一、细胞凋亡研究进展（论文文献综述）
张小莉[1]（2021）在《杠柳毒苷对H9C2心肌细胞的影响及机制研究》文中研究表明目的:以H9C2心肌细胞为研究对象,探究不同干预时间、不同浓度的杠柳毒苷对H9C2心肌细胞活力、增殖、凋亡、血管新生的影响及其机制,从而揭示“有是证,用是药”的科学内涵,并且为后续杠柳毒苷的效应研究提供实验基础。方法:H9C2心肌细胞培养,设立空白对照组、模型组（缺氧）以及不同浓度杠柳毒苷给药组（杠柳毒苷浓度500、250、125、100、50、20μmol/L）,并在不同的时间点（24h、48h、72h）进行CCK-8细胞活性检测、MTT细胞增殖检测、LDH细胞毒性测定、TUNEL,以及Western blot检测Cleaved Caspase-3、VEGF-A、P-Akt、Akt等蛋白表达。结果:1、H9C2心肌细胞培养:光镜下（5x、10x）观察H9C2心肌细胞,细胞贴壁生长,呈梭形,放射状紧密规则排列,胞体饱满,细胞周围透亮有光泽。2、MTT细胞增殖结果:24h时,与空白对照相比,杠柳毒苷（125μmol/L）干预后细胞增殖明显升高,其他剂量组明显下降,差异具有明显统计学意义（P<0.01）;48h时,与空白对照相比,杠柳毒苷各个剂量组干预后细胞增殖均下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;72h时,与空白对照相比,杠柳毒苷各个剂量组均明显抑制细胞的增殖（P<0.01）。3、CCK-8细胞活性结果:缺氧后细胞活性明显下降（P<0.01）,随着时间的延长,细胞活性降低越来越明显。与模型组相比,杠柳毒苷干预后,24h时,500和250μmol/L（P<0.05,P<0.01）剂量组细胞活性均下降,其他剂量组均没有统计学意义;48h、72h时,500μmol/L（P<0.05）剂量组细胞活性均下降,125、100、50和20μmol/L（P<0.05,P<0.01）剂量组细胞活性均升高,250μmol/L剂量组,48h时对细胞活性影响没有统计学意义,72h时细胞活性升高（P<0.05）。4、不同浓度的杠柳毒苷对H9C2心肌细胞毒性的影响:杠柳毒苷干预6h、12h和24h后,随着时间的延长,各个剂量组LDH的含量均越来越高（P<0.01）。所有干预时间点,200μmol/L剂量组LDH的释放量均低于100μmol/L剂量组,此外,除24h时500μmol/L剂量组LDH的含量高于200μmol/L剂量组（P<0.05）,其他时间点均没有统计学意义。5、TUNEL心肌细胞凋亡检测结果:各个时间点的模型组凋亡率均升高,随着时间的延长,凋亡率呈增高的趋势。24h时,杠柳毒苷各给药组（500、100和20μmol/L）对细胞的凋亡起不到抑制作用,反而促进细胞凋亡;48h和72h时,100和20μmol/L剂量组抑制细胞凋亡,500μmol/L剂量组促进细胞的凋亡。6、各个时间和浓度杠柳毒苷对H9C2心肌细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表达的影响:缺氧后,各个时间点Cleaved Caspase-3的表达均升高（P<0.05）;与模型组相比,杠柳毒苷干预24h后,250、100和50μmol/L剂量组均能明显促进Cleaved Caspase-3的表达（P<0.01）;48h时,100、50和20μmol/L剂量组均抑制Cleaved Caspase-3的表达（P<0.05）;72h时,500、250、100和20μmol/L剂量组均明显降低（P<0.01）,50μmol/L剂量组升高（P<0.05）。500、20μmol/L（24h）和500、250μmol/L（48h）剂量组对Cleaved Caspase-3的表达影响不显着（P>0.05）。7、各个时间和浓度杠柳毒苷对H9C2心肌细胞VEGF-A表达的作用结果:缺氧24h时,VEGF-A的表达升高（P<0.05）,缺氧48h、72h时,VEGF-A的表达均降低（P<0.01）;与模型组相比,杠柳毒苷干预后,各个时间点100和50μmol/L剂量组均升高（P<0.05）;24h时,250μmol/L剂量组升高（P<0.05）,500和20μmol/L剂量组降低（P<0.05）;48h时,250和20μmol/L剂量组降低（P<0.05）,500μmol/L剂量组无明显差异（P>0.05）;72h时,500和250μmol/L剂量组明显升高（P<0.01）,20μmol/L剂量组无明显差异（P>0.05）。8、杠柳毒苷对H9C2心肌细胞影响的机制:缺氧后,各个时间点P-Akt/Akt的表达均升高（P<0.05,P<0.01）;与模型组相比,杠柳毒苷干预后,各个时间点250和50μmol/L剂量组均降低（P<0.01,P<0.05）;24h后,500μmol/L剂量组升高（P<0.05）,100和20μmol/L剂量组均明显降低（P<0.01）;48h后,500和100μmol/L剂量组均降低（P<0.05）,20μmol/L剂量组明显升高（P<0.01）;72h后,500μmol/L剂量组升高（P<0.05）,100和20μmol/L剂量组均无明显差异（P>0.05）。结论:1、杠柳毒苷干预早期,对细胞凋亡无明显改善作用。随着作用时间延长,杠柳毒苷明显改善细胞凋亡,并且250μmol/L和100μmol/L浓度对凋亡的抑制作用最佳。随着浓度的升高,药物的毒性作用更明显,促进细胞凋亡。2、杠柳毒苷（250μmol/L和100μmol/L）干预,24h、72h可能存在促进血管新生作用。3、杠柳毒苷100、50和20μmol/L剂量组（48h）和500、250、100和20μmol/L剂量组（72h）能够使缺氧H9C2心肌细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达降低,100和50μmol/L剂量组（24h、48h、72h）和250μmol/L剂量组（24h和72h）VEGF-A蛋白表达升高,可能通过调节Akt通路,调控心肌细胞凋亡。
翟雨晴[2]（2021）在《大豆苷元诱导肺癌A549细胞凋亡及其相关机制的研究》文中指出肺癌是一种对全世界人类健康都具有极大威胁的恶性肿瘤疾病,癌症数据分析表明,每年死于肺癌的肿瘤患者约有176万人。大豆苷元（daidzein,DAI）是一种广泛存在于大豆产品中的天然异黄酮类化合物,因其具有良好的药效药理机制而受到各国学者关注,但其对于肺癌的防癌抗癌作用机制尚不清晰。因此,本实验以肺癌细胞作为体外研究模型,从细胞及分子水平上对DAI的抗癌机制进行研究。本研究通过研究DAI对3种肺癌细胞的杀伤效应以及3种正常细胞的毒副作用,利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法进行了检测;采用荧光显微镜观察法和流式细胞术（FCM）对DAI的诱导凋亡进行检测;通过FCM对DAI在肺癌细胞内的周期阻滞作用进行检测;通过FCM对DAI在肺癌细胞内活性氧（ROS）水平的调控作用进行检测;通过细胞划痕实验对DAI在肺癌细胞的抑制迁移作用进行检测;通过蛋白质免疫印迹法（western blot）对细胞凋亡、ROS水平、周期阻滞、迁移抑制以及相关信号通路蛋白表达量情况进行检测。结果显示,与阳性对照5-FU组相比,DAI对3种肺癌细胞具有杀伤作用,且对3种正常细胞表现出的毒副作用并不显着;随着DAI处理A549细胞时间的不断增加,细胞出现明显的皱缩变圆的凋亡形态、早晚期凋亡数量的总和不断增加并显着降低了A549细胞内线粒体膜电位,此外,DAI还能够显着降低凋亡相关蛋白Bcl-2/Bad的比例,释放细胞色素C（Cytochrome C,cyto-c）,介导caspase-3和PARP被活化,最终使细胞发生线粒体依赖性凋亡;DAI可通过促进周期蛋白p21、p27的表达,抑制周期蛋白p-AKT、CDK2/4/6和cyclin D1/E的表达,使细胞在G0/G1期发生周期阻滞;DAI能够上调肺癌A549细胞中ROS水平,进而激活JNK、p38信号通路,抑制ERK,STAT3和NF-κB信号通路,使A549细胞发生凋亡;DAI在处理A549细胞后,其迁移作用明显地受到了抑制,且呈时间依赖性,并通过TGF-β信号通路有效抑制肺癌A549细胞发生迁移。综合以上结果,DAI对3种肺癌细胞具有杀伤作用,且能够使肺癌A549细胞内ROS水平升高,进而调控MAPK,STAT3和NF-κB信号通路,使肺癌A549细胞发生线粒体依赖性凋亡和细胞周期阻滞,并通过调控TGF-β信号通路抑制细胞迁移和侵袭。本研究为研制出一种安全有效的防治肿瘤功能因子提供新的思路和理论依据。
田军[3]（2021）在《降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究》文中研究表明创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）的定义是由于外部机械力造成的脑损伤,并导致大量的死亡和残疾,许多受害者有功能障碍,如运动和感觉功能障碍,甚至认知功能缺陷。据估计,全世界每年约有5000万人被诊断为TBI。颅脑损伤根据发生的不同过程和阶段,可分为原发性和继发性脑损伤,都是由脑外伤引起的复杂疾病。组织丢失和细胞死亡是主要的损伤,TBI后由于原发性颅脑损伤导致的继发性脑损伤,导致激活的小胶质细胞、募集的中性粒细胞和巨噬细胞以及血液代谢物中引起的炎症反应均可导致继发性脑损伤,进而导致进一步的功能性和器质性的脑损伤。炎症反应被认为是TBI继发性损伤的重要机制。从理论上讲,减少炎症改善受损脑组织能量及代谢可以减轻TBI引起的继发性脑损伤。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide CGRP）是由37个氨基酸组成的多肽,广泛表达于中枢和外周神经系统。目前,CGRP被认为是最有效的血管舒张药。CGRP在脑组织中起保护作用。当脑组织受到损伤并出现缺血时,小鼠脑TBI后产生大量自我保护物质,CGRP是其中最重要的保护物质之一。研究表明,在TBI后的病理过程中,CGRP的分泌在TBI后增多。增加的目的是使脑血管扩张,尽快为损伤后缺血缺氧的脑组织提供血液供应。然而,当脑组织损伤缺血较严重时,脑组织产生的CGRP不能完全防御这种损伤。因此出现了严重的脑组织继发性和永久性损伤。考虑到CGRP具有保护脑损伤的潜力,而自噬和凋亡在TBI诱导的继发性损伤中发挥重要作用,我们检测了CGRP是否能抑制TBI小鼠的自噬和凋亡的表达。结果表明,CGRP通过减轻脑水肿、调节神经元自噬和凋亡,减低TBI后神经炎症反应来保护大脑。第一部分创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系目的:临床工作中,观察不同TBI患者CGRP表达变化、判断伤情程度,进一步探讨CGRP与TBI患者病情程度及预后的关系,并探讨CGRP是否可以作为判断TBI预后的可靠指标。方法:选取138例TBI患者进行分组:健康体检者54例（对照组）,重度TBI组73例,轻度TBI组65例。采用酶联免疫分析试剂法（ELISA）,测定TBI患者特定时间的血清CGRP水平。采用格拉斯哥昏迷量表（GCS）判定TBI严重程度。统计分析:各组不同时间CGRP比较采用重复测量资料的方差分析,同一时间组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。采用wilicoxon秩和检验分析患者血清CGRP水平与临床变量的关系。结果:1.TBI后患者血清CGRP的变化对照组随时间变化呈现平稳状态,TBI（轻度组）和TBI（重度组）先下降后逐渐上升。两组血清CGRP水平均低于对照组。入院时、1天、3天、7天和14天时间点,TBI（重度组）低于TBI（轻度组）,差异显着,有统计学意义;入院时、1天、3天时间点,TBI（轻度组）低于对照组,差异显着,有统计学意义;入院时间点7天和14天,TBI（轻度组）低于对照组,但差异不显着。2.入院时TBI患者血清CGRP水平与临床病理特征关系相对于GCS评分<5分的患者,GCS评分≥5分的患者血清CGRP水平较高（Z=-2.277,P=0.023）。存活患者的CGRP水平高于死亡患者（Z=-3.571,P<0.001）。3.入院血清CGRP预测TBI患者伤后死亡的价值评估血清CGRP水平预测TBI患者伤后死亡的特异度为88.24%,灵敏度为68.82%,CGRP预测最佳临界值为13.255pg/ml。4.TBI患者预后与血清CGRP的相关性CGRP高水平组患者生存情况优于低水平组患者,差异显着;单因素Cox分析发现,年龄,中线结构移位,GCS分数,CGRP水平与TBI患者预后相关;多因素Cox分析发现,中线结构移位,CGRP水平是TBI患者独立预后因素。小结:1.TBI后患者血清中的CGRP变化趋势为随伤后时间变化先降低,然后逐渐升高。约至24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡,而且该预测效能较高。第二部分降钙素基因相关肽（CGRP）对小鼠创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用目的:通过重物打击法（Feeney重物下降挫伤法）,建立开放性创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）动物模型,并予以脑室注射联合尾静脉注射外源性降钙素基因相关肽（CGRP）干预TBI模型小鼠;通过旷场实验、水迷宫实验、巴恩斯迷宫实验、跳台实验对实验小鼠的行为学评分进行测量,验证（CGRP）对创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用。通过测量CGRP干预前后小鼠脑挫伤面积比较、脑水肿比较、血脑屏障破坏程度等方面的比较,来探讨CGRP对TBI小鼠脑损伤的保护作用。方法:清洁级（SPF）雄性BALB/C小鼠390只,随机分为sham组、TBI组和TBI+CGRP组。用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg,i.p.i.）麻醉小鼠,根据Feeney重物下降法,建立开放性颅脑创伤模型。TBI+CGRP两组分别用CGRP肽（脑室注射+尾静脉注射）,术后每日采用改良神经严重程度评分（m NSS）检测各组小鼠的神经功能缺损程度。各组小鼠分别于术后相应的时间点（1、3、5、7天）取材;苏木精伊红染色（HE染色法）和（TTC）染色法:测量小鼠脑组织损伤面积,并进行组间对比;通过干湿重法测量不同组别小鼠的脑组织含水量;通过测量Evans Blue（EB）渗透率的方法,来判定TBI后血脑屏障的破坏程度。通过蛋白质印迹法（Western blot）测量脑组织CGRP蛋白的表达量。通过行为学测试对小鼠神经行为学进行测量:术后第8、9天进行旷场实验;术后第10-15天行水迷宫实验;术后第16-22天行巴恩斯迷宫实验;术后第23、24天为跳台实验的训练和测试阶段。结果:1.创伤性颅脑损伤（TBI）（Feeney重物下降挫伤法）动物模型稳定:术后小鼠平均昏迷时间约为1.5-2h,生命体征较平稳,体温恢复,呼吸平稳,逐渐苏醒和爬行,可进食水。脑组织经解剖,均可见局部挫伤灶,局部坏死、淤血,伴部分脑组织的凹陷缺损;部分样本损伤灶同侧可见蛛网膜下腔出血。2.各组小鼠m NSS评分差异术后第1天,TBI+CGRP组和TBI组相对sham组,神经功能均受损明显。TBI+CGRP组和TBI组神经功能基本相同,差异无统计学意义;在TBI后第2-7天,TBI+CGRP组小鼠m NSS评分低于TBI组,差异显着;第2-7天TBI+CGRP组和TBI组神经功能逐渐有所好转,两组小鼠的分数逐渐下降。3.TBI小鼠神经功能行为学评分结果旷场实验（Open field test）评分结果:总活动距离测试:sham组总距离最长,TBI+CGRP组小鼠的总距离居中间水平,TBI组的总距离最短。TBI+CGRP组小鼠的总距离相比TBI组的总距离长,差异显着。静止次数和静止时间和测试方面:TBI组小鼠静止次数最多,sham组和TBI+CGRP组静止次数较低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。TBI组小鼠静止时间最长,sham组和TBI+CGRP组静止时间相对较最低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。水迷宫实验:定位航行实验阶段:水迷宫测试小鼠发现平台的潜伏期,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比TBI组小鼠的潜伏期时间短,差异显着,有统计学意义。TBI组小鼠比sham组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。空间探索实验阶段:在测试的第五天小鼠穿过平台次数,sham组最多,TBI组最少,TBI+CGRP组居中。TBI组穿过平台次数相比sham组少,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组穿越平台次数多于TBI组,差异显着,有统计学意义。巴恩斯迷宫测试:训练阶段:TBI组小鼠的潜伏期相比较TBI+CGRP组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。第六天试验中,第一次探查目标洞（无暗箱）前的错误探查次数比较,TBI+CGRP组小鼠的探错次数相比TBI组小鼠多,差异显着,有统计学意义。跳台实验评分:在跳台试验测试阶段,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比较TBI组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义;错误次数:TBI+CGRP组小鼠的错误次数相比较于TBI组小鼠的错误次数少,差异显着,有统计学意义。4.不同组别小鼠脑组织标本创伤面积的测量和比较:三组小鼠脑组织切片相比较:TBI+CGRP组与TBI组相比较,均可见一定程度的脑组织损伤及局灶性神经细胞组织缺失,早期缺损范围的差异性较小。随着时间的推移,TBI小鼠脑组织切片可见更严重的脑损伤;定量计算脑损伤体积,TBI+CGRP组小鼠脑组织切片与TBI组小鼠脑组织切片相比较,损伤面积略小,但差异不显着,无统计学意义。5.脑水肿测定:外源性CGRP干预,将TBI术后脑水肿消退的时间点提前,减少了TBI诱导的脑水肿在TBI后持续时间,加速了TBI诱导的脑组织水肿的吸收,进而减轻脑损伤;另一方面,TBI+CGRP组小鼠的脑含水量在1天、3天、5天、7天这四个时间点,脑水肿程度均低于TBI组小鼠,差异显着,有统计学意义。6.血脑屏障损伤程度:TBI术后第1天,sham组未见明显依文思蓝（EB）渗出,TBI+CGRP组小鼠（EB）渗透率和TBI组相比无明显差异;TBI后第3、5、7天,TBI+CGRP组和TBI组小鼠依文思蓝（EB）渗透率仍较高,TBI+CGRP组小鼠依文思蓝（EB）渗透率低于TBI组,两者差异显着,有统计学意义。7.TBI后各组小鼠CGRP蛋白表达水平的差异:TBI组小鼠脑组织中CGRP表达水平显着降低,并随着时间的推移逐渐升高;TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的开放性颅脑损伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。2.CGRP干预减低了创伤性颅脑损伤小鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度。3.通过蛋白印迹法可见TBI后小鼠脑组织中CGRP的表达水平显着降低,24h达最低,随时间推移逐渐回升。TBI+CGRP组小鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示本实验采用的脑室注射+尾静脉注射干预途径有效可靠。第三部分降钙素基因相关肽（CGRP）对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响目的:通过对小鼠挫伤脑组织部位取材,对其进行自噬和凋亡相关标志性蛋白检测,观察对比CGRP干预前后自噬和凋亡标志性蛋白的变化情况,探讨CGRP在TBI环境下对自噬和凋亡的调控作用。方法:通过免疫荧光双染法:定位分析LC3和Neu N及GFAP蛋白;蛋白质印迹法,定量分析LC3、P62、Beclin-1、cleaved-caspase-3表达量;TUNEL和Neu N双染色法,分析TBI后神经元凋亡的表达变化情况。结果:1.CGRP对TBI小鼠神经元细胞自噬的影响免疫荧光双染法:脑皮层挫伤区LC3（+）蛋白定位于挫伤部位神经元的胞质中,Sham组可见少量阳性表达,随时间推移阳性表达程度无变化。TBI组于伤后1天可见LC3（+）细胞显着增多,随时间推移表达程度逐渐增强,高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组与TBI组比较,LC3（+）细胞数量较少,表达程度明显减弱,TBI后第1天,差异不显着,无统计学意义;而TBI后第3、5、7天,两组差异性逐渐增强,差异显着,有统计学意义。蛋白质印迹法:部分自噬标志物LC3、P62、Beclin-1蛋白表达与双染结果一致。TBI+CGRP组的LC3II/LC3I比值和Beclin-1水平较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。P62水平的变化则相反,与sham组相比,TBI导致小鼠P62表达降低,TBI+CGRP组的P62较TBI组明显升高,差异显着,有统计学意义。CGRP的干预导致P62蛋白表达逐渐增强并维持在一个相对较高的阶段。2.CGRP对TBI小鼠神经元细胞凋亡的影响:TUNEL和Neu N双染色显示:TBI导致神经元凋亡增加,挫伤灶周围TUNEL（+）细胞明显增加;TBI+CGRP组的TUNEL（+）较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义;蛋白质印迹法:（Western blot法）:TBI导致神经元凋亡,小鼠挫伤灶脑组织凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达升高,皮层组织细胞凋亡增加。TBI+CGRP组的cleaved-caspase-3较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。3.CGRP对TBI小鼠神经元细胞神经胶质纤维酸性蛋白GFAP的影响:与sham组相比,TBI导致小鼠神经元细胞GFAP数量明显增加,Neu N数量明显减低,而CGRP的干预降低了神经元细胞损伤。脑皮层挫伤区GFAP（+）表达:Sham组可见少量阳性细胞表达,表达不明显。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见阳性细胞显着增多。TBI组GFAP（+）计数率高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组GFAP（+）计数率低于TBI组第1、3天差异无显着性,第5、7天差异显着,有统计学意义。脑皮层挫伤区Neu N（+）表达:Sham组可见适量Neu N（+）表达。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见Neu N（+）细胞显着减少。TBI组Neu N（+）计数率低于Sham组,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组Neu N（+）计数率高于TBI组差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,予以外源性CGRP干预,有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡;2.TBI后小鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在显着增加,CGRP干预后,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位的胶质纤维酸性蛋白的出现,保护神经细胞功能。第四部分AKT/m TOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控目的:通过利用CGRP干预TBI小鼠模型,在信号通路层面探讨CGRP对自噬和凋亡相关通路蛋白的调控情况,进一步探讨CGRP对自噬和凋亡的调控机制。方法:通过CGRP干预TBI小鼠模型,采用蛋白质印迹法（Western Blot法）,测定CGRP干预前后挫伤灶局部脑组织的AKT/m TOR、Fox O3a通路相关标志蛋白的变化情况,并对比CGRP干预前后的蛋白表达变化差异。结果:1.CGRP对AKT/m TOR通路的影响TBI术后导致了小鼠脑神经元细胞内p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR水平降低,TBI+CGRP组和TBI组均低于sham组,差异显着,有统计学意义。CGRP使这两者比值均升高。其中,CGRP对p-Akt/Akt激活作用较明显,术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的p-Akt/Akt相比TBI组表达升高,差异显着,有统计学意义;CGRP对p-m TOR/m TOR激活作用较弱,术后第1、3天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异显着,有统计学意义;术后第5、7天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异不显着,无统计学意义;同时,Akt/m TOR信号的激活也在TBI后逐渐增强。2.CGRP对Fox O3a表达的影响TBI术后细胞核中Fox O3a蛋白水平显着升高,而细胞浆中Fox O3a蛋白水平显着降低,证实TBI导致了小鼠脑神经元细胞内Fox O3a蛋白分布的变化。CGRP使细胞核内Fox O3a增加逐渐减弱,而胞浆中Fox O3a逐渐升高。细胞核中Fox O3a蛋白表达情况可见,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达低于TBI组,差异显着,有统计学意义;而细胞浆中Fox O3a表达情况可见,TBI术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预促进了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡的降低,起到了脑保护作用。2.TBI促进了Fox O3a蛋白向神经元细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预可缓解细胞核内的Fox O3a升高趋势,保护神经元细胞。结论:1.临床TBI患者血清样本中CGRP变化趋势为先迅速降低然后逐渐升高,约24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰,与动物模型变化趋势相同。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡情况,而且该预测的效能较高。CGRP高水平组远期预后、存活率优于CGRP低水平组;存活患者血清CGRP水平高于因TBI死亡的患者。CGRP可以作为TBI预后不良及死亡评估的参考指标。3.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的颅脑挫伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。4.CGRP干预,减低了创伤性颅脑损伤鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度;通过蛋白印迹法,可见TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示脑室注射联合尾静脉注射的外源性干预途径有效可靠。5.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,神经胶质纤维酸性蛋白GFAP增加;CGRP的干预有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位GFAP的表达。6.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡水平升高,同时促进了Fox O3a蛋白向细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;相反,外源性CGRP干预可促进Akt/m TOR信号通路的激活,抑制了神经元细胞自噬和凋亡,缓解了细胞核内的Fox O3a升高趋势,起到了脑保护作用。
李永红[4]（2020）在《空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中认为研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸（SBOs）调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系（MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化））;RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显着升高（p<0.05）,与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显着降低（p<0.01）,Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低（p<0.001）;与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显着降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显着降低,但胃癌细胞株组间无显着差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）表达显着升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显着下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。
张生英[5]（2020）在《牛支原体P48蛋白诱导EBL细胞凋亡的研究》文中进行了进一步梳理牛支原体（Mycoplasma bovis,Mb）是感染牛的一种重要的病原体,主要引起牛的呼吸道疾病,呈全球性分布且发病率高,给全世界养牛业造成重大的经济损失。支原体及其脂蛋白可诱导宿主细胞凋亡造成器官损伤,牛支原体P48蛋白在结构和功能上都比较保守,在感染与致病过程中扮演着重要的作用。为此对于P48蛋白诱导宿主细胞凋亡的具体机制有待进一步研究清楚。基于此,本研究开展以下研究工作:（1）研究牛支原体诱导EBL细胞凋亡。牛支原体感染EBL细胞,通过MTT法检测细胞增殖率;流式细胞技术检测牛支原体诱导EBL细胞的凋亡率;qRT-PCR检测凋亡基因的mRNA相对表达变化;Western blot鉴定Bax和Beclin-1蛋白表达水平。结果显示:当作用时间为72 h,牛支原体浓度在0.1、0.5?g/mL时对EBL细胞增殖的抑制作用不显着,在10μg/mL时,对EBL细胞增殖有显着的抑制作用;凋亡基因mRNA表达在2 h、12 h没有明显的提高,在24 h、48 h、72 h时显着提高,同时凋亡相关蛋白Bax和Beclin-1的表达上调;流式细胞技术结果显示牛支原体诱导EBL细胞的凋亡率显着提高。结果表明,牛支原体促进EBL细胞凋亡。（2）研究P48蛋白胞外诱导EBL细胞凋亡。纯化P48蛋白诱导EBL细胞,通过DAPI染核法观察EBL细胞核形态变化,并按照研究工作（1）中的方法检测。结果显示:当作用时间为72 h,P48蛋白浓度在0.1、0.5?g/mL时对EBL细胞增殖的抑制不显着,在10μg/mL时,对EBL细胞增殖有显着的抑制作用;经蛋白诱导48 h、72 h时细胞核发生碎裂;凋亡标志基因mRNA在2 h、12 h的表达量没有明显提高,在24 h、48 h、72 h时有显着提高,凋亡相关蛋白Bax和Beclin-1的表达上调。流式细胞技术结果显示在72 h时P48蛋白诱导EBL细胞凋亡率显着提高。结果表明,P48蛋白胞外诱导EBL细胞凋亡。（3）研究P48蛋白胞内诱导EBL细胞凋亡。成功构建P48基因真核表达载体pEGFP-N1-P48和pcDNA3.1-P48并转染EBL细胞,按照（1）中检测方法。结果显示:当作用时间为24 h时细胞发生早期凋亡,48 h时细胞发生中期凋亡,72 h时细胞发生晚期凋亡;凋亡基因mRNA表达在24 h提高不显着,48 h、72 h时显着提高,同时凋亡蛋白Bax的表达上调。结果表明,P48蛋白胞内诱导EBL细胞发生凋亡。（4）研究4-PBA抑制内质网应激介导的P48蛋白诱导EBL细胞凋亡。4-PBA预处理EBL细胞3 h后与P48蛋白共孵育,按照（1）中方法检测。结果显示:当作用时间为24 h,4-PBA抑制剂浓度为10 mmol/L时EBL细胞的凋亡率提高不显着,凋亡基因和内质网应激标志基因的mRNA表达下调,同时Bax、Beclin-1和GRP78蛋白的表达下调或不表达。结果表明,4-PBA通过抑制内质网应激途径从而减少P48蛋白诱导的EBL细胞凋亡。
管斯琪[6]（2020）在《补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究》文中认为目的人类生育力逐年降低已经成为影响发展的医学和社会学问题,男性因素导致的不孕不育占了 40%-50%,其中少弱精子症是男性不育症最常见的病因之一。对于特发性精液异常,西药治疗效果欠佳,手术治疗的应用范围存在一定局限性,而中医药具有较好的疗效。菟枸助育汤是在五子衍宗丸的基础上加减化裁而来,临床用于治疗少弱精子症逾20年,但目前尚无相关的研究。故本研究设计临床试验,观察评价菟枸助育汤对男性不育少弱精子症患者的临床疗效,并设计动物实验探究菟枸助育汤的核心药对“菟丝子-枸杞子”对生精功能障碍模型大鼠生精功能的影响,并对其具体的作用机制进行探讨。方法临床研究:收集男性不育少弱精子症76例,采用无病例对照研究的方法,观察菟枸助育汤对少精子症和弱精子症受试者精液质量（包括精液液化状态、精液量、精子活动率、精子浓度和总数等指标）和中医证候评分的干预作用。入组时,采集所有受试者的一般信息、病史、合并用药、体格检查等相关资料。研究第1天起每日给予入组的受试者菟枸助育汤中药免煎颗粒治疗,疗程共90天,分别于第0、30、60、90天各进行一次访视,记录受试者的精液常规结果和中医证候评分,同时进行安全性观察,记录各类不良事件,填写病例报告表,每次访视时严格进行脱落、剔除的评估,最后统计所有数据。实验研究:1.将78只SD大鼠随机分为空白对照组（NC组）、模型对照组（GTW组）、左卡尼汀组（GTW+LEV组）、菟丝子-枸杞子药对组（GTW+SCFL组）和药对+抑制剂组（LY+SCFL组）。2.除NC组以外,其余各组用雷公藤多苷（40mg/kg）灌胃4周,建立生精功能障碍模型。3.第5周起GTW+LEV组（予10ml/kg左卡尼汀灌胃）、GTW+SCFL组（予菟丝子-枸杞子中药液灌胃）和LY+SCFL组（予菟丝子-枸杞子中药液灌胃）每日分别予以相应药物干预,LY+SCFL组于第1周起每周1次尾静脉注射PI3K抑制剂。4.实验8周后测定各组大鼠精子质量、附睾/睾丸脏器系数,检测性激素、抑制素B、附睾肉毒碱的水平,光镜下和透射电镜下观察睾丸的组织病理形态和细胞的超微结构,用免疫组化法、western blot以及Real-Time PCR技术检测大鼠睾丸组织SCF、c-kit、PI3K、p-Akt、Bad、Bcl-2 和 Bax 蛋白及 mRNA 的表达。结果临床研究:本研究共完成临床病例76例,纳入研究的男性不育少精子症和弱精子症患者经过菟枸助育汤治疗后,总体的精液质量中液化状态、PR精子百分比、PR+NP精子百分比、精子浓度和精子总数等疗效性指标显着改善,具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;中医证候评分随着治疗进行有了明显的下降（P<0.05或P<0.01）;疗效判定为“痊愈”的11例,“显效”29例,“有效”32例,“无效”4例,总有效率为94.74%。整个观察期间脱落病例4例,无剔除病例,未见任何不良反应报告。实验研究:经菟丝子-枸杞子干预后的GTW+SCFL组与GTW组相比,大鼠的一般状态、附睾脏器系数、精子质量、卵泡生成素（FSH）、黄体生成素（LH）、泌乳素（PRL）和附睾肉毒碱均有显着的改善,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;睾丸组织病理形态及细胞的超微结构观察发现,GTW+SCFL组与GTW组比较,生精小管结构、排列较正常,生精细胞明显增多,形态改善,内含的线粒体等细胞器增多;免疫组化、western blot和Real-Time PCR结果显示,与GTW组比较,GTW+SCFL组大鼠睾丸SCF、c-kit、PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白含量升高,Bax、Bad蛋白表达下降（P<0.05或P<0.01）;LY+SCFL组与GTW+SCFL组相比,SCF、c-kit和PI3K的表达无明显差异,p-Akt和Bcl-2表达减少,Bad和Bax的蛋白表达增加（p<0.05或P<0.01）。结论1.菟枸助育汤在改善男性不育少弱精子症患者的精液参数和肾虚证候中医评分方面疗效显着,能提高患者的生精功能。2.菟枸助育汤中的核心药对“菟丝子-枸杞子”可以改善生精功能障碍模型大鼠一般状态、附睾脏器系数、精子质量、FSH、LH、PRL和附睾肉毒碱,并对雷公藤多苷致睾丸组织和生精细胞的形态结构和功能的损伤具有较好的修复作用。3.“菟丝子-枸杞子”药对可以有效调控模型大鼠睾丸组织SCF、c-kit、PI3K、p-Akt、BAD、Bcl-2、Bax 蛋白及其 mRNA 的表达,通过调控 SCF/c-kit-PI3K-Bcl-2 信号通路促进生精细胞增殖和抑制生精细胞凋亡的作用。综上,菟枸助育汤可有效提高男性不育少弱精子症患者的生精功能,临床疗效显着,其作用机制可能是通过SCF/c-kit--PI3K--Bcl-2通路调控生精细胞增殖和凋亡来实现的。
王晓兴[7]（2020）在《多拉菌素诱导食管癌细胞发生凋亡的作用研究》文中指出食管癌具有高发病率和高死亡率的特点,在世界癌症排名中位居前十,已成为影响全球人类身体健康的恶性疾病之一。目前根据食管癌患者自身体质及患病的程度,其治疗手段主要有手术切除病变肿瘤部位、同步放化疗、手术联合新辅助化疗、生物治疗、靶向治疗等,但是治疗效果不佳,所以针对食管癌治疗药物的研发至关重要。已有研究发现,在逆转肿瘤细胞的多药耐药方面,大环内酯类药物发挥着关键的作用,并且该类药物在一定程度上对肿瘤细胞的生长存在抑制作用,另外该类药物还可以诱导细胞发生凋亡与自噬,但是具体的理论基础研究匮乏。因此本实验选择大环内酯类抗生素家族的多拉菌素（Doramectin,DOR）,探究该药物是否可以通过诱导细胞凋亡进一步抑制食管癌细胞增殖。本研究主要是通过MTT实验和划痕实验,探究经过DOR处理后的细胞其增殖活力和迁移能力是否发生变化;分别通过倒置显微镜、透射电子显微镜,观察细胞经过DOR处理后形态的主要变化;流式细胞术检测细胞经过DOR处理后,凋亡率和不同周期DNA含量变化;Western blotting检测凋亡蛋白在经过不同浓度DOR处理的细胞中表达量的具体变化;建立动物模型,通过HE、TUNEL、免疫组织化学染色等实验,深入探讨DOR对食管癌细胞在体内增殖、凋亡的影响,为临床上食管癌的治疗寻找新型辅助药物提供充足的理论基础。研究结果如下:（1）用不同浓度的DOR分别处理Eca109、EC9706细胞,结果证明,随着药物剂量逐渐增加,两种细胞的增殖活力和迁移能力均呈现出下降趋势。（2）在倒置显微镜下观察到加药处理后的Eca109、EC9706细胞变圆、皱缩、逐渐稀疏,数量减少;在透射电镜下明显发现加药后细胞的体积减小,核仁固缩,出现了凋亡小体。（3）通过流式细胞术检测经DOR处理后Eca109细胞在不同时期的DNA含量变化,结果证明,随着药物剂量增加,细胞的G2/M期DNA含量明显提高（P<0.001）。（4）流式细胞术检测经过不同浓度的DOR处理后细胞的凋亡情况,结果表明,细胞的凋亡率随着药物剂量的增加出现较大幅度的递增（P<0.0001）。Western blotting实验检测细胞中凋亡蛋白表达情况,结果显示,Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax蛋白表达水平上升,此外Cytochrome-c、caspase-3、caspase-9蛋白表达均出现增加趋势。（5）在体内荷瘤裸鼠模型中,DOR抑制了Eca109细胞生长,而裸鼠体重无明显差异（P<0.05）,加药组的肿瘤体积与湿重明显变小,差异性显着（P<0.01）;TUNEL染色实验证明经过药物处理后,肿瘤组织中凋亡细胞数量明显增多。免疫组化的结果表明,药物处理组的组织中caspase-3与caspase-9的阳性表达量出现了明显增加的现象。综上所述,DOR可以抑制食管癌细胞的增殖、迁移,并将细胞周期阻滞在G2/M期。线粒体通路与caspase途径参与了细胞凋亡的整个过程。因此,DOR诱导食管癌细胞凋亡的理论基础研究对于临床治疗食管癌具有重大意义。
刘岩松[8]（2020）在《基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制》文中提出目的:院内制剂舒心生脉丹,是三十多年临床经验总结得出的经验方,在治疗冠心病为代表的心血管疾病方面疗效确切。为进一步探讨其作用机制,本课题通过病理学、分子生物学等分析方法,探索其对心肌细胞的保护机制,探讨其与细胞凋亡相关性,运用实验数据评价舒心生脉丹的疗效,为舒心生脉丹新药研发提供数据支持,为中医治疗心血管疾病的临床药物应用以及疾病治疗提供有价值的理论依据。方法:1.将70只健康SPF级SD雌性大鼠随机分成7组:空白组、假手术组、阳性对照组（复方丹参滴丸）、模型组、舒心生脉丹低剂量组、舒心生脉丹中剂量组、舒心生脉丹高剂量组。2.中药预处理:适应性饲养5天后,分组给药。给药剂量:根据动物与人之间药物等效剂量换算系数表计算,舒心生脉丹中剂量组为健康成年人1日用量,舒心生脉丹高剂量组与舒心生脉丹低剂量组分别为2倍剂量与0.5倍剂量,对照组复方丹参滴丸按照健康成年人1日用量给药。预给药7天,每日给药1次,空白组、假手术组、模型组给予蒸馏水。7天后禁食进行造模,空白组不做处理,假手术组只进行穿线,不予结扎。其余各组行左冠状动脉前降支结扎30min,再灌注120min,制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型。造模成功取心脏组织。3.监测并记录缺血/再灌注过程中心电图、血流动力学的改变,分析舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心功能的影响。4.通过HE染色和透射电镜观察MI/RI大鼠心肌组织及超微结构,分析舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织及超微结构的干预效果。5.分别采用qRT-PCR法、Western blot法、IHC法检测中药舒心生脉丹对SIRT1信号通路相关因子SIRT1、p53、ac-p53、Bax、Bcl-2、Capase-3、Capase-9的mRNA及蛋白的表达量影响。分析舒心生脉丹对MI/RI大鼠心肌组织SIRT1/p53信号通路上相关因子的调控。结果:1.心电图:各组大鼠在造模成功后心电图均有明显ST段改变,肢体导联出现ST段抬高,并有出现T波倒置改变;再灌注30min后各组大鼠心电图提示ST段不同程度回落改变,提示MI/RI大鼠造模成功。2.血流动力学:与模型组相比,舒心生脉丹各剂量治疗组及阳性对照组大鼠血流动力学指标均有不同程度的改善,舒心生脉丹组改善更为明显。3.HE染色:MI/RI模型组大鼠心肌组织结构欠完整,形态排列紊乱,细胞间质水肿明显,细胞核出现固缩。与模型组相比,中药舒心生脉丹各治疗组结构相对完整,形态排列较规则,层次较清晰,细胞间质水肿程度较模型组减轻,细胞核固缩减少。其中舒心生脉丹高剂量组改善最明显。4.电镜观察:模型组肌纤维排列不整齐,线粒体肿胀,排列呈不规则形态,部分线粒体嵴不完整,出现空泡。中药舒心生脉丹各剂量治疗组及阳性药组线粒体可见轻度肿胀变形,多数结构完整,肌纤维排列大致整齐,程度较模型组减轻。5.qRT-PCR法检测MI/RI大鼠心肌组织中SIRT1、Bcl-2、Bax、Caspase-9的基因表达量:与模型组相比,舒心生脉丹能上调SIRT1、Bcl-2的基因表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）,降低Bax、Caspase-9基因表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot法检测MI/RI大鼠心肌组织中SIRT1、Caspase-9、p53、ac-p53的蛋白表达量:与模型组相比,舒心生脉丹能够上调MI/RI模型大鼠心肌细胞中SIRT1的蛋白表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）,下调Caspase-9、p53、ac-p53的蛋白表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）。IHC检测提示舒心生脉丹能够上调SIRT1的蛋白表达,降低p53、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达。结论:1.舒心生脉丹对能改善大鼠MI/RI后的心功能和心肌超微结构,对心肌细胞具有保护作用。2.舒心生脉丹能调控MI/RI模型大鼠心肌细胞中SIRT1、p53、ac-p53、Bax、Bcl-2、Capase-3、Capase-9的mRNA及蛋白的表达量,减少细胞凋亡的发生,其保护作用与细胞凋亡机制相关。
谷韶科[9]（2020）在《基于PI3K/Akt信号通路探讨优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心功能的影响及机制研究》文中研究说明目的:本实验通过冠状动脉前降支结扎术方法建立心力衰竭（心衰）大鼠模型,选用心脏超声仪器、多道生理仪及力竭游泳实验方法分别评价优化新生脉散方对心衰大鼠心功能的影响;基于TUNEL法、Western Blot等技术检测心肌细胞凋亡及相关调控蛋白的表达,探讨优化新生脉散方改善心衰大鼠心功能的分子生物学机制,为优化新生脉散方防治心衰提供科学依据。研究方法:实验动物选取正常健康的Wistar大鼠（雄性）100只,体重约200～240g,采用予冠状动脉前降支结扎术方法建立心梗后心衰大鼠模型,术后6周采用VEVO2100超声心动图（MS-250）评价成模情况,即左室射血分数（Left Ventricular Ejection Fractions,LVEF）≤45%造模成功。将符合实验标准的心衰大鼠模型采用随机分组分为模型组、西药组、中药中剂量组、中药高剂量组;另外取正常大鼠予冠状动脉前降支部位只穿线不结扎,设为假手术组。西药组予以盐酸贝那普利（0.9mg/kg）干预,中药各组给予优化新生脉散方（中剂量8.1g生药/kg,高剂量16.2g生药/kg）干预,模型组与假手术组给予同等剂量的空白溶剂（0.5%CMC-Na）,各组均灌胃给药,给药共计4周。给药前及末次给药12h后,采用VEVO2100超声心动仪测定LVEF、左室短轴缩短率（Left Ventricular Fraction Shortening,LVFS）;左心室压力-容积环检测定左室内压上升或下降最大速率（±dp/dtmax）等指标评价心功能;对各组心衰大鼠进行称重,并将铅条（5%体质量）卷成小块束于心衰大鼠尾根部,放入加水的塑料水槽中,水深为大鼠尾巴长度的3倍,水温恒温为（25-29）℃,大鼠进入水槽后开始计时,直到大鼠头部沉入水中10s不能浮出水面（处于体力耗竭状态）的时间,以游泳时长作为大鼠心功能的评价指标。处死大鼠,留取心肌组织于甲醛溶液中固定和液氮中保存。采用TUNEL法染色,在显微镜下观察各组组织切片上细胞,染色显示绿色细胞是阳性凋亡细胞,细胞核蓝色的是正常细胞;采用免疫荧光法测定Caspase-3蛋白酶体活性,即细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为相应荧光素标记的红光;Western Blot蛋白印迹法技术检测细胞凋亡相关调控蛋白PI3K、Akt、JNK、Bcl-2、Bax、Caspase-3等表达。评价优化新生脉散方对心衰大鼠心功能的影响,并浅析其作用机制。研究结果:1优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心功能的影响（1）心脏超声指标:与假手术组相比,术后6周即给药前模型组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药组大鼠的LVEF和FS明显下降（P<0.01）;给药4周后,模型组的LVEF、FS较假手术组相比明显降低（P<0.01）;与模型组相比,西药组、中药中剂量组、中药高剂量组LVEF、FS明显升高（P<0.01）;西药组、中药中剂量组及中药高剂量组组间无统计学差异（P>0.05）。（2）血流动力学指标:与假手术组照组比,模型组±dp/dtmax（mmHg/s）明显降低（P<0.01）;经药物干预后,西药组、中药中剂量组、中药高剂量组±dp/dtmax（mmHg/s）较模型组明显升高（P<0.01）;西药组与中药各组间无统计学差异（P>0.05）。（3）力竭游泳实验指标:与假手术组相比,模型组游泳时长显着降低（P<0.01）;与模型组相比,中药中剂量组、中药高剂量组、西药组游泳时长均明显提高（P<0.01）;而中药剂量组与西药组有增加的趋势但无统计学差异（P>0.05）。2 基于PI3K/Akt信号通路探讨优化新生脉散方改善心衰大鼠心功能影响的分子生物学机制的研究（1）TUNEL染色各组大鼠心肌的凋亡表达各组心衰大鼠心肌组织经TUNEL染色后,假手术组可见少量绿色荧光细胞;而模型与假手术组相比较心肌组织有大量阳性绿色荧光的细胞;与模型组相比,中药中剂量组、中药高剂量组、西药组心肌阳性绿色荧光的细胞较少。与假手术组相比,模型组的心肌细胞凋亡率显着增加（P<0.01）;与模型组相比,西药组、中药中剂量组及中药高剂量组心肌细胞凋亡率情况显着减少（P<0.01）;西药组与中药各组间差异无统计学意义（P>0.05）。（2）各组心衰大鼠心肌组织经荧光比色法检测Caspase-3活性表达与假手术组相比,模型组显示染红色荧光的细胞核的细胞较多;与模型组相比,中药中剂量组显示染红色荧光的细胞核的细胞较少,而西药组、中药高剂量组同样观察到少量染红色荧光的细胞核的细胞。各组大鼠心肌组织由荧光染色后,与假手术组相比,模型组的Caspase-3蛋白显着增加（P<0.01）;与模型组相比,西药组、中药中剂量组、中药高剂量组Caspase-3蛋白显着减少（P<0.01）;中药中剂量组、高剂量组与西药组间无统计学差异（P>0.05）。（3）各组心衰大鼠心肌组织PI3K、Akt蛋白及p-PI3K、p-Akt磷酸化水平表达:各组PI3K、Akt总蛋白水平无统计学差异（P>0.05）;与假手术组对比,模型组p-PI3K、p-Akt磷酸化水平降低（P<0.05）;与模型组相比,西药组、中药中剂量组、中药高剂量组p-PI3K、p-Akt磷酸化水平升高（P<0.05）;西药组与中药中剂量组及中药高剂量组间无统计学差异（P>0.05）。（4）各组心衰大鼠心肌组织JNK蛋白表达:与假手术组对比,模型组JNK蛋白表达升高（P<0.05）;西药组、中药中剂量组、中药高剂量组JNK蛋白表达较模型组明显下降（P<0.05）;西药组与中药各组间无统计学差异（P>0.05）。（5）各组心衰大鼠心肌组织的Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达:与假手术组对比,模型组心肌组织Bax、Caspase-3表达升高,Bcl-2下降（P<0.01）;西药组与中药中剂量组、中药高剂量组心肌组织Bax、Caspase-3蛋白表达较模型组明显下降,Bcl-2升高（P<0.01或P<0.05）;西药组与中药各组间无统计学差异（P>0.05）。结论:1.优化新生脉散方可改善心肌梗死后心衰大鼠心功能。2.优化新生脉散方对心肌细胞凋亡有明显的抑制作用,其作用机制可能是促进PI3K/Akt信号通路激活,同时抑制靶点JNK信号通路激活,JNK通路失活并抑制下游基因Bax和Caspase-3蛋白的表达调控心肌细胞凋亡,同时提升Bcl-2蛋白予抗细胞凋亡。表明优化新生脉散方可以通过PI3K/Akt通路抑制心衰大鼠心肌细胞凋亡,推测该通路可作为优化新生脉散方治疗心力衰竭的分子机制研究之一。
戚文艳[10]（2020）在《lncRNA rp11-521C20.3-BMF信号通路在GOPD肺泡上皮细胞凋亡作用机制研究》文中指出[目 的]慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）的发生发展除了受多种环境影响外,更多的是受到遗传因素影响,本研究利用基因芯片对COPD患者外周血lncRNA及mRNA表达谱进行检测,构建COPD患者的lncRNA及mRNA差异表达谱。通过生物信息学技术,预测差异表达的lncRNA及其靶基因的生物学功能,同时应用RT-qPCR验证筛选出的lncRNA及其靶mRNA表达水平,探讨COPD发病过程中可能涉及的分子机制。[方法]我们选择了 2017年1月在昆明医科大学第一附属医院呼吸科收住院的3例吸烟的COPD患者作为实验组,对照组选择肺功能检测正常的3例健康吸烟志愿者。收集所有受试者的清晨空腹静脉血。通过人微阵列技术检测了有吸烟史的COPD患者（n=3）健康对照组（n=3）血液中lncRNAs和mRNAs的差异表达。然后利用基因本体论（GO）分析和基因组百科全书（KEGG）途径,对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行分析,以发现差异表达的基因可能参与的生物学通路。接着,我们收集了 2017年1月至12月在昆明医科大学第一附属医院呼吸科住院的有吸烟史的COPD患者以及体检肺功能正常的吸烟健康者各50例清晨空腹血液标本,利用RT-qPCR法进一步验证前期芯片中lncRNA及mRNA的表达水平。而后收集了吸烟COPD合并肺癌的远癌组织,及未患COPD的气胸肺组织各 5 例,进一步在组织水平对 lncRNA rp11-521C20.3 和 BMF（Bcl-2 modifying factor）的表达情况进行验证。[结果]通过微阵列技术,发现COPD患者及健康吸烟者外周血中存在大量表达差异的lncRNA和mRNA,两组共有3359个lncRNAs表达差异,其中1995个lncRNAs在copd中表达上调,1364个lncRNAs表达下调;mRNA芯片检测结果提示共有175个mRNA在COPD组与对照组之间的表达差异具有统计学意义,其中上调的有147种,下调的有28种。通过生物信息学分析提示表达差异的mRNA主要参与COPD的多种生物学过程,主要包括炎症、代谢等。差异倍数较大且可能与COPD发生、发展相关的mRNA有7种,包括:BMF、TRIM13、PDE4B、MYL-9、PFKFB3、ARIH2、CLEC2B 等,在 lncRNA-mRNA 位置对应表中进行搜索,最终仅获得与BMF基因位置上有反义关系的lncRNA rp11-521C20.3,可能在BMF的基因转录和翻译上有重要作用。通过50例人外周血进行qRT-PCR验证后显示,RP11-521C20.3在吸烟COPD组中相对表达量（COPD组2^-△CT=0.357）低于吸烟健康对照组的相对表达量（对照组2^-△CT=1）,即RP11-521C20.3在COPD组中表达下调。BMF在吸烟COPD组中相对表达量（COPD组2^-△CT=1.924）高于对照组的相对表达量（对照组2^-△CT=1）,即mRNA在COPD组中表达上调。故lncR-RP11-521C20.3、BMF的相对表达水平在病例组与对照组之间差异有统计学意义（P<0.05）。采用qRT-PCR验证两组患者肺组织中lncR-RP11-521C20.3和BMF的表达量,结果显示COPD组BMF在肺组织中的mRNA表达量高于对照组,而与其有位置关系的lncRNA RP11-521C20.3下调,并且两组的BMF和lncR-RP11-521C20.3表达量差异有统计学意义（P<0.05）。进一步验证了前期基因芯片结果。[结 论]微阵列基因芯片分析表明,有吸烟史的COPD患者与健康吸烟者相比,外周血中存在差异表达的lncRNA与mRNA。其中lncR-RP11-521C 20.3表达降低,与其位置邻近的促凋亡基因BMF表达增高。通过生物信息学方法预测lncR-RP11-521C20.3的靶基因可能是与凋亡密切相关的BMF,进而对COPD患者血及肺组织采用QPCR验证lncR-RP11-521C20.3和BMF的表达量,证实了前期结果,提示lncR-RP11-521C20.3可能在COPD的凋亡中起重要作用,为COPD的防治提供新证据。
二、细胞凋亡研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞凋亡研究进展（论文提纲范文）
（1）杠柳毒苷对H9C2心肌细胞的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 不同浓度杠柳毒苷对H9C2 细胞活力及毒性的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 H9C2 心肌细胞培养 |
| 2.2 药物制备 |
| 2.3 MTT细胞增殖检测 |
| 2.4 CCK-8 细胞活性检测 |
| 2.5 LDH释放试验 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 杠柳毒苷对H9C2 细胞凋亡的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 |
| 2.2 Western Blot法检测Cleaved Caspase-3、VEGF-A表达 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 实验三 杠柳毒苷通过调控Akt途径影响缺氧诱导的H9C2 细胞凋亡 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Western Blot法检测P-Akt、Akt表达 |
| 2.2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 心肌细胞的凋亡及其机制研究进展 |
| 1 心肌细胞凋亡的调控因素 |
| 1.1 Bcl-2 家族 |
| 1.2 caspase家族 |
| 1.3 细胞色素C |
| 1.4 TNF-α |
| 1.5 p53 |
| 1.6 其他 |
| 2 心肌细胞凋亡的三大途径 |
| 2.1 线粒体凋亡通路 |
| 2.2 死亡受体凋亡通路 |
| 2.3 内质网应激凋亡通路 |
| 3 心肌细胞内信号传导通路 |
| 3.1 PI3K/Akt |
| 3.2 MAPK |
| 3.3 AMPK |
| 3.4 NF-κB |
| 3.5 其他 |
| 参考文献 |
| 综述二 杠柳毒苷的药理作用研究进展 |
| 1 抗炎活性 |
| 2 抗肿瘤活性 |
| 3 强心作用 |
| 4 免疫调节作用 |
| 5 药物代谢动力学 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）大豆苷元诱导肺癌A549细胞凋亡及其相关机制的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.2 肺癌的发病机制 |
| 1.2.1 性别因素 |
| 1.2.2 吸烟 |
| 1.2.3 环境污染因素 |
| 1.2.4 饮食习惯因素 |
| 1.3 肺癌的治疗方法 |
| 1.3.1 手术治疗 |
| 1.3.2 化学治疗 |
| 1.3.3 放射治疗 |
| 1.3.4 分子靶向治疗 |
| 1.4 细胞凋亡和相关信号通路 |
| 1.4.1 细胞凋亡 |
| 1.4.2 活性氧簇 |
| 1.4.3 MAPK信号通路 |
| 1.4.4 STAT3 信号通路 |
| 1.4.5 NF-κB信号通路 |
| 1.5 大豆苷元(DAI)及其药理活性 |
| 1.5.1 抗骨质疏松 |
| 1.5.2 心脑血管保护作用 |
| 1.5.3 降血脂作用 |
| 1.5.4 抗癌作用 |
| 1.5.5 雌激素样作用 |
| 1.6 目的及意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 肺癌细胞系及正常细胞系 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 细胞的传代培养及体外扩增 |
| 2.3 CCK-8 实验 |
| 2.4 Hoechst33342 染色法 |
| 2.5 流式细胞术(FCM) |
| 2.6 线粒体膜电位(JC-1)检测法 |
| 2.7 活性氧(ROS)水平检测 |
| 2.8 蛋白质免疫印迹法(western blot) |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细胞存活率结果分析 |
| 3.2 DAI对A549 细胞的凋亡作用的分析 |
| 3.2.1 Hoechst33342/PI染色法观察细胞凋亡情况 |
| 3.2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡数量 |
| 3.2.3 JC-1 染色法检测细胞线粒体膜电位变化 |
| 3.2.4 DAI对细胞凋亡蛋白表达量的影响 |
| 3.3 DAI对人肺癌A549 细胞周期调控机制 |
| 3.4 DAI对人肺癌A549 细胞内MAPK/NF-κB/STAT3 凋亡相关信号通路的调控机制 |
| 3.5 DAI调控ROS水平诱导人肺癌A549 细胞凋亡 |
| 3.5.1 FCM检测DAI对 A549 细胞内ROS水平的影响 |
| 3.5.2 FCM检测DAI对人正常肝L-02 细胞内ROS水平的影响 |
| 3.5.3 FCM检测ROS积累对A549 细胞凋亡的影响 |
| 3.6 DAI抑制人肺癌A549 细胞迁移作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤模型小鼠的神经功能保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 AKT/mTOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 自噬和凋亡在颅脑创伤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 降钙素基因相关肽CGRP在神经系统疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 1.2.2 可变剪接与肿瘤治疗 |
| 1.2.3 凋亡因子Mcl-1可变剪接与肿瘤 |
| 1.2.4 空间阻滞寡核苷酸应用现状 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 主要研究内容与研究方案 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 Mcl-1可变剪接与胃癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验对象 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Mcl-1表达与胃癌的相关性 |
| 2.3.2 Mcl-1 可变剪接异构体mRNA在胃癌组织中的表达 |
| 2.3.3 Mcl-1S和 Mcl-1L mRNA表达与胃癌临床进展的相关性 |
| 2.3.4 胃癌组织Mcl-1L与 Mcl-1S表达的蛋白水平验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验对象 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌细胞株 Mcl-1L 及 Mcl-1S 基础表达 |
| 3.3.2 空间阻滞寡合苷酸(SBOs)转染效率评价 |
| 3.3.3 SBOs 对 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 3.3.4 SBOs对胃癌细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.3.5 SBOs对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导凋亡的体内实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 研究对象 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 SBOs对裸鼠的毒性反应 |
| 4.3.2 SBOs 治疗对移植瘤体 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 4.3.3 SBOs 治疗对移植瘤体细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.3.4 SBOs 对移植瘤增殖生长的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）牛支原体P48蛋白诱导EBL细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛支原体 |
| 1.1 牛支原体培养特性 |
| 1.2 牛支原体流行病学 |
| 1.3 牛支原体感染的症状 |
| 1.4 牛支原体病的危害 |
| 2 牛支原体脂蛋白生物学功能 |
| 3 细胞凋亡及内质网应激简介 |
| 4 支原体及其脂蛋白诱导细胞凋亡 |
| 5 研究目的及意义 |
| 第二章 牛支原体诱导EBL细胞凋亡的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 化学试剂及培养基配制 |
| 2.1.1 化学试剂配制 |
| 2.1.2 培养基配制 |
| 2.2 EBL细胞培养 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.3 牛支原体的培养 |
| 2.4 收集牛支原体 |
| 2.5 MTT法检测牛支原体对EBL细胞的影响 |
| 2.6 Annexin V-FITC检测细胞凋亡 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.8 Western blot |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛支原体抑制EBL细胞的增殖 |
| 3.2 Annexin V-FITC凋亡检测牛支原体诱导的细胞凋亡 |
| 3.3 实时荧光定量PCR结果分析 |
| 3.4 Western blot结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 牛支原体P48蛋白胞外诱导EBL细胞凋亡的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞 |
| 1.2 主要仪器及设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 EBL细胞的培养 |
| 2.2 重组P48蛋白的纯化 |
| 2.3 MTT法检测重组蛋白对EBL细胞的作用 |
| 2.4 DAPI细胞核染色 |
| 2.5 Annexin V-FITC检测细胞凋亡 |
| 2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.7 Western blot |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 P48蛋白抑制EBL细胞的增殖 |
| 3.2 P48蛋白诱导EBL细胞凋亡 |
| 3.2.1 P48蛋白诱导对EBL细胞核的影响 |
| 3.2.2 P48蛋白诱导EBL细胞凋亡的检测 |
| 3.2.3 流式细胞仪检测P48蛋白对EBL细胞凋亡的影响 |
| 3.3 实时荧光定量PCR结果分析 |
| 3.4 Western blot结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 牛支原体P48蛋白胞内诱导EBL细胞凋亡的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、载体 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 化学试剂及培养基配制 |
| 2.1.1 化学试剂配制 |
| 2.1.2 培养基配制 |
| 2.2 牛支原体基因组的提取 |
| 2.3 牛支原体分离株P48基因的扩增 |
| 2.4 提取pcDNA3.1和pEGFP-N1 克隆菌质粒 |
| 2.5 牛支原体P48基因的真核表达 |
| 2.5.1 真核表达载体pcDNA3.1-P48和pEGFP-N1-P48 的构建 |
| 2.5.2 重组质粒转染EBL细胞 |
| 2.6 AnnexinV-FITC检测细胞凋亡 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.8 Wsetern blot |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛支原体P48基因的扩增 |
| 3.2 重组表达质粒pcDNA3.1-P48和pEGFP-P48 的鉴定 |
| 3.3 重组表达质粒表达情况鉴定 |
| 3.4 Annexin-V FITC检测细胞凋亡 |
| 3.5 实时荧光定量PCR结果分析 |
| 3.6 Western blot结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 4-PBA抑制内质网应激介导的P48 蛋白诱导EBL细胞凋亡 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 化学试剂配制 |
| 2.2 细胞培养与处理 |
| 2.3 细胞增殖测定 |
| 2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.5 Western blot |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 4-PBA对 P48 蛋白诱导EBL细胞增殖的影响 |
| 3.2 实时荧光定量PCR结果分析 |
| 3.2.1 4-PBA抑制细胞凋亡相关基因mRNA的表达 |
| 3.2.2 4-PBA抑制细胞内质网应激相关基因mRNA的表达 |
| 3.3 Western blot结果分析 |
| 3.3.1 4-PBA抑制细胞相关凋亡蛋白的表达 |
| 3.3.2 4-PBA抑制细胞内质网应激相关蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文研究成果等 |
| 导师简介 |
| 导师简介 |
（6）补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药诊治男性不育少弱精子症的研究进展 |
| 1 少弱精子症诱因 |
| 2 中医病名 |
| 3 中医病因病机 |
| 4 中医药治疗 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 生精细胞增殖、凋亡相关蛋白及通路的研究进展 |
| 1 精子发生的三个阶段 |
| 2 生精细胞的增殖 |
| 3 生精细胞的凋亡 |
| 4 生精细胞增殖、凋亡相关蛋白 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 菟枸助育汤治疗男性不育少弱精子症的临床研究 |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 菟丝子-枸杞子对生精功能障碍SD大鼠生精功能的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于SCF/c-kit--PI3K--Bcl-2通路探讨菟丝子-枸杞子调控生精细胞增殖与凋亡的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）多拉菌素诱导食管癌细胞发生凋亡的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 食管癌 |
| 1.1.1 食管癌简介 |
| 1.1.2 食管癌的诊治现状 |
| 1.2 细胞凋亡 |
| 1.2.1 细胞凋亡简介 |
| 1.2.2 细胞凋亡的信号通路 |
| 1.2.3 细胞凋亡与肿瘤防治 |
| 1.3 大环内酯类药物 |
| 1.3.1 药物分类及抗菌机制 |
| 1.3.2 临床应用 |
| 1.3.3 多拉菌素 |
| 1.4 本课题的研究内容 |
| 1.5 本课题的技术路线 |
| 1.6 本课题研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞及裸鼠 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT实验 |
| 2.2.3 细胞划痕实验 |
| 2.2.4 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 2.2.5 透射电镜观察细胞形态 |
| 2.2.6 细胞周期分析 |
| 2.2.7 细胞凋亡检测 |
| 2.2.8 Western blotting实验 |
| 2.2.9 体内增殖实验 |
| 2.2.10 统计分析方法 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 DOR在体外对食管癌细胞増殖的影响 |
| 3.2 DOR对食管癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.3 DOR对食管癌细胞的形态影响 |
| 3.4 透射电镜下食管癌细胞的超微结构 |
| 3.5 DOR对食管癌Eca109 细胞周期的影响 |
| 3.6 DOR对食管癌Eca109 细胞凋亡的影响 |
| 3.7 DOR对 Eca109 细胞中凋亡蛋白表达量的影响 |
| 3.8 DOR对食管癌动物模型的影响 |
| 3.8.1 DOR对体内肿瘤生长的影响 |
| 3.8.2 HE染色结果 |
| 3.8.3 TUNEL染色结果 |
| 3.8.4 免疫组织化学染色结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DOR对食管癌细胞增殖的抑制作用 |
| 4.2 DOR诱导食管癌细胞周期阻滞的可能性分析 |
| 4.3 DOR诱导食管癌细胞凋亡的分子机制 |
| 4.4 DOR对荷瘤裸鼠模型的体内研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一中西医对心肌缺血再灌注损伤的认识及研究进展 |
| 1 西医对心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 1.1 心肌缺血再灌注损伤的概念及常见损伤 |
| 1.2 心肌缺血再灌注损伤的发病机制 |
| 1.3 西医对心肌缺血再灌注损伤的治疗 |
| 2 中医对心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 2.1 病名源流 |
| 2.2 病因病机 |
| 2.3 辨证分型 |
| 2.4 中医药治疗研究进展 |
| 综述二SIRT1 信号通路在心血管疾病中的研究进展 |
| 实验研究 |
| 第一章 MI/RI大鼠模型的建立及心功能指标测定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验用药 |
| 1.3 实验主要试剂、器械、仪器与耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 MI/RI大鼠模型建立 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MI/RI大鼠心电图改变 |
| 3.2 MI/RI大鼠血流动力学改变 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织形态学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 石蜡病理切片的制备 |
| 2.2 HE染色法 |
| 2.3 透射电镜检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HE染色实验结果 |
| 3.2 透射电镜实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织SIRT1 信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验用药 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 q RT-PCR检测法 |
| 2.2 Western blot检测法 |
| 2.3 IHC检测法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 q RT-PCR实验结果 |
| 3.2 Western blot实验结果 |
| 3.3 IHC 化结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 1 舒心生脉丹的创立和意义 |
| 2 MI/RI模型建立的关键问题 |
| 3 实验指标分析 |
| 3.1 舒心生脉丹对心电图影响 |
| 3.2 舒心生脉丹对血流动力学的影响 |
| 3.3 舒心生脉丹对心肌组织形态学影响 |
| 3.4 对SIRT1 信号通路的影响 |
| 4.实验总结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（9）基于PI3K/Akt信号通路探讨优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 优化新生脉散方对心衰大鼠心功能影响的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 基于优化新生脉散方提高心衰大鼠运动耐量的分子生物学机制研究 |
| 1 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药调控心力衰竭心肌细胞凋亡的研究进展 |
| 1 细胞凋亡的理论研究 |
| 2 心力衰竭与细胞凋亡 |
| 3 中医药对心力衰竭心肌细胞凋亡的研究 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）lncRNA rp11-521C20.3-BMF信号通路在GOPD肺泡上皮细胞凋亡作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表（以字母顺序排列） |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验一 对COPD患者外周血进行微阵列测序初步筛选与发病机制相关的lncRNA 和 mRNA |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二 验证外周血及肺组织中IncR-RPll- 521C20.3和BMF mRNA的差异表达 |
| 第一部分：验证人外周血中IncRNA RP11-521C20.3及BMF的差异表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二部分：验证肺组织中IncRNA RP11-521C20.3和BMF的差异表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 BMF与自噬及凋亡的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
四、细胞凋亡研究进展（论文参考文献）
- [1]杠柳毒苷对H9C2心肌细胞的影响及机制研究[D]. 张小莉. 天津中医药大学, 2021(01)
- [2]大豆苷元诱导肺癌A549细胞凋亡及其相关机制的研究[D]. 翟雨晴. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [3]降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究[D]. 田军. 河北医科大学, 2021(02)
- [4]空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究[D]. 李永红. 兰州大学, 2020(04)
- [5]牛支原体P48蛋白诱导EBL细胞凋亡的研究[D]. 张生英. 甘肃农业大学, 2020(12)
- [6]补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究[D]. 管斯琪. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]多拉菌素诱导食管癌细胞发生凋亡的作用研究[D]. 王晓兴. 东北农业大学, 2020(04)
- [8]基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制[D]. 刘岩松. 长春中医药大学, 2020(08)
- [9]基于PI3K/Akt信号通路探讨优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心功能的影响及机制研究[D]. 谷韶科. 天津中医药大学, 2020(04)
- [10]lncRNA rp11-521C20.3-BMF信号通路在GOPD肺泡上皮细胞凋亡作用机制研究[D]. 戚文艳. 昆明医科大学, 2020(02)