肝组织基因芯片检测乙肝病毒pre-C区/BCP区基因突变

一、基因芯片检测肝组织中乙型肝炎病毒前C区/BCP区基因突变的研究（论文文献综述）

王铭杰^[1]（2018）在《乙肝相关肝纤维化宿主表达谱及病毒谱研究》文中研究表明背景和目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是严重的全球公共卫生问题,慢性HBV感染所致的肝纤维化（liver fibrosis,LF）是发病率和致死率较高的肝脏相关疾病。目前HBV相关肝纤维化（HBV-LF）的发病机制尚不明确。HBV-LF是病毒与宿主长期相互作用的结果,要全面地研究HBV-LF的发病机制,必须从宿主因素和病毒因素两个方面进行探索。本研究通过对HBV相关肝纤维化患者的肝组织基因表达谱和血清病毒准种进行大数据分析,深入探讨引起LF发生发展的宿主和病毒因素。内容及方法:共入组124例慢性HBV感染患者进行肝组织表达谱芯片检测,通过整合的生物信息学分析,筛选可能在LF中发挥重要作用的通路和关键基因。进而通过细胞实验证实特定基因的作用机制,并用血清学检测分析其对肝纤维化的无创诊断效能。为研究病毒因素的影响,本研究还入组107例HBV不同感染阶段的患者血清样本,利用二代测序（Next generation sequencing,NGS）检测HBV全长准种,通过开发一套完整的准种分析软件,深入分析病毒准种与LF的相关性,并利用机器学习算法建立肝纤维化诊断模型,分析其在LF无创诊断中的效能。结果:第一部分研究中,通过HBV-LF患者的表达谱研究,发现LF进展中的动态调控过程,筛选出TGFβ信号转导和上皮间质细胞转换为参与LF启动和进展的重要通路,鉴定出ITGBL1为调控HBV-LF的关键基因。第二部分细胞学实验证实ITGBL1通过上调TGFβ1促进LF进展,而且与肝纤维化程度显着相关。第三部分通过检测慢性HBV感染者血清中ITGBL1水平并构建诊断模型,结果发现其作为肝纤维化无创诊断模型的效能有限。第四部分构建了可用于病毒准种高通量测序数据分析的软件QAP,其具备多样化的分析工具和运行模式。第五部分中使用QAP软件,对HBV不同感染阶段患者的病毒准种构成进行定量比较,发现LF患者的病毒谱系与其他感染阶段存在显着差异,通过机器学习构建的无创诊断模型对肝纤维化的诊断准确率达到100%。结论:本研究通过大规模的表达谱分析了HBV-LF过程中的分子机制,鉴定并证实了关键基因ITGBL1在HBV-LF中的作用。研发了一款病毒准种高通量测序分析软件,并用于深入描述HBV-LF的病毒谱特征,在国际上首次建立了基于HBV准种特征的高效的HBV-LF新型无创诊断模型。

何雨^[2]（2016）在《广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究》文中提出研究背景:HBV属于嗜肝病毒科,是一种长3.2kb的DNA病毒,其为有包膜的环状不完全双链DNA。HBV是已知可感染人体的最小的双链DNA病毒,但其复制效率最高。它包含4个部分重叠的开放读码框（ORF）,pre S1/S2/S,pre C/C,P和X。由于HBV聚合酶缺乏校准功能,导致HBV有很强的序列异质性。核苷酸异质性大于8%是HBV分型的原则,按照此原则HBV可以被分为8个基因型:A-H,新发现的基因型I和J还存在争议（未被NCBI在线基因分型工具收录）。急慢性肝炎,肝硬化和肝癌的发生都与HBV感染紧密相关,严重影响人类健康。HBV是人体中最常见的病原体,全球有20亿人既往感染或现症感染。其中2千5百万人有慢性乙肝。超过75%的乙肝病人生活在西太平洋和东南亚。中国是HBV感染高发区,有1千2百万乙肝病人,其中大约有15%-40%发展成HBV相关肝硬化和肝癌。每年有大约60万人死于此类疾病。HBV在中国的分布:北方地区以C型为主,中南地区以B型为主,西南地区B型和C型均等,C/D重组基因型主要分布在西北地区,C2和B2是最多见的亚型。在我国农村,恶性肿瘤中胃癌死亡率最高,其次是肝癌;在城市,肝癌死亡率仅次于肺癌和胃癌死亡率,居第三位,因此其病原生物学、发病机制及预防和治疗是研究的重点内容。广西扶绥地区的肝癌发病率和死亡率均超过50/10万,远高于全国平均水平27/10万。而广西桂林地区肝癌发病率约为29/10万,与全国水平接近。本课题组既往研究发现HBV感染、黄曲霉毒素的摄入和饮用水源污染等是广西扶绥县肝癌发生的主要三大环境危险因素,在黄曲霉毒素的摄入和饮用水污染得到控制后,扶绥县肝癌仍持续高发。目前HBV基因型、亚型以及变异成为其致癌作用研究的重点。为了了解扶绥地区HBV的生物学特征,现选取肝癌低发区桂林的HBV感染者和肝癌患者一同进行对照研究,预期从病毒学角度发现导致扶绥肝癌持续高发的根本原因。目的:（1）建立适用于多种HBV基因型的PCR反应体系并优化其反应条件,实现对广西壮族自治区内存在的各个基因型HBV全序列的高灵敏度扩增,并确保反应的特异性,为后续测序工作打下基础。（2）对扶绥地区和桂林地区感染HBV的肝癌和慢性肝炎患者及携带者,通过PCR产物直接测序的方法,获得其血清中HBV序列信息,再使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接,获得HBV全序列。并使用进化树的方法对全序列进行分型和确定亚型。研究肝癌组和非肝癌组病人HBV突变情况,确定HBV感染相关肝癌的独立危险因素。（3）对扶绥和桂林地区可能存在的特有基因型进行分析鉴定。方法:（1）通过文献检索和使用引物设计软件,找到适用于大多数HBV基因型的PCR引物,验证引物的特异性。同时比较一片段法和两片段法PCR在HBV全序列扩增中的效果差异,从而选择最优化的方法,确定PCR反应体系和反应条件,使用经荧光定量PCR准确测出HBV DNA含量的标本验证该PCR反应体系的检测灵敏度。（2）收集来自扶绥地区和桂林地区的肝癌和慢性乙肝患者及HBV携带者血清,使用两片段法结合半巢式PCR,扩增HBV全基因,使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接,获得HBV全序列。并使用NCBI的在线分型工具和分子进化树的方法对全序列进行分型并确定亚型。按照基因分型分别研究肝癌组和非肝癌组病人的HBV突变情况,使用SPSS进行比较分析,找出肝癌相关突变位点;使用多因素统计分析,确定独立危险因素,并确定这些突变位点用于肝癌诊断的灵敏度和特异性,并尝试进行联合诊断分析。（3）对基因分析得到的重组序列,使用NCBI的BLAST功能找到与重组序列相似的序列,查找文献原文,了解其分布情况。使用SIMPLOT确定重组位点,找出重组序列来源;分析其全序列与不同基因型标准序列的差异情况、以及S区氨基酸表达情况,确定重组基因型的分类。结果:（1）通过对30例临床标本的检测发现:两片段法的检测灵敏度远高于一片段法,HBV DNA定量大于1.45×103 IU/ml的标本均可以检出明显的产物条带。故在后续实验中确定使用两片段法进行PCR扩增。同时,将本实验用到的引物序列与HBV标准序列进行匹配验证,证明其具有很好的特异性和较强的结合能力。此外,半巢式PCR方法的使用,既提高了检测灵敏度,又避免了非特异性产物的出现。（2）本研究共收集来自扶绥和桂林地区的血清标本共339例,按照实验流程去除资料不全,HBV DNA含量过低及测序失败的病例后,共有187例研究对象测得HBV全基因序列。经NCBI基因分型工具鉴定分型,获得本地区HBV B型和C型的参考序列。扶绥地区的受试者中,C基因型占77.1%,B基因型占18.8%,重组基因型占4.2%。桂林地区的标本中C基因型占21.8%,B基因型占78.2%。两地HBV基因型分布存在显着差异。在全部受试者中,HBV B型有86例,其中B2占88.4%（75/86）,B4占11.6%（11/86）;HBV C型有93例,其中C1占69.9%（65/93）,C2占9.7%（9/93）,C5占20.4%（19/93）。扶绥地区以C1,C5亚型为主,B2,C2,B4次之。桂林地区以B2占绝对多数,C1,C5,B4,C2次之。多因素统计分析结果显示:男性,年龄大于50岁,HBV C基因型感染分别是HCC发病的独立危险因素。将全部研究对象按照基因型分组,分别研究肝癌组和非肝癌组的HBV全基因序列,将超过10%的研究对象出现突变的位点定义为突变热点。B型有147个突变热点,C型有249个突变热点,将这些突变位点分为肝癌组和非肝癌组进行研究和分析,B型中有20个位点有统计学差异,C型有17个位点有统计学差异。经过多因素统计分析,在C基因型中发现3组位点突变（T53C,A1762T/G1764A,G1775A）是肝癌发生的独立危险因素,三者联合诊断将有助于提高诊断效能。（3）本课题组发现编号为414,441,533,678的四例标本经NCBI基因分型工具确定为A,C,G重组基因型,在GENEBANK中找到与其相近的HBV全序列进行进化树分析,发现其不属于目前已有的分型;经查看参考文献,发现近年有文献报道类似的HBV全序列,有学者将其命名为基因型I,对本研究的标本进行全序列分析及S区氨基酸分析均支持将其分为新的基因型。时间树分析发现该新的基因型I分化年代约在1200年前。结论:（1）本课题组结合已有文献和引物设计工具,找到了一种能够对HBV全基因进行高保真PCR的方法,该实验方法能够保证检测的高灵敏度和高特异性,具有广泛的应用前景。（2）对来自扶绥和桂林的183例肝癌和非肝癌病人的血清标本的HBV全序列分析,我们研究发现了肝癌高低发区的HBV基因型和基因亚型分布存在显着差异;建立的B和C型参考序列为后续的研究提供了参考;发现的肝癌相关突变位点将为后续的肝癌早诊早治工作提供帮助。（3）经过多序列比对和生物进化分析,本研究发现的四例HBV重组基因型最终确定为基因型I,这是在广西扶绥首次报道该基因型的存在,这完善了该基因型分布的地域资料并为NCBI基因分型工具提供了补充。

石仁芳^[3]（2015）在《乙型肝炎病毒基因型及基因亚型和基本核心启动子区/前C区基因突变与广西肝癌家族聚集的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的：探讨广西肝癌高发区乙型肝炎病毒（HBV）基因型和基因亚型的分布特征及与广西肝癌家族聚集的相关性。方法：按相同的性别、年龄（±5）岁、相同的生活环境配对,收集2007年7月～2012年7月广西肝癌高发区39个肝癌高发家族（实验组）和59个无癌家族（对照组）中的成员各103例,入选者均为HBV感染者并且HBV DNA≥100IU/ml者。应用型特异性引物巢式PCR以及测序的方法进行基因型的检测,应用巢式PCR以及聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术进行基因亚型的检测分析。结果：（1）肝癌高发家族成员的HBV DNA基线水平显着高于无癌家族成员（P=0.008）,HBV DNA≥105copies/ml病毒高载量的成员在肝癌高发家族和无癌家族中分别为35.9%和17.5%,差异有统计学意义（P=0.003）。（2）研究对象共检出HBV基因型有B、C、B/C混合、D四种,分别占30.6%、59.2%、4.4%、2.4%,以B、C基因型为主,其中C型为优势基因型。肝癌高发家族和无癌家族成员在B、C、B/C混合、D四种基因型中所占比例分别为31.1%、63.1%、1.9%、1.9%和30.1%、55.3%、6.8%、2.9%,均无显着差异（P>0.05）。HBeAg阳性率C高于B基因型（P=0.000）,B、C基因型在性别、年龄、民族、HBV DNA水平上均无统计学差异（P>0.05）。在肝癌高发家族中,各级亲属间B、C基因型的分布比较均无统计学差异（P>0.05）。在肝癌高发家族成员中,男性及>≥30岁的C基因型比例明显高于无癌家族成员（P<0.01）,女性、<30岁、民族、HBeAg阳性及HBeAg阴性的C基因型比例在两组中没有显着差异（P>0.05）；B基因型无论从性别、年龄分层、民族还是HBeAg状态上比较两组均无统计学差异（P>0.05）。（3）研究对象检出各基因亚型比例为B2（30.6%）,C1（38.8%）,C2 （20.4%）, B2C1 （2.9%）, B2C2 （1.5%）,未发现其他亚型,B2和C1亚型占绝大多数。肝癌高发家族和无癌家族成员在B2、C1、C2、B2C1、B2C2亚型中所占比例分别为31.1%、41.7%、21.4%、1.0%、1.0%和30.1%、35.9%、19.4%、4.9%、1.9%,两组无显着差异（P>0.05）。HBeAg阳性率C1高于B2亚型（P=0.000）。B2、Cl、C2亚型在性别、年龄、民族、HBV DNA水平上无统计学差异（P>0.05）。在肝癌高发家族中,B2、C1、C2亚型在各级亲属间的比例无统计学差异（P>0.05）。肝癌高发家族成员中,男性及≥30岁的C1亚型比例明显高于无癌家族成员（P<0.05）,女性、<30岁、民族、HBeAg阳性及HBeAg阴性的C1亚型比例在两组中没有统计差异（P>0.05）。B2及C2亚型比例无论从性别、年龄分层、民族还是HBeAg状态上比较两组均无统计学差异（P>0.05）。结论：HBV的复制水平与广西肝癌高发区肝癌家族聚集密切相关。广西肝癌高发区HBV基因型以B、C基因型为主,C型占绝大多数,有少量的B／C混合型和D基因型。B基因型其亚型全部为B2亚型,C基因型有C1和C2亚型,以C1亚型为主,B2和C1亚型占绝大多数。各基因型和亚型的分布在肝癌高发家族和无癌家族中没有明显差异。但男性及≥30岁的C基因型和C1亚型成员可能可以增加患肝癌的风险。目的：探讨广西肝癌高发区乙型肝炎病毒（HBV）基因组基本核心启动子（BCP）区和前C区基因突变对肝癌家族聚集的影响。方法：收集2007年7月～2012年7月广西肝癌高发区39个肝癌高发家族中103例作为试验组,为了尽可能避免混杂因素对研究对象的影响,在相同地区59个无癌家族中选择与试验组年龄、性别、生活环境相匹配的103例作为对照组。将研究对象按民族分布分为壮族组（96例）、瑶族组（52例）和汉族组（58例）。按HBeAg阳性及阴性分为阴性组（140例）和阳性组（66例）。按是否突变分为突变组和未突变组。按亲属分级将肝癌高发家族成员分为一级亲属组（48例）,二级亲属组（32例）,三级及以上亲属组（23例）。所有研究对象均为HBV感染者,并且HBV DNA≥100IU/ml,采用聚合酶链反应（PCR）扩增HBV DNA BCP区／前C区的基因片段并测序分析,检测HBV DNA BCP区和前C区的基因突变情况,并分析BCP区和前C区的基因突变与HBV基因型的关系。结果：（1）肝癌高发家族成员HBV DNA基线水平和HBV DNA≥ 105copies/ml病毒高载量的例数均高于无癌家族成员（P<0.01）。（2）HBV DNA BCP区／前C区基因突变发生频率在前十位的位点为A1762T、G1764A、T1858、A1775G、C1856T、G1896A、T1753C、A1846T、T1803G、G1898A,它们在肝癌高发家族和无癌家族组成员中的检出数分别为74.8%、70.9%、52.4%、46.6%、41.7%、34.0%、22.3%、18.4%、14.6%、6.8%和53.4%、46.6%、42.7%、35.0%、22.3%、15.5%、9.7%、9.7%、7.8%、3.9%。它们有多种突变组合形式,以联合突变为主,A1762T/G1764A双突变在联合突变中最常见。在十个突变位点中,其中BCP区的A1762T、G1764A、T1753C三个位点和前C区的C1856T、G1896A两个位点的突变率在肝癌高发家族成员中均显着高于无癌家族成员（P<0.05）,此外,肝癌高发家族成员组和无癌家族成员组中联合突变及A1762T/G1764A双突变的检出率差异均有统计学意义（P<0.01）。将单因素有统计学差异的HBV DNA≥105copies/ml、联合突变、A1762T/G1764A双突变、A1762T、G1764A、T1753C、C1856T和G1896A等指标进行Logistic多因素分析显示:HBVDNA≥105copies /ml（P=0.000,OR=18.637, 95%CI:6.014-57.757）、A1762T / G1764A双突变（P=0.009,OR=3.388, 95%CI:1.360-8.441）、C1856T （P=0.000, OR=10.270, 95%CI:3.638-28.996）和G1896A （P=0.000, OR=7.597, 95%CI: 2.720-21.213）是肝癌高发的独立危险因素。（3）A1762T、G1764A、C1856T、T1753C、G1896A的突变率在壮族、瑶族、汉族组中没有统计学差异（P>0.05）。A1762T、G1764A、C1856T和G1896A位点HBeAg阴性组的突变率显着高于HBeAg阳性组（P<0.01）,而T1753C在两组中的突变率无统计学差异（P>0.05）。突变组A1762T、G1764A和G1896A的HBV DNA复制水平比未突变组低（P<0.01）,而T1753C和C1856T在两组中的HBV DNA复制水平无统计学意义（P>0.05）。在肝癌高发家族中,一级亲属组A1762T及G1764A的突变率高于二级亲属组（P<0.05）,各级亲属在C1856T、T1753C、G1896A的突变率无统计学差异（P>0.05）。（4）在BCP区突变中,C基因型A1762T、G1764A和T1753C位点的突变率显着高于B基因型（P<0.05）,而A1775G和T1803G突变率在B、C基因型中无统计差异（P>0.05）；在前C区突变中,B基因型的C1856T突变率显着高于C基因型（P=0.000）,而A1846T、T1858C、G1896A、G1898A的突变率在B、C基因型中没有统计学差异（P>0.05）。（5）在B基因型中,BCP区A1762T、G1764A、A1775G、T1753C.T1803G的突变率在两组成员中比较没有统计学意义（P>0.05）,前C区C1856T位点的突变率在肝癌高发家族成员中的比例高于无癌家族成员（P=0.032）,其余位点A1846T, T1858C、G1896A、G1898A的突变率在两组成员中无显着差异（P>0.05）；在C基因型中,BCP区A1762T、G1764A、T 1753C、T1803G的突变率在肝癌高发家族成员中的比例高于无癌家族成员（P<0.05）,A1775G的突变率在两组成员中无显着差异（P>0.05）,前C区A1846T、G1896A的突变率在肝癌高发家族成员中的比例高于无癌家族成员（P<0.05）,C1856T、T1858C、G1898A的突变率在两组成员中无显着差异（P>0.05）。（6）在BCP区突变中,C1亚型A1762T、G1764A和T1753C位点的突变率均高于B2亚型（P<0.05）,C2亚型A1762T和G1764A突变率高于B2亚型（P<0.05）,C1、C2亚型在A1762T、G1764A和T1753C位点的突变率无统计学差异（P>0.05）,B2、C1、C2亚型间A1775 G和T1803G的突变率无统计学差异（P>0.05）。在前C区突变中,C1856T位点的突变率C1、C2、B2依次增加,两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）,C2亚型G1898A位点的突变率高于C1亚型（P<0.05）, B2、C1、C2亚型间A1846T、T1858C和G1896A的突变率无统计学差异（P>0.05）。（7）在B2亚型中,BCP区A1762T、G1764A、A1775G、T1753C、T1803G 5个位点的突变率在两组成员中比较没有统计学意义（P>0.05）,前C区C1856T位点的突变率在肝癌高发家族成员中的比例高于无癌家族成员（P=0.032）,其余位点A1846T、T1858C、G1896A、G1898A的突变率在两组成员中无显着差异（P>0.05）。在C1亚型中,BCP区A1762T、G1764A、T1753C、T1803G的突变率在肝癌高发家族成员中的比例均高于无癌家族成员（P<0.05）,而A1775G的突变率无统计差异（P>0.05）,前C区A1846T、G1896A、 C1856T、T1858C、G1898A5个位点的突变率在在两组成员中无显着差异（P>0.05）。在C2亚型中,BCP区/前C区10个位点的突变率在两组成员中均无显着差异（P>0.05）。结论：（1）广西肝癌高发区HBV DNA水平和HBV DNA BCP区/前C区中的A1762T、G1764 A、T1753C、C1856T和G1896A基因位点的突变均与广西肝癌高发区肝癌家族聚集密切相关。联合突变是主要的突变形式,联合突变可能发挥协同的作用,T1762／A1764双突变可能对肝癌的高发具有重要的预测价值。（2）HBV DNA BCP区/前C区的突变可能使HBeAg减少或消失,而且突变组HBV DNA的水平低于未突变组的HBV DNA的水平,广西肝癌高发区肝癌家族聚集的发生可能不是通过突变提高HBV DNA复制水平的机制而起作用的。（3）C基因型和C1亚型以BCP区突变为主,B基因型和B2亚型以前C区突变为主。C基因型和C1亚型合并BCP区突变以及B基因型和B2亚型合并前C区突变均有可能增加患肝癌的风险。

肖春海^[4]（2013）在《金山区慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布及其与临床特征的相关性》文中研究说明目的：了解上海金山地区HBV感染者基因型的分布及其与临床的关系，并作初步探讨。方法：根据2010年慢性肝炎防治指南把451例HBV DNA阳性患者分为无症状携带者（ASC）、慢性轻中度肝炎（CMHB）、慢性重型肝炎（CSHB）和肝硬化（LC）四组，HBV DNA定量采用聚合酶链式反应-酶联免疫法（PCR-ELISA），基因分型采用微流基因芯片法，e抗原（HBeAg）采用ELISA法，以上结果结合生化指标进行综合分析。结果：B型206例（47.89%），C型201例（44.56%），B/C混合型20例（4.43%），其他未分型14例（3.10%）。B型患者的平均年龄比C型小（P＜0.05）。B型在CSHB中的比例显着低于ASC和CMHB，C型则在CSHB中比例最高（P＜0.01）。ASC中B型患者的HBV DNA水平最低（P＜0.05）。C型患者的丙氨酸转移酶（ALT）和谷氨酰胺转肽酶（GGT）的水平均高于B型（P＜0.01），总胆红素（TBIL）和总胆汁酸（TBA）的水平均也高于B型（P＜0.05）结论：上海市金山地区HBV感染者的基因分型以B型为主， C型次之，少量B/C混合型。B型患者的年龄比C型患者小。C基因型HBV与重肝病的关系比B型密切。

徐航娣^[5]（2013）在《与慢加急性肝衰竭（ACLF）相关的乙型肝炎病毒（HBV）突变位点的研究》文中研究说明乙型病毒性肝炎仍是一个世界性的公共卫生问题,全球范围内乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）的慢性感染人群高达3.5亿以上。HBV相关的慢加急性肝衰竭（acute on chronic liver failure, ACLF）是慢性肝炎患者死亡的重要原因,如果不进行肝移植,其死亡率高达60-80%,每年大约有22600的患者死于肝衰竭。长期以来宿主免疫一直被认为是乙型肝炎加剧的主要原因,但是近年的研究结果表明病毒因素在ACLF的发病中同样起重要作用。HBV是嗜肝病毒家族的一员,其DNA全长约为3200个核苷酸,呈现部分双链环状。HBV基因组包含4个相互重叠的开放性读码框,分别编码HBV表面抗原、核心抗原、聚合酶和多功能的非结构性蛋白X。由于HBV的复制过程包含前基因组RNA的逆转录,其逆转录酶缺乏校正功能,故HBV的突变率显着高于其它的DNA病毒。HBV基因组的突变率可随着病毒的复制不断增加,其中一些突变可能与慢性肝炎的急性加剧相关,可作为ACLF的预警的生物标志物和抗病毒治疗的靶标。近来有研究表明基本核心启动子区的A1762T/G1764A突变与ACLF发病相关,A1846T、G1896A和C1913A/G位点的突变在ACLF患者中发生率显着高于慢性肝炎患者。目前关于HBV突变和ACLF发病的关系主要集中于基本核心启动子区和前核心区,对HBV基因其它部位的研究尚少。ACLF是否有另外的一些HBV突变位点与ACLF发病有关尚不清楚,为此本研究用HBV全基因组测序筛选出与ACLF发病相关的HBV突变,并发现一些新的突变位点,经过扩大样本的验证,以期为ACLF的预警提供依据。方法1HBV全基因测序筛选与ACLF发病可能相关的HBV突变位点1.1Illumina高通量测序。样本来自两组（12例ACLF和12例慢性轻度乙型肝炎（mildchronic hepatitis B, CHB-M））年龄配对、性别和基因型分布无显着差异患者,所有样本HBV的DNA水平均>100,000copies/mL。首先从200μl的血清中提取病毒DNA,分3段重叠扩增HBV全基因组。PCR产物在Genome Analyzer II平台上进行高通量测序,然后处理高通量测序数据。1.2检测上述样本的肝功能指标（ALT, AST, TBIL, PTA）, HBV血清标记物和HBV DNA滴度。1.3分析GenBank数据库的HBV基因突变情况：在GenBank数据库中搜索中国地区报道的ACLF和CHB-M相关的HBV全基因序列共258条（ACLF患者序列143条,CHB-M患者序列115条）,分析其突变。2HBV突变与ACLF发病的关系的验证2.1样本。来自80例无症状携带者（asymptomatic carriers, ASC）、152例CHB-M、102例慢性重度乙型肝炎患者（severe chronic hepatitis B, CHB-S）和104例ACLF患者,共438例。2.2从200μ1血清中提取HBV DNA,半巢式PCR扩增HBV基因组目标序列,PCR产物行常规Sanger测序。2.3检测上述样本肝功能指标,HBV血清标记物和HBV DNA商度。结果1Illumina高通量测序筛选结果1.1作为质量控制的质粒测序结果显示：所测得的读长36bpDNA序列的不同位置发生测序错误的频率不一致,在20位碱基之后其碱基替换率呈现上升趋势,当位于序列的第30-36个碱基时,测序的错误率显着上升。为了降低错配率,我们截取每个短片段序列前面的20bp进行质粒全长的拼接。质粒序列的总体误差率为0.49%,其中每一百个核苷酸中错配碱基读取频率>4%的核苷酸平均为2.4个,将4%作为区分真实突变和技术误差的界线。1.2T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、A2159G、A2189C和G2345A为ACLF患者常见的突变位点,在12例ACLF患者中发生上述突变的病例数分别为10例、9例、10例、10例、8例、5例、10例、11例和7例。1.3T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、A2159G、A2189C和G2345A这9个位点的突变频率在ACLF患者中显着高于慢性轻度肝炎患者（P<0.05或P<0.01）。1.4基本核心启动子区（basal core promoter, BCP）（A1762T/G1764A）突变在12例ACLF和12例CHB-M患者中的发生率均为6例。其突变频率在ACLF患者和慢性轻度肝炎患者未见显着差异。1.5从Genbank数据库下载258条HBV全基因序列,分析上述突变的分布情况发现：T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A在ACLF中的发生率均显着高于CHB-M, G2095A、G2345A和A1762T在ACLF组和CHB-M组间未见差异。分别对HBV B基因型和C基因型患者的突变进行分析发现,在B基因型的患者中,T216C、G285A、A1846T、G1896A和C1913A/G这5个位点突变在ACLF组中显着高于CHB-M组；C基因型患者中,A1846T、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A这5个突变在ACLF组中显着高于CHB-M组。A1762T/G1764A双联突变在B基因型和C基因型的ACLF患者中均未见显着升高。2HBV点突变与ACLF发病的关系的验证结果2.1ACLF组的B基因型比率显着高于其余三组慢性乙型肝炎患者。2.2T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C这7个突变的发生率在ACLF组显着高于ASC、CHB-M和CHB-S组（P<0.05或P<0.01）。2.3T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G这5个位点在HBV基因型B的感染者中显着高于HBV基因型C感染者。2.4对ASC、CHB-M、CHB-S和ACLF患者的B基因型和C基因型毒株的突变进行比较发现：以ASCs为对照组,B基因型毒株感染者中,T216C、G285A、G1896A、 C1913A/G突变在CHB-S和ACLF组中均显着升高；C基因型毒株感染者中,A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C突变在ACLF组和CHB-S组中显着升高。以CHB-M为对照组,HBV B基因型毒株感染者中,T216C、G285A、G1896A、 C1913A/G和A2159G/C在ACLF患者中显着升高；C基因型毒株感染者中,G285A、A1846T/G、G1896A和C1913A/G在ACLF患者中显着升高。当以CHB-S为对照时,基因型B毒株感染者中,A2159G/C和A2189T/C在ACLF组中显着升高。2.5与非ACLF组比较,B基因型毒株的T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、 C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C与ACLF密切相关,而C基因型毒株的G285A、 A1846T/G、G1896A、C1913A/G和A2159G/C与ACLF密切相关。2.6多因素分析显示T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C是ACLF发病的独立危险因素。2.7T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C的两个或以上的联合突变与ACLF发生密切相关。2.8“含C216的联合突变”,“含A/G1913的联合突变”,“含G/C2159的联合突变”对ACLF诊断具有较高的特异性。结论1B基因型病毒感染的慢性乙型肝炎患者更容易发展为ACLF。2T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C突变为ACLF发生的独立危险因素。其中T216C和A2159G/C系本研究新发现的ACLF发病的独立危险因素（T216C位点已申请国际专利,国际申请号PCT/CN2012/071108）,提示了HBV S区和核心区突变在ACLF发病过程中可能起着重要作用。3HBV联合突变的分析发现,联合突变在ACLF发病中发挥更为重要的作用。“含C216的联合突变”,“含A/G1913的联合突变”,“含G/C2159的联合突变”对ACLF的诊断特异性较高。4上述病毒突变可作为预测乙型肝炎加剧的分子标志物,为阻止ACLF发病和改善HBV感染者的预后提供依据。

陈莉^[6]（2012）在《慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞中微小RNA的表达分析及其功能研究》文中认为研究背景：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染所致的慢加急性肝衰竭（HBV-related acute-on-chronic liver failure, ACLF）是临床常见的危重症,病死率较高,对人类危害严重。关于ACLF的发病机制,目前认为主要包括病毒复制和宿主免疫反应及其相互作用两个方面,但是HBV无直接致细胞病变效应,其本身并不直接对感染细胞产生破坏效应,由此人们认为ACLF发病机制的主要环节为病毒在一定条件下所诱发的宿主免疫应答异常。微小RNA（microRNA, miRNA）是近年来新发现的一类非编码小分子RNA。miRNA表达丰富,作用广泛,胚胎发育、细胞增殖分化均受miRNA的调控,同时miRNA也参与机体免疫反应的调节。miRNA可以通过Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）与细胞因子信号途径对机体固有免疫进行调控,也可通过干扰抗原呈递及T细胞受体（T cell receptors, TCRs）途径对机体适应性免疫进行调控。作为机体免疫应答的始动者,miRNA在HBV感染发病机制中的作用也日益得到重视。多项研究已经证实,多个miRNA参与控制HBV复制、HBV相关肝脏疾病的进展,尤其是肝硬化和肝细胞癌的进展；也有研究发现对于接受干扰素（interferon,IFN）治疗的慢性HBV或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染者,可利用患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）中miRNA表达水平的变化来协助判断疾病的临床转归。然而关于miRNA与ACLF的关系,目前知之甚少。研究目的：（1）了解肝脏炎症程度不同的慢性HBV感染者PBMC中miRNA的表达谱。（2）确认慢性HBV感染者PBMC中是否存在与肝脏炎症程度相关的特异性miRNA。（3）对特异性miRNA可能的靶基因进行预测,了解慢性HBV感染者PBMC中特异性miRNA靶基因的表达水平。（4）对miR-197、miR-328的靶基因进行确认,初步探讨慢性HBV感染者体内]miR-197、miR-328的作用途径。研究方法：（1）应用miRNA基因芯片技术对HBV相关的4例无症状携带者（asymptomatic carrier, ASC）及4例ACLF患者PBMC中miRNA的表达谱进行检测,对差异性表达的miRNA进行筛选。（2）采用TargetScan5.2,DIANA-microT3.0及Pictar生物软件对miR-197、 miR-328的靶基因进行预测。（3）采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction, real-time PCR）对HBV相关的70例ASC,107例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者,76例ACLF患者,及51例健康对照者PBMC中miR-150、miR-197、 miR-223、miR-328、miR-30a、miR-574-3p的表达水平进行验证分析；同时对PBMC中miR-197的靶基因白细胞介素18（interleukin18,IL18）、肿瘤坏死因子配体超家族10（tumor necrosis factor ligand superfamily member10, TNFSF10）, miR-328的靶基因肿瘤坏死因子受体超家族9（tumor necrosis factor receptor superfamily member9, TNFRSF9）的mRNA表达水平进行检测。（4）采用基因瞬时转染的方法,分别将miR-197mimic和inhibitor; miR-328mimic和inhibitor转染至单核细胞系THP-1细胞中,采用CCK-8法检测各转染组及对照组细胞增殖率；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测各转染组及对照组细胞培养上清中IL18表达水平;应用real-time PCR检测各转染组及对照组miR-328, miR-197与TNFRSF9、TNFSF10、IL18的mRNA表达水平；western blot检测各转染组及对照组TNFRSF9、TNFSF10的蛋白表达水平。研究结果：（1）miRNA基因芯片检测显示慢性HBV感染所致的ASC与ACLF患者PBMC中共有17个miRNAs出现差异性表达,与ASC患者相比较,肝脏炎症活动明显的ACLF患者PBMC中hsa-miR-1246、hsa-miR-30a、hsa-miR-1305、hsa-miR-193a-3p和hsa-miR-196b共5个miRNAs表达上调,同时hsa-miR-223、 hsa-miR-574-3p、hsa-miR-150等12个miRNAs表达下调。（2）对肝脏炎症程度不同的慢性HBV感染者PBMC中miRNA的表达水平扩大样本进行验证分析发现,miR-197、miR-574-3p及miR-30a的PCR验证分析结果与miRNA基因芯片分析结果一致,而miR-150、miR-223与miR-328的PCR验证分析结果与miRNA基因芯片分析结果存在一定的差异。验证分析显示随着慢性HBV感染者肝脏炎症程度的逐渐加重,miR-197的表达水平逐渐下调,而miR-328的表达水平逐渐上调。同时,正常对照组PBMC中miR-574-3p、miR-30a的表达水平较慢性HBV感染者明显升高;而与正常对照组相比较,ACLF患者PBMC中miR-150表达上调；但是各组间miR-223的表达水平无明显差异。（3）TargetScan5.2等靶基因预测软件分析发现,miR-197可与TNFRSF9、TNFSF10、IL18的3’非编码区（untranslated region,UTR）互补配对,miR-328可与TNFRSF9的3’UTR互补配对。肝脏炎症程度不同的慢性HBV感染者PBMC中,TNFRSF9的表达水平随肝脏炎症程度的加重而降低,与1miR-328的表达水平趋势相反；TNFSF10、IL18的表达水平随肝脏炎症程度的加重而增加,与miR-197的表达水平趋势相反。（4）与空白转染组及mimic control （miR-C）转染组,inhibitor control （anti-miR-C）转染组相比较,miR-197mimic转染组中IL18、TNFRSF9、TNFSF10的mRNA及蛋白表达水平均降低,有显着性差异；miR-197inhibitor转染组中IL18的mRNA及蛋白表达水平均增加,有显着性差异；虽然miR-197inhibitor转染组中TNFRSF9的mRNA表达水平明显增加,但是其蛋白表达水平并没有显着增加；同时,miR-197inhibitor转染组中TNFSF10的1mRNA表达水平明显增加,但是其蛋白表达水平并没有显着增加；与空白转染组及miR-C转染组,anti-miR-C转染组相比较,miR-328mimic转染组中TNFRSF9的mRNA及蛋白表达水平均降低,有显着性差异；miR-328inhibitor转染组中TNFRSF9的mRNA及蛋白表达水平均增加,有显着性差异。结论：（1）miRNA基因芯片检测技术的重复性欠佳,miRNA表达谱的确定需结合real-time PCR检测技术综合分析。（2）慢性HBV感染者PBMC中存在与肝脏炎症程度相关的特异性miRNA,这些miRNA（尤其是1miR-197,miR-328）参与HBV的发病,可能是慢性HBV相关肝脏炎症程度的潜在生物学标志之一。（3）慢性HBV感染者PBMC中IL18、TNFRSF9、TNFSF10的表达水平与肝脏炎症程度存在一定的联系。（4）miR-197可对IL18的mRNA及蛋白表达水平产生负性调节作用：miR-328可对TNFRSF9的mRNA及蛋白表达水平产生负性调节作用。（5）]miR-197可对TNFRSF9的mRNA表达水平产生负性调节作用。（6）1miR-197可对TNFSF10的mRNA表达水平产生负性调节作用。（7）可能miR-197通过下调IL18的表达,miR-328通过下调TNFRSF9的表达参与慢性HBV感染后的发病。

郝燕^[7]（2009）在《HBV前C/BCP区基因突变及血清sHLA-Ⅰ水平与慢性HBV感染的相关性》文中指出研究背景:乙型病毒性肝炎是常见的感染性疾病之一,在世界各地均有不同程度的流行,目前世界约有3.5亿人为慢性乙型肝炎（CHB）。慢性乙型肝炎是一种潜在的进展性致死性疾病,据世界卫生组织资料显示,乙肝已成为人类第九大死因。我国是乙型病毒性肝炎的流行大国,其中HBV携带者约占人口的10%,即1.2亿人,约占世界乙肝病毒携带者的1/3,而携带者中又有约15%～40%的感染者发展为不同类型的肝病,如活动性肝炎、肝硬化、甚至原发性肝癌,而我国乙肝的发病率还呈持续上升趋势。机体感染HBV后的临床结局,多数人认为是由病毒、肝细胞和宿主免疫系统相互作用决定的。HBV基因突变是影响病毒生物学特性的基本因素之一,HBV基因突变有可能改变病毒的复制能力和致病性、改变抗原表位而影响免疫应答,进而可能造成严重的肝细胞损伤等。研究表明前C/BCP（基本核心启动子）区突变可影响HBeAg的表达/分泌,认为分泌型HBeAg与HBcAg有共同的抗原表位,可以减缓细胞毒T淋巴细胞（ CTL）对表达HBcAg的肝细胞的攻击,故而该区突变不利于免疫耐受,与慢性肝炎的病情加重有关。但对上述观点也存在争议。人白细胞抗原Ⅰ类分子（Human leucocyte antigenⅠ,HLA-Ⅰ）是由人类主要组织相容性复合体编码的一类糖蛋白,广泛存在于有核细胞表面。HLA-Ⅰ抗原在免疫系统中起关键作用,是参与机体特异性免疫反应的主要分子。正常人肝实质细胞HLA-Ⅰ表达甚微或基本不表达,当HBV感染后,肝细胞上HLA-Ⅰ表达异常。血清可溶性HLA-Ⅰ分子（soluble HLA-Ⅰ,sHLA-Ⅰ）与组织HLA-Ⅰ分子有共同的多态特异性决定簇。sHLA-Ⅰ在正常人血清中的含量很低且相对恒定,HBV感染后,血清sHLA-Ⅰ水平明显升高。本文就HBV前C/BCP区突变和机体sHLA-Ⅰ水平解析他们与慢性HBV感染病情发展的关系;并研究他们二者的相关性。研究对象:本实验以在汾阳医院就诊的吕梁地区慢性HBV感染患者为研究对象。目的:（1）比较三种HBV DNA提取方法对PCR产物量的影响。（2）探讨HBV前C/BCP基因突变和血清sHLA-Ⅰ与慢性HBV感染的发生、发展及转归的关系,并从机体免疫角度研究HBV基因突变对sHLA-Ⅰ水平的影响。方法:（1）采集山西医科大学附属汾阳医院就诊的HBsAg阳性的血清133例和健康体检者的血清20例,均于清晨空腹静脉采集,收集临床资料。（2）模板制备:分别用碱裂解法、直接煮沸法、裂解液煮沸法抽提患者血清中HBV DNA,比较所得DNA条带的阳性率、光密度值,寻找合适的模板提取方法。（3）采用巢式PCR法扩增,HBV前C/BCP区基因组不同区段分别设计两套引物,增加实验的灵敏度。（4）采用限制性片断长度多态性（RFLP）分析方法,对PCR产物进行酶切分析,确定HBV的突变型、野生型和混合型。为证实该方法的准确性,随机挑取一些PCR产物测序。（5）采用ELISA技术测定健康体检者和HBV感染者血清sHLA-Ⅰ水平。（6）统计学处理采用SPSS 13.0版统计软件。结果:（1）在3种不同的DNA抽提方法中,碱裂解法所得DNA条带亮度与条带面积均较好,阳性率高,模板量多,与其它组比有显着差异（P<0.01）。（2）本地区HBV感染人群BCP T1762A1764双突变率58.2%,PreCA1896突变率15.2%,两组间突变率比较有显着差异（P<0.001）。（3）HBeAg的表达与BCP双突变有显着相关性（P<0.01）,与前C区A1896突变无明显相关性（P>0.05）。前C区A1896突变或BCP双突变从总体上与病情的发展有显着关系（P<0.05;P<0.01）,但在慢性肝炎轻度、慢性肝炎中度和肝硬化组之间无显着差异（P>0.05）。（4）血清sHLA-Ⅰ水平在慢性肝炎患者的含量明显高于正常对照（P<0.01）;并且随慢性肝炎病变加重有逐渐增加的趋势,但无统计学意义（P>0.05）;无症状携带者组其含量也高于正常对照组,但差异无统计学意义（P>0.05）。（5）血清sHLA-Ⅰ表达与前C或BCP突变有关,突变组sHLA-Ⅰ表达明显增加,与正常组和未突变组相比有显着意义（P<0.05）。（6）将入选标本分为HBeAg（+）组和HBeAg（-）组,血清sHLA-Ⅰ水平在e抗原阴性患者中表达较低,但两组之间比较无显着差异（P>0.05）。结论:（1）碱裂解法在血清HBV DNA抽提中的效果最好。（2）慢性乙肝患者更容易发生BCP双突变,前C/BCP突变与乙肝病情发展有关。BCP区变异可作为携带者随访的重要指标, BCP区一旦有双突变发生,将预示病情会有发展。（3）前C/BCP区突变影响患者的免疫功能。肝脏细胞的损害会导致sHLA-Ⅰ的释放,sHLA-Ⅰ的水平与乙型肝炎的发展有关。

陈建,许建民,王敏,刘福国^[8]（2008）在《基因芯片检测乙醇对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变的研究》文中提出目的:研究乙醇对HBV DNA多位点基因变异的影响,为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法:选取85例慢性乙肝患者为研究对象,分为嗜酒组和非嗜酒组,采用DNA芯片技术,检测HBV DNA前C区G1896A及A1814C位点、BCP区A1762T及G1764A位点、P区C528A及T552C位点的基因突变。结果:嗜酒组在BCP区A1762T及G1764A位点的突变频率明显高于非嗜酒组（均P<0.05）。在前C区G1896A及A1814C位点,P区C528A及T552C位点突变频率无明显差异（均P>0.05）。结论:乙醇导致乙肝病毒BCP区A1762T及G1764A位点发生基因突变,增强HBV基因的表达和复制,加重慢性乙型肝炎患者的病情。

许建民^[9]（2007）在《酒精对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变影响研究》文中研究说明背景：乙型肝炎病毒感染和长期饮酒是全世界重要的公共卫生问题，嗜酒明显影响乙型肝炎的预后，使乙型肝炎易于重症化、慢性化，并且肝癌的发生率明显升高。临床流行病学研究显示，长期饮酒者乙肝病毒血清标志物阳性率明显高于正常人群，许多研究者通过HBV转基因小鼠的酒精干预实验探讨了酒精对乙肝病毒复制和基因表达的影响，证实酒精对乙肝病毒复制和基因表达有促进作用，从而对嗜酒者高乙肝病毒标志物阳性率现象作出部分解释。同时探讨了乙肝病毒感染对酒精性肝病易感性的影响，证实乙肝病毒感染是酒精性肝病的正性危险因素，但目前关于酒精对乙肝病毒变异影响的研究较少。目的：本研究采用基因芯片技术检测嗜酒组和非嗜酒组慢性乙肝患者的血清标本，观察HBV DNA多位点基因变异，以探讨酒精对HBV DNA基因变异的影响，为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法：选取45例慢性乙型肝炎患者为研究对象，其中饮酒史超过10年，酒精摄入量超过80g／d的慢性乙肝患者为嗜酒组，共20例，无饮酒史的慢性乙肝患者为非嗜酒组，共25例。采用基因芯片技术，同时检测HBV DNA前C区1896及1814位点、BCP区1762及1764位点、P区528及552位点的基因变异。结果：嗜酒组与非嗜酒组在性别、年龄、基因型、输血史、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清HBeAg（+／-）、临床诊断比较差异均无统计学意义（p＞0.05）。嗜酒组在BCP区1762、1764位点的突变频率明显高于非嗜酒组（p均＜0.05），在前C区1896及1814位点，P区528及552位点突变频率无明显差异（p均＞0.05）。结论：酒精导致乙肝病毒BCP区1762及1764位点发生基因突变，BCP区基因变异可促进HBV在人体内的复制表达，使慢性肝炎患者病情加重并可能发生肝硬化、肝癌。酒精引起HBV BCP区基因突变是酒精促进HBV病毒复制和基因表达增强的机制之一。本研究未发现HBV前C区1896及1814位点、P区528位点及552位点突变频率在嗜酒组与非嗜酒组具有统计学差异，可能系酒精对上述位点突变无影响或病例数较少有关。

胡传芳,李瀚旻,肖玲,晏雪生,高翔^[10]（2007）在《慢性乙型肝炎肝肾阴虚证HBV基因突变点的分布规律》文中研究表明目的:研究慢性乙型肝炎肝肾阴虚证HBV基因突变点的分布规律。方法:基因芯片方法检测慢性乙型肝炎肝肾阴虚证患者HBV前C区基因变异。结果:慢性乙型肝炎肝肾阴虚证患者HBV前C区变异可见于多个位点,1896位点变异率为31.37%,1764位点变异率为25.49%,1762位点变异率为24.51%,1899位点变异率为12.75%,1862位点变异率为5.88%。1762、1764、1896和1899点的突变株信号值高于野生株信号值;1862点野生株信号值高于突变株信号值,差异有显着性意义（P<0.01）。结论:揭示慢性乙型肝炎肝肾阴虚证患者HBV基因突变点的分布规律,有利于进一步探讨中医药抑制HBV突变株复制的方法。

二、基因芯片检测肝组织中乙型肝炎病毒前C区/BCP区基因突变的研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、基因芯片检测肝组织中乙型肝炎病毒前C区/BCP区基因突变的研究（论文提纲范文）

（1）乙肝相关肝纤维化宿主表达谱及病毒谱研究（论文提纲范文）

（2）广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究（论文提纲范文）

（3）乙型肝炎病毒基因型及基因亚型和基本核心启动子区/前C区基因突变与广西肝癌家族聚集的相关性研究（论文提纲范文）

（4）金山区慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布及其与临床特征的相关性（论文提纲范文）

（5）与慢加急性肝衰竭（ACLF）相关的乙型肝炎病毒（HBV）突变位点的研究（论文提纲范文）

（6）慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞中微小RNA的表达分析及其功能研究（论文提纲范文）

（7）HBV前C/BCP区基因突变及血清sHLA-Ⅰ水平与慢性HBV感染的相关性（论文提纲范文）

（8）基因芯片检测乙醇对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变的研究（论文提纲范文）

（9）酒精对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变影响研究（论文提纲范文）

（10）慢性乙型肝炎肝肾阴虚证HBV基因突变点的分布规律（论文提纲范文）

四、基因芯片检测肝组织中乙型肝炎病毒前C区/BCP区基因突变的研究（论文参考文献）

• [1]乙肝相关肝纤维化宿主表达谱及病毒谱研究[D]. 王铭杰. 上海交通大学, 2018
• [2]广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究[D]. 何雨. 广西医科大学, 2016(11)
• [3]乙型肝炎病毒基因型及基因亚型和基本核心启动子区/前C区基因突变与广西肝癌家族聚集的相关性研究[D]. 石仁芳. 广西医科大学, 2015(11)
• [4]金山区慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布及其与临床特征的相关性[D]. 肖春海. 苏州大学, 2013(01)
• [5]与慢加急性肝衰竭（ACLF）相关的乙型肝炎病毒（HBV）突变位点的研究[D]. 徐航娣. 浙江大学, 2013(03)
• [6]慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞中微小RNA的表达分析及其功能研究[D]. 陈莉. 中南大学, 2012(03)
• [7]HBV前C/BCP区基因突变及血清sHLA-Ⅰ水平与慢性HBV感染的相关性[D]. 郝燕. 山西医科大学, 2009(03)
• [8]基因芯片检测乙醇对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变的研究[J]. 陈建,许建民,王敏,刘福国. 中国病理生理杂志, 2008(03)
• [9]酒精对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变影响研究[D]. 许建民. 山东大学, 2007(03)
• [10]慢性乙型肝炎肝肾阴虚证HBV基因突变点的分布规律[J]. 胡传芳,李瀚旻,肖玲,晏雪生,高翔. 中西医结合肝病杂志, 2007(02)

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