一、细胞移植与脊髓再生（论文文献综述）
李芳[1]（2021）在《ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是指由于外界直接或间接因素导致的中枢神经系统疾病,受累神经细胞的结构和功能受损,最终导致损伤部位以下运动功能和感觉的缺失,严重影响患者生活质量,降低患者生命预期,给家庭和社会带来沉重的负担。由于神经细胞的再生能力较低,损伤后微环境改变等不良因素,脊髓损伤治疗预后较差,使脊髓损伤的治疗成为了世界性的医学难题。传统的脊髓损伤治疗方法手术减压、药物对症治疗及术后康复治疗,不能促进神经细胞和轴突的再生,没有从根本上恢复神经功能,因此需要联用新的有效治疗方法共同作用。随着近几年分子生物学和细胞生物学研究的巨大进步,细胞移植作为脊髓损伤的一种新型治疗手段受到了广泛关注和研究,间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）由于其低免疫原性,体外容易培养,能分泌大量生物活性分子,成为研究的热点。体内外实验表明,脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs）移植在治疗脊髓损伤中具有良好的应用前景。在脊髓损伤动物模型中,与骨髓间充质干细胞相比,脂肪来源的间充质干细胞体内移植到脊髓损伤部位时具有更高的存活率。也有研究表明,ADSCs可以通过分泌细胞因子和生长因子,促进轴突再生,减少炎症细胞的浸润和空洞形成,从而促进脊髓损伤的恢复。尽管已有研究证明ADSCs在治疗脊髓损伤中的作用,但ADSCs促进脊髓损伤修复的具体机制尚不完全清楚。Torres-Espin等研究发现,大鼠脊髓损伤后MSCs体内移植可促进前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸 5-双加氧酶 2（procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2,PLOD2）表达,PLOD2可能通过促进胶原纤维的交联和细胞外基质重塑起到组织修复的作用。越来越多的研究表明,在肿瘤的侵袭和迁移过程中,HIF-1α、TGF-β1 和 microRNA-26a/b 等分子通过 PI3K-AKT、TGF-β/Smad 信号通路,调控PLOD2的表达。但是PLOD2在治疗脊髓损伤中发挥的作用,目前还未见文献报道。ADSCs可以通过分泌多种细胞因子促进脊髓损伤的修复,TGF-β1作为ADSCs分泌的重要因子,具有抗炎、修复和神经保护功能。ADSCs能否通过分泌TGF-β1,上调PLOD2的表达,进而促进脊髓损伤的恢复,成为本研究的重点。本研究分为三个部分,第一部分:ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用,第二部分:ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复,第三部分:ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复。第一部分ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用研究目的1.从人脂肪组织中分离培养间充质干细胞,通过成脂成骨分化能力和细胞表面标志的表达对其进行鉴定。2.培养PC12细胞和大鼠皮质神经元原代细胞,体外建立神经细胞机械损伤模型。3.体外建立ADSCs和损伤神经细胞共培养体系,通过相关检测,明确ADSCs对损伤神经细胞的修复作用,以及PLOD2在ADSCs治疗神经损伤中的表达变化。研究方法1.ADSCs的分离培养及鉴定间充质干细胞从健康志愿者脂肪组织培养获得。P3-P5代的细胞用于后续实验。ADSCs经成脂成骨诱导分化后,Oil Red O染色,观察成脂诱导分化情况,Alizarin Red S和Von Kossa染色,观察成骨诱导分化情况。流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况。2.神经细胞机械损伤模型制备（mechanical injury,MI）150ng/mLNGF诱导PC12细胞向神经细胞分化,MAP2染色鉴定。取Wistar新生鼠大脑皮质,分离培养原代神经细胞,NeuN染色鉴定。使用10ul枪尖于6孔板内“井”字划割,造成神经元机械性损伤。3.ADSCs共培养对损伤神经细胞的影响ADSCs接种Transwell上室,每孔接种3×105细胞,接种24h后与机械损伤的PC12细胞或大鼠皮质神经元共培养3天,EdU实验检测ADSCs对神经细胞的促增殖情况。微板试剂盒检测细胞培养上清中LDH表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2和神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达。研究结果1.ADSCs的分离培养及鉴定镜下观察从脂肪组织中分离出的细胞,呈典型的成纤维样梭形细胞;经成脂和成骨诱导培养基诱导分化后,Oil Red O染色成阳性,表明ADSCs具有成脂分化的能力,Alizarin Red S和Von Kossa染色成阳性,表明ADSCs具有成骨分化的能力;流式细胞仪检测其表面抗原的表达,结果显示ADSCs高表达CD13、CD44、CD73、CD90 和 CD105,低表达 HLA-DR、CD34 和 CD45。2.神经细胞的培养及鉴定PC12细胞经150ng/mL NGF诱导分化5-7天后,有神经突起长出,细胞形态类似于神经细胞,MAP2染色结果阳性。大鼠皮质神经元体外培养6-8天,细胞体较小,从胞体延伸出轴突和树突,轴突细长,NeuN染色结果阳性。3.ADSCs共培养促进损伤神经细胞的修复ADSCs与损伤神经细胞共培养三天,结果显示神经细胞伤口愈合率显着升高;EdU结果显示,ADSCs共培养能促进大鼠皮质神经元的增殖;LDH检测结果显示,ADSCs共培养可以抑制神经细胞LDH的释放;qRT-PCR和western blot结果显示,ADSCs共培养可以促进PLOD2和神经细胞相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。研究结论1.我们成功地从脂肪组织中分离出间充质干细胞。2.ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞伤口愈合率,促进大鼠皮质神经元的增殖。ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。提示ADSCs可能通过提高神经元的存活率,促进神经细胞生长和轴突再生,减少胶质瘢痕的形成而促进损伤神经细胞的恢复。3.神经细胞机械损伤以后,PLOD2表达降低,ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞PLOD2的表达。第二部分ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复研究目的1.通过米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测抑制PLOD2表达对ADSCs神经修复作用的影响。2.ELISA检测共培养体系中TGF-β1的表达情况,同时使用外源性TGF-β1作用于损伤的神经细胞,明确TGF-β1的神经修复作用。3.SB431542 抑制 TGF-β1/Smad 信号通路,LY294002 抑制 PI3K/AKT 信号通路,明确PLOD2具体的信号调控通路。研究方法1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测PLOD2下调对ADSCs神经修复作用的影响不同浓度米诺地尔（0.25mM,0.5mM,1.0mM）作用于PC12细胞,筛选米诺地尔抑制PLOD2表达的最佳作用浓度。在ADSCs与神经细胞共培养体系中加入米诺地尔,免疫细胞化学技术、EdU实验和LDH释放实验检测抑制PLOD2基因表达对ADSCs神经保护作用的影响,qRT-PCR和western blot检测PLOD2以及神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达变化。2.TGF-β1对受损神经细胞的修复作用ELISA检测损伤神经细胞及ADSCs共培养上清中TGF-β1的表达。外源性TGF-β1（浓度分别为 0.31,0.62,1.25,2.5,5.0,10,20 ng/mL）作用于划痕损伤的 PC12 细胞,qRT-PCR 和 western blot 检测 PLOD2、P-AKT、AKT、P-Smad3和Smad2/3的表达变化。3.抑制TGF-β1/Smad、PI3K/AKT信号通路,对PLOD2表达的调控ADSCs与损伤神经细胞共培养体系中加入SB431542,抑制TGF-β1/Smad信号通路。PC12细胞经NGF诱导分化后,加入LY294002抑制PI3K/AKT信号通路。ELISA检测上清中TGF-β1的表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2、TGF-β1、P-Smad3、Smad2/3、P-AKT、AKT 和神经相关分子 MAP2、NSE、GAP43、GFAP的表达变化。研究结果1.抑制PLOD2的基因表达,体外实验结果显示ADSCs的神经细胞修复作用减弱根据qRT-PCR及western blot结果,我们最终确定米诺地尔实验浓度为0.5mM。在共培养体系中,MAP2的免疫荧光染色结果显示,抑制PLOD2表达,ADSCs的神经修复作用减弱。EdU结果显示,米诺地尔可以降低ADSCs对大鼠皮质神经元增殖的刺激作用。LDH释放实验表明,米诺地尔可增加共培养体系中LDH含量。qRT-PCR和western blot实验进一步证实,米诺地尔可以抑制神经细胞PLOD2、MAP2、NSE和GAP43的表达,促进GFAP表达。2.TGF-β1在修复神经细胞损伤中的作用ELISA检测结果显示,ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞培养上清中TGF-β1含量。qRT-PCR和western blot检测结果显示,外源性TGF-β1作用于划痕损伤的PC12细胞,低浓度TGF-β1（0.31-2.5 ng/mL）促进PLOD2的表达,当TGF-β1浓度达到5 ng/mL时这一作用减弱,当TGF-β1浓度为10和20 ng/mL时则抑制PLOD2表达。Western blot检测结果显示,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.TGF-β1/Smad信号通路在ADSCs促进损伤神经细胞修复中的作用共培养体系中加入SB431542可以降低共培养上清中TGF-β1的含量,抑制神经细胞TGF-β1、P-Smad3和PLOD2的表达,降低神经相关分子MAP2、NSE、GAP43的表达,提高GFAP表达水平。加入LY294002抑制P-AKT表达后,PLOD2表达下降。上述结果进一步证实了 AKT信号通路可以调控PLOD2的表达,但是当低浓度TGF-β1存在时,PLOD2主要受TGF-β1/Smad信号通路调控。研究结论1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2基因表达后,ADSCs的神经细胞修复作用减弱,提示PLOD2在ADSCs修复神经细胞损伤中发挥重要作用。2.ADSCs共培养可以增加细胞培养上清中TGF-β1的含量,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3和PLOD2的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.体外实验显示SB431542抑制TGF-β1/Smad信号通路后,降低ADSCs神经修复作用及PLOD2表达。ADSCs通过分泌低剂量TGF-β1,激活Smad3信号通路促进PLOD2表达,发挥神经修复作用。第三部分ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复研究目的1.建立脊髓损伤动物模型,体内实验验证ADSCs输注对脊髓损伤动物模型的治疗作用。2.大鼠体内输注SB431542,验证ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路促进脊髓损伤功能恢复的作用。研究方法1.大鼠脊髓损伤模型制备大鼠腹腔麻醉后,以大鼠T8-T10棘突为中心取后正中切口切开,剥离并咬除棘突、椎板暴露脊髓,血管夹夹击脊髓30s,建立脊髓损伤模型。2.实验分组脊髓损伤模型制备成功3天后,大鼠分别给予PBS、ADSCs和SB431542原位注射。实验具体分为5组:假手术组,PBS对照组,ADSCs治疗组,ADSCs治疗+SB431542 组,SB431542 组。3.ADSCs输注对脊髓损伤的治疗作用在治疗后 3、7、14、21、28 天根据 BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan）量化评分标准对所有动物运动功能进行评定。大鼠心脏取血,离心收集血清,ELISA检测血清中TGF-β1的含量。移植后3天随机取各组动物,取出脊髓组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡和冰冻切片,进行HE染色,尼氏染色,免疫组织化学染色检测脊髓组织中MAP2的表达。取出治疗3天后的脊髓组织,提取总RNA和总蛋白。qRT-PCR和western blot检测神经细胞相关分子（MAP2、NSE、GAP43和 GFAP）和 PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和 Smad2/3 的表达变化。研究结果1.ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以促进大鼠运动功能的恢复,减少脊髓病变体积及空泡的形成,增加尼氏小体数量,促进脊髓神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43表达,抑制GFAP表达。2.ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以显着提高大鼠血清中TGF-β1的含量,促进脊髓神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3的基因和蛋白表达。抑制剂SB431542输注明显抑制ADSCs对大鼠运动功能的恢复作用,脊髓组织结构损伤加重,神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和神经相关分子（MAP2、NSE、GAP43）表达降低,GFAP表达增加,ADSCs的神经修复作用减弱。研究结论1.脊髓损伤动物实验研究结果显示,ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,同时也能促进神经元的存活,促进损伤结构的恢复。2.体内实验表明,ADSCs的治疗作用会被SB431542抑制。体内实验进一步证实ADSCs通过激活TGF-β1/Smad3信号通路促进神经细胞PLOD2表达,从而促进脊髓损伤的修复。
董万亮[2]（2020）在《骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究》文中研究表明脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是脊髓由于外力撞击、压迫等直接或间接因素造成的一种严重的神经损伤性疾病。SCI常在脊髓原发性损伤的基础上,继发缺血、水肿、缺氧、炎症反应、钙超载等病理过程,导致运动功能丧失和SCI后相应节段下的感觉异常[1]。运动功能的丧失以及感觉异常,严重的影响了患者的生存质量,并给患者的家庭带来了沉重的经济负担。目前该病发病率呈逐年上升的趋势[2],且针对脊髓损伤尚无十分有效的治疗方法,大部分治疗以对症治疗为主,因此临床上急需可以改善脊髓损伤后病情的发展和预后的新的治疗方法。近年来,干细胞的生物治疗逐渐引起人们的关注,并在再生医学领域的研究和临床治疗中得到广泛的应用。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一类具有自我更新能力和多项分化潜能的成体干细胞,它来源广泛,且具有低免疫原性的特点,是组织工程修复的理想移植物。MSCs作为公认的抗炎症反应屏障,是目前SCI细胞移植治疗的最佳选择。大量的文献报道显示MSCs移植在SCI的治疗中有着积极的效应。研究发现,MSCs不仅可以抑制SCI后损伤局部的炎症反应和细胞凋亡情况,还可以促进损伤处轴突及血管的生成;也有文献发现,MSCs可以减少星形细胞疤痕和组织空洞,促进运动功能恢复,但具体机制尚不清楚。在MSCs的临床应用中,存在着细胞移植后存活率低,疗效不稳定等问题。而MSCs上清中提取的外泌体治疗SCI有很大优势,外泌体在血液、培养基中更加稳定,利于保存,易于质量管理,更加安全、体积小不易堵塞血管,不会诱发或者产生肿瘤,它是纳米级载体,可以有选择地到达炎症部位。外泌体是细胞外小泡的一种,在细胞与细胞间的通讯中起着重要作用,MSCs上清中提取的外泌体治疗SCI是通过基因信息和交换蛋白的方式为解决这些问题提供了新思路,促进细胞间的信息交流。外泌体在自然界中的来源及其分布比较广泛,大多数哺乳动物当中都可以分泌,在各种体液中也存在分布,不同的细胞分泌的外泌体有差异,尤其在发生疾病时,正常细胞分泌的外泌体和病态分泌的外泌体成分差别很大。因此对提高MSCs来源的外泌体治疗效果具有重要意义。肿瘤坏死因子α刺激基因-6（Tumor necrosis factor α stimulated gene 6,TSG-6）编码的分泌性蛋白是一种保护性的炎症反应因子,它通过与透明质酸、硫酸软骨素或蛋白多糖结合,介导炎症细胞迁移、黏附与免疫调节和细胞外基质重塑,进而发挥炎症调控作用[3]。重组TSG-6蛋白已应用于多种疾病模型的研究,并表现出了有效的抗炎作用。最近的研究发现,重组人TSG-6局部应用可减轻多种疾病的炎症反应和病理表现[4]。而TSG-6已被证明可在MSCs中表达,并在MSCs移植治疗一些疾病中,发挥了重要作用[5]。因此,明确TSG-6是否在MSCs来源的外泌体移植治疗中发挥关键作用,并以此为基础对MSCs来源的外泌体进行修饰,提高MSCs来源的外泌体移植治疗SCI的效果,对于临床MSCs来源的外泌体移植治疗SCI,有着指导意义。第一部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体对脊髓损伤的影响目的外泌体（exosomes）是近年来新发现的细胞与细胞相互作用的重要手段。它们是纳米级小囊泡（30-150纳米）,内含复杂的RNA和蛋白质,可以通过膜受体和其他方式结合到靶细胞。外泌体参与生物信息的调节;各种细胞在正常和病理条件下都能分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒形成的多胞体,通过多胞外膜与细胞膜融合释放到细胞外基质中。大量研究表明,移植的间充质干细胞来源的外泌体具有良好的治疗效果,在神经系统损伤的修复中起着关键作用。在该研究中,分离来自骨髓间充质干细胞（BMSCs）的外泌体并通过尾静脉移植到大鼠SCI模型中。观察移植前后大鼠SCI模型的行为学和组织学变化,初步观察尾静脉注射BMSCs外泌体对SCI的治疗作用。方法1.从大鼠骨髓中原代分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）;2.采集BMSCs细胞培养上清液。用试剂盒提取外泌体。并利用透射电镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;3.将30只大鼠随机分为三组,每组分别10只:假手术组、手术对照组和外泌体组。外泌体组大鼠术后1h静脉注射500μl外泌体,手术对照组大鼠术后1h静脉注射500 μl无菌磷酸盐溶液。4.通过BBB评分法和斜板实验评估术后各组大鼠的运动功能;5.通过Nissl染色、HE染色和LFB染色观察脊髓组织形态。结果1.透射电镜结果显示,上清中提取的外泌体,显示出大量具有圆形或椭圆形形状的囊泡状结构。囊泡周围的膜结构明显。尺寸相对均匀,直径约为40-100nm。2.Western Blot检测结果显示CD9和CD63呈阳性,鉴定提取物,确定其为外泌体。3.各组大鼠术前行为学评分均位于正常水平。术后外泌体组以及手术对照组BBB评分和斜板评分均明显低于假手术组（p<0.05）。外泌体注射7天后,外泌体组的BBB评分以及斜板评分高于手术对照组（p<0.05）,且差异具有统计学意义。4.移植后D28结果显示,Nissl染色、HE染色和LFB染色发现假手术组的脊髓形态结构正常,手术对照组大鼠体内Nissl体减少,炎性细胞浸润,髓鞘丢失明显。与手术对照组相比,外泌体组脊髓组织内Nissl体增多,炎性细胞浸润减少,髓质减少,减少了鞘层损耗。结论骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以减轻脊髓损伤后的组织损伤程度,促进神经运动功能的恢复。第二部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤的基因表达谱分析目的本研究中我们制作大鼠脊髓损伤模型后利用转录组测序技术,建立大鼠脊髓损伤及骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗的基因表达谱分析。在转录组测序中,可以通过将读数的数量映射到基因区域来估计基因表达水平,但读数的数量不仅与基因表达水平成正比,而且与基因本身的长度和测序数据的数量成正比。为了使不同基因和不同样品之间的基因表达水平相当,将读数转化为FPKM（每百万映射读数的外显子模型的片段每千克碱基）以标准化基因表达。方法SD大鼠（SPF级）,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,利用美国PSI公司,型号IH-0400撞机仪制作大鼠脊髓损伤的模型,20g的撞击棒,在4.5cm处自由落体撞击T10椎体层面脊髓中央,造模成功的标志性为,大鼠双下肢抽搐,尾巴甩向一侧,出现双下肢的瘫痪。从损伤脊髓中提取总RNA,以脊髓中心为中点,上5mm,下5mm。采用转录组测序技术扫描总RNA,获得脊髓损伤后大鼠差异mRNA表达谱从。大鼠骨髓中原代分离骨髓间充质干细胞（MSCs）;采集MSCs细胞培养上清液。用试剂盒提取外泌体。并利用透射电镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;将12只大鼠随机分为四组,每组分别3只:假手术组、手术对照组、骨髓间充质干细胞组和外泌体组。外泌体组大鼠术后1 h静脉注射500 μl外泌体,手术对照组术后1h静脉注射500 μl无菌磷酸盐溶液,骨髓间充质干细胞组大鼠术后1 h静脉注射500 μ1骨髓间充质干细胞。并于术后24h,通过透射电镜观察外泌体在脊髓组织中的分布情况;成功建立大鼠脊髓损伤模型,并对提取的总RNA进行质量评价,质量可靠。采用转录组测序技术获得脊髓损伤后大鼠mRNA的差异表达谱。观察差异性表达基因数目,并制作基因聚类分析热图。结果通过差异基因筛选并文献查阅,从中选定TSG-6基因进一步研究,测序结果显示,TSG-6在手术对照组中表达比假手术组显着降低;脊髓损伤大鼠经外泌体治疗后,该基因表达水平较手术对照组增高,低于假手术组。结论TSG-6在手术对照组和假手术之间表达有差异;而且治疗组和手术对照组之间存在差异。通过转录组测序,假手术组、手术对照组、外泌体组和骨髓间充质干细胞组之间存在基因表达水平差异。根据基因表达差异和GO功能分析及KEGG信号通路分析,结合文献阅读,选定TSG-6基因与神经损伤相关。第三部分 TSG-6在骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤中的关键作用目的本研究通过沉默和高表达MSCs来源的外泌体中的TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠。观察注射前后大鼠脊髓损伤模型的行为学和组织学变化。确定TSG-6在脊髓损伤治疗中的作用。方法1.从大鼠骨髓中纯化并培养MSCs,慢病毒沉默和高表达MSCs中的TSG-6基因和鉴定,提取外泌体。将75只雄性SD大鼠分为五组,每组分别15只:假手术组,手术对照组,外泌体组,TSG-6沉默组,TSG-6高表达组。术后24h进行大鼠灌注,观察外泌体在脊髓组织中的定位和分布。其他大鼠在术后1,3,7,14和D28测试运动能力和行为的变化。同时在术后D28,通过组织切片染色观察损伤处组织形态的变化。2.术后24h观察外泌体在脊髓损伤处分布。术后D28,通过Nissl染色,HE染色和Luxol fast blue（LFB）染色观察脊髓的形态学变化。3.沉默TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠,通过BBB评分和术后各时间点的斜板实验评分观察各组神经损伤的恢复情况。4.高表达TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠,通过BBB评分和术后各时间点的斜板实验评分观察各组神经损伤的恢复情况。结果1.荧光显微镜观察慢病毒转染效果。采用聚合酶链反应（PCR）和蛋白质印迹（Western blot）检测转染效果。结果显示MSCs内TSG-6基因沉默和高表达成功;2.外泌体组和TSG-6高表达组大鼠脊髓损伤后BBB评分和斜板评分均显着高于手术对照组（p<0.05）,而TSG-6沉默组与手术对照组相比无显着统计学差异。脊髓损伤后第7天TSG-6高表达组BBB评分以及斜板评分均高于外泌体组（p<0.05）。3.移植后D28结果显示,Nissl染色、HE染色和LFB染色发现假手术组的脊髓形态结构正常,手术对照组和TSG-6沉默组大鼠体内Nissl体减少,炎性细胞浸润,髓鞘丢失明显。与手术对照组相比,外泌体组和TSG-6高表达组脊髓组织内Nissl体增多,炎性细胞浸润减少,髓质减少,减少了鞘层损耗。且TSG-6高表达组优于外泌体组。结论MSCs来源的外泌体可以降低脊髓损伤后组织损伤程度,促进神经运动功能的恢复,为生物移植治疗脊髓损伤提供了新的方向和思路。但是高表达TSG-6的MSCs来源的外泌体显示具有更强的治疗效果,TSG-6在MSCs来源的外泌体治疗脊髓损伤中发挥着重要的作用。
吴宇[3]（2020）在《低强度脉冲超声激励雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究》文中提出[目的]脊髓损伤（Spinal cord injuries,SCI）是一种高度致残性疾病,改善脊髓损伤后局部微环境促进损伤轴突再生和神经功能恢复已成为当前研究的重要方向。在脊髓损伤微环境中,神经营养因子是调节失衡微环境中多种病理生理过程的重要蛋白分子,其在保护细胞存活、改善炎症反应、促进轴突再生以及再髓鞘化过程中起着不可替代的作用。研究表明,雪旺细胞（Schwann cells,SCs）通过分泌BDNF、NT-3、NGF、FGF、GDNF等多种神经营养因子,协同作用于损伤后微环境,促进神经功能的恢复。前期研究证明,低强度脉冲超声（Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS）可以促进包括骨髓间充质干细胞、神经干细胞等细胞的神经营养因子的分泌。本研究旨在利用雪旺细胞分泌多样神经营养因子的特性,采用LIPUS体外激励雪旺细胞促进神经营养因子的分泌,通过移植LIPUS激励的雪旺细胞到脊髓损伤局部发挥神经保护作用及炎症调节作用,促进脊髓损伤大鼠轴突再生和运动功能恢复,为脊髓损伤的细胞移植联合疗法提供一种新的方法。[方法]本实验分为两个部分:（1）分离培养雪旺细胞及激活态雪旺细胞（预损伤7天）;观测LIPUS激励的雪旺细胞（LIPUS-SCs）在神经营养因子分泌、细胞增殖、凋亡、迁移等生物学特性方面的改变,评价LIPUS对雪旺细胞的调控作用;并与激活态雪旺细胞进行比较评价。（2）观察LIPUS-SCs细胞移植后,对损伤后微环境的改善作用及胶质瘢痕形成、轴突生长、再髓鞘化情况;探讨LIPUS-SCs细胞移植通过NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤的作用机制。体外实验部分:雪旺细胞及激活态雪旺细胞的分离、纯化及鉴定:从4周龄雌性Wistar大鼠的坐骨神经中分别提取雪旺细胞及激活态雪旺细胞（预损伤7天）,使用双重酶消化和差速贴壁法对细胞进行培养纯化。S-100荧光染色鉴定细胞纯度。LIPUS激励系统的建立及实验分组:对纯化至第3代的雪旺细胞进行强度为50m W/cm2,每次5min,连续3d的刺激。本部分研究分为三组:SC组、LIPUS-SCs组与ASCs组。LIPUS调节细胞生物学特性相关检测:采用ELISA法检测上清液中BDNF、NT-3、NGF的表达水平,探究LIPUS激励对于雪旺细胞神经营养因子表达的影响;CCK-8法检测雪旺细胞细胞增殖活性;Annexin V-FITC/PI双染色法检测雪旺细胞细胞凋亡情况;Transwell细胞迁移实验评价体外雪旺细胞细胞迁移情况。通过与ASCs组进行比较,综合评价LIPUS对雪旺细胞的调控作用效果。体内实验部分:动物实验模型及分组:60只成年雌性wistar大鼠,建立脊髓胸10（T10）节段脊髓损伤大鼠模型,分为4组:假手术组（Sham组）、损伤组（Injury组）、SCs移植组、LIPUS-SCs移植组。于脊髓损伤后第7天进行细胞移植治疗。大鼠运动功能恢复的行为学评价:从损伤后即刻开始,每周1次直到第8周实验结束,对各组大鼠进行BBB评分,观察其运动功能恢复情况。神经营养因子及炎症因子改变检测:ELISA法检测脊髓组织神经营养因子BDNF、NT-3、NGF;Western blot检测炎症因子IL-1β、IL-10的改变情况。综合评价LIPUS-SCs细胞移植对神经保护及炎性调节的作用。损伤后局部组织保留及炎症改变检测:在脊髓损伤后8周,取大鼠灌注脊髓组织用于HE染色以观察各组组织保留及炎症改变情况。轴突再生及星形胶质细胞活化情况检测:在脊髓损伤后8周,对脊髓纵切切片进行神经丝蛋白-200（NF200）,胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色,DAPI染核。观察比较细胞移植后轴突生长,星形胶质细胞活化及胶质瘢痕形成情况。NRG1/ErbB信号通路改变检测:脊髓损伤后8周,Western blot法检测各组脊髓组织NRG1、ErbB2及MBP表达改变,明确LIPUS-SCs细胞移植通过NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤的作用机制。[结果]1.成功分离纯化了雪旺细胞及激活态雪旺细胞（预损伤7天）,经S-100荧光染色鉴定,细胞纯度在95%以上。2.LIPUS激励促进雪旺细胞BDNF、NT-3、NGF的分泌表达:在接受LIPUS激励后,LIPUS-SCs组中BDNF、NT-3、NGF的表达与SCs组相比明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与ASCs组的神经营养因子分泌情况对比发现,达到与ASCs相似表达水平（P?0.05）。3.LIPUS激励提高雪旺细胞增殖活性:与未经LIPUS处理的SCs组相比（100%）,LIPUS-SCs组的细胞活性明显提高（114.1%±1.754%）,差异具有统计学意义（P<0.01）。同时,与ASCs组的细胞活性（112.5%±2.032%）对比发现,LIPUS-SCs组的细胞活性高于ASCs组（P<0.05）。4.LIPUS激励是一种安全的物理干预方式:Annexin V-FITC/PI双染色法发现,LIPUS激励后的雪旺细胞凋亡率比正常雪旺细胞低（2.003%±0.4888%vs.1.447%±0.1050%,P?0.05）,LIPUS激励不会诱发细胞凋亡。5.LIPUS激励促进雪旺细胞迁移:通过Transwell细胞迁移实验发现,结晶紫染色的细胞数量在LIPUS-SCs组（53.50±4.203个/视野）显着高于SCs组（31±4.761个/视野）,差异具有统计学意义（P<0.01）。在ASCs组也观察到较多的结晶紫染色细胞（57.50±6.557个/视野）,与LIPUS-SCs组相比差异没有统计学意义（P?0.05）。6.LIPUS-SCs细胞移植促进大鼠运动功能恢复:在细胞移植后,到第8周大鼠后肢功能均有一定恢复;到第8周实验结束时,大鼠BBB评分在LIPUS-SCs移植组（15.667±0.578分）最高,SCs移植组（14±0分）次之,injury组（6.333±0.578分）最低,差异具有统计学意义（P<0.01）。7.LIPUS-SCs细胞移植促进脊髓组织局部营养因子表达并改善炎性反应:ELISA对损伤后2周脊髓损伤中神经营养因子的分泌进行检测,结果表明,LIPUS-SCs细胞移植组中脊髓局部BDNF、NT-3、NGF表达水平最高,优于SCs移植组,差异具有统计学意义（P<0.01）。LIPUS-SCs细胞移植还有很好的炎性调节作用,其可以抑制促炎症因子IL-1β过度表达,促进抑炎因子IL-10的表达上升。8.LIPUS-SCs细胞移植促进神经功能恢复:HE染色显示,细胞移植尤其是LIPUS-SCs细胞移植有助于损伤后组织形态的保留,减少脊髓空洞形成及炎性细胞的浸润;NF200/GFAP免疫荧光双标染色显示,在SCs及LIPUS-SCs细胞移植组中,和Injury组相比,观察到更多的NF200标记的轴突生长,而GFAP免疫荧光强度明显低于Injury组（P<0.05）;且LIPUS-SCs移植组中NF200阳性轴突的数量及平均长度明显多于SCs移植组（P<0.05）。9.LIPUS-SCs细胞移植通过激活NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤:通过Western blot对NRG1/ErbB信号通路关键蛋白进行检测,结果显示,LIPUS-SCs组中,NRG1,ErbB2及MBP的蛋白表达水平较SCs组明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。[结论]1.低强度脉冲超声激励雪旺细胞,可以显着提高营养因子BDNF、NT-3和NGF的表达;促进细胞迁移能力及细胞增殖活性;且不会诱发细胞凋亡,是一种安全的物理干预方式。2.与预损伤获得的激活态雪旺细胞相比,LIPUS-SCs可以达到与之相似的营养因子分泌及细胞迁移能力,为雪旺细胞的高效获取提供了一种新的方法。3.LIPUS-SCs细胞移植有利于损伤组织的保留,可以有效促进局部营养因子分泌,调节炎症反应,抑制反应性星形胶质细胞增生,有助于脊髓损伤后轴突再生及轴突生长,获得更好的运动功能恢复。4.LIPUs-SCs细胞移植通过激活NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤。
孙健[4]（2020）在《振荡电场刺激联合神经干细胞移植促进大鼠脊髓损伤后神经功能恢复》文中提出目的:证实振荡电场刺激（oscillating field stimulation,OFS）调节在体移植的神经干细胞（neural stem cell,NSC）定向分化和促进脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后神经功能恢复的作用,并为研究其机制提供理论参考,以求为临床上修复SCI提供新的技术方向。方法:采用随机分组的方式将Sprague Dawley（SD）大鼠分入脊髓损伤组、单纯移植组和联合治疗组三组,分别构建相应的大鼠模型;以BBB大鼠运动功能评分（Basso-Beattie-Bresnahan,BBB）的结果评估大鼠SCI后神经功能恢复情况;利用蛋白质印迹法（Western Blot,WB）、冰冻切片和组织免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）的方法,观察在OFS作用下大鼠损伤脊髓内移植的NSC增殖和分化情况;采用WB和IF的方法检测大鼠SCI后轴突的受损及再生情况。结果:1.在术后第3到5周时,联合治疗组大鼠在各时间点的平均BBB评分均高于单纯移植组大鼠,差异具有统计学意义（P<0.05）;2.WB结果表明术后第3天时,联合治疗组的大鼠脊髓组织中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）平均表达水平高于单纯移植组,且差异具有统计学意义（P<0.05）;3.IF结果显示在术后第3、7和14天时,联合治疗组大鼠脊髓组织切片中呈GFP/β-Tubulin III阳性细胞的平均数量均高于单纯移植组,且差异具有统计学意义（P<0.05）;4.IF结果显示在术后第3、7和14天时,联合治疗组大鼠脊髓组织切片中呈GFP/NG2阳性细胞的平均数量均高于单纯移植组,且差异具有统计学意义（P<0.05）;5.IF结果显示术后第7和14天时,联合治疗组大鼠脊髓组织切片中呈GFP/S100β阳性细胞的平均数量均低于单纯移植组,且差异具有统计学意义（P<0.05）;6.WB结果表明在术后第14天时,联合治疗组的大鼠脊髓组织中神经丝蛋白（neurofilament200,NF-H）平均表达水平高于单纯移植组,且差异具有统计学意义（P<0.05）,IF结果显示在术后第14天时,联合治疗组中NF-H染色阳性面积所占比例明显大于单纯移植组,且差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:OFS能够调节大鼠在体移植的NSC定向分化,促进神经元的再生、神经的再髓鞘化及轴突的再生,减少星形胶质瘢痕的形成。相比单纯移植NSC的方式,联合治疗更有助于SCI后大鼠的神经功能恢复。
孙磊[5]（2019）在《HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究》文中研究说明第一部分HUC-MSCs联合hNSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究研究背景脊髓损伤是脊柱骨折脱位的严重并发症,常导致损伤节段以远感觉、运动及其他躯体功能严重障碍,不仅给患者的身心造成巨大的影响,还会对其家庭及社会带来沉重的负担。目前,临床上还没有找到一种令人满意的方法来治疗或治愈此疾病。间充质干细胞（MSCs）属于多能干细胞,具有自我复制及多向分化潜能。MSCs能分泌多种神经营养因子和细胞因子,具有免疫调节,抗细胞凋亡和抗炎作用,能够促进神经细胞的存活及再生。神经干细胞（NSCs）是能够自我复制及具有多种神经细胞分化潜能的干细胞,能够促进脊髓损伤后受损的神经通路的修复重建。但由于受到损伤脊髓局部炎性环境的影响,移植的NSCs存活率较低。有研究表明,MSCs可以调节NSCs生长的微环境,提高其存活率。此外,许多研究指出,MSCs可以减少与干细胞移植相关的肿瘤形成。我们应用hUC-MSCs与hNSCs联合移植治疗大鼠脊髓损伤,经查阅国内外文献,未见有报道。本研究旨在找寻治疗脊髓损伤更为有效的方法及探索其内在机制,为将来hUC-MSCs与hNSCs的临床应用垫定基础。研究目的（1）研究hUC-MSCs与hNSCs联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用。（2）研究hUC-MSCs与hNSCs单独移植修复大鼠脊髓损伤的作用及对二者进行比较研究。（3）通过免疫组化、免疫荧光、Elisa实验、LFB-CV染色等方法来研究探索hUC-MSCs与hNSCs移植修复大鼠脊髓损伤的作用机制。研究方法（1）HUC-MSCs的分离、培养及鉴定新鲜脐带于孕38～40周的健康产妇剖宫产术中获取。我们应用组织块贴壁法培养hUC-MSCs。将自脐带分离的华通胶切成细小碎块后,转入细胞培养瓶中,在添加有相应添加剂的DMEM完全培养基中培养。在含5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养7～10天后,吸除组织块,重铺贴壁细胞,每3天换液1次。细胞经传代后,收集第3～5代细胞用于移植实验。以流式细胞仪鉴定细胞表面特异标志物;细胞经成骨成脂诱导分化后,应用茜素红S染色及油红0染色鉴定其分化能力。（2）HNSCs的分离、培养及鉴定我们采用常规人工流产的8～10周龄胚胎来获取前脑组织。通过机械分离法提取细胞,加入到NSCs无血清培养基中,在5%CO2的培养箱中37℃下培养。每周2次换液,7～10天便可形成神经球。细胞经传代后,获取第3～5代NSCs备移植用。同时应用细胞免疫荧光的方法鉴定细胞特异性标志物;细胞经诱导分化后,以抗β-tubulinⅢ与抗GFAP抗体通过免疫荧光鉴定其分化能力。（3）实验分组、脊髓损伤模型制作及细胞移植本研究采用NYU撞击器对成年雌性Wistar大鼠建立中度脊髓挫伤模型。造模后第二天BBB评分≤2的大鼠被选用。本实验共选取了 108只脊髓损伤大鼠进行研究,随机分为以下五组:1)hUC-MSCs组;2)hNSCs组;3)hUC-MSCs+hNSCs组;4)PBS组（对照组）;5)Sham组（假手术组）。我们在大鼠脊髓损伤1周后于T10节段行干细胞髓内注射移植治疗。（4）指标检测在大鼠SCI之前和之后1天用BBB评分法对所有动物进行评估,然后每周一次直至实验结束。细胞移植后2周,处死部分大鼠并提取脊髓组织,行冰冻切片,进行免疫荧光和免疫组织化学检测,观察及评估移植干细胞的存活、分化及受损脊髓BDNF的表达。细胞移植后2周处死部分大鼠,提取新鲜脊髓组织行脊髓匀浆,以夹心ELISA法检测BDNF的表达。在大鼠SCI造模后第8周,将实验动物处死并提取脊髓组织,行石蜡切片,进行Luxol Fast Blue-Cresyl Violet染色,检测脊髓损伤部位髓鞘及脊髓前角运动神经元的数量。研究结果（1）细胞培养及鉴定我们以组织块贴壁培养方法从脐带华通胶基质中成功分离培养出hUC-MSCs。获取的第三代细胞经流式细胞仪检测其表面标志物,结果为高表达CD44,CD90,CD105,而CD34和CD45则表达阴性。经成骨与成脂培养基诱导分化后,茜素红S染色及油红0染色均为阳性结果,表明其具有成骨及成脂分化能力。我们通过从常规人工流产的胚胎前脑组织中成功分离和培养出hNSCs。其细胞标志物Nestin和SOX2免疫荧光染色阳性。经诱导分化后,免疫荧光结果显示β-tubulinⅢ与GFAP抗体染色阳性,证实其具有分化为神经元及星形胶质细胞的能力。（2）BBB评分结果自大鼠SCI后第2周至实验结束,hUC-MSCs+hNSCs组BBB评分明显高于其他3个治疗组,结果存在显着统计学差异。自大鼠SCI后4周开始,hNSCs组评分高于PBS组,其差异具有统计学意义（P<0.05）,并持续至试验结束。在大鼠SCI后第5周,hUC-MSCs组的BBB评分迅速增加,与PBS组相比有显着差异,并且这种趋势一直持续到第8周（P<0.01）。在整个实验过程中,hUC-MSCs组大鼠的BBB评分与hNSCs组相比,差异无统计学意义。（3）干细胞的存活与分化关于细胞移植后2周所移植干细胞存活的计数,hUC-MSCs+hNSCs组明显高于hNSCs组（P<0.05）和hUC-MSCs组（P<0.01）。在PBS组（阴性对照组）中未发现有HuNu 阳性细胞。hUC-MSCs组与hNSCs组相比,差异无统计学意义。在 hUC-MSCs 组中,未观察到 HuNu-GFAP、HuNu-β-tubulinⅢ 或 HuNu-CNP抗体双标阳性的细胞,说明所移植存活的干细胞未向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化。而在hNSCs组和hUC-MSCs+hNSCs组中均可观察到上述双标阳性细胞,表明此2组中所移植的干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。根据免疫荧光图像,我们还可以观察到存活的hUC-MSCs分布比较集中,大部分位于注射移植点附近,与宿主组织未能很好的整合;但在hNSCs组和hUC-MSCs+hNSCs组中,所移植干细胞比较分散,游走距离较远,与宿主组织整合较好。（4）BDNF免疫组化及ELISA检测结果干细胞移植2周后受损脊髓组织BDNF免疫组化表达结果为:三个干细胞移植组较PBS组明显增高,其差异具有统计学意义（PBS组vs hUC-MSCs+hNSCs组,P<0.01;PBS组vs hUC-MSCs组与hNSCs组,P<0.05）。但在三个干细胞移植组两两之间,差异无统计学意义。脊髓组织匀浆的BDNF表达ELISA检测结果与免疫组织化学结果一致。（5）脊髓损伤部位髓鞘及脊髓前角运动神经元的检测结果在大鼠SCI后第8周,我们行脊髓横切面Luxol Fast Blue-Cresyl Violet染色,结果显示4个脊髓损伤组的脊髓横切面可见大量坏死细胞碎片,轴突退变和空洞。各组髓鞘染色的IOD值,三个干细胞移植组均较PBS组高,差异具有统计学意义（PBS 组 vs hUC-MSCs+hNSCs 组,P<0.01;PBS 组 vs hUC-MSCs 组与hNSCs 组,P<0.05）。hUC-MSCs+hNSCs 组髓鞘染色 IOD 值最高（hUC-MSCs+hNSCs组 vs UC-MSCs 组,P<0.01,hUC-MSCs+hNSCs 组 vs hNSCs 组,P<0.05）。三个干细胞移植组脊髓灰质前角中运动神经元的数量显着高于PBS组（hUC-MSCs+hNSCs 组与 hUC-MSCs 组 vs PBS 组,P<0.01;hNSCs 组 vs PBS组,P<0.05）。三个干细胞移植组与假手术组相比,其脊髓前角运动神经元数量均明显减少（P<0.01）,但此三组两两之间无统计学差异。研究结论（1）本研究表明,hNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs在大鼠脊髓损伤亚急性期局部髓内移植均能够促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复,且联合移植组效果更佳。（2）联合移植hNSCs和hUC-MSCs可以促进所移植干细胞的存活。（3）HNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs三种细胞移植方法均能促进脊髓损伤瘢痕周围BDNF的分泌。（4）HUC-MSCs单独移植后于体内未分化为神经谱系细胞,hNSCs则在移植后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。（5）HNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs移植均能够增加受损脊髓髓鞘的数量及脊髓前角运动神经元的数量。联合移植对增加髓鞘数量的作用效果最显着。第二部分HNSCs联合电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究研究背景脊髓损伤（SCI）是指由于脊髓组织受到各种损伤因素的破坏,导致躯体神经功能发生暂时或永久性的改变。脊髓一旦严重损伤,修复将十分困难。关于脊髓损伤的治疗主要集中在两个方面,神经保护与神经再生。神经保护能够防止或减缓神经损伤后继发性损害,而神经再生则旨在恢复中断的神经通路,恢复神经功能。目前,干细胞移植是脊髓损伤治疗的研究热点。由于干细胞可以分化成脊髓损伤后所缺失的多种类型的细胞,而且还能够分泌多种营养因子,调节损伤局部炎性反应,干细胞移植成为将来修复受损脊髓缺失组织和促进神经保护和神经再生十分有前景的方法。而NSCs,作为神经再生的种子细胞,更具有其独特的优势。脊髓损伤破坏了大脑和身体之间的通信,导致大脑失去了对完整躯体神经肌肉系统的控制。目前研究者已经开发了许多神经假体,以通过中枢和外周神经系统的功能性电刺激（FES）来恢复部分躯体功能,并能够加强肌肉强度及减轻其萎缩。研究发现,电刺激的作用并非局限于此,受损脊髓部位局部的电刺激,还具有改善局部血液循环,抵消局部内生电流,维持细胞膜的稳定性,激活内源性神经再生等功能。由于脊髓损伤的病理生理过程复杂,靠单一的治疗方式,很难有满意的疗效。而联合多种方法治疗,是目前修复脊髓损伤的一个趋势。我们已有前期研究证实,MSCs联合电刺激治疗脊髓损伤比单独行细胞移植或电刺激效果更好。关于hNSCs联合电刺激治疗脊髓损伤,目前国内外还未有研究报道,我们进行此项研究,旨在寻求更好的治疗脊髓损伤的方法及探索其作用机制,为将来治疗甚至治愈脊髓损伤垫定基础。研究目的（1）研究hNSCs移植联合电刺激对大鼠脊髓损伤的治疗作用。（2）探索hNSCs移植、电刺激分别对大鼠脊髓损伤的治疗作用及对二者进行比较研究。（3）通过免疫组化、免疫荧光、组织western blot等方法探索hNSCs及电刺激对脊髓损伤修复的病理生理机制。（4）探索电刺激对所移植的hNSCs在损伤脊髓局部存活、向神经元分化等生物学行为的影响。研究方法（1）hNSCs的分离、培养我们选择常规人工流产的8-10周龄胚胎来提取前脑组织。通过机械分离法提取细胞,加入到NSCs无血清培养基中,在含5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养。每周2次换液。7-10天便可形成神经球,细胞经传代后,获取第3-5代NSCs备用。（2）动物分组、脊髓损伤动物模型制作、细胞移植及电刺激我们于大鼠胸10水平以NYU脊髓打击器建立大鼠SCI模型。选取SCI造模成功的成年雌性Wistar大鼠共100只。随机分为4组,分别为hNSCs组,ES组,hNSCs+ES组及PBS组（对照组）,每组25只大鼠。在SCI模型建成1周后行刺激电极安装固定手术及hNSCs移植手术。自安装刺激电极后第二天开始,电刺激组给予电刺激干预,每日2次,直至造模后第10周实验结束。（3）指标检测在大鼠SCI之前和之后1天及之后每周进行后肢运动功能BBB评分至第10周实验结束。实验结束时处死大鼠并提取脊髓组织。行脊髓组织切片,进行免疫组化及免疫荧光检测,观察hNSCs的存活、分化情况;观察NF-H、GFAP的表达情况;HE染色观察局部空洞形成情况;脊髓组织匀浆后行Western blot检测,观察受损脊髓组织内NF-H,NGF蛋白表达情况。研究结果（1）BBB评分本实验结束时,各组大鼠后肢功能BBB评分由高到低排列分别为:hNSCs+ES组,ES组,hNSCs组,PBS组;各组间表达差异均具有显着统计学意义（p<0.01）。（2）免疫荧光hNSCs的存活及向神经元分化的检测所移植hNSCs的存活检测结果为:hNSCs+ES组存活数量大于hNSCs组,差异具有统计学意义（p<0.05）。所移植存活的细胞分化为神经元的数量,hNSCs+ES组大于hNSCs组,差异有统计学意义（p<0.05）。（3）NF-H免疫荧光表达结果HNSCs组、ES组及hNSCs+ES组脊髓损伤部位瘢痕组织周围NF-H的表达较PBS组均增高,差异具有统计学意义（PBS组vs hNSCs组,P<0.05;PBS组vs ES组及hNSCs+ES组,P<0.01）。三个治疗组NF-H表达由高到低为hNSCs+ES组、ES组及hNSCs,三组两两之间表达差异亦具有统计学意义（hNSCs+ES组vs ES组,p<0.05;hNSCs+ES 组 vs hNSCs 组,p<0.01;ES 组 vs hNSCs 组,P<0.01）。（4）免疫组化检测GFAP在脊髓损伤部位胶质瘢痕中的表达脊髓损伤部位胶质瘢痕组织GFAP表达,三个治疗组与对照组（PBS组）相比,GFAP表达降低,差异具有统计学意义（PBS组vs hNSCs组及hNSCs+ES组,P<0.01;PBS组vs ES组,p<0.05）。其中,hNSCs+ES组表达最低,与其余三组相比差异具有统计学意义（hNSCs+ES组vs hNSCs组,p<0.05;hNSCs+ES组vs ES及 PBS 组,p<0.01）。（5）脊髓损伤部位坏死空洞区域HE染色HE染色检测脊髓损伤局部坏死空洞面积,hNSCs组及hNSCs+ES组小于PBS组,数据差异有统计学意义（hNSCs组vs PBS组,p<0.05;hNSCs+ES组vs PBS组,p<0.01）。ES组面积数值虽比PBS组小,但差异无统计学意义。（6）Western blot检测受损脊髓组织匀浆NF-H及NGF表达NF-H的检测结果,三个治疗组,hNSCs+ES组、ES组及hNSCs组较对照组均明显增高,差异具有统计学意义（P<0.01）。hNSCs+ES组较ES及hNSCs组表达增高,差异具有统计学意义（P<0.01）。ES组较hNSCs组亦明显增高（P<0.01）。关于NGF的western blot检测,hNSCs+ES组、ES组及hNSCs三个治疗组较PBS组均明显增高,差异具有统计学意义（P<0.01）;但三个治疗组间差异没有统计学意义。研究结论（1）HNSCs移植及电刺激均能促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复,以二者联合应用效果最好。（2）电刺激能促进hNSCs的存活,并能提高其分化为神经元的数量。（3）HNSCs移植及电刺激在体内能通过促进受损脊髓组织中NGF分泌、NF-H的表达,下调损伤局部GFAP的表达,抑制受损脊髓局部胶质瘢痕形成等机制,促进受损脊髓的修复。
张田慧[6]（2019）在《活性氧响应性高分子材料和多功能可注射水凝胶用于脊髓损伤治疗》文中研究说明脊髓损伤（SCI）可引起患者严重的神经功能障碍或永久性残疾。治疗脊髓损伤的研究大致可分为两个主要领域:神经保护和神经再生。神经保护疗法侧重于阻止继发性损伤的进一步发展,而神经再生疗法则侧重于通过修复断裂的脊髓神经回路来恢复受损或失去的功能。大量的研究报告显示活性氧（ROS）在脊髓损伤后过量产生,并在继发性损伤的级联反应中发挥关键性作用,清除ROS可以防止或减轻SCI后的继发性损伤。为此,本论文首先设计合成了一系列ROS响应性的高分子材料,并研究其氧化响应性性质及用作活性氧响应性药物载体的潜力。将其中一种活性氧响应性的材料制备成脂质聚合物纳米粒子探索其脊髓损伤后清除ROS的神经保护治疗效果。同时,针对脊髓损伤修复过程中存在的多重再生障碍,设计、制备了一种同时担载神经干细胞、西妥昔单抗和FTY720药物的多功能可注射水凝胶,系统研究了其在脊髓损伤后的神经再生作用。具体研究内容和主要结论如下:（1）设计合成了一种用苯硼酸频哪醇酯连接的ROS响应性PEG化脂质材料mPEG2k-PBPE-DSA。首先通过Passerini反应合成了含有苯硼酸频哪醇酯的末端带有炔基的聚乙二醇单甲醚衍生物mPEG2k-PBPE-alkynyl,然后与叠氮化双硬脂酸甘油酯（N3-DSA）通过Cu（Ⅰ）催化的点击反应,制备成具有H2O2响应性的mPEG2k-PBPE-DSA。在含有 H2O2 的水溶液中,mPEG2k-PBPE-alkynyl 可以被H2O2氧化,并且氧化程度随H2O2的浓度增加而加快。基于原位1HNMR和质谱分析,证明了 mPEG2k-PBPE-DSA的氧化断裂机理。另外,mPEG2k-PBPE-DSA可以在水溶液中自组装成稳定的纳米胶束。该胶束可以被MCF-7细胞内吞,对巨噬细胞RAW264.7有很好的生物相容性。DLS结果显示H2O2条件下mPEG2k-PBPE-DSA纳米粒子的粒径逐渐减小,证明该纳米胶束可以在H2O2存在时被氧化最终解体。此外,体外药物释放实验表明担载尼罗红模型药物的纳米粒子能够实现药物的氧化响应性控制释放。上述实验表明,mPEG2k-PBPE-DSA有望用作活性氧响应性纳米药物载体。（2）将1,4二噻烷结构引入聚氨基酸侧链,合成了一种新型ROS响应性聚氨基酸材料。首先,通过缩合反应制备1,4-二噻烷修饰的L-谷氨酸酯（DTG）,并合成相应的α-氨基-N-羧基内酸酐单体（DTGNCA）;再利用端氨基聚乙二醇单甲醚mPEG5k-NH2引发开环聚合,合成具有1,4-二噻烷侧链的聚谷氨酸嵌段共聚物mPEG-b-PDTG。该两亲性聚合物在水环境中自组装成球状纳米粒子。用DLS,红外和浊度实验研究纳米粒子的H202响应行为。结果显示,在H202水溶液中,1,4-二噻烷的硫醚结构被氧化成亚砜,从而使聚合物由两亲性变成亲水性,导致纳米粒子解体。纳米粒子的氧化速率随H202浓度的增加而加快,而无H2O2存在时,纳米粒子保持稳定。同时,体外药物释放实验表明担载尼罗红模型药物的纳米粒子能够实现药物的氧化响应性控释。上述实验表明,含1,4二噻烷侧基的聚氨基酸材料有望用作ROS响应性纳米药物载体。（3）开发了活性氧响应性脂质聚合物纳米粒子作为活性氧清除剂,以减轻急性脊髓损伤后的继发性损伤。采用简单的硫醇-炔点击聚合法制备了一种高密度硫醚基聚合物,即聚丙二醇（甲硫基）乙酸酯-乙二醇二（β-巯基丙酸酯）[poly（PMT-co-EGDM）],并用卵磷脂（lethicin）和 PEG-DSPE 的混合物进一步包封,形成活性氧响应性脂质聚合物纳米粒子,称为PELPNPs。体外实验表明该PELPNPs能清除过量产生的ROS,减轻炎症反应,保护胶质细胞和神经元免受H2O2诱导的氧化损伤。动物实验结果表明,PELPNPs通过对神经元和髓鞘的有效保护,减少了损伤面积,明显改善了 SCI大鼠的运动功能的恢复。此外,我们还对PELPNPs的作用机理进行了验证研究,而且其在体内外均表现出良好的生物相容性和生物安全性。因此,我们提出的具有ROS清除功能的脂质聚合物纳米粒子在SCI的抗氧化治疗方面具有较大的潜力。（4）用氧化葡聚糖（o-Dex）和末端肼解的四臂聚乙二醇（4-arm-PEG-NHNH2）,通过醛基和肼形成腙键作为交联点,制备出可注射的共价适应性水凝胶Gel4P-hy-D。该水凝胶快速成胶,模量和脊髓组织相似,且有一定的膨胀性和粘附性,适用于受损脊髓处的填充。我们用Gel4P-hy-D水凝胶搭载神经干细胞（NSCs）,同时加入促进NSCs向神经元分化的西妥昔单抗和抑制胶质瘢痕的药物FTY720,制备成具有多功能的可注射水凝胶（G-N-C-F）。体外和体内实验研究结果表明,西妥昔单抗和FTY720对神经再生具有协同作用。将G-N-C-F注射到急性脊髓横断损伤大鼠的损伤部位,验证其对脊髓再生和功能恢复的治疗作用。实验结果证明,植入G-N-C-F的大鼠可以增加脊髓损伤中心的神经元数量,减少胶质瘢痕的产生,促进轴突再生,从而更好的重建受损神经网络,最终有助于脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。对比实验说明多功能的可注射水凝胶的组织修复效果优于单一功能的水凝胶。该多功能的可注射水凝胶为SCI的神经再生治疗提供了新的思路,有望用于SCI的临床研究。
陈春茂[7]（2019）在《仿生静电纺水凝胶纤维束支架用于脊髓损伤修复的研究》文中研究表明第一部分 GelMA水凝胶生物支架的制作及其材料结构和性能表征[目的]构建定向Gelatin和GelMA水凝胶生物支架,并评估相关物理和化学性能。[方法]首先制备GelMA材料,再使用静电纺丝和紫外光照交联,制备出定向GelMA水凝胶纤维,通过纤维的多次折叠即可得到纤维束。使用静电纺丝技术制备出定向Gelatin和GelMA纤维,再通过戊二醛的交联作用,得到定向Gelatin水凝胶纤维,通过光交联获得GelMA水凝胶纤维,再通过纤维的多次折叠得到相应的纤维束支架。采用SEM对材料进行拍照,所得的图像结合NanoMesurer软件分析两组纤维的直径分布情况,采用吸水称重的方式评估支架的吸水率,将纤维支架放置在PBS中,通过称重,考察纤维支架的降解率。通过生物力学仪器测试其力学性能。[结果]经过SEM图片和NanoMesurer分析,本实验通过平行接收装置制备出表面光滑,具有相同方向的纤维支架,而滚筒接收制备的纤维支架是定向性较差。其中GelMA纤维支架的直径为1.1±0.13um,Gelatin纤维支架的直径为1.4±0.13um;通过力学测试,可以得到两种纤维支架都具有一定的弹性。其中GelMA纤维支架的最大拉伸长度是原长度的4.54倍,Gelatin纤维支架的最大拉伸长度近原长度的1.94倍。通过计算杨氏模量可以得到,GelMA纤维支架的杨氏模量为0.7Kpa,远远小于Gelatin纤维支架的杨氏模量（1.5Kpa）。而循环应力-应变结果结果显示,Gelatin纤维支架的应力应变曲线的斜率,随着反复拉伸有很大的变化。于此相反,GelMA纤维支架的曲线斜率基本不变。吸水率的测试结果显示,在0天时,GelMA纤维支架的吸水率是本身的6.17倍,而Gelatin纤维支架为5.26倍。虽然随着时间的延长,两种支架的吸水率都在下降,但是GelMA支架的吸水率始终大于Gelatin（p<0.05）。降解实验显示,在第 3 天时,GelMA 剩余 94.8±0.84%,Gelatin 剩余 95.2±0.84（p>0.05）,但是随着时间的延长,Gelatin支架和GelMA支架的降解率差距在增大,35天后Gelatin支架剩余 40±1.58%,而 GelMA 支架只剩下 19±1.58%（p<0.05）。[结论]GelMA纤维支架具备定向良好的定向效果和力学性能,并且实现较好的保水性和可降解性。第二部分 GelMA水凝胶生物支架促进BMSCs和神经元细胞的粘附和体外迁移的研究[目的]探讨定向Gelatin和GelMA水凝胶生物支架促进大鼠BMSCs和海马神经元细胞迁移、黏附、增殖的能力。[方法]将BMSCs种植在Gelatin和GelMA支架上,培养1天后,将种植在支架上的细胞进行酒精脱水,冻干后利用扫描电子显微镜观察细胞的粘附和迁移。将BMSCs种植在两种支架上后在第1和3天,使用CCK-8法检测细胞增殖率。通过鬼笔环肽染色检测支架促进细胞粘附的能力。使用活死细胞染色技术,检测支架的生物相容性。通过荧光染色,观察纤维支架对海马神经元细胞的形态和轴突生长的影响。采用共聚焦显微镜和鬼笔环肽染色,在培养细胞的1、2、3天后,进行拍照,考察Gelatin和GelMA支架促进细胞迁徙渗透的能力。[结果]BMSCs在Gelatin和GelMA支架上状态正常,粘附良好,且细胞朝GelMA支架深处迁移。鬼笔环肽染色显示,BMSCs在两种支架上都有很好的粘附,但对照组上细胞形状为不规则形状,朝向不定,而长在Gelatin和GelMA支架上的细胞细长,且定向。活死细胞染色结果显示,接种在Gelatin和GelMA的细胞大部分都存活。CCK-8结果显示,在培养的1、3天细胞正常增殖。GelMA支架显着促进细胞的增殖,相对于其余二组差异有显着统计学意义（p<0.01）,对海马神经元细胞的轴突染色结果显示,对照组上的海马神经元细胞没有生长,轴突没有延伸,非定向的两种纤维支架虽然可以促进轴突的延长,但是不能使轴突朝一个方向延伸。而Gelatin支架和GelMA支架上的海马神经元细胞不仅数量多,定向,而且轴突延伸性好,其中GelMA支架上的轴突延伸性最好。通过鬼笔环肽染色和共聚焦显微镜拍照,可以看出,GelMA支架上的细胞随着时间的延长,正在逐渐的往下迁移（第一天为38.9±4.92um,第二天为127.55±14.54um,第三天为197.5±18.lum）,而Gelatin支架上的细胞只有轻微迁移（第一天 24±4.35um,第二天 41.87±6.28um,第三天 60.6±8.4um）。定量数据显示GelMA组与Gelatin组相比,差异有统计学意义（p<0.05）。[结论]GelMA支架生物相容性良好,能促进细胞在支架上黏附、增殖、迁移;在体外有促进神经元轴突伸长的能力。第三部分 GelMA水凝胶生物支架促进脊髓损伤修复的研究[目的]探讨GelMA支架促进活体脊髓损伤修复的可行性。[方法]建立大鼠脊髓损伤模型,分为Gelatin和GelMA纤维支架和对照组。通过BBB运动评价量进行大鼠术后下肢运动功能的评价。在术后12周取脊髓进行组织切片及免疫组化染色(包括神经干细胞染色,神经元染色,神经轴突染色,胶质疤痕染色,星形胶质细胞染色,血管内皮细胞染色。观察神经修复、血管形成情况。[结果]通过评价下肢功能恢复情况可以判断支架修复脊髓的效果。术后第1、2、3、4、6、8、10、12周使用BBB量表进行大鼠后肢运动功能评价。结果显示,术后对照组和Gelatin组大鼠下肢自主运动功能恢复较慢且有限,GelMA组大鼠恢复较好。随着治疗时间的延长,GelMA组的治疗效果与另外两组相比,越来越好,当达到12周时GelMA组评分达到12.4±1.67,相对于空白组6.6±1.52和Gelatin组8±1.23有显着性差异（p<0.05）。本研究中脊髓神经再生观测指标包括神经干细胞、神经元以及神经突触。Nestin染色结果显示在损伤后12周仍能在损伤部位观察到神经干细胞的存在,通过光密度定量测定发现GelMA组脊髓中神经干细胞明显多于Gelatin组和空白对照组（p<0.05）,证明GelMA支架更适宜周围NSCs向支架内迁移并生存。而神经元是脊髓功能恢复的细胞基础,同样,Tuj-1标记的由NSCs分化的神经元在GelMA支架内于其Gelatin支架和对照组相比显着性增高（p<0.05）。神经突触免疫组化的定性和定量结果显示,GelMA支架组的synaptophysin阳性信号明显高于Gelatin组和空白对照组（p<0.05）,证明GelMA支架内有更多的突轴形成。星形胶质细胞和胶质疤痕的染色结果显示,Gelatin组和空白对照组有大量的胶质细胞增生和胶质疤痕形成,而GelMA组明显少（p<0.05）。通过对比12周后CD31标记的血管内皮细胞的图片,GelMA组比另外两组有着更多的荧光,定量结果显示差异有统计学意义（p<0.05）。[结论]用电纺水凝胶纤维构建的软仿生支架,不仅促进了神经干细胞的迁移,诱导其分化为神经元,而且抑制了其向胶质细胞分化,减少胶质瘢痕的形成,同时促进了血管生成。此外,该支架具有较高的弹性,可以在缺少骨性椎管保护的情况下抵抗变形。仿生的水凝胶微纤维在促进活体脊髓功能再生方面被证明是有效的。
赵腾飞[8]（2019）在《PHBV/PLA/Col微/纳米纤维支架的构建及其在脊髓损伤修复中的应用和机制研究》文中研究指明[背景和目的]生物材料常被用于修复脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后损伤的神经组织并用来引导轴突的生长。脊髓损伤后神经再生的研究最重要的挑战之一是如何有效设计构建具有模拟脊髓神经细胞外基质环境并促进神经纤维再生的人工支架。纳米纤维支架因相对于其他材料具有较高的表面积体积比,能够提供种子细胞外基质从而为组织再生提供更加自然的环境。鉴于纳米纤维表面结构可通过改变星形胶质细胞的形态进而影响其基因和蛋白的表达水平,我们推测通过调节PHBV/PLA系列电纺膜表面微纳结构可抑制星形胶质细胞活化并引导神经纤维的再生。本研究通过静电纺丝制备不同直径和比例的PHBV,PLA和胶原复合纳米纤维支架,明确具有不同微纳结构的PHBV/PLA系列微/纳纤维支架对星形胶质细胞活化的影响,系统探讨复合PHBV/PLA/Col系列纳米材料表面微纳结构在脊髓损伤后移植保护残留神经元,减轻脊髓损伤区域胶质瘢痕聚集及脊髓损伤后替代同种异体硬脊膜修复硬脊膜缺损,减轻炎症反应,促进运动功能恢复的作用。[方法]实验一:检测PHBV/PLA/Col纳米纤维支架的表面形态及化学特性,星形胶质细胞在该支架上的增殖及毒性试验通过MTT及LDH测定。星形胶质细胞在支架上的分化及基因表达的变化通过免疫荧光及实时定量PCR检测。在大鼠胸段脊髓半横断损伤模型当中（缺损直径3 mm）,80只SD大鼠被随机分为五组:假手术组,单纯损伤组,损伤后移植PHBV/PLA组,损伤后移植PHBV/PLA/Col（70:30）组,损伤后移植PHBV/PLA/Col（50:50）组。术后采用BBB评分每周对大鼠后肢运动功能进行评分。术后8周大鼠灌注后获取标本进行HE、免疫荧光染色及相关蛋白表达量测定。实验二:构建P-P-C 1.5和P-P-C 4.5纳米纤维膜,SEM检测其纤维直径及孔径大小,微/纳膜对VSC 4.1的增殖及毒性试验通过CCK-8及LDH测定。埋植实验测定其降解周期及局部炎症反应情况。在大鼠胸段脊髓打击损伤模型当中（Allen,s法）,72只SD大鼠被随机分为6组:假手术组,单纯损伤组,损伤后切开减压移植同种异体硬脊膜组,减压后移植P-P膜组,减压后移植P-P-C 1.5膜组,减压后移植P-P-C 4.5膜组。术后采用BBB评分每周对大鼠后肢运动功能进行评分。术后3天和8周大鼠灌注后获取标本进行HE、LFB染色及相关蛋白表达量测定。[结果]:实验一:PHBV/PLA/Col纳米材料显着抑制星形胶质细胞的活化,但不明显抑制其增殖,无明显毒性作用,qPCR结果显示星形胶质细胞在该材料上培养14 d后其BLBP,GLT-1,S-100的表达明显增加,但其GFAP,CSPG,neurocan及phosphacan等的表达减少,体内动物实验显示,术后4周PHBV/PLA/Col组CD68及GFAP的表达量显着减少,术后8周PHBV/PLA/Col组脊髓损伤交界区GFAP表达降低,相反,其NF-200表达升高,运动功能评分也明显高于对照组。然而PHBV/PLA/Col（70:30）和 PHBV/PLA/Col（50:50）两组无明显差异,但在 BBB 评分上两者有差异。实验二:P-P-C微/纳膜对VSC4.1细胞基本无毒性并且促进其增殖,SEM显示其和纤维膜粘附良好。P-P-C 4.5组纳米纤维膜皮下埋置后7天和28周,炎症反应均低于P-P组和P-P-C 1.5组。脊髓损伤硬脊膜减压术后3天,同种异体膜移植组和微/纳膜移植组炎症小体NLRP3减少,炎症因子IL-1β,TNF-a表达降低,CD68表达也减少,其中P-P-C 4.5组炎症小体表达明显降低。术后8周,微/纳膜移植组大鼠脊髓损伤区域GFAP蛋白表达相对于单纯损伤组和同种异体膜移植组有所降低,但微/纳膜移植组之间无显着性差异,GAP43蛋白表达各组之间均无明显差异。[结论]:PHBV/PLA/Col微/纳纤维支架生物相容性较佳并且能促进星形胶质细胞的增殖但抑制其活化,PHBV/PLA/Col（70:30）和PHBV/PLA/Col（50:50）纳米纤维能抑制星形胶质细胞的激活,减轻脊髓损伤后胶质瘢痕的形成并保护残留神经元,促进运动功能的恢复。制备的P-P-C 1.5和P-P-C 4.5促进VSC 4.1的粘附增殖,P-P-C系列微/纳膜可替代同种异体硬脊膜,修复缺损的硬脊膜后能明显减轻炎症反应,并降低脊髓损伤区域GFAP的表达。
聂继平[9]（2018）在《n-3多不饱和脂肪酸通过抑制mTORC1信号通路促进脊髓损伤运动功能康复的实验研究》文中提出背景脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）,是临床上骨科常见的一种疾病,具有发生率高、致残率高和耗费高的特点。探索脊髓损伤的有效治疗措施一直是医学领域研究难点与热点。大量研究对脊髓损伤修复进行了尝试,对脊髓轴突再生及损伤后功能恢复有一定的提高,但距损伤的完全修复尚有一定距离。n-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs）,包括两个或两个以上碳碳双键的脂肪酸,对人体生理病理代谢尤为重要中的。最近的研究发现饮食中增加比例,能延缓衰老,增强记忆力,降低糖尿病并发症及心血管病发病率,还可以抑制结肠、乳腺癌等癌症疾患中癌细胞的复制。伴随脊髓损伤相关研究的深入,发现n-3PUFAs与神经、免疫系统等生理活动密切相关,可改变细胞膜的流动性,从而在神经递质合成中产生影响,对SCI的修复发挥重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白受体（mTORC1）能全面调控细胞代谢、生长、增殖、存活,并调节机体的自噬活动。有研究表明,抑制mTORC1信号通路活性可增强机体损伤部位自噬活动,从而协助损伤机体的修复。那么n-3PUFAs是否能通过调节损伤脊髓部位mTORC1和自噬活性,来达到促进脊髓损伤修复呢?目的:探讨外源性n-3PUFAs对脊髓损伤后运动功能康复的影响,并对其可能机制作初步探讨,为脊髓损伤的临床防治提供新视角。方法:实验大鼠随机分组,构建T10脊髓挫伤模型,不同n-3PUFAs含量的饲料喂养。通过气相色谱法分析术前和术后大鼠血清和脊髓中PUFAs构成,行为学检测、电生理检测进行运动功能评估,实时逆转录-聚合酶链反应、免疫组织荧光染色、免疫印迹检测损伤部位脊髓修复情况、mTORC1和自噬活性。此外,应用体外实验证实PUFAs对神经细胞mTORC1和自噬的作用。结果:成功建立脊髓挫伤模型。高n-3PUFAs含量饲料喂养组大鼠术前、术后脊髓及血清中n-3PUFAs含量及n-3PUFAs/n-3PUFAs比率显着高于低n-3PUFAs含量饲料饲养组及正常饮食喂养组（P<0.05）。BBB运动功能评分及电生理检测结果显示,高n-3PUFAs含量饲料饲养组的运动功能恢复显着优于其余两组（P<0.05）。术后8w,高n-3PUFAs含量饲料饲养组损伤部位脊髓MBP,Galc,GFAP和TUBB3表达水平高于其余两组（P<0.05）。术后2w,高n-3PUFAs含量饲料饲养组 mTORC1 相关蛋白 p-Akt（S473）、p-S6（S235/S236）、p-S6（S240/S244）、p-S6K表达水平低于其余两组（P<0.05）。在术后1w、2w,高n-3PUFAs含量饲料饲养组损伤部位脊髓LC3-Ⅱ自噬相关蛋白表达较其余两组增强（P<0.05）。体外实验显示,n-3PUFAs能够对神经细胞mTORC1和自噬分别起到抑制和促进作用。结论:外源性n-3PUFAs可抑制mTORC1信号通路活性,加强脊髓损伤部位自噬活动,从而促进脊髓损伤运动功能恢复。
杨二柱[10]（2016）在《PLGA导管联合雪旺细胞与骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究》文中指出目的:比较两种不同三维结构PLGA神经导管移植于完全性脊髓损伤动物模型后对其功能恢复的影响。评估导管联合细胞的治疗策略对完全性脊髓损伤的治疗效果。方法:采用PLGA材料做成两种不同三维结构的神经导管,移植于完全性脊髓损伤大鼠模型上。术后通过运动功能恢复情况,空腔形成大小,轴突再生数量以及损伤区域神经元数量来比较两组间的差异。将PLGA导管联合激活态的雪旺细胞和或骨髓间充质干细胞移植于成年大鼠脊髓损伤形成的3mm胸脊髓缺损处。术后第3天及每周测量各组大鼠BBB评分及爬网格运动;术后第2,4,8周检测各组大鼠电生理恢复情况。术后第4和8周,功能检测完毕后,取脊髓标本制作冰冻切片,并进行HE和Nissl染色来计算空腔面积大小,GFAP观察疤痕形成情况,免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞分化、神经再生、髓鞘形成及特异神经组织抗原表达情况同时采用透视电镜观察髓鞘形成情况。术后第8周,AS+MS组部分大鼠接受了再切手术。结果:术后8周在促进运动功能恢复、减小空腔面积大小、增强轴突再生及神经元存活上导管1较导管2更有优势。体内移植4周以后,接受神经导管联合激活态的雪旺细胞与骨髓间充质干细胞移植的大鼠,在BBB评分和电生理检测上显示了明显的神经功能恢复。然而,接受空导管移植和损伤对照的大鼠未能检测到神经功能恢复。移植后第4周和第8周,免疫组织化学检测分析显示移植的骨髓间充质干细胞于移植损伤区域存活,并分化成神经元样细胞与宿主神经元建立连接。在激活态雪旺细胞与骨髓间充质干细胞联合移植组,损伤区域观察到大量的再生纤维,同时NF200免疫组化染色确认这些再生纤维为神经组织。此外,在移植损伤区域检查到髓鞘碱性蛋白阳性表达的髓鞘结构,并通过电镜检查予以证实。很重要的一点是,在激活态雪旺细胞与骨髓间充质干细胞联合移植大鼠的损伤区域发现,少量骨髓间充质干细胞来源的神经元样细胞除表达成熟神经元标志物外,还表达突触素。结论:本研究的结果表明,采用PLGA材料做成内含微导管的神经导管移植于完全性脊髓损伤处,能良好的与宿主脊髓结合。ASC诱导的MSC来源的神经元样细胞与内源性神经元细胞相互接触及局部神经通路的形成,促进了严重脊髓损伤后的功能恢复。这种移植物来源的神经连接所带来的功能重建通过脊髓的再次横断予以证实。AS+MS组接受再切手术后大鼠BBB评分立即降到完全性脊髓损伤水平。多孔道的PLGA神经导管有效的将完全性脊髓损伤的断端桥接在一起,同时联合细胞移植策略促进了MSCs的存活和神经分化,增强了轴突的再生和功能的恢复。该研究结果表明,联合移植激活态的雪旺细胞和骨髓间充质干细胞与多孔道的高分子聚合物神经导管,可以作为一种新的治疗脊髓损伤的组合策略。
二、细胞移植与脊髓再生（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞移植与脊髓再生（论文提纲范文）
（1）ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、总论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（2）骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体对脊髓损伤的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤的基因表达谱分析 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6治疗脊髓损伤 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脊髓损伤的细胞移植治疗 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（3）低强度脉冲超声激励雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、低强度脉冲超声对雪旺细胞的体外调控作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.1.2 低强度脉冲超声激励系统完善及探头支架系统的构建 |
| 1.1.3 雪旺细胞的提取及培养 |
| 1.1.4 雪旺细胞的纯度鉴定 |
| 1.1.5 雪旺细胞的营养因子分泌检测 |
| 1.1.6 雪旺细胞的增殖活性检测 |
| 1.1.7 雪旺细胞的流式凋亡检测 |
| 1.1.8 雪旺细胞的细胞迁移检测 |
| 1.1.9 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 雪旺细胞的形态及纯度鉴定 |
| 1.2.2 LIPUS对雪旺细胞营养因子分泌的影响 |
| 1.2.3 LIPUS对雪旺细胞增殖能力的影响 |
| 1.2.4 LIPUS对雪旺细胞凋亡的影响 |
| 1.2.5 LIPUS对雪旺细胞迁移能力的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 LIPUS在调节细胞生物学特征中的作用 |
| 1.3.2 雪旺细胞在中枢神经系统修复中的作用 |
| 1.3.3 雪旺细胞高效获取的方法比较 |
| 1.4 小结 |
| 二、LIPUS-SCs移植修复脊髓损伤及其机制研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验动物及分组 |
| 2.1.4 脊髓损伤动物模型的制备及护理 |
| 2.1.5 细胞移植治疗 |
| 2.1.6 大鼠BBB评分 |
| 2.1.7 ELISA检测大鼠脊髓组织内的营养因子的表达情况 |
| 2.1.8 大鼠脊髓组织HE染色 |
| 2.1.9 大鼠脊髓组织NF200/GFAP免疫荧光染色 |
| 2.1.10 Western blot法检测NRG1/ErbB信号通路的改变情况 |
| 2.1.11 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 运动功能恢复评价 |
| 2.2.2 脊髓组织营养因子表达及炎性调节情况 |
| 2.2.3 脊髓病变部位的形态学观察 |
| 2.2.4 轴突生长及星形胶质细胞活化情况 |
| 2.2.5 NRG1/ErbB信号通路关键蛋白进行检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 细胞移植治疗在脊髓损伤修复中的作用 |
| 2.3.2 营养因子及炎性调节在神经保护中的作用 |
| 2.3.3 NRG1/ErbB信号通路与脊髓损伤 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 图1.LIPUS设备及雪旺细胞激励模型示意图 |
| 图2.雪旺细胞及激活态雪旺细胞(预损伤7d)鉴定 |
| 图3.神经营养因子表达及细胞增殖活性变化分析 |
| 图4.LIPUS激励对细胞凋亡影响 |
| 图5.细胞迁移能力评价 |
| 图6.大鼠运动功能评分 |
| 图7.细胞移植后脊髓组织局部神经营养因子的表达 |
| 图8.细胞移植后脊髓组织局部炎症因子的表达 |
| 图9.细胞移植后脊髓组织HE染色 |
| 图10.细胞移植后脊髓组织NF200/GFAP免疫荧光染色 |
| 图11.细胞移植后脊髓组织NRG1/ErbB信号通路关键蛋白表达 |
| 综述 雪旺细胞联合移植策略在脊髓损伤修复中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）振荡电场刺激联合神经干细胞移植促进大鼠脊髓损伤后神经功能恢复（论文提纲范文）
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 电场刺激治疗脊髓损伤的机制及研究进展 |
| 参考文献 |
（5）HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 引言 中文摘要 英文摘要 英汉缩略语名称对照 第一部分 |
| HUC-MSCs联合hNSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究 前言 一、 |
| 材料与方法 二、结果 三、讨论 四、结论 附图 参考文献 第二部分 |
| HNSCs移植联合电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究 前言 一、材料与方法 二、结果 三、讨论 四、结论 附图 参考文献 文献综述 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文 学位论文评阅及答辩情况表 英文论文一 英文论文二 |
（6）活性氧响应性高分子材料和多功能可注射水凝胶用于脊髓损伤治疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脊髓 |
| 1.2 脊髓损伤 |
| 1.3 脊髓损伤的分类和病理 |
| 1.3.1 原发性损伤和继发性损伤(二次损伤) |
| 1.3.2 脊髓损伤的病理 |
| 1.4 脊髓损伤模型 |
| 1.5 脊髓损伤的治疗手段 |
| 1.5.1 临床前研究 |
| 1.5.2 脊髓损伤的抗氧化治疗 |
| 1.5.3 纳米材料在SCI治疗中的应用 |
| 1.5.4 细胞治疗 |
| 1.5.5 作为组织工程的生物材料用于SCI治疗 |
| 1.5.6 生物材料和细胞移植结合治疗脊髓损伤 |
| 1.6 本论文的选题目的和主要研究内容 |
| 第二章 苯硼酸频哪醇酯连接的PEG化-脂质材料的合成及其用作活性氧响应性药物载体的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料与测试 |
| 2.2.2 mPEG_(2K)-COOH的合成 |
| 2.2.3 丙炔基异氰乙酰酰胺的合成 |
| 2.2.4 3-叠氮-1,2-丙二醇的合成 |
| 2.2.5 mPEG_(2K)-PBPE-alkynyl的合成 |
| 2.2.6 N_3-DSA的合成 |
| 2.2.7 mPEG_(2K)-PBPE-DSA的合成 |
| 2.2.8 mPEG_(2K)-PBPE- alkynyl的氧化行为 |
| 2.2.9 尼罗红标记纳米胶束的制备和尼罗红的释放实验 |
| 2.2.10 mPEG_(2K)-PBPE-DSA的临界胶束浓度(CMC)的测定 |
| 2.2.11 细胞毒性测定 |
| 2.2.12 mPEG_(2K)-PBPE-DSA胶束的细胞内吞 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 mPEG_(2K)-PBPE-alknyl的合成与表征 |
| 2.3.2 mPEG_(2K)-PBPE-alknyl在H_2O_2下的氧化 |
| 2.3.3 mPEG_(2K)-PBPE-alknyl在H_2O_2下的氧化断裂机理 |
| 2.3.4 mPEG_(2K)-PBPE-DSA的合成与表征 |
| 2.3.5 mPEG_(2K)-PBPE-DSA胶束的制备和基本性质表征 |
| 2.3.6 mPEG_(2K)-PBPE-DSA胶束的氧化响应性 |
| 2.3.7 mPEG_(2K)-PBPE-DSA胶束的内吞 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 含1,4-二噻烷侧基聚氨基酸的合成及其用作活性氧响性药物载体的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 使用仪器 |
| 3.2.3 2-羟甲基-1,4二噻烷(DTM)的合成 |
| 3.2.4 Boc-Glu(Odt)-Otbu的合成 |
| 3.2.5 2-羟甲基-1,4二噻烷酯谷氨酸(DTG)的合成 |
| 3.2.6 2-羟甲基-1,4二噻烷酯谷氨酸NCA (DTG-NCA)的合成 |
| 3.2.7 mPEG-b-PDTG的合成 |
| 3.2.8 mPEG-b-PDTG胶束的制备 |
| 3.2.9 mPEG-b-PDTG的临界胶束浓度(CMC)的测定 |
| 3.2.10 mPEG-b-PDTG胶束的氧化行为 |
| 3.2.11 DTM的氧化 |
| 3.2.12 尼罗红标记纳米胶束的制备和尼罗红的释放实验 |
| 3.2.13 细胞毒性测定 |
| 3.2.14 mPEG-b-PDTG胶束的细胞内吞 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 mPEG-b-PDTG的合成与表征 |
| 3.3.2 mPEG-b-PDTG胶束的制备和基本性质表征 |
| 3.3.3 mPEG-b-PDTG胶束的在H_2O_2下的粒径变化 |
| 3.3.4 mPEG-b-PDTG胶束的在H_2O_2下的浊度变化 |
| 3.3.5 mPEG-b-PDTG在H_2O_2下的结构变化 |
| 3.3.6 mPEG-b-PDTG胶束在H_2O_2下的尼罗红释放 |
| 3.3.7 mPEG-b-PDTG的细胞毒性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 活性氧响应性脂质-聚合物纳米粒子用于脊髓损伤后的神经保护 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 细胞和动物 |
| 4.2.3 丙炔(甲硫基)乙酸酯(PMT)的合成 |
| 4.2.4 poly(PMT-co-EDM)的合成 |
| 4.2.5 脂质聚合物纳米粒子(PELPNPs)的制备和表征 |
| 4.2.6 PELPNPs的细胞内吞 |
| 4.2.7 poly(PMT-co-EGDM)的氧化 |
| 4.2.8 PELPNPs的ROS响应性 |
| 4.2.9 DCFH-DA法测定PELPNPs清除ROS的能力 |
| 4.2.10 H_2O_2诱导星形胶质细胞死亡 |
| 4.2.11 PELPNPs的细胞保护能力 |
| 4.2.12 诱导型一氧化氮合酶(iNOS)免疫染色的体外实验 |
| 4.2.13 体外酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 4.2.14 大鼠脊髓挫伤模型和分组给药 |
| 4.2.15 药代动力学 |
| 4.2.16 PELPNPs的体内分布 |
| 4.2.17 行为学评估 |
| 4.2.18 组织准备 |
| 4.2.19 免疫组化和免疫荧光 |
| 4.2.20 TEM观察脊髓的超微结构 |
| 4.2.21 脊髓内ROS水平检测 |
| 4.2.22 ELISA法检测脊髓内的炎症因子 |
| 4.2.23 PELPNPs的体外细胞毒性评价 |
| 4.2.24 PELPNPs的体内毒性评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 poly(PMT-co-EGDM)的制备与表征 |
| 4.3.2 PELPNPs的制备与性质表征 |
| 4.3.3 PELPNPs的H_2O_2响应性 |
| 4.3.4 DCFH-DA实验证明PELPNPs的活性氧清除能力 |
| 4.3.5 PELPNPs对细胞的保护能力 |
| 4.3.6 PELPNPs的体外抗炎实验 |
| 4.3.7 PELPNPs的药物代谢动力学和组织分布 |
| 4.3.8 PELPNPs有助于SCI大鼠的运动功能恢复 |
| 4.3.9 不同制剂组SCI大鼠脊髓的解剖特征 |
| 4.3.10 PELPNPs体内活性氧清除、抗氧化应激和抗炎作用 |
| 4.3.11 PELPNPs的生物安全性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 可注射的水凝胶搭载神经干细胞原位移植对脊髓损伤的修复作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料与测试 |
| 5.2.2 4-arm-PEG-NHNH_2的合成 |
| 5.2.3 氧化葡聚糖(o-Dex)的合成 |
| 5.2.4 水凝胶的制备 |
| 5.2.5 水凝胶的动态流变学分析 |
| 5.2.6 水凝胶的微观结构 |
| 5.2.7 水凝胶的体外降解 |
| 5.2.8 水凝胶在体内降解过程及生物相容性评价 |
| 5.2.9 神经干细胞的转染 |
| 5.2.10 动物实验 |
| 5.2.11 运动功能评价 |
| 5.2.12 脊髓组织的组织学和免疫荧光分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 材料的合成 |
| 5.3.2 水凝胶的制备 |
| 5.3.3 水凝胶基本性质的表征 |
| 5.3.4 水凝胶的体外降解行为 |
| 5.3.5 水凝胶的体内降解及组织相容性评价 |
| 5.3.6 绿色荧光蛋白标记神经干细胞 |
| 5.3.7 在Gel4P-hy-D水凝胶中培养NSCs |
| 5.3.8 多功能的可注射水凝胶支架用于大鼠脊髓损伤的修复 |
| 5.3.9 大鼠运动功能评价 |
| 5.3.10 HE染色 |
| 5.3.11 NSCs在体内的分化 |
| 5.3.12 多功能的可注射水凝胶支架有助于髓鞘和轴突的生长 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（7）仿生静电纺水凝胶纤维束支架用于脊髓损伤修复的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 GELMA水凝胶生物支架的制作及其材料结构和性能表征 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二部分 GELMA水凝胶生物支架促进BMSCS和神经元的粘附和体外迁移的研究 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三部分 CELMA水凝胶生物支架促进脊髓损伤修复的研究 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、结果 |
| 四、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 明胶及甲基丙烯酸化水凝胶的制备及应用 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间已发表的论文、专利和学术获奖 |
| 主持或参与的科研项目 |
| 参加学术会议情况 |
| 致谢 |
（8）PHBV/PLA/Col微/纳米纤维支架的构建及其在脊髓损伤修复中的应用和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照缩写词表 |
| 第一部分 PHBV/PLA/COL微/纳纤维支架抑制星形胶质细胞活化降低脊髓损伤后胶质瘢痕聚集的研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料、仪器及实验动物 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PHBV/PLA系列微/纳纤维薄膜的构建及其表征检测 |
| 2.2 大鼠原代星形胶质细胞的纯化及鉴定 |
| 2.3 星形胶质细胞在PHBV/PLA系列微/纳膜上的生长和增殖 |
| 2.4 体内动物实验验证 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 微/纳米纤维支架的形态和化学特性 |
| 4.2 细胞和微/纳纤维膜相互作用充分说明PHBV/PLA/Col纤维膜的良好的生物相容性 |
| 4.3 微/纳纤维膜移植填补脊髓缺损减轻炎症反应并促进运动功能的恢复 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 7 参考文献 |
| 第二部分 特定微纳功能的PHBV/PLA/COL纳米纤维膜修复硬脊膜对脊髓损伤后炎症反应的影响 |
| 前言 |
| 1 实验试剂、仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器与材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PHBV/PLA系列微/纳纤维薄膜的构建及其表征检测 |
| 2.2 VSC 4.1在PHBV/PLA系列微/纳膜上的生长和增殖 |
| 2.3 微/纳米纤维支架膜拉伸力学性能测试 |
| 2.4 埋植实验 |
| 2.5 微/纳膜体内应用 |
| 3 结果分析及讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（9）n-3多不饱和脂肪酸通过抑制mTORC1信号通路促进脊髓损伤运动功能康复的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 第一章 |
| 大鼠脊髓挫伤模型的建立 1.1 |
| 前言 1.2 |
| 材料和方法 1.3 |
| 实验结果 1.4 |
| 讨论 第二章 |
| n-3多不饱和脂肪酸对脊髓损伤修复的影响 2.1 |
| 前言 2.2 |
| 材料和方法 2.3 |
| 实验结果 2.4 |
| 讨论 第三章 |
| n-3多不饱和脂肪酸促进脊髓损伤修复机制研究 3.1 |
| 前言 3.2 |
| 实验材料和方法 3.3 |
| 实验结果 3.4 |
| 讨论 参考文献 中英文缩略词对照表 博士研究生期间发表论文情况 致谢 综述 参考文献 |
（10）PLGA导管联合雪旺细胞与骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英语缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 不同三维结构的PLGA神经导管修复脊髓损伤的比较研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 PLGA导管制作相关材料与仪器 |
| 2.3 手术操作相关仪器与物品 |
| 2.4 HE染色及免疫组织化学相关仪器 |
| 2.5 试剂 |
| 2.6 试剂配置 |
| 3 方法 |
| 3.1 PLGA神经导管制作 |
| 3.2 扫描电镜观察 |
| 3.3 计算导管的孔隙率 |
| 3.4 神经导管体外降解率及体内组织相容性测定 |
| 3.5 完全性脊髓损伤模型制作 |
| 3.6 术后大鼠运动功能评分 |
| 3.7 大鼠灌注及标本取材与切片 |
| 3.8 HE染色 |
| 3.9 免疫荧光染色 |
| 3.10 透视电镜检测 |
| 3.11 空腔面积计算 |
| 3.12 MAP2 阳性细胞及NF阳性神经纤维定量 |
| 3.13 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 两种不同规格的PLGA神经导管及其孔隙率 |
| 4.2 神经导管的体外降解率及体内组织响应性 |
| 4.3 手术 |
| 4.4 功能恢复 |
| 4.5 神经导管与大鼠脊髓整合效果及空腔形成 |
| 4.6 神经纤维再生 |
| 4.7 移植损伤处可见神经元细胞 |
| 4.8 新生神经纤维的髓鞘形成 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第三章 激活态的雪旺细胞与骨髓间充质干细胞联合多孔道的PLGA神经导管修复完全性脊髓损伤大鼠 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 PLGA导管制作相关材料与仪器 |
| 2.3 手术操作及电镜检查相关仪器与物品等 |
| 2.4 细胞培养所用仪器设备 |
| 2.5 冰冻切片、HE、Nissl染色及免疫组织化学相关仪器 |
| 2.6 试剂及抗体 |
| 2.7 试剂配置 |
| 3 方法 |
| 3.1 激活态雪旺细胞的分离培养及传代 |
| 3.2 雪旺细胞的鉴定 |
| 3.3 雪旺细胞纯度计算 |
| 3.4 骨髓间充质干细胞的分离培养及传代 |
| 3.5 骨髓间充质干细胞的鉴定 |
| 3.6 激活态的雪旺细胞与骨髓间充质干细胞在PLGA神经导管内共培养 |
| 3.7 脊髓损伤模型建立及细胞导管联合移植 |
| 3.8 术后运动功能评估 |
| 3.9 电生理检测 |
| 3.10 标本处理 |
| 3.11 免疫组织化学检测 |
| 3.12 HE染色和Nissl染色 |
| 3.13 电镜检测 |
| 3.14 空腔面积计算 |
| 3.15 细胞定量分析 |
| 3.16 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 与ASCs体外导管内共培养促进了MSCs分化成神经元样细胞 |
| 4.2 运动功能恢复 |
| 4.3 电生理检测 |
| 4.4 神经再生 |
| 4.5 PLGA神经导管移植空和疤痕形成。 |
| 4.6 移植MSCs体内存活,分化及迁移 |
| 4.7 宿主神经元迁移至移植损伤区域 |
| 4.8 移植损伤区域新生轴突髓鞘的形成和神经递质的表达 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第四章 全文总结和展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其他相关成果 |
| 1.攻读博士期间发表及接受的相关论文 |
| 2.承担及参与课题(近三年) |
四、细胞移植与脊髓再生（论文参考文献）
- [1]ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究[D]. 李芳. 山东大学, 2021(11)
- [2]骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究[D]. 董万亮. 郑州大学, 2020
- [3]低强度脉冲超声激励雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究[D]. 吴宇. 天津医科大学, 2020
- [4]振荡电场刺激联合神经干细胞移植促进大鼠脊髓损伤后神经功能恢复[D]. 孙健. 安徽医科大学, 2020(02)
- [5]HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[D]. 孙磊. 山东大学, 2019(02)
- [6]活性氧响应性高分子材料和多功能可注射水凝胶用于脊髓损伤治疗[D]. 张田慧. 中国科学技术大学, 2019(02)
- [7]仿生静电纺水凝胶纤维束支架用于脊髓损伤修复的研究[D]. 陈春茂. 苏州大学, 2019(04)
- [8]PHBV/PLA/Col微/纳米纤维支架的构建及其在脊髓损伤修复中的应用和机制研究[D]. 赵腾飞. 浙江大学, 2019
- [9]n-3多不饱和脂肪酸通过抑制mTORC1信号通路促进脊髓损伤运动功能康复的实验研究[D]. 聂继平. 南方医科大学, 2018(01)
- [10]PLGA导管联合雪旺细胞与骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究[D]. 杨二柱. 上海交通大学, 2016(03)