一、The Role of Endogenous Carbon Monoxide in the Hypoxic Vascular Remodeling of Rat Model of Hypoxic Pulmonary Hypertension（论文文献综述）
康丽丽[1]（2021）在《西地那非通过Notch3/Hes1通路抑制新生大鼠持续性肺动脉高压的机制研究》文中研究表明研究背景新生儿持续肺动脉高压（Persistent pulmonary hypertension in neonates,PPHN）是指新生儿出生后由于各种原因导致的肺血管阻力持续性增高,肺动脉压超过体循环动脉压,使从胎儿型血液循环过渡到正常（成人）型血液循环发生障碍,导致在心房水平或未闭动脉导管水平发生右向左分流,临床出现不同程度的紫绀和/或难以纠正的低氧血症。PPHN如果治疗不及时或不充分,死亡率和致残率会显着增加。患有PPHN的婴儿可能会发生严重呼吸衰竭,需要重症监护,约10%的病例可能死亡。在存活的患者中,PPHN可能会引起神经损伤、脑瘫、失明等严重的并发症。结构性肺血管重构在PPHN的发病过程中起着重要作用。肺血管重构包括血管内膜、中膜和外膜增厚,导致肺动脉管腔狭窄,肺动脉压力升高。其病理基础主要是肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）、血管内皮细胞和成纤维细胞发生增殖、迁移和表型转化等改变。Notch3是四种Notch蛋白家族的成员之一,是介导细胞间信号传递的细胞膜受体,在细胞间通信中发挥着重要作用[1]。不同Notch受体可介导不同的细胞效应,Notch3在血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）中的表达最多见[2]。Notch3 信号通路异常通常与肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension,PAH）引起的VSMC过度增殖和血管重构有关。此外,Notch3被认为是肺动脉高压中VSMC去分化和增殖的一个重要介质[3]。Hes/Hey家族是Notch信号传导的关键下游基因[4],研究证实,Notch3过表达导致大鼠PASMCs增殖,同时Hes1转录因子表达上调[5]。Hes1转录因子可能是PASMCs中Notch3信号的重要转录靶点。因此阻断Notch3/Hes1通路,可能是治疗PPHN有价值的途径之一。西地那非是一种磷酸二酯酶-5（Phosphodiesterase-5,PDE5）抑制剂,通过抑制环鸟苷单磷酸（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）的水解从而诱导血管舒张。吸入一氧化氮（inhaled nitric oxide,iNO）通过选择性的扩张肺部血管被广泛用于治疗PPHN,但有部分PPHN患者使用iNO治疗无效,尤其是肺实质病变和肺发育不全的患者。而西地那非能改善新生儿局部微循环,有效抑制和预防肺损伤,降低肺动脉压力,改善右心室功能。因此,当iNO无效时,西地那非可能是治疗PPHN最佳选择。目前对于Notch3/Hes1信号通路在PPHN大鼠及PASMCs中的变化和影响,未见相关报道,西地那非抗PPHN作用是否与Notch3/Hes1信号通路相关也未见报道,因此我们进行了以下研究:第一部分西地那非对PPHN大鼠肺血管重构及低氧诱导的PASMC细胞功能的影响研究目的:通过低氧（Hypoxia,Hypo）和吲哚美辛（Indometacin,Indom）诱导孕鼠建立PPHN新生大鼠模型,并且体外培养低氧诱导的新生大鼠来源的PASMCs,探讨西地那非对PPHN的作用和PPHN形成过程中对Notch3/Hes1表达的变化,揭示西地那非可以抑制PASMC增殖,降低PPHN大鼠肺血管重构及右心室肥厚指数的增加;西地那非可以降低PPHN大鼠肺组织Notch3/Hes1通路基因和蛋白表达。研究方法:1.建立Hypo+Indom诱导的PPHN大鼠模型及给药8周龄的SD大鼠,雄鼠20只,雌鼠46只,分组合笼24小时后,取雌鼠阴栓涂片检测,以在显微镜下看到精子计为孕鼠,共36只孕鼠,在大鼠妊娠第11天,选取30只随机分配为对照组、模型组、西地那非低剂量组（50mg/kg）、西地那非中剂量组（100mg/kg）、西地那非高剂量组（200mg/kg）,每组6只。对照组的孕鼠放在常氧的环境下,腹腔注射同体积的0.9%NaCl2溶液。模型组在大鼠妊娠的第19天,放于12%O2的低氧箱中饲养,箱内温度与湿度与外面环境相同,且孕鼠可自由活动,并通过腹腔注射0.5mg/kg的吲哚美辛,每天两次,连续3天。西地那非实验组在大鼠妊娠的第11天,腹腔注射不同浓度的西地那非（50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg）,1天1次,连续10天,并于妊娠第19天后与模型组接受相同处理。2.PPHN新生大鼠模型鉴定（1）右心室肥厚指数（RVHI）测定:将大鼠开胸迅速游离心脏,去除心房组织,沿心室边缘剪下右心室（RV）,分别称取右心室重量和室间隔+左心室（LV+IVS）的重量,二者重量相比RV/（LV+IVS）（mg/mg）,估测右心室肥厚指数。（2）肺血管重构评价:肺组织苏木精-伊红染色,观察肺血管形态学变化。选取各组每只新生大鼠的肺组织苏木精-伊红染色片子,分别选择直径50-200μm的肺动脉和肺小动脉,测量肺血管内外径,依照以下公式计算PAWT百分比:PAWT（%）=（外径-内径）/外径×100%3.原代PASMCs鉴定采用原代培养方法培养新生大鼠PASMCs,对细胞进行鉴定,采用α-SMA免疫荧光染色的方法。4.西地那非对培养的Hypo-PASMC增殖、迁移和凋亡的影响（1）PASMC细胞增殖和凋亡检测:MTT,流式细胞凋亡实验检测西地那非对PASMCs增殖和凋亡情况。（2）细胞周期检测:流式细胞周期实验检测西地那非对PASMCs细胞周期影响。（3）细胞迁移和侵袭检测:划痕和Transwell实验用于西地那非对PASMCs的迁移和侵袭影响的检测。5.肺组织及培养PASMC中Notch3和Hes1 mRNA表达测定通过qRT-PCR检测肺组织和Hypo-PASMCs中Notch3和Hes1 mRNA表达变化。6.大鼠肺组织及培养PASMC中Notch3和Hes1蛋白表达测定通过Western blot检测PPHN大鼠肺组织和培养Hypo-PASMCs中Notch3和Hes1蛋白表达变化。研究结果:1.PPHN动物模型鉴定及西地那非对新生PPHN大鼠肺血管重构及Notch3/Hes1通路表达的影响（1）RVHI检测结果与对照组相比,模型组RVHI显着增高,（0.23±0.03）vs（0.49±0.05）,P<0.001。与模型组相比,西地那非组显着降低了 RVHI,（0.40±0.04）or（0.36±0.03）vs（0.49±0.05）,P<0.001。（2）HE肺组织染色及PAWT结果对照组血管平滑肌细胞排列规则,内膜光滑,管腔大;模型组肺动脉的血管中膜显着增厚,PASMC肥大、增生,管腔变狭窄;与模型组相比,西地那非组,肺组织形态均有改观,肺血管中层明显变薄,血管平滑肌细胞排列规则,管腔明显变大;与对照组相比,模型组PAWT明显增加（0.30±0.04）vs（0.52±0.04）,P<0.001,西地那非可显着降低 PAWT,（0.42±0.03）or（0.38±0.06）vs（0.52±0.04）,P<0.001。（3）西地那非对新生PPHN大鼠肺组织中的Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达影响的检测结果与对照组相比,模型组中的Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达水平明显增加（P<0.001）;给予西地那非干预后,Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达低于模型组（P<0.05,P<0.001）。2.原代PASMCs鉴定结果培养细胞α-SMA表达率高于97%,成功培养了原代 PASMCs。3.西地那非对培养新生大鼠Hypo-PASMCs增殖、凋亡、迁移、侵袭及Notch3/Hes1通路表达的影响。（1）培养PASMCs增殖和凋亡与对照组相比,模型组PASMCs增殖明显增强（P<0.001）,西地那非能明显抑制PASMCs增殖;模型组的PASMC凋亡比例显着减少（P<0.001）,给予西地那非干预后,凋亡细胞比例明显增多（P<0.05,P<0.01）。（2）培养PASMCs周期结果表明与对照组相比,模型组S期细胞比例增加（P<0.001）,给予西地那非干预后,S期细胞比例明显下降（P<0.05,P<0.001）。（3）PASMCs迁移和侵袭结果显示与对照组相比,模型组迁移距离、迁移面积百分比和迁移数量明显增加（P<0.001）;给予西地那非后,迁移距离、迁移面积百分比和迁移数量都较模型组减少（P<0.05,P<0.001）。（4）西地那非对PASMCs中Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达影响的检测结果显示与对照组相比,模型组中的Notch3和Hes1蛋白和mRNA表达水平明显增加（P<0.001）;给予西地那非干预后,Notch3和Hesl蛋白和mRNA表达低于模型组（P<0.05,P<0.001）。研究结论:1.西地那非能够改善Hypo+Indom诱导的PPHN大鼠RVHI增加和肺血管重构。2.西地那非可抑制Hypo-PASMCs增殖、迁移和侵袭,促进Hypo-PASMCs凋亡。3.西地那非可以抑制体内PPHN模型中的肺组织和体外Hypo-PASMCs中的Notch3和Hes1 mRNA和蛋白的表达。第二部分西地那非通过Notch3/Hes1通路抑制低氧诱导的PASMC增殖和侵袭研究目的:采用论文第一部分原代培养由低氧诱导的新生大鼠PASMC,探讨西地那非是否通过Notch3/Hes1通路发挥抑制Hypo-PASMC增殖,从而发挥抑制肺血管重构的作用。研究方法:1.沉默Notch3通过慢病毒转染短发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）到培养的Hypo-PASMCs中,敲低Notch3,检测Notch3对大鼠PASMC表达的影响。2.过表达Notch3构建Notch3过表达质粒,通过慢病毒转染到Hypo-PASMCs中,通过过表达Notch3探讨西地那非是否通过Notch3通路影响Hypo-PASMC表达。3.PASMC中Notch3和Hes1 mRNA和蛋白含量测定通过实时荧光定量RT-PCR检测和免疫印迹分析检测培养的Hypo-PASMCs中的Notch3和Hes1 mRNA和蛋白的表达。4.细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭检测MTT,流式细胞凋亡实验检测PASMC增殖和凋亡;流式细胞周期实验检测PASMC增殖周期影响;划痕和Transwell实验检测PASMCs的迁移和侵袭变化。研究结果:1.西地那非对Notch3/Hes1信号通路的影响在PASMCs中,与对照组相比,模型组中的Notch3/Hes1蛋白和mRNA表达水平明显增加（P<0.001）;给予西地那非干预后,Notch3/Hes1蛋白和mRNA表达明显低于模型组（P<0.01,P<0.001）,提示Notch3/Hes1信号通路参与了西地那非对PASMC抑制作用。2.西地那非通过Notch3/Hes1通路对PASMCs增殖、迁移、侵袭和PASMCs凋亡等的影响（1）培养PASMCs增殖和凋亡实验结果在转染Notch3 shRNA序列后,由低氧诱导的大鼠PASMCs增殖被抑制,凋亡增加,与西地那非组作用相同（P<0.001,P<0.001）:而Notch3过表达反转西地那非的抑制细胞增殖和促进凋亡作用（P<0.001）:（2）培养PASMCs流式细胞周期实验结果西地那非与Notch3 shRNA组都能够显着降低由低氧诱导的细胞S期比例升高（P<0.001）,使细胞停留在G0/G1期,而Notch3过表达组能够逆转西地那非与Notch3 shRNA的这一作用（P<0.001）;（3）PASMCs迁移和侵袭实验结果Notch3沉默组与西地那非均具有抑制PASMCs迁移和侵袭的作用（P<0.001,P<0.01）,而Notch3过表达明显减弱西地那非抑制PASMCs迁移和侵袭的作用（P<0.05）。研究结论:1.Notch3/Hes1信号通路参与了西地那非抑制低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和肺血管重构。2.西地那非通过调节Notch3/Hes1信号通路抑制PASMC增殖、迁移和侵袭,促进PASMC凋亡,从而抑制PPHN大鼠肺血管重构。
李宛卫[2]（2019）在《一氧化碳干预Cx43-ERK信号通路在新生儿急性肺损伤中的保护作用》文中提出背景与目的各种原因所致的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）仍是引起新生儿伤残甚至死亡的最常见的临床危重症,其所并发的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）可引起了肺组织结构的大量破坏,肺功能受到严重影响,易发展为难治性新生儿呼吸衰竭而死亡。目前国内外新生儿ALI/ARDS的研究起步较晚,临床上缺乏大样本数据的对照性研究。一氧化碳（carbon monoxide,CO）是一种重要的内源性气体信号分子,通常由血红素加氧酶分解血红素而形成。其作为血红素分解代谢的副产物,在体内外具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗增殖、舒张血管等多种生物学作用。越来越多的研究发现CO水平在一定程度范围内升高对多种细胞的坏死具有保护作用。本课题组前期研究表明,低浓度CO不仅可以通过抑制肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells,AEC）凋亡而减少ALI,而且也可以减少AEC坏死。遗憾的是,CO减少AEC坏死从而保护ALI的分子通路还没有完全揭示清楚。新近的观点认为细胞坏死可受信号分子的调控,与凋亡一样存在较为复杂的信号通路,即细胞程序性坏死（necroptosis）。因此可能为细胞死亡的干预提供新机会。在CO保护ALI的过程中,程序性坏死发挥何种作用,目前也尚不清楚,需要进一步的研究。新生儿持续性肺动脉高压（Persistent pulmonary hypertension of newborn,PPHN）是新生儿重症监护室里重症患儿中较常见的一种非常严重的疾病,其发病凶险,死亡率较高,对新生儿的健康造成严重威胁,也是导致新生儿死亡的重要原因之一。而目前国内外治疗PPHN的手段有限,迫切需要研究新的治疗方法来降低其病死率和伤残率。而CO具有舒张血管、抑制平滑肌细胞增殖等生物学效应,研究显示,肺血管平滑肌细胞和内皮细胞均有血红素氧合酶（heme oxygenase,HO）蛋白及其活性的表达,是内源性CO生成和释放的重要场所之一,内源性HO/CO系统可能参与了低氧性肺动脉高压的形成。深入研究CO抑制AEC程序性坏死的信号转导通路,为临床上外源性吸入低浓度CO防治新生儿呼吸危重病提供新的理论基础和开发新药提供新思路。方法（一）:通过气管插管,气管内注入脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）制备新生大鼠ALI的动物模型;（二）:在新生大鼠ALI动物模型腹腔注射一氧化碳释放分子3（Carbon monoxide releasing molecule 3,CORM3）或非活性一氧化碳释放分子3（Inactive carbon monoxide releasing molecule 3,i CORM3）。收集各组肺组织标本进行组织学检测,测定支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞的总数和蛋白质的含量。并同时对各组肺组织应用定量实时定量PCR和western blot的方法来检测Cx43（Connexin43）及坏死相关标志物的表达。（三）:采用A549细胞,完成细胞复苏与传代,利用细胞转染技术,研究CO通过下调Cx43水平保护LPS导致的ALI。（四）:临床选择机械通气PPHN新生儿,随机给予一氧化氮（Nitric oxide,NO）吸入或CO吸入,收集临床资料,检测相关指标。结果1.气管导管内滴入LPS或者腹腔内注入LPS均可以建立新生大鼠ALI的动物模型。其表现为肺湿/干重比（Lung wet/dry weight ratio,w/d）升高,支气管肺泡灌洗液中总细胞数和蛋白浓度升高。2.LPS导致肺组织损伤这些变化通过腹腔注射给予CORM3后得到显着改善,但给予i CORM3却没有明显效果。3.CORM3能抑制LPS诱导的ALI中Cx43表达升高,过度表达的Cx43能减弱CORM3对肺的保护作用。4.LPS能增加坏死相关标记物MLKL、RIP1、RIP3、FADD的表达,给予CORM3能够明显阻碍这些标记物表达的升高。5.CORM3可减弱LPS诱导的细胞外信号调节激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）的激活,ERK抑制剂U0126可减弱其对细胞程序性坏死的保护作用。6.吸入NO能降低肺动脉压力（n=8,P<0.05）和吸入CO也能一定程度降低肺动脉压力（n=5,P<0.05）。7.低浓度吸入CO能降低炎症指标白细胞介素1-β、α肿瘤坏死因子、白介素-8、白介素-6的水平（n=5,P<0.05）。结论1.通过气管导管内滴入LPS或者腹腔内注入LPS均可以建立新生大鼠ALI的动物模型,为研究ALI提供更好的动物模型。2.CO减少LPS诱导的ALI肺泡上皮细胞程序性坏死。3.CO通过下调Cx43减少LPS诱导的肺泡上皮细胞程序性坏死。4.CO通过下调Cx43激活的ERK信号通路保护LPS诱导的ALI。5.低浓度CO有抗炎的作用及一定的降低肺动脉压力的作用。
王丽娜[3]（2019）在《低氧通过miR-203抑制FGF2参与低氧性肺动脉高压的机制研究》文中指出背景:肺动脉高压Pulmonary hypertension（PH）,是一种由多种原因诱导的,肺部血管动力学的异常,其能够导致进行性的肺部血管阻力的进行性的增加。PH能够进行性地造成右心室的肥厚,最终导致右心衰和死亡。缺氧性肺动脉高压(（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）的发生则属于各种疾病发展的中心环节之一。HPH常见于各种间质性肺病以及慢性阻塞性肺病。HPH的发病原因非常复杂,其机制可能涉及了遗传学因素、炎症因子的激活和免疫学失控等因素。研究发现,HPH其病理学主要改变是肺动脉的血管收缩性加强、肺部血管重构以及微小血管的损伤。HPH中参与小动脉收缩最重要的细胞即为肺动脉平滑肌细胞。近年来,PH的研究重点是逆转肺血管的重构和抑制血管平滑肌细胞的增殖异常,促进血管平滑肌细胞的凋亡。微小RNA（micro RNA或mi RNA）进化高度地保守,它是一种含有二十二个核苷酸的单链非编码RNA,并且能改变一些靶基因的表达,而这是通过转录后调节实现的。Micro RNA在很多的生物学过程中占据重要的作用,如细胞增殖、生长以及凋亡等。研究发现,在很多的疾病中,micro RNA甚至可以作为诊断疾病的潜在的生物学靶分子目标,对疾病的诊断、治疗做贡献。接近三分之一的人类基因表达过程存在mi RNAs参与。但是绝大多数mi RNAs的功能及其详细而具体的调控机制还等待进一步研究探索。Micro RNA能够与靶基因m RNA的3’UTR区域的碱基对相结合从而进一步对靶基因进行调控,进而对人体的增殖、凋亡、发育等生理、病理学过程进行操控和调节。近期的一些研究表明了micro RNA在HPH的形成和进展中发挥了重要的作用。尽管很多研究都对mi RNAs是如何参与HPH发生和进展做出了一定程度的研究,但到底有多少mi RNAs参与到了其发病过程及进展过程中,以及其参与的具体作用机制还有待进一步的研究。近年来的研究发现,在HPH组织中mi R-203的表达显着下调,我们猜测,mi R-203是否参与了HPH的发生和发展。目的:对HPH组织与细胞中的mi R-203的表达水平进行研究和分析,研究其功能变化,探讨其内在的分子机制。方法:1、构建HPH大鼠模型,并验证其是否成功。从大鼠模型中分离大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC）以供后续实验使用。2.用q RT-PCR的方法检测了缺氧处理组的大鼠的细胞和常氧处理组大鼠的PASMCs细胞中的mi R-203的表达,并进行EDU细胞增殖实验、CCK8分析实验、细胞划痕试验以验证mi R-203对PASMCs细胞的增殖和迁移是否具有调控作用。3.通过生物信息学手段寻找mi R-203可能的靶基因。选取FGF2为可能的靶基因后,预测mi R-203和FGF2可能的结合位点,并进行验证。4.在PASMCs细胞中转染FGF2 si RNA以敲低其表达水平,并进行验证。检测正常对照组、HPH对照组和HPH+FGF2 si RNA组三组大鼠肺部的相关指标。结果:1、我们测定了HPH模型大鼠和常氧对照大鼠的右心室收缩压（right ventricle systolic pressure,RVSP）和右心室肥厚指数（right ventricle hypertrophy index,RVHI）,发现前者的RVSP和RVHI明显高于后者。对大鼠模型的组织进行了HE染色检查,缺氧组大鼠的肺血管平滑肌层明显增厚,管腔狭窄,周围炎性细胞浸润,表明HPH大鼠模型的构建成功。接下来进行的免疫荧光的结果表明,大鼠PASMCS的纯度高,可用于后续实验。2、用q RT-PCR的方法检测了缺氧处理组和常氧处理组的大鼠的PASMCs细胞中的mi R-203的表达,结果表明,在缺氧处理组的PASMCs细胞中,mi R-203的表达显着下降。转染mi R-203 mimics和inhibitor上调或降低PASMCs细胞内mi R-203的表达,EDU细胞增殖实验和CCK8分析实验的结果表明,mi R-203的过度表达减少了PASMCs细胞的增殖,而下调mi R-203的表达则显着提高了PASMCs细胞的增殖能力。细胞划痕试验中我们发现过度表达的mi R-203可以减弱PASMCs细胞的迁移,同时抑制mi R-203则可以增强PASMCs细胞的迁移能力。3、通过生物信息学手段,我们寻找了mi R-203可能的靶基因,并选取了FGF2基因为其可能的靶基因。构建了用于双荧光素酶报告基因分析的野生型和突变质粒,结果表明,mi R-203可以靶向FGF2并与其3’UTR结合。PCR实验、Western blot的结果显示,在过表达mi R-203后,FGF2的表达水平下降。我们得出结论,mi R-203可以选择性地结合FGF2并减少其表达。4、我们在PASMCs细胞中转染了FGF2 si RNA以敲低其表达水平,并通过RT-PCR和Western blot实验,结果表明转染细胞中的FGF2的m RNA表达水平和蛋白质表达水平均出现下降。我们检测了正常对照组、HPH对照组和HPH+FGF2 si RNA组三组大鼠的相关指标。结果显示,与对照组相比,HPH+FGF2 si RNA组大鼠的RVSP、RVHI、WT%、（PM+FM）%、肺动脉平滑肌层厚度等指标均出现明显下降。我们得出结论:抑制FGF2可降低HPH大鼠的肺动脉压,从而有效改善肺血管重构。结论:本研究发现,低氧通过抑制mi R-203激活FGF2参与了HPH的形成。此外,特异性抑制FGF2可降低低氧性肺动脉高压,改善肺血管重构。
张晓萍[4]（2018）在《ABCA1对低氧诱导的肺动脉高压的影响及其机制研究》文中研究表明背景低氧性肺动脉高压（hypoxia pulmonary arterial hypertension,HPAH）为肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）中的一类,其病理学改变主要以肺远端小动脉的中膜平滑肌细胞的肥大增殖、进一步引起血管腔狭窄为特征,可见,肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）的异常增殖是HPAH发展过程中的关键环节,所以本文将以肺动脉平滑肌细胞为研究对象。腺苷三磷酸结合转运体 A1（ATP-binding cassette transporter,ABCA1）是 ABC转运蛋白超家族成员之一,可促进细胞内游离胆固醇和磷脂流出,抑制血管壁脂质的堆积,防止泡沫细胞的形成,且可抑制血管壁炎性反应,在心血管疾病中发挥重要的作用。近年来,脂质代谢异常在PAH中的作用受到广泛关注。ABCA1可调控血清高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）的合成,而高血清HDL有利于PAH患者的生存,可作为PAH生存的指标,且高密度脂蛋白可调控血管平滑肌细胞的增殖及迁移,因此,我们推测ABCA1可能对肺动脉高压的发生发展有一定的影响。研究发现,低氧环境下微小RNA（microRNA,miRNA）的表达异常,可调节肺动脉平滑肌细胞增殖、凋亡、迁移等过程,参与HPAH的形成。有研究报道,miR-361-5p在PAH患者血液中的表达显着上升,且microRNA.org-Targets and Expression软件预测显示,ABCA1为miR-361-5p潜在的靶基因之一,但miR-361-5p对PAH的具体的作用及作用机制尚不清楚。目的本文旨在研究ABCA1对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移及炎性因子表达的影响,以及miR-361-5p在PAH的发生发展过程中的作用,并探讨其具体的作用机制。材料与方法为了在体外模拟低氧性肺动脉高压的病理过程,首先将人肺动脉平滑肌细胞（hPASMCs）进行低氧及常规培养,低氧环境37℃,5%CO2、93%N2培养箱中,常规培养条件为37 ℃,5%CO2、95%O2。分别根据以下分组进行实验:（1）为了研究ABCA1对低氧诱导的hPASMCs的影响,先利用Real-time PCR和Western blot法检测其在低氧条件下的表达情况,再将ABCA1过表达载体pcDNA-ABCA1 或 ABCA1 shRNA 及相应对照 pcDNA-vector、shRNA-control 分别用Lipofectamine 3000转染至细胞中,然后进行低氧处理,分组为:normoxia组、hypoxia 组、hypoxia+pcDNA-ABCA1 转染组、hypoxia+pcDNA-vector 转染组;hypoxia+sh-ABCA1 转染组、hypoxia+shRNA-control 转染组;每组均重复 5个孔。（2）为了研究miR-361-5p对低氧诱导的hPASMCs的影响,先利用Real-time PCR法检测其在低氧条件下的表达情况,然后将miR-361-5p抑制剂（anti-miR-361-5p）及 miR-361-5p 模拟物（miR-361-5p mimic）及相应对照anti-NC 和 mimic control 转染到细胞中,分组为:normoxia 组、hypoxia 组、hypoxia+anti-miR-361-5p 转染组、hypoxia+anti-NC 转染组;hypoxia+miR-361-5p mimic转染组、mimic control转染组。上述各组处理完成后,最后利用Real-time PCR及Western blot法检测各组ABCA1的表达情况;CCK-8法检测各组细胞增殖情况;Transwell法检测各组细胞迁移情况;Western blot法检测各组细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子的表达情况及p-JAK2、p-STAT3等的表达情况。为了进行体内研究,分别尾静脉注射ABCA1腺病毒载体（Ad-ABCAl）及其对照（Ad-control）,以及 miR-361-5p 抑制剂 antagomiR-361-5p 及其对照（antagomiR-NC）,然后应用低氧诱导法建立PAH大鼠模型。分组如下:（1）将Ad-ABCA1尾静脉注射到大鼠体内,分为:对照组、PAH组、PAH+Ad-control,PAH+Ad-ABCA1。（2）尾静脉注射 antagomiR-361-5p,分为:对照组、PAH 组、PAH+antagomiR-361-5p 组、PAH+antagomiR-NC 和 PAH+antagomiR-361-5p+Ad-ABCA1组。进行大鼠肺循环血流动力学及右心室肥厚指数的测定,然后检测ABCA1,miR-361-5p的表达,评估二者对大鼠肺动脉血流动力学相关参数、平滑肌增生程度、炎症水平和p-JAK2、p-STAT3表达情况的影响。结果（1）与常氧组相比较,hPASMCs经低氧处理24、48及72 h后,ABCA1的表达显着下降,且呈时间依赖性。（2）低氧条件下,hPASMCs 经 pcDNA-ABCAl 转染 24、48 及 72 h 后,与转染pcDNA-vector组相比较,细胞增殖能力明显减弱;转染24h后细胞迁移及IL-6、IL-1β、TNF-α的表达显着受到抑制;而转染sh-ABCA1后则作用相反。（3）低氧处理后,p-JAK2及p-STAT3的表达显着上升,hPASMCs经pcDNA-ABCAl转染24 h后,p-JAK2及p-STAT3的表达显着下降,而转染sh-ABCA1表达作用则反之。（4）转染 pcDNA-ABCAl 或 sh-ABCAl 的 hPASMCs 进一步用 JAK2 抑制剂 AG490 处理后发现,AG490 可增强 pcDNA-ABCAl 对 p-JAK2、p-STAT3 的表达的抑制作用;而AG490处理则抑制了 sh-ABCAl转染后p-JAK2、p-STAT3的升高。（5）与常氧组相比较,低氧处理24、48及72h后,miR-361-5p的表达显着上调;且荧光素酶活性实验证明miR-361-5p可靶向调控ABCA1的表达。此外,与低氧组相比较,anti-miR-361-5p可显着抑制hPASMCs增殖,迁移及IL-6、IL-1β、TNF-α 的表达,抑制 p-JAK2 及 p-STAT3 的表达,而 miR-361-5p mimic的作用则反之,且pcDNA-ABCA1可显着增强anti-miR-361-5p的抑制作用,抑制miR-361-5pmimic的促进作用。（6）与PAH组大鼠相比较,尾静脉注射Ad-ABCAl后,PAH大鼠肺动脉平均压、右心室收缩压及右心室肥厚指数显着下降,还可抑制大鼠肺动脉平滑肌的增生及IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。（7）与PAH组大鼠相比较,尾静脉注射antagomiR-361-5p可抑制PAH大鼠肺动脉平均压、右心室收缩压及右心室肥厚指数的上升,还可抑制大鼠肺动脉平滑肌的增生及IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,抑制p-JAK2和p-STAT3的表达,且Ad-ABCAl可增强antagomiR-361-5p的抑制作用。结论本研究表明,在低氧诱导的hPASMCs及PAH大鼠模型中,ABCA1的表达显着下降。过表达ABCA1可通过抑制JAK2/STAT3信号通路抑制低氧诱导的PASMCs增殖、迁移及炎性因子的产生。此外,ABCA1是miR-361-5p的一个靶基因,抑制miR-361-5p的表达可显着上调ABCA1的表达,缓解低氧诱导的PAH的发生与发展。
高崴崴[5]（2017）在《DJ-1对缺氧性肺动脉高压的作用及其分子机制的研究》文中提出背景缺氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary arterial hypertension,HPH）是由持续性缺氧引起的肺血管收缩,重构及肺血栓形成等病理损伤,并最终导致血流动力学异常甚至右心衰竭的疾病。HPH在临床上比较常见,但至今并没有较好的治疗方法,其发病机制复杂,涉及多个途径,并有多种血管效应分子促其发生。HPH的病理特征肺血管收缩以及肺血管重塑已经非常清楚,在此过程中肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）起到关键作用。PASMCs的过度增生、迁移以及表型从分化型向去分化型的转换,造成肺血管壁的增肥增厚,最终导致肺动脉压力与肺血管阻力增强,因此,PASMCs的过度增殖和迁移被认为是肺血管重构的关键过程而成为学者们研究的热点,其分子机制可能牵涉遗传因素、分子介质和细胞异常等多个途径,血管内皮细胞功能受损、炎症反应和免疫异常等参与其形成,多种血管活性物质失衡促进其发生,最终导致肺血管收缩和肺血管结构重建。DJ-1,别名Park7,在体内各组织中广泛存在,虽然是胞浆蛋白,但在细胞核与细胞质中均有表达。其最早作为帕金森综合征的突变基因被熟知,此外,DJ-1在多种细胞中具有生物学特性,与转录调控、氧化应激和癌症的形成等密切相关,并能够通过线粒体途径保护心血管。有文献报道,DJ-1能够调节小凹蛋白caveolin-1（Cav-1）的表达,但其在HPH中的作用尚未有报道。小凹（caveolae）是细胞膜上特殊的囊泡状凹陷,其主要成分为小凹蛋白caveolin,其中Cav-1在多类细胞中均有表达,在信号转导途径中发挥着重要的作用。有研究表明,Cav-1在特发性肺动脉高压病人的体内表达降低,可作为特发性肺动脉高压的生物学标记物,已经成为肺动脉高压病理过程中不可或缺的分子。因此,我们推测DJ-1和Cav-1在HPH发病过程中互相作用并影响肺动脉高压的病理过程。目的该课题拟利用持续低氧环境构建缺氧性肺动脉大鼠模型,检测其血流动力学特征以及组织中DJ-1和Cav-1蛋白水平的表达;将DJ-1过表达载体和Cav-1沉默载体分别感染低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞,分别检测其对肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移、钙离子浓度和细胞表型转化的影响。探索DJ-1和Cav-1在缺氧性肺动脉高压中发挥的作用及其潜在的分子机制,为缺氧性肺动脉高压的临床治疗提供新的靶点和理论依据。方法1、DJ-1和Cav-1在缺氧性肺动脉高压大鼠模型中的表达情况。将野生型和DJ-1敲除型大鼠在含氧10%的低氧仓中饲养,4周后即可建立缺氧性肺动脉高压模型;常氧组大鼠在常氧条件下饲养,期间大鼠正常饮水、进食。模型构建成功后分别检测其血流动力学指标,免疫蛋白印迹法检测DJ-1和Cav-1蛋白的水平。2、DJ-1过表达和Cav-1沉默对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的影响。将PASMCs进行缺氧处理,并分别感染DJ-1过表达和Cav-1沉默载体,通过MTT法检测细胞增殖、Transwells小室检测细胞迁移、Fluo3-AM检测钙离子浓度、免疫蛋白印迹法检测表型转化标志蛋白水平等的检测,探索DJ-1对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的影响。3、DJ-1过表达对ERK1/2和TGFβ1/Smad信号通路的调控。DJ-1过表达或者Cav-1沉默处理缺氧诱导的PASMCs,通过免疫蛋白印迹法检测缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞中通路分子的表达,研究DJ-1和Cav-1在缺氧性肺动脉高压中潜在的分子机制。结果1、证实DJ-1和Cav-1在缺氧性肺动脉高压大鼠模型中异常表达。持续的缺氧环境成功构建了缺氧性肺动脉高压大鼠的模型,通过检测,其组织中DJ-1和Cav-1的表达水平均显着降低,另外在DJ-1敲除型大鼠中,缺氧诱导之后肺动脉高压的症状更为显着,表明DJ-1可能在肺动脉高压病理过程中发挥着重要的作用。2、发现DJ-1能够调控缺氧诱导的PASMCs生物学功能并且通过Cav-1实现。对缺氧诱导的PASMCs分别进行了 DJ-1过表达和Cav-1沉默处理,结果表明,缺氧处理PASMCs之后,细胞增殖迁移增加,胞内钙离子浓度升高,细胞从分化型转化为去分化表型,而DJ-1过表达之后能够抑制缺氧诱导的PASMCs增殖、迁移、钙离子浓度升高以及细胞表型转换。另外,Cav-1蛋白的沉默反转了 DJ-1对缺氧诱导的PASMCs的作用,因此我们推测,DJ-1可能是通过Cav-1对PASMCs的损伤发挥保护作用。3、初步证明DJ-1可能通过Cav-1抑制ERK1/2和TGFβ 1/Smad通路的激活。通过对PASMCs感染DJ-1过表达载体和Cav-1沉默载体,深入研究了 DJ-1影响缺氧诱导的PASMCs增殖迁移等过程的分子机制,结果表明,缺氧诱导PASMCs之后,ERK1/2和TGF β 1/Smad通路均被激活,而DJ-1过表达之后,通路的激活被抑制,相反的,Cav-1沉默之后,DJ-1的作用被反转,因此我们推测DJ-1可能通过上调Cav-1的表达抑制ERK1/2和TGFβ 1/Smad信号通路,从而抑制缺氧造成的PASMCs增殖、迁移、表型转化和胞内钙离子含量的升高。结论1、DJ-1和Cav-1蛋白在HPH大鼠模型肺组织中的表达较正常组大鼠均显着下降;DJ-1和Cav-1蛋白在缺氧诱导的PASMCs中的表达较常氧组细胞均显着下降;2、DJ-1过表达能够抑制缺氧诱导的PASMCs增殖、迁移、钙离子浓度升高以及细胞表型转换;而Cav-1的沉默促进缺氧诱导的PASMCs增殖、迁移、钙离子浓度升高以及细胞表型转换;DJ-1过表达和Cav-1沉默共处理之后,DJ-1对缺氧诱导的PASMCs的影响被反转;3、DJ-1过表达抑制ERK1/2和TGFβ1/Smad信号通路,且其作用在与Cav-1沉默载体共处理之后被反转。综上所述,DJ-1可能通过上调Cav-1的表达抑制ERK1/2和TGFβ1/Smad信号通路进一步抑制缺氧造成的PASMCs增殖、迁移、钙离子浓度升高以及细胞表型转换。
路政[6]（2016）在《miR-17通过靶向mitofusin 2调控缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡》文中提出背景:肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）是一种与肺血管痉挛、肺血管重塑及肺血栓形成导致的肺血管阻力增加紧密相关的异常血流动力学疾病,若未及时治疗,病情进行性发展可发生右心衰竭而死亡。其发病机制涉及细胞异常、分子介质和遗传因素等多个途径,肺血管内皮细胞功能受损、肺血管收缩反应增强和血管重建、炎症和免疫失调等参与形成,多种血管活性物质失衡促进其发生。低氧性肺动脉收缩（hypoxic pulmonary artery vasoconstriction,HPV）和低氧性肺血管重建（hypoxic pulmonary vascular remodeling,HPVR）是PAH的主要病理生理变化,特别是肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）的增殖起了重要的作用,尽管PAH发病机制未完全明确,目前增殖与凋亡的失平衡（尤其是PASMCs）越来越受到重视,并成为研究的热点。微小RNA（micro RNA,miRNA）是在真核细胞中广泛存在的非编码、高度保守、单链、小分子RNA（长度约22个氨基酸）,能够通过完全和（或）部分互补的原则结合靶基因m RNA的3’UTR区域碱基调控靶基因的表达,从而参与调控个体发育、分化、增殖及凋亡等生命活动。人类基因组中有300多个miRNA基因簇,miR-17家族又叫miR-106b家族,是由6个序列相似、结构相仿、种子序列相同（AAAGUGCU）、物种间高度保守的成熟体miRNA组成,许多研究表明其中miR-17家族由于参与哺乳动物心、肺、免疫系统等器官发育并与实体肿瘤的发生紧密相关而受到广泛关注。线粒体融合蛋白2（mitofusin2,Mfn2）是线粒体融合蛋白家族的成员,不仅是维持线粒体正常形态和发挥必要分子特征的重要元素,同时还具有调节细胞增殖、分化、凋亡和信号转导等功能的作用,研究发现Mfn2可以抑制PI3K/Akt信号通路,使线粒体外膜通透性增高,激活线粒体凋亡途径,促进血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells VSCMs）凋亡。Mfn2在心血管疾病中对VSCMs增殖发挥重要作用且被深入研究,那么其对低氧性肺动脉高压中PASMCs是否具有同样作用还不清楚。近年来有研究发现miR-17可通过PDLIM5或BMPR2等下调miR-17的表达来调控细胞的增殖或凋亡,参与肺动脉平滑肌细胞的调控,从而导致肺动脉高压的发生。然而miR-17在肺动脉高压疾病中参与的研究多是动物模型水平,miR-17及Mfn2在低氧诱导的动物肺动脉高压模型中发挥着重要作用,然而miR-17是否可以通过靶向调节Mfn2在人离体肺动脉平滑肌细胞模型等临床研究中发挥作用并未报道。因此,我们推测miR-17的表达下调可能通过靶向调节Mfn2的表达从而抑制PASMCs的增殖并延缓肺动脉高压的发生。目的该课题拟以肺动脉高压患者的肺组织标本和低氧诱导肺动脉平滑肌细胞为材料,模拟PAH的慢性缺氧过程,通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）和免疫印迹（Western Blot）分别检测miR-17和Mfn2蛋白在肺动脉高压（PAH）患者肺组织及正常肺组织中的表达水平,通过双荧光素酶报告实验验证miR-17与靶基因的作用位点,探索miR-17及其靶基因对缺氧PASMCs的增殖、凋亡及相关蛋白的影响。方法1.为了模拟PAH的慢性缺氧过程,我们把PASMCs在低氧（即3%O2、5%CO2、92%氮气）的条件下培养48 h,然后收取细胞,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和Western Blot技术检测正常和缺氧处理的PASMCs miR-17和Mfn2表达水平。2.在缺氧处理的PASMCs中,运用脂质体转染技术转染化学合成的anti-miR-17和anti-miR-NC,在低氧条件下培养48 h后收取细胞进行q RT-PCR实验检测miR-17表达水平,通过噻唑蓝（MTT）实验检测细胞增殖活性,进行western blot实验检测增殖细胞核抗原（Proliferating cell Nuclear Antigen,PCNA）的表达情况;进行流式细胞术检测肺动脉平滑肌细胞凋亡情况,并且检测凋亡相关蛋白Caspase-3的活性,研究miR-17表达抑制对肺动脉平滑肌细胞细胞增殖、凋亡的影响。3.在肺动脉平滑肌细胞转染miR-NC、miR-17 mimics、anti-miR-NC和anti-miR-17,48 h后收取细胞,荧光素酶报告基因实验验证miR-17和Mfn2m RNA3’UTR的结合情况,运用western blot检测miR-17 mimics、anti-miR-17对Mfn2蛋白表达的影响。为了进一步验证miR-17对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞增殖、凋亡的调控机制,我们在肺动脉平滑肌细胞转染si Mfn2抑制内源性Mfn2蛋白的表达,观察si Mfn2对anti-miR-17增殖抑制和凋亡促进作用的影响,运用western blot检测PCNA以及凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果1.和正常肺组织样本相比,miR-17在肺动脉高压患者肺组织中的表达明显增多,而Mfn2蛋白表达水平下调。q RT-PCR和western blot检测结果显示,和常氧处理的肺组织对照组相比,缺氧处理组细胞miR-17表达量上升,Mfn2蛋白表达降低。2.和anti-miR-NC对照组细胞相比,转染anti-miR-17的肺动脉平滑肌细胞增殖活性明显降低。转染miR-17抑制剂anti-miR-17后,PCNA的蛋白表达水平下降。相比anti-miR-NC对照组,anti-miR-17组细胞凋亡率和Caspase-3活性明显升高。3.与共转染miR-NC和Mfn2-3’UTR报告基因载体组相比,共转染miR-17mimics和Mfn2-3’UTR报告基因载体后,萤火虫荧光素酶活性明显降低。与共转染miR-NC和Mfn2-Mut-3’UTR报告基因载体组相比,共转染miR-17 mimics和Mfn2-Mut-3’UTR报告基因载体后,萤火虫荧光素酶活性没有明显变化,miR-17对萤火虫荧光素酶活性的抑制作用消失。转染miR-17 mimics的细胞,Mfn2蛋白表达水平明显降低,而转染anti-miR-17后,Mfn2蛋白表达水平明显上调。在PASMCs转染anti-miR-17和si Mfn2,抑制miR-17和内源性Mfn2蛋白的表达,观察肺动脉平滑肌细胞增殖、凋亡的变化。和anti-miR-NC+si NC组细胞相比,anti-miR-17+si Mfn2组细胞增殖活性降低,增殖蛋白PCNA表达降低,细胞凋亡率和Caspase-3活性上升,凋亡相关蛋白Caspas-3表达升高。结论1.miR-17在缺氧肺动脉平滑肌细胞和肺动脉高压患者肺组织表达上调,而Mfn2表达下调。2.降低miR-17的表达能够抑制低氧条件下肺动脉平滑肌细胞增殖,促进肺动脉平滑肌细胞凋亡。3.miR-17通过靶向调控Mfn2基因表达,调控低氧条件下肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡。综上所述,miR-17/Mfn2调控途径是缺氧诱导肺动脉平滑肌细胞过度增殖和凋亡减少的重要调节机制,miR-17可能成为防治肺动脉高压的潜在治疗靶点。
刘洋[7]（2016）在《毛蕊花糖苷对高原低氧性肺动脉高压大鼠的影响》文中进行了进一步梳理目的:研究管花肉苁蓉（C.tubulosa）中毛蕊花糖苷（Acteoside,ACT）对高原低氧性肺动脉高压大鼠的作用及可能的作用机制。方法:1.采用模拟5000m海拔高原人工舱饲养SD大鼠。SD大鼠共72只,分为空白对照组、模型组、西地那非组（6.25mg/kg）和毛蕊花糖苷高、中、低剂量组（分别为50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg）,每组12只,先给药一周,再进舱灌胃给药,共给药35天。2.测定平均肺动脉压、右心室收缩压并计算右心室肥厚指数。3.观察肺组织、右心室病理变化。4.测定肺组织匀浆液中NO含量及NOS酶活力、ET-1和VEGF的含量。5.检测肺组织中HIF-1αmRNA和蛋白的表达。结果:1.与正常对照组相比,模型组大鼠右心室收缩压、平均肺动脉压及右心室肥厚指数明显升高（P﹤0.01）;与模型组大鼠相比,毛蕊花糖苷高、中剂量组均能降低高原肺动脉高压大鼠平均肺动脉压及右心室收缩压（P﹤0.05）。2.光镜下可见模型组大鼠肺气管周围炎性浸润明显,心肌细胞增厚肥大,肺动脉血管中膜厚度和肺动脉血管壁厚度明显增加;与模型组相比,毛蕊花糖苷低、中、高剂量组及西地那非组肺动脉高压大鼠肺动脉血管壁、炎性浸润及心肌细胞增厚肥大情况均明显改善。3.与正常对照组相比,模型组大鼠肺匀浆液中NO含量明显降低（P﹤0.01）,NOS和eNOS酶活力明显降低（P﹤0.01）,iNOS酶活力明显升高（P﹤0.01）,ET-1、VEGF含量明显升高（P﹤0.01）;与模型组相比,毛蕊花糖苷高、中剂量组及西地那非组NO含量明显升高（P﹤0.01）,NOS和eNOS酶活力明显升高（P﹤0.01）,iNOS酶活力、ET-1、VEGF含量明显降低（P﹤0.01）。4.与正常对照组相比,模型组肺组织HIF-1αmRNA及蛋白表达量明显增加（P﹤0.01）;与模型组相比,毛蕊花糖苷高、中剂量组及西地那非组肺动脉高压大鼠肺组织HIF-1αmRNA及蛋白表达量明显降低（P﹤0.01）。结论:1.模拟5000m海拔高原人工舱可成功制备高原肺动脉高压大鼠模型。2.毛蕊花糖苷能降低肺动脉高压模型大鼠肺动脉压,减轻心肺病理改变。其作用机制可能是通过增强NO通路作用、抑制血管收缩功能及下调HIF-1α表达来实现。
李晓晨[8]（2015）在《转录因子KLF5在缺氧性肺动脉高压中的作用》文中研究说明第一部分转录因子KLF5在缺氧性肺动脉高压中的作用目的：缺氧性肺动脉高压是一种复杂的系统性疾病,肺小动脉重构是其主要的病理特征。KLF5（Kruppel-like factor5）作为一种锌指结构的转录因子,参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化以及迁移过程。它在肺动脉高压病人的肺动脉平滑肌细胞中高表达。研究发现KLF5参与了心血管重构的形成过程。然而,目前KLF5在缺氧性肺动脉高压中的作用及分子机制尚不清楚。方法：实验采用成年雄性SD大鼠（体重为200-250g）,分别置于常氧或缺氧环境（10%氧浓度）中培养。‘检测大鼠血流动力学指标,评估其肺动脉中膜厚度和右心室肥厚程度,行肺组织HE染色观测大鼠血管重构情况。在常氧或缺氧（5%氧浓度）培养箱中培养人肺动脉平滑肌细胞（human pulmonary artery smooth muscle cells, HPASMC）。在HPASMC中行CCK-8、BrdU标记、PI单染、Annexin-V/PI双染、transwell迁移实验检测细胞活力、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移能力。行免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光染色实验检测目的蛋白水平。行实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测目的基因mRNA水平。提取暴露于常氧和缺氧环境的HPASMC裂解产物,通过免疫共沉淀实验明确KLF5和缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-la, HIF-1α）之间是否存在关联。采用小干扰RNA （small interfering RNA, siRNA）下调HPASMC中KLF5和HIF-1α的表达。为上调KLF5水平,建立过表达KLF5基因的慢病毒载体并感染HPASMC。构建KLF5基因短发卡结构RNA （short hairpin RNA, shRNA）慢病毒载体,通过尾静脉注射入大鼠体内以下调KLF5表达。结果：缺氧组大鼠的平均肺动脉压力显着升高,伴随远端肺小动脉中膜增厚及右心室肥厚。缺氧引起大鼠肺动脉中膜层PCNA、Ki67阳性细胞增多,TUNEL阳性细胞减少。缺氧HPASMC的增殖和迁移能力增强,细胞凋亡减少。沉默KLF5或HIF-1α可以逆转这些生物学改变。在平滑肌细胞中,沉默KLF5后HIF-1α蛋白水平下调,过表达KLF5可以上调HIF-1α水平,而沉默HIF-1α后KLF5表达无显着改变。免疫共沉淀实验提示KLF5和HIF-1α存在直接结合,缺氧刺激下沉淀的目的蛋白增多。细胞周期蛋白cyclin B1、cyclin D1和凋亡相关蛋白bax、bc-2、survivin、caspase-3和caspase-9参与了KLF5-HIF-1α轴对HPASMC生长的调控。KLF5沉默大鼠的肺动脉中HIF-1α表达显着下调,平均肺动脉压和肺动脉重构情况显着改善,与细胞实验的结果一致。结论：缺氧促进肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移增加,凋亡减少,血管重构形成。本研究从细胞水平和在体水平验证了KLF5-HIF-1α轴存在于缺氧大鼠的肺动脉平滑肌细胞,并且在缺氧性肺血管重构中发挥了重要作用。KLF5是缺氧性肺动脉高压治疗的潜在靶点。第二部分转录因子KLF5在在缺氧对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡中的作用目的：转录因子KLF5在肿瘤组织中广泛表达,且是肿瘤的一个预后因子。然后,KLF5在非小细胞肺癌中的作用尚未阐明。缺氧通过HIF-1α在肿瘤的发展中起重要作用。本研究旨在探讨KLF5在缺氧性肺癌细胞生长中的作用以及KLF5和HIF-1α的潜在关联。方法：我们通过对暴露于常氧（20%氧浓度）或缺氧（1%氧浓度）环境的A549细胞进行CCK-8实验、克隆形成实验、CFSE标记实验、Annexin-V/PI实验检测细胞的活力、克隆形成能力、‘增殖和凋亡。通过合成小干扰RNA来下调KLF5和HIF-1α的表达。采用PCR和免疫印迹的方法检测mRNA和蛋白的表达水平。结果：研究显示缺氧可以增强A549细胞活力、克隆形成能力,促进增殖,抑制细胞凋亡。缺氧上调HIF-1α和KLF5的表达,呈时间依赖性。沉默KLF5和HIF-1α可以通过下调cyclin B1、survivin,上调caspase-3逆转缺氧引起的细胞活力增加和凋亡减少。免疫共沉淀实验提示KLF5和HIF-1α存在直接关联,且缺氧环境中沉淀的目的蛋白更多。此外,沉默KLF5可以降低HIF-1α的水平,而KLF5表达不受HIF-1α的影响,确定了KLF5是HIF-1α的上游调控因子。结论：本研究证实缺氧是一个促癌因素,在肺癌细胞中通过激活KLF5→HIF-1α→cyclin B1/survivin/caspase-3发挥作用。
王建荣[9]（2013）在《HIF-1α、ET-1、iNOS在新生大鼠HPH的表达变化及其与肺血管重塑的相关性研究》文中研究说明目的：观察HIF-1α及其调控因子：ET-1、iNOS在缺氧性肺动脉高压（HPH）新生大鼠肺组织中的表达水平,并分析HIF-1α、ET-1、iNOS与肺血管重塑的相关性。方法：新生Wistar大鼠120只,随机平均分为模型组和常氧组,建造HPH新生大鼠模型：模型组大鼠饲养给予低氧供应,常氧组给予常压空气供应。在实验开始后第3、5、7、10、14、21天分别从模型组及常氧组同日龄新生大鼠各随机取大鼠10只,检测平均肺动脉压（mPAP）;观察大鼠肺组织HIF-1α、ET-1、iNOS三因子免疫组化反应强度及其mRNA的表达；观察肺血管重塑指标：大鼠肺小动脉超微结构并计算MT%、MA%,并将其与HIF-1α、ET-1、iNOS mRNA分别进行相关性分析。结果：1)模型组大鼠在缺氧3、5、7、10、14、21天mPAP显着高于常氧组大鼠（P<0.05）,提示造模成功。2)缺氧7天时模型组大鼠肺小动脉可见内膜出现不同程度增厚,内皮细胞增大,可呈隆突状突入管腔,提示肺血管重塑改变已形成。3)模型组大鼠缺氧7天后MT%、MA%显着较常氧组高（P<0.05）,说明已形成肺血管重塑。4)肺组织HIF-1α、ET-1、iNOS免疫组化：三因子模型组总阳性率表达均高于常氧组（P<0.05）；常氧组肺HIF-1α表达在缺氧3、5、7、10天较模型组低（P<0.05）,ET-1与iNOS表达在缺氧3、5、7天均低于模型组（P<0.05）。5)肺组织HIF-1α、ET-1、iNOS mRNA测定：与常氧组相比,模型组大鼠HIF-1α与iNOS mRNA值在缺氧3、5、7天增强（P<0.05）；ET-1mRNA值在缺氧3天升高（P<0.05）。（6）通过直线相关分析,模型组大鼠肺组织HIF-1αmRNA与肺血管重塑指标（MT%、MA%）正相关（r分别为0.835、0.850,P<0.05）。结论：新生大鼠缺氧7天后肺血管出现重塑；HIF-1α、ET-1及iNOS均在新生大鼠HPH的发病机制中发挥作用。
申霖[10]（2011）在《重返平原后高原肺动脉高压大鼠肺组织细胞凋亡的变化以及5-HT抑制剂的干预效果》文中进行了进一步梳理目的观察氟西汀药物干预与重返平原对高原性肺动脉高压大鼠肺组织凋亡的影响,探讨氟西汀与重返平原对高原性肺动脉高压治疗是否有积极意义。方法220只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（N组,10只）,无干预组（W1-7组,各10只）,氟西汀组（F1-7组,各10只）,蒸馏水组（C1-7组,各10只）,共高原10天、20天、30天及重返平原10天、20天、30天、90天合计7个时间阶段,22个组;N组置于常压常氧处喂养,W、F、C各组均同时置于模拟海拔5000m高原环境低压氧舱中饲养。应用流式细胞仪检测各组肺组织细胞凋亡情况。结果1.与N组相比较,随高原低压低氧时间延长,W组肺组织细胞早期凋亡呈进行性增高,而活细胞比例呈进行性降低,高原时间段各组比较具有明显差异（P<0.05）。2.脱离高原低压低氧环境后,W组肺组织细胞早期凋亡逐步向晚期凋亡及死亡细胞过渡,活细胞比例呈进行性恢复。W6组早期凋亡、晚期凋亡及死亡细胞已明显减少,与W3、4、5组比较具有显着差异（P<0.05）,与W7组比较无明显差异。3.W7组各项指数数据与N组比较,无统计学差异。4. F、C组组内各时间段比较,各数据走形趋势同W组相似; W、F、C组间各时间段比较,无显着性差异。结论1.低压低氧诱导肺组织凋亡增加,凋亡比例与缺氧时间成正相关。2.重返平原后,随着脱离低压低氧时间的延长,肺组织细胞凋亡逐渐减少,并最终恢复至正常状态。3.氟西汀对于高原肺动脉高压肺组织凋亡无干预作用及远期效应。
二、The Role of Endogenous Carbon Monoxide in the Hypoxic Vascular Remodeling of Rat Model of Hypoxic Pulmonary Hypertension（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、The Role of Endogenous Carbon Monoxide in the Hypoxic Vascular Remodeling of Rat Model of Hypoxic Pulmonary Hypertension（论文提纲范文）
（1）西地那非通过Notch3/Hes1通路抑制新生大鼠持续性肺动脉高压的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 西地那非对PPHN大鼠肺血管重构及低氧诱导的PASMC细胞功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 西地那非通过Notch3/Hes 1通路抑制低氧诱导的PASMC |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述一 西地那非治疗新生儿持续肺动脉高压研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 Notch3信号通路与肺动脉高压血管重构的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附英文论文一 |
| 附英文论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）一氧化碳干预Cx43-ERK信号通路在新生儿急性肺损伤中的保护作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 一氧化碳在肺泡上皮细胞程序性坏死中的保护作用研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 急性肺损伤新生大鼠动物模型的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 一氧化碳对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 一氧化碳干预LPS诱导的急性肺损伤新生大鼠肺泡上皮细胞程序性坏死的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 Cx43在一氧化碳保护新生大鼠急性肺损伤中的作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 Cx43-ERK信号通路在肺泡上皮细胞程序性坏死中的作用研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第二部分 一氧化碳吸入治疗新生儿持续性肺动脉高压的随机对照研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 一氧化碳吸入治疗新生儿持续性肺动脉高压的临床研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 一氧化碳保护急性肺损伤的分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 |
| 附件2 |
| 攻读博士研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）低氧通过miR-203抑制FGF2参与低氧性肺动脉高压的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料和试剂 |
| 1.1 大鼠HPH动物模型的构建 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验主要溶液配制方法 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 RNA提取,逆转录和实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.4 Western Blot |
| 2.5 大鼠右心室收缩期压力测定 |
| 2.6 右心室肥厚指数的计算 |
| 2.7 苏木精和伊红(HE)染色 |
| 2.8 免疫组织化学 |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10免疫荧光染色实验 |
| 2.11 CCK8 细胞计数实验 |
| 2.12 EDU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)细胞增殖检测实验 |
| 2.13双荧光酶报告基因实验 |
| 2.14 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 HPH大鼠模型的成功建立及PASMCs的鉴定 |
| 2 在缺氧的PASMCs细胞中miR-203 表达下降并能抑制PASMCs的增殖和迁移 |
| 3 MiR-203 可选择性地结合于FGF2 并抑制其表达 |
| 4 抑制FGF2 能够降低肺动脉压力并减轻肺血管重建 |
| 讨论 |
| 1、HPH的研究现状 |
| 2、microRNA在 HPH中的作用 |
| 3、MiR-203 通过抑制FGF2 参与低氧性肺动脉高压 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）ABCA1对低氧诱导的肺动脉高压的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 ABCA 1对低氧诱导的hPASMCs的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 ABCA 1通过调控JAK2/STAT3通路发挥生物学作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 miR-361-5p通过调控ABCA1影响低氧诱导的hPASMCs的增殖与迁移 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 ABCA1对低氧诱导的肺动脉高压大鼠模型的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五部分 miR-361-5p通过调控ABCA1影响低氧诱导的大鼠肺动脉高压病理过程 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结及展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）DJ-1对缺氧性肺动脉高压的作用及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 DJ-1敲除对缺氧性肺动脉高压大鼠的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 DJ-1对低氧诱导肺动脉平滑肌细胞的作用 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 DJ-1对缺氧性肺动脉高压影响的分子机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肺动脉高压的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）miR-17通过靶向mitofusin 2调控缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词（Abbreviation） |
| 引言 |
| 1 肺动脉高压(PAH) |
| 2 miRNAs在PAH的研究 |
| 第一部分 mi R-17和Mfn2在缺氧肺动脉平滑肌细胞（hPASMCs）和肺动脉高压(PAH)患者表达情况 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺氧对PASMCs中mi R-17和Mfn2蛋白表达的影响 |
| 2.2 miR-17和Mfn2在PAH患者肺组织中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 miR-17对低氧介导的肺动脉平滑肌细胞（hPASMCs）增殖和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 miR-17对PASMCs增殖的影响 |
| 2.2 miR-17对低氧介导的PASMCs凋亡的影响 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 miR-17调控低氧介导的肺动脉平滑肌细胞（h PASMCs）增殖和凋亡的分子机制 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 miR-17靶基因预测 |
| 2.2 Mfn2是miR-17的靶基因 |
| 2.3 miR-17抑制Mfn2的蛋白表达 |
| 2.4 miR-17通过抑制Mfn2的表达介导PASMCs增殖、凋亡的调控过程 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述：miRNAs在低氧诱导的肺动脉高压中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（7）毛蕊花糖苷对高原低氧性肺动脉高压大鼠的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 实验动物与分组 |
| 2.2 血流动力学指标的检测 |
| 2.3 大鼠心脏、肺组织病理学观察 |
| 2.4 大鼠肺组织中NO含量测定 |
| 2.5 大鼠肺组织中TNOS、iNOS和 eNOS活力测定 |
| 2.6 大鼠肺组织中ET-1、VEGF含量测定 |
| 2.7 大鼠肺组织中HIF-1αmRNA表达测定 |
| 2.8 大鼠肺组织中HIF-1α蛋白表达测定 |
| 2.9 统计学分析方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
（8）转录因子KLF5在缺氧性肺动脉高压中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 转录因子KLF5在缺氧性肺动脉高压中的作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 第二部分 转录因子KLF5在缺氧促进非小细胞肺癌细胞增殖和抑制凋亡中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 综述 缺氧性肺动脉高压：血管重构和免疫炎症反应 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩略词表 |
| 附录2 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）HIF-1α、ET-1、iNOS在新生大鼠HPH的表达变化及其与肺血管重塑的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 主要仪器及试剂 |
| 3 实验方法 |
| 4 模型步骤 |
| 5 标本釆集 |
| 6 模型中质量控制 |
| 7 统计学分析 |
| 附本研繊图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（10）重返平原后高原肺动脉高压大鼠肺组织细胞凋亡的变化以及5-HT抑制剂的干预效果（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
四、The Role of Endogenous Carbon Monoxide in the Hypoxic Vascular Remodeling of Rat Model of Hypoxic Pulmonary Hypertension（论文参考文献）
- [1]西地那非通过Notch3/Hes1通路抑制新生大鼠持续性肺动脉高压的机制研究[D]. 康丽丽. 山东大学, 2021(11)
- [2]一氧化碳干预Cx43-ERK信号通路在新生儿急性肺损伤中的保护作用[D]. 李宛卫. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [3]低氧通过miR-203抑制FGF2参与低氧性肺动脉高压的机制研究[D]. 王丽娜. 青岛大学, 2019(07)
- [4]ABCA1对低氧诱导的肺动脉高压的影响及其机制研究[D]. 张晓萍. 郑州大学, 2018(12)
- [5]DJ-1对缺氧性肺动脉高压的作用及其分子机制的研究[D]. 高崴崴. 郑州大学, 2017(01)
- [6]miR-17通过靶向mitofusin 2调控缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡[D]. 路政. 郑州大学, 2016(03)
- [7]毛蕊花糖苷对高原低氧性肺动脉高压大鼠的影响[D]. 刘洋. 新疆医科大学, 2016(05)
- [8]转录因子KLF5在缺氧性肺动脉高压中的作用[D]. 李晓晨. 华中科技大学, 2015(07)
- [9]HIF-1α、ET-1、iNOS在新生大鼠HPH的表达变化及其与肺血管重塑的相关性研究[D]. 王建荣. 新疆医科大学, 2013(02)
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