维化。研究结论:PD-1基因敲除或药理学抑制,损害了缺血腓肠肌组织内的血管新生、血流恢复和运动能力的恢复,并加重了腓肠肌萎缩和纤维化。PD-1基因敲除提高了缺血腓肠肌氧化应激水平,促进了炎症细胞浸润并提高了IFN-γ表达。IFN-γ的增加,可能主要来源于浸润的炎症细胞。而IFN-γ可直接抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、管形成以及促进凋亡而损害血管新生。这些结果表明PD-1在缺血后血流灌注恢复和血管新生中发挥重要作用,PD-1可通过调节炎症反应参与缺血后血流灌注恢复和血管新生的调控。

刘娟^[5]（2020）在《GM-CSF对子宫内膜再生修复的作用及机制研究》文中提出第一部分:GM-CSF对子宫内膜损伤修复的作用和内膜细胞效应机制研究目的:探究GM-CSF对子宫内膜损伤修复的作用,明晰其对子宫内膜腺上皮和基质细胞的生物学效应及机制,为临床难治性薄型子宫内膜的新治疗探索提供理论依据。材料与方法:采用宫腔灌注90%乙醇建立子宫内膜损伤小鼠模型,通过HE染色观测小鼠子宫内膜厚度、免疫组化检测ki67表达评估细胞增殖、在体早期胚胎种植数目评估内膜容受性。在建立稳定的子宫内膜损伤小鼠模型后,对其行腹腔注射GM-CSF,观察子宫内膜修复再生及妊娠情况。向人原代子宫内膜腺上皮和基质细胞培养基中加入不同浓度GM-CSF后,通过Brd U检测子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞增殖,Transwell检测基质细胞迁移,从而探究GM-CSF对子宫内膜细胞增殖和迁移能力的影响。在子宫内膜腺上皮细胞中,通过Western Blot检测Akt信号通路中的p-Akt,c-Jun,p70S6K蛋白分子。Akt信号通路抑制剂（LY294002）被用来探究GM-CSF对子宫内膜腺上皮细胞的相关作用能否被抑制。研究结果:宫腔内灌注乙醇可以建立稳定的子宫内膜损伤小鼠模型,与对照侧的小鼠子宫内膜相比,受损侧表现为子宫内膜厚度变薄（342.1±30.2μm vs.215.1±32.4μm,p<0.05）,腺细胞Ki67表达降低（IRS评分:11.7±0.2 vs.7.5±1.2,p<0.05）以及胚胎种植数减少（7.7±0.8 vs.3.2±1.1,p<0.01）。对子宫内膜损伤模式小鼠行GM-CSF腹腔注射后,对照侧和损伤侧相比,子宫内膜厚度（350.2±21.3μm vs.356.0±22.4μm,p>0.05）、腺上皮细胞中Ki67的表达（IRS评分:7.5±2.0 vs.7.1±1.8,p>0.05）以及胚胎种植数（6.2±0.5 vs.5.8±0.5,p>0.05）均未见显着差异,GM-CSF修复了受损的子宫内膜。GM-CSF促进人原代子宫内膜腺上皮细胞的增殖和基质细胞的迁移;在子宫内膜腺上皮细胞中,GM-CSF能激活p-Akt的磷酸化、增加p70S6K和c-Jun蛋白分子的表达量,上述GM-CSF对子宫内膜腺上皮细胞的作用可以被Akt信号通路抑制剂（LY294002）所抑制。结论:GM-CSF对宫腔灌注乙醇所致小鼠子宫内膜损伤可促进其再生修复,可促进人原代子宫内膜腺上皮细胞增殖和基质细胞迁移,激活Akt信号通路,为临床子宫内膜再生修复障碍所致薄型子宫内膜提供新的治疗思路。第二部分:GM-CSF促进血管再生的效应及机制研究研究目的:探究GM-CSF对血管再生的作用和机制,为临床子宫内膜损伤修复过程中的血管再生提供新的临床切入点。材料与方法:通过子宫内膜损伤小鼠模型评估血管生成因子CD31的表达,观察注射GM-CSF后是否促进血管生成;通过Sorafenib构建斑马鱼胚胎的体节间血管损伤模型,加入GM-CSF后观察是否促进血管修复。体外培养人脐静脉血管内皮细胞系HUVECs,检测不同浓度GM-CSF对HUVECs的再生作用。通过Ed U检测细胞增殖,通过Tube formation检测血管形成效应,通过划痕修复和Transwell实验检测细胞迁移作用;采用Real-time PCR技术验证差异表达m RNA、Western Blot验证差异表达蛋白、胞浆核蛋白分离Western Blot证实蛋白入核、Ch IP验证转录因子入核后调控相关DNA启动子的表达;通过FAK抑制剂（PF573228）和STAT3 si RNA分别抑制FAK和敲降STAT3,验证GM-CSF对HUVECs生物学行为的效应能否被抑制。研究结果:GM-CSF促进子宫内膜损伤小鼠模型中血管生成因子CD31的表达;GM-CSF对Sorafenib导致的斑马鱼胚胎体节间血管损伤模型具有修复作用。GM-CSF可促进HUVECs增殖和迁移,增加血管样网络结构的形成以促进HUVECs的血管生成。GM-CSF用药组中,HUVECs中血管形成相关基因VEGF,MMP2,Ang1,Ang2,Tie2的m RNA表达量显着增加;GM-CSF可以激活FAK/Src/ERK信号通路,增加p-FAK,p-Src,p-ERK 1/2,p-STAT3,p-p38 MAPK,p-c-Jun,p-CREB,p-Akt,p-e NOS的磷酸化表达量,增加下游VEGF和MMP2蛋白的表达。GM-CSF处理30 min后,可增加STAT3的表达量,促进STAT3从胞浆到胞核转运,从而调控下游VEGF和MMP2基因的表达。以上GM-CSF对HUVECs生物学行为的影响效应均可被FAK抑制剂（PF573228）和STAT3 si RNA抑制。结论:GM-CSF促进子宫内膜损伤小鼠模型和血管损伤斑马鱼模型的血管再生;GM-CSF可能通过激活FAK/Src/ERK信号通路,促进STAT3入核从而发挥对HUVECs的促增殖、血管生成和迁移作用,为临床治疗子宫内膜血管修复异常提供新的切入点。

郭晓瑞^[6]（2020）在《人源内皮克隆形成细胞（ECFCs）旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究》文中研究说明研究背景和目的:2型糖尿病（T2D）是最常见的代谢性疾病之一,其主要特征是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而出现慢性高血糖。慢性创伤具有特征性的病理联系,不能通过有序和及时的修复来恢复结构和功能的完整性。在糖尿病患者中,每年有2%-3%的患者发生足部溃疡。糖尿病足是一种严重的T2D并发症,常导致疼痛、痛苦和生活质量低下。内皮克隆形成细胞（Endothelial colony-forming cells,ECFCs）被认为晚期内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,在创伤修复中的作用受到广泛关注。ECFCs是一种来源于骨髓的原始细胞,在一定的条件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞（endothelial cells,ECs）。该细胞不仅参与胚胎时期的血管生成,而且在人体出生后的血管新生、血管损伤的内皮修复以及功能维持中仍然有重要的作用。干/祖细胞对创面的修复机制可概括为:（1）分化为成熟内皮细胞;（2）旁分泌产生多种生物活性的细胞因子促进创面的血管新生及神经再生。为此,我们推测内皮克隆形成细胞通过旁分泌机制可促进糖尿病患者慢性创面的愈合以及破损处血管再生。本实验通过探讨ECFCs条件培养基（Conditioned medium,CM）对人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）和人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts,HDFs）的作用功能,为ECFCs对于糖尿病患者创面修复作用提供新思路和理论支持。方法:1.ECFCs的提取、分离培养及鉴定1.1 ECFCs细胞提取及分离培养:采集健康志愿者脐带血,采用密度梯度离心法获得单个核细胞,将人纤维蛋白加入六孔细胞培养板中,置于37℃培养箱中孵育3h进行包被,接种到包被人纤维蛋白的细胞培养板中进行培养;1.2 ECFCs细胞鉴定:将培养的ECFCs细胞,采用流式细胞仪及免疫荧光法检测ECFCs细胞表面抗原,Matrigel成管实验对ECFCs细胞进行体外检测,共聚焦法检测ECFCs细胞对于Dil-acLDL和FITC-UEA-I的摄取结合能力。2.ECFCs-CM制备与细胞因子检测2.1细胞条件培养基ECFCs-CM的制备:对数生长期的ECFCs细胞于无血清的M199基础培养液中置于常氧和低氧条件下持续培养24h和48h,收集上清液,即为条件培养液（ECFCs-CM）;2.2.细胞条件培养基（ECFCs-CM）细胞因子检测:采用抗体芯片及ELISA法检测ECFCs-CM细胞因子表达;3.ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞的生物学作用3.1 CCK-8法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞增殖能力的影响;3.2细胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.3 Transwell间接共培养法检测ECFCs对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.4流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞周期的影响;3.5流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞凋亡的影响;4.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶的制备结果:1.ECFCs细胞提取及培养:ECFCs原代培养第4天,见少量呈纺锤形贴壁细胞,呈集落样生长集落中间可见圆形细胞,周边为梭形细胞,其结构与形状和血岛极其相似,ECFCs原代培养第8天,细胞集落开始接触融合;ECFCs原代培养第14天,细胞呈典型的“铺路石”样生长;2.ECFCs细胞的鉴定:流式细胞仪检测显示KDR、CD144（vWF）高表达,CD34部分表达,CD133、CD45低表达;Matrigel基质胶上形成管腔样结构,表现出典型的内皮细胞特征;3.抗体芯片检测显示,细胞条件培养基ECFCs-CM在常氧和低氧条件下多种细胞因子高表达,随时间表达谱稍有不同。在低氧条件且持续培养48h更有利于细胞培养液上清中细胞因子表达;ELISA法检测显示,EBM-2组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF无表达,ECFCs-CM组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF表达量较高;4.ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞的作用:CCK-8法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞增殖情况明显高于EBM-2组（P<0.05）;细胞划痕法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞培养至0h、6h和12h和24h细胞迁移覆盖率明显大于EBM-2组（P<0.05）;Transwell间接共培养法检测显示ECFCs-CM共培养组的HUVECs和HDFs细胞数明显高于EBM-2组（P<0.05）;流式细胞仪检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞处于G0/G1期细胞比例明显少于EBM-2组（P<0.05）;ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞早晚期凋亡率明显降低。5.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶:SF/ALG复合水凝胶的孔径为50-120μm,FTIR光谱结果表明重要官能团的振动模式对比纯的ALG和SF,无明显差异;SF/ALG水凝胶孔隙率分析显示水凝胶孔隙率高,均一性良好;SF/ALG水凝胶溶胀度随着时间增加。结论:富含多种细胞因子的ECFCs-CM可促进HUVECs和HDFs细胞增殖、迁移和成管,减少HUVECs和HDFs细胞的凋亡,ECFCs通过旁分泌促进新生血管形成,为干/祖细胞旁分泌机制为基础的“无细胞”治疗策略促进糖尿病及难愈性创面修复可提供新思路。

李雪伟^[7]（2019）在《长链非编码RNA-LLEST抑制白血病血管形成及机制探讨》文中研究指明[目的]1.研究在恶性血液病细胞株K562、U937、SHI-1中长链非编码RNA-LLEST的表达及对血管形成的影响。2.研究长链非编码RNA-LLEST在恶性血液病细胞株K562、U937、SHI-1中抑制血管形成的机制。3.探讨长链非编码RNA-LLEST和PDGFA在急性髓系白血病（AML-M2）病人及缺铁性贫血（IDA）病人标本中表达差异。[方法]前期实验结果发现,与缺铁性贫血患者相比,LLEST在恶性血液病中表达较低。我们构建LLEST高表达稳定细胞株K562及LLEST低表达稳定细胞株U937和SHI-1,并通过定量qRT-PCR验证其表达。运用生物信息学分析软件预测LLEST可能发挥作用的基因或靶点。基于对血管形成相关PDGFA基因的预测,随机选择8例缺铁性贫血与8例初治急性髓系白血病（M2）治疗前后的骨髓标本,提取其单个核细胞,通过qRT-PCR方法检测LLEST及PDGFA基因表达。选取高表达LLEST的K562细胞株、LLEST敲除后低表达的U937,SHI-1细胞株及其各自对照细胞株,检测PDGFA基因及蛋白水平。分别提取其上清,探究体外小管形成是否有差异。选取高表达LLEST的K562细胞株和对照细胞株进行裸鼠皮下成瘤实验所成的瘤块,并进行免疫组化即HE及CD31染色,探究体内血管形成是否存在差异。应用双荧光素酶报告基因技术、向细胞上清中加入抑制剂和激活剂对LLEST抑制恶性血液病细胞血管形成机制进行深入探索。[结果]1.小管形成实验发现高表达LLEST的K562细胞株血管形成较对照组明显减少,低表达LLEST的U937和SHI-1细胞株血管形成较对照显着增多。体内实验的结果与体外实验类似,高表达LLEST组皮下成瘤体积明显小于对照组,且免疫组化提示CD31、HE染色明显少于对照组。2.qRT-PCR发现初治急性髓系白血病（M2）患者LLEST表达显着低于缺铁性贫血患者,治疗缓解后LLEST表达显着高于初诊时。缺铁性贫血患者PDGFA表达明显低于初诊M2患者,且治疗缓解后PDGFA水平较初诊时明显下降。定量RT-PCR及ELISA均提示,在高表达LLEST的K562细胞中,PDGFA表达较低,在低表达LLEST的U937和SHI-1细胞中,PDGFA表达高于对照组。3.荧光素酶报告基因发现LncRNA-LLEST与PDGFA基因具有相互作用。4.向细胞上清中分别加入抑制剂和激活剂后,发现前者较空白对照相比,血管形成显着减少;后者较空白对照相比,血管形成显着增加。[结论]1.长链非编码RNA-LLEST抑制急性髓系白血病细胞株血管形成。2.PDGFA是LLEST抑制白血病血管形成的重要影响因素。3.LLEST在急性髓系白血病和缺铁性贫血患者及初治急性髓系白血病治疗前后表达有差异,PDGFA表达与LLEST相反。

郑积富^[8]（2019）在《长链非编码RNA PVT1通过调控miR-26b促进血管新生的机制研究》文中指出研究背景:白血病（leukemia）是血液系统排名首位的恶性疾病,也是成人前十大常见恶性肿瘤的一种,其发病率及死亡率呈逐年上升的趋势。我国作为世界第一人口大国,具有国际上最庞大的白血病群体,治疗白血病所花费的巨额医疗费用和为此付出的巨大精力,使患者及其家庭背负巨大的经济和精神压力,同时也使得国家医疗负担日益加重,成为目前不容忽视的社会问题。白血病的发病机制十分复杂,到目前为止,尚不能完全将之阐述清楚。根据现有研究对病人进行危险度分层并进行相应的治疗,部分患者仍存在耐药和复发的问题,提示我们需要进一步探索白血病新的发病机制。最近的研究表明,骨髓造血微环境的变化也是白血病发病机制中的重要因素,而骨髓血管新生是骨髓造血微环境改变的一项重要病理过程。多项研究证实白血病中存在明显的血管新生。血管新生的细胞和分子调节机制在各种恶性肿瘤间存在许多共性,表现为诱导因子表达上调,而抑制因子的表达则相对减弱。血管新生过程的相关分子机制极其复杂,包含众多信号通路,目前尚未被详尽阐明。我们都知道,编码基因的表达水平受到上游miRNA的调控,目前已有很多文献证实miRNA的表达异常和血管新生的发生发展有着密切的联系,因此探索靶基因相关miRNA是研究靶基因的核心环节。根据Salmena等提出的竞争性内源RNA（ceRNA）假说,长链非编码RNA（LncRNAs）通过自身miRNA应答元件（MREs）竞争性结合miRNA,调控有关基因的表达。提示lncRNA重要的作用之一就是起到miRNA海绵作用,调控靶基因表达。综上所述,lncRNA-miRNA-mRNA这样的ceRNA机制值得我们进行研究。研究目的:血管新生对于各种生物过程是必需的,包括肿瘤血液供应递送、癌细胞生长、侵袭和转移。最近有研究发现,在食管癌及黑色素瘤中lncRNA PVT1可通过ceRNA机制作用于miR-26b,从而影响肿瘤的发生、转移、血管新生等过程。然而,PVT1调节血管内皮细胞血管新生的具体潜在分子机制仍有待阐明。研究方法:1、为了确定miR-26b对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞增殖、迁移和血管形成的影响,将miR-26模拟物或miR-26b抑制剂转染到HUVECs中。分别采用MTT法,Transwell迁移法和体外血管的小管形成实验法,研究miR-26b在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）细胞增殖、迁移和血管形成中的作用。进行逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（western blotting）以定量靶基因的信使RNA（Messenger RNA,mRNA）和蛋白质表达水平。随后使用双荧光素酶报告基因研究miR-26b与CTGF的3’-UTR的相互作用。2、为了确定PVT1对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞增殖、迁移和血管形成的影响,构建PVT1过表达（pEX2-PVT1）和PVT1敲减（sh-PVT1）的HUVECs。分别采用MTT法,Transwell迁移法和体外血管的小管形成实验法,研究PVT1在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）细胞增殖、迁移和血管形成中的作用。进行逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-26b和靶基因的mRNA表达水平变化,并使用蛋白质印迹法（western blotting）以定量靶基因的蛋白质表达水平。随后使用双荧光素酶报告基因研究PVT1和miR-26b的相互作用。研究结果:1、miR-26b的过表达在Transwell细胞体外侵袭实验中抑制了HUVECs的细胞迁移（P<0.05）,而抑制miR-26b的表达水平则促进这种迁移（P<0.05）。细胞增殖试验（MTT法）结果证实,过表达miR-26b的HUVECs细胞的细胞增殖活性显着减少（P<0.05）,相反,miR-26b的消耗增加了HUVECs的细胞增殖能力（P<0.05）。通过对不同组HUVECs的成管长度、成环数、覆盖面积、结点数进行测量和记录,并进行统计学分析,结果显示,miR-26b过表达减少了血管的长度（P<0.05）。RT-qPCR和western blotting结果显示,与模拟物阴性对照组相比,miR-26b过表达导致CTGF和ANGPT2的mRNA和蛋白表达水平降低。双荧光素酶实验证实,miR-26b能够识别并结合野生型CTGF 3’-UTR,导致荧光素酶的活性降低（P<0.05）,而加入突变型载体组的荧光素酶强度没有改变。2、与对照相比,PVT1过表达细胞（pEX2-PVT1）具有更高的迁移能力（P<0.05）,而PVT1敲减细胞（sh-PVT1）的迁移能力减弱（P<0.05）。MTT法结果证实,PVT1过表达（pEX2-PVT1）显着促进HUVECs的细胞增殖（P<0.05）,而PVT1低表达则损害HUVECs的细胞生长速率（P<0.01）。体外血管形成实验结果表明,与PVT1敲减细胞（sh-PVT1）相比,PVT1过表达（pEX2-PVT1）促进体外血管形成（P<0.001）。RT-qPCR结果显示,PVT1过表达（pEX2-PVT1）导致miR-26b的表达水平降低（P<0.01）而CTGF和ANGPT2的mRNA表达水平增加（P<0.05和P<0.01）,而缺乏PVT1的细胞表现出升高的miR-26b水平（P<0.05）和下调的CTGF和ANGPT2的mRNA水平（P值均<0.05）。western blotting结果显示,PVT1过表达（pEX2-PVT1）的HUVECs中CTGF和ANGPT2蛋白表达水平增加,而PVT1敲减（sh-PVT1）的HUVECs中CTGF和ANGPT2蛋白表达水平降低。双荧光素酶报告基因测定证明,仅野生型PVT1显着降低miR-26b的荧光素酶活性（P<0.05）,结合位点突变后的PVT1不改变miR-26b的荧光素酶活性。研究结论:1、过表达miR-26b可抑制HUVECs细胞株的细胞增殖、迁移和血管形成。2、miR-26b通过下调CTGF和ANGPT2在HUVECs的血管新生中起到抑制作用。3、miR-26b直接作用于CTGF的3’-UTR区域,抑制CTGF的转录。4、过表达PVT1可促进HUVECs细胞株的细胞增殖、迁移和血管形成。5、lncRNA PVT1直接作用于miR-26b,使miR-26b表达下调。6、lncRNA PVT1扮演着miR-26b吸附海绵的作用从而促进CTGF和ANGPT2的表达,最终达到促进血管新生作用。

沙如拉,吴岩^[9]（2013）在《黄芪注射液对内皮细胞的增殖及表达E-Selectin和VCAM-1的影响》文中研究说明目的:了解黄芪注射液对内皮细胞增殖及分泌黏附分子VCAM-1和E-selectin的影响,探讨黄芪注射液对造血调控的机理。方法:（1）.建立人脐静脉内皮细胞体外培养模型,用免疫细胞化学方法及电子显微镜技术鉴定内皮细胞;（2）.将HUVEC与黄芪注射液不同剂量（0μg/mL、4μg/mL、40μg/mL、400μg/mL和4000μg/mL）一起培养,用MTT法检测内皮细胞增殖;以流式细胞分析术测定内皮细胞增殖周期;以TNF作为阳性对照,用ELISA法对黏附分子VCAM-1和E-selectin进行测定。结果:（1）成功的建立了人脐静脉内皮细胞的体外模型;用Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色结果为阳性、电镜检测到W-P小体,证实培养细胞为人脐静脉内皮细胞。（2）内皮细胞随着培养时间的延长,各组均显示出不同程度的促生长效应（Time:P<0.05;Concentration:P<0.05）。（3）细胞周期检测显示实验组内皮细胞周期各时相的细胞数占细胞总数的百分比与黄芪组比较有明显的不同（P<0.05）。S期和G 2/M期细胞显着增多（P<0.05）,而G 0/G 1期细胞相对比例减少（P<0.05）。（4）体外培养的内皮细胞可自然分泌VCAM-1。各个浓度的黄芪注射液与TNF一样均具有促进内皮细胞分泌VCAM-1的作用,其中400μg/mL的黄芪注射液浓度是促进内皮细胞分泌VCAM-1的最佳浓度（P<0.05）,而且黄芪注射液具有协同TNF的作用（P<0.05）。（5）内皮细胞体外培养在没有任何刺激的情况下未检测到E-se-lectin.黄芪注射液刺激内皮细胞也未检测到E-selectin.内皮细胞在TNF刺激活化后表达E-selectin.黄芪注射液能促进TNF活化的内皮细胞分泌E-selectin（P<0.05）。结论:本研究提示,黄芪的补气生血途径之一可能是通过直接刺激内皮细胞增殖和分泌造血生长因子和黏附分子,从而间接发挥造血调控作用的;黄芪可能促进造血干祖细胞的归巢,并为开发黄芪用于辅助治疗血液病及肿瘤放、化疗后骨髓重建提供了理论依据。

石晓月^[10]（2011）在《建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系并诱导单核细胞向树突状细胞分化的研究》文中提出树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是目前所知功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞（NT cell）的专职抗原提呈细胞（Antigen-presenting cell,APC）,在免疫应答中处于中心地位。临床和研究中的DCs通常是人外周血单核细胞（peripheral blood monouclear cell,PBMC）在细胞因子GM-CSF、IL-4作用下体外诱导一周得到。但是有研究人员提出这种细胞因子来源的DCs缺乏功能的完整性,而模拟DCs在体内的分化过程,在体外诱导DCs前体细胞向DCs的分化,对DCs功能的研究更具意义。在体内短期循环的单核细胞在炎症或损伤信号的刺激下,穿越血管内皮细胞进入外周组织到达炎症位点,同时分化为DCs并进一步成熟。基于内皮细胞提供的微环境在DC的发育中的重要作用,Randolph课题组最早提出了单核细胞-内皮细胞穿越模型,PBMCs通过两次穿越原代人脐静脉血内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）分化为APCs,该细胞在功能和表型上都与DCs相似。但是该方法操作复杂,使得其应用受到极大的限制。而Schanen利用transwell技术将HUVECs与外周血单核细胞进行共培养,在PBMCs单向穿越HUVECs细胞层后成功获得DCs,培养过程不需要加入外源细胞因子,分化时间仅为两天。但是以上培养系统存在着较大的缺点,即HUVECs是原代细胞,分离时操作繁琐,在体外培养需要加入细胞因子,传代次数较少,不适于长期使用。本研究提出了构建分泌GM-CSF、IL-4的内皮细胞系EA.hy926来诱导PBMCs的分化。EA.hy926细胞是由HUVECs和人肺癌A549细胞融合得到,具有HUVEC的部分特征,可在不加入外源细胞因子的条件下在体外长期传代,遗传背景单一,避免了原代细胞培养的缺点。通过慢病毒重组系统将GM-CSF、IL-4的基因重组进入EA.hy926细胞的基因组中,达到提高两个细胞因子表达的目的,该细胞系将对DC的分化培养具有重要的意义。本论文成功构建了GM-CSF、IL4慢病毒共表达质粒;包装获得的重组慢病毒可以高效的感染内皮细胞系EA.hy926,感染后的EA.hy926经实时定量PCR、Western bloting及ELISA等多种方法进行蛋白翻译表达的鉴定,经鉴定感染后细胞可以高效表达细胞因子GM-CSF、IL4,感染后细胞的生长状态良好,能够长期在体外进行传代培养,可以用于DC诱导实验;丝裂霉素C（MMC）可以抑制细胞增殖,而不改变细胞分泌蛋白的性质,是体外常用的制备饲养层的方法之一,我们通过实验,最终确定了MMC的作用时间和浓度。采用免疫磁珠的方法从人外周血单核细胞（PBMC）中分离得到了高纯度的CD14+单核细胞,与建立的内皮细胞系进行共培养,通过表型及形态分析,最后得出结论本实验室建立的内皮细胞系可以诱导单核细胞分化为DCs,高表达T细胞共刺激分子和HLA-DR分子。本论文共分两部分:（1）建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系;（2）GM-CSF、IL-4-EA.hy926细胞作为饲养层与外周血单核细胞共培养。主要研究结果如下:一、建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系利用重叠PCR将GM-CSF、IL4基因通过剪切体T2A序列相连,得到GM-CSF-T2A-IL4融合基因。将融合基因构建入慢病毒表达载体pBPLV,得到重组的慢病毒表达载体。该重组慢病毒经双酶切、测序鉴定显示重组质粒构建成功。重组慢病毒载体及慢病毒包装质粒、包膜质粒共转染293FT细胞,转染24h后经荧光显微镜观察转染效率达到90%以上;浓缩后的病毒可以有效的感染内皮细胞系EA.hy926细胞,感染后的细胞经过扩大培养后感染效率依然可以达到94%,说明目的基因可以在感染细胞内稳定的传代;感染后细胞进行生长曲线的测定,其结果说明,感染后细胞的生长趋势没有减弱,能够很好的进行增殖;经实时定量PCR和ELISA方法证实感染后细胞hGM-CSF、hIL-4在mRNA水平的表达分别是未感染细胞的24倍和9946倍,在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的145倍和23倍。二、GM-CSF、IL-4-EA.hy926细胞作为饲养层与外周血单核细胞共培养在丝裂霉素C（MMC）抑制内皮细胞系生长的实验中,确定了在处理时间为2.5h时,MMC的浓度选择为10μg/ml。在此浓度作用下,内皮细胞系生长受到抑制,但是保持其分泌的功能;利用磁珠分选CD14+单核细胞分选纯度达到94%以上,与以构建的内皮细胞系进行共培养后, CD14+单核细胞向DC方向分化,分化得到的DC表面有细小而密集的突起,流式细胞术检测DC表面的标志,结果显示此方法得到的DC表达CD1a,CD83,高表达DC特异性表面标志DC-SIGN,高表达共刺激分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR。

二、体外人脐静脉内皮细胞分泌GM-CSF的研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、体外人脐静脉内皮细胞分泌GM-CSF的研究（论文提纲范文）

（1）TNF-α诱导的脐带间充质干细胞外泌体对修复细胞及创面愈合的影响研究（论文提纲范文）

（2）苦参素对HepG2细胞条件培养基诱导的人脐静脉内皮细胞血管生成作用的研究（论文提纲范文）

（3）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（4）PD-1在调节缺血后小鼠下肢血流恢复和血管新生能力的作用及机制研究（论文提纲范文）

（5）GM-CSF对子宫内膜再生修复的作用及机制研究（论文提纲范文）

（6）人源内皮克隆形成细胞（ECFCs）旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究（论文提纲范文）

（7）长链非编码RNA-LLEST抑制白血病血管形成及机制探讨（论文提纲范文）

（8）长链非编码RNA PVT1通过调控miR-26b促进血管新生的机制研究（论文提纲范文）

（9）黄芪注射液对内皮细胞的增殖及表达E-Selectin和VCAM-1的影响（论文提纲范文）

（10）建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系并诱导单核细胞向树突状细胞分化的研究（论文提纲范文）

四、体外人脐静脉内皮细胞分泌GM-CSF的研究（论文参考文献）

• [1]TNF-α诱导的脐带间充质干细胞外泌体对修复细胞及创面愈合的影响研究[D]. 郝艺. 遵义医科大学, 2021
• [2]苦参素对HepG2细胞条件培养基诱导的人脐静脉内皮细胞血管生成作用的研究[D]. 覃小珊. 右江民族医学院, 2021(01)
• [3]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
• [4]PD-1在调节缺血后小鼠下肢血流恢复和血管新生能力的作用及机制研究[D]. 刘晓光. 上海体育学院, 2020
• [5]GM-CSF对子宫内膜再生修复的作用及机制研究[D]. 刘娟. 浙江大学, 2020(01)
• [6]人源内皮克隆形成细胞（ECFCs）旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究[D]. 郭晓瑞. 南方医科大学, 2020(01)
• [7]长链非编码RNA-LLEST抑制白血病血管形成及机制探讨[D]. 李雪伟. 苏州大学, 2019(04)
• [8]长链非编码RNA PVT1通过调控miR-26b促进血管新生的机制研究[D]. 郑积富. 南昌大学, 2019(01)
• [9]黄芪注射液对内皮细胞的增殖及表达E-Selectin和VCAM-1的影响[J]. 沙如拉,吴岩. 内蒙古医科大学学报, 2013(S1)
• [10]建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系并诱导单核细胞向树突状细胞分化的研究[D]. 石晓月. 中国人民解放军军事医学科学院, 2011(08)

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