一、高效畜牧生产的数量遗传工程（论文文献综述）
仪登霞,庞永珍[1]（2022）在《我国豌豆生产和育种的现状与问题》文中提出豌豆是经济和粮菜饲兼用作物,在我国农业可持续发展中发挥着重要作用。对我国豌豆生产概况、育种历程、育种目标、分子育种等方面进行概述,分析当前我国豌豆生产和育种中存在的问题并提出相应对策,以期为我国豌豆生产和育种提供有益参考。
江苏省人民政府办公厅[2]（2021）在《江苏省人民政府办公厅关于印发江苏省“十四五”新型基础设施建设规划的通知》文中指出苏政办发[2021]45号各市、县（市、区）人民政府,省各委办厅局,省各直属单位:《江苏省"十四五"新型基础设施建设规划》已经省人民政府同意,现印发给你们,请认真组织实施。2021年8月10日江苏省"十四五"新型基础设施建设规划新型基础设施是以新发展理念为引领,以技术创新为驱动,以信息网络为基础,面向高质量发展和增进人民福祉需要,提供数字转型、智能升级、融合创新服务的现代化基础设施体系。为抢抓新一轮科技革命和产业变革机遇,构建与新发展格局相适应的更高层次、更高水平新型基础设施体系,培育壮大经济发展新动能,根据《中华人民共和国国民经济和社会发展第十四个五年规划和2035年远景目标纲要》《"十四五"新型基础设施建设规划》《江苏省国民经济和社会发展第十四个五年规划和二〇三五年远景目标纲要》,制定本规划。
李丹阳,孙玲伟,吴彩凤,张树山,张德福,戴建军[3]（2021）在《长江三角洲白山羊保种群体的SSR遗传多样性分析》文中认为长江三角洲白山羊是皮、肉、毛兼优的地方山羊品种。通过微卫星标记（SSR）对长江三角洲白山羊保种群体进行遗传多样性分析,可为种质资源保护和品种改良提供数据支持。选取30个SSR标记,采用PCR扩增和毛细管电泳技术检测海门山羊、崇明白山羊和崇明地区杂交白山羊的遗传多样性。对各群体不同位点和各位点不同基因型进行分析。海门山羊、崇明白山羊和崇明地区杂交山羊群体中等位基因总数分别为205、191和147个,平均有效等位基因数（Ne）为4.012、3.812、3.092,平均期望杂合度（He）为0.683、0.668、0.617,平均观测杂合度（Ho）为0.726、0.691、0.633,平均多态信息含量（PIC）为0.647、0.630、0.567。三个群体的平均近交系数（Fis）为0.011 0,平均遗传分化系数（Fst）为0.050 7,平均基因流（Nm）为4.680 6。杂交山羊和崇明白山羊的遗传距离较近,和海门山羊遗传距离较远。系统进化树聚类分析表明,崇明白山羊与崇明杂交山羊聚为一类。两个纯种长江三角洲白山羊群体和杂交群体均表现出较高的杂合度、多态性和遗传变异;两个保种群体为中度遗传分化,近亲繁殖率低,存在基因交流,可用于种质资源的保存和利用。
张婷[4]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中指出近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
胡慧宇[5]（2021）在《FGF5基因编辑细毛羊的遗传稳定性和自身健康评估》文中认为
王凤红[6]（2021）在《山羊SNP芯片设计与内蒙古绒山羊重要经济性状全基因组关联分析及基因组选择研究》文中研究说明绒山羊是我国特色优势品种,所产山羊绒是我国唯一具有出口定价权的畜产品。内蒙古绒山羊因产绒量高、绒毛品质优良和遗传性能稳定而享誉世界。本研究基于课题组前期完成的不同山羊品种基因组、转录组数据筛选功能位点,研发出首张适用于国内地方山羊品种芯片,结合系谱和生产性能测定记录,构建了高质量参考群体,基于该芯片在内蒙古绒山羊群体内开展了全基因组关联分析及大数据基因组选择研究,对绒毛品质性状的遗传机理进行初步解析,确定了内蒙古绒山羊基因组选择最佳方法。本研究充分利用我国绒山羊种质资源优势,从基因组角度研究和挖掘一批与羊绒生产性状相关的分子标记和基因资源,为今后绒山羊遗传资源保护和利用提供科学依据,为内蒙古绒山羊优质高产新品系培育提供新的基因资源和理论指导。论文主要结果如下:1.基于课题组近30年测定积累的616 113条内蒙古绒山羊系谱和生产性能记录数据,通过ASREML软件,对内蒙古绒山羊重要经济性状进行遗传参数估计。结果表明:群、测定年份和个体年龄对各性状均有显着影响,可作为固定效应纳入模型。产绒量、绒细、毛长的遗传力分别是0.24、0.27、0.32,均属于中等遗传力（0.20-0.40）,体重和绒长属于低遗传力（0.12和0.14）。产绒量、体重、绒长、绒细、毛长之间的遗传相关在-0.32～0.40之间,表型相关在-0.02～0.20之间;发现各性状加性方差较前人研究减小,说明选育后的性状遗传变异减小,有利于选育目标性状的基因型得到有效选择和纯合性状表型更加整齐。2.利用36个典型的中国地方品种（372个个体）和49个国外品种（226个个体）的山羊基因组、转录组数据,同时最大化兼容Illumina山羊52K SNP芯片位点,添加课题组多年来积累的重要功能位点数据,累计约4 500万个MAF大于0.2的SNPs,采用条件性的多目标局域性优化算法,通过对SNPs严格筛选,最终保留67 088 SNPs位点,集成一款全新的山羊70K SNP芯片（GGP＿Goat＿70K）;基于山羊70K SNP芯片,在内蒙古绒山羊群体中进行基因分型测试,所有个体均成功分型,平均call rate98.8%。说明利用该芯片可以实现山羊的基因分型,同时获得了1 920个个体的基因型数据,可用于后续的GWAS和基因组选择研究。3.基于获得的1 920个个体的基因型数据,对内蒙古绒山羊的绒长、绒细和产绒量三个性状进行全基因组关联分析。首先对绒长、绒细和产绒量进行数据整理,检测表型数据是否符合正态分布;同时对内蒙古绒山羊群体进行主成分分析,判断是否存在群体分层现象;然后使用混合线性模型进行GWAS分析,通过分位数-分位数（Quantile-Quantile,Q-Q）图判断期望值和观测值的拟合程度。结果表明在基因组水平获得了4个显着SNPs,扩大100 kb后经注释发现GALNTL5、CCDC171、STUM、CMAS、FGF12、POLN、TACC3、PRLR、EVPL、COL3A1和SOX5为内蒙古绒山羊绒毛性状的重要候选基因,可以用于后续深入研究。4.基于70K SNP芯片在国内开展了绒山羊基因组选择研究,使用GBLUP和SSGBLUP方法估计了内蒙古绒山羊绒长、绒细、产绒量、体重和毛长5个性状的遗传力和基因组育种值,同时与研究一使用的ABLUP法获得的数据进行比较,并用5次重复的5倍交叉验证来评价育种值预测的准确性。结果表明（1）GBLUP和SSGBLUP法估计产绒量的遗传力为0.26和0.28;体重的遗传力为0.17和0.14;绒长的遗传力均为0.09;绒细的遗传力均为0.30;毛长的遗传力为0.31和0.32。（2）SSGBLUP对5个性状评估准确性在45%-82%之间,与ABLUP相比提高19%-25%;（3）SSGBLUP相比于GBLUP和ABLUP有更高的预测准确性和无偏性,SSGBLUP是内蒙古绒山羊基因组选择的最佳方法;（4）通过实施基因组选择可以使内蒙古绒山羊育种世代间隔从4.5年缩短至2年。
武静桥[7]（2021）在《共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究》文中研究表明肝细胞癌（HCC）异质性、死亡率和转移程度高,以血管增生为主要特征。早期患者临床症状不明显,晚期难以治愈,临床治疗较为棘手。人和动物患病率都逐年升高,耐药现象不断增加,因此,具靶向性的基因治疗成为肝癌治疗的研究热点。HIV反式激活转录（TAT）蛋白,源自人类HIV病毒TAT蛋白,可穿透细胞膜,促进大分子物质进入细胞质;Apoptin诱导的细胞凋亡受到Bcl-2和Apaf-1凋亡小体的调控,通过激活凋亡小体和Bcl-2调节的死亡途径,同时激活自噬和线粒体凋亡途径特异性诱导肿瘤细胞凋亡;肿瘤归巢肽RGD能够识别存在于癌细胞表面的整联蛋白,特异性靶向肿瘤的血管区;MEL通过与细胞膜结合,形成跨膜环状孔而使细胞膜破坏,细胞中的物质泄漏,细胞膜通透性增加,最终导致细胞溶解。本课题选择凋亡素Apoptin与蜂毒肽MEL作为肝癌靶向治疗基因,借助腺病毒作为载体,高效传递至靶细胞。将穿膜肽TAT与Apoptin融合表达,促进裂解的肝癌细胞中Apoptin蛋白二次内化进癌细胞;以靶向肽RGD靶向肝癌血管中的整合素受体,使其与MEL融合表达,引导MEL特异性杀伤肿瘤细胞,减轻对正常组织的非特异性损伤。共表达Apoptin与MEL基因,利用Apoptin以线粒体凋亡和自噬特异性诱导杀伤肿瘤细胞,同时,结合MEL溶解癌细胞的细胞膜、破坏细胞的完整结构特性,实现双基因协调抑瘤的目的,为肝癌的基因靶向治疗奠定基础。试验中将pMD-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL基因片段利用高保真特异性扩增,无缝克隆连接至线性化的GV314,构建腺病毒穿梭载体GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL。将腺病毒穿梭载体与大骨架质粒共转染至HEK293A细胞,包装纯化获得的重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin滴度为1010.75 pfu/m L,Ad-RGD-MEL的滴度为1010.38 pfu/m L,TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的滴度为1010.25 pfu/m L,Ad-EGFP的滴度为1011 pfu/m L。将各重组腺病毒分别侵染SMMC-7721细胞,间接免疫荧光和Western Blotting检测到肝癌细胞中目的基因成功表达;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL增加了活性氧的表达含量,促使细胞核DNA碎片化;重组腺病毒对L-02无显着抑制作用,对SMMC-7721与Huh 7细胞抑制作用呈现时间和剂量依赖性;流式细胞术检测1000 MOI重组腺病毒侵染SMMC-7721细胞36 h后,与对照组相比,Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的早期和晚期凋亡率均存在极显着升高（P<0.01）;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL极显着抑制SMMC-7721细胞的迁移,极显着抑制FBS介导的SMMC-7721细胞的侵袭和趋化作用（P<0.01）。重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够延缓裸鼠体重下降趋势;Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL组靶向性强,对正常组织器官损伤小,同时诱导肿瘤与肝脏中Caspase3和P53蛋白表达,凋亡细胞数增多。本实验成功包装了重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL,体外试验结果证实重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够显着抑制SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭。经异位瘤模型验证,重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL治疗组肿瘤中P53、Casepase3蛋白表达量增加,延缓裸鼠体重下降趋势,对正常组织无明显杀伤作用。综上所述,本试验表明重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够靶向抑制肝癌细胞,为比较医学和肿瘤靶向治疗提供理论基础。
俞海山[8]（2021）在《腾冲嗜热厌氧杆菌cmr1和cmr4的热适应机制研究》文中研究表明腾冲嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）的tte2635和tte2633基因分别被注释为cmr1和cmr4,属于CRISPR-CasⅢ-B亚型系统。前期研究发现腾冲嗜热厌氧杆菌在高温培养条件下CRISPR相关基因转录上调,CRISPR与嗜热机制的相关性研究尚未见报道,本论文为探究其嗜热机制进行了以下研究:1)嗜热菌中CRISPR结构特征分析。首先从Gene Bank下载61株嗜热菌的全基因组,利用软件分析嗜热菌的CRISPR结构特征与嗜热程度之间的关系。结果发现61株嗜热菌中有59株含有CRISPR位点,其中CRISPRⅢ型系统占比最多为49.62%,嗜热菌的CRISPR位点平均长度、间隔序列平均数量关系为:一般嗜热菌>中等嗜热菌>极度嗜热菌,重复序列对应的RNA二级结构最小自由能、CRISPR位点平均数量关系为:极度嗜热菌>中等嗜热菌>一般嗜热菌。CRISPR位点平均长度、间隔序列平均数量与嗜热菌嗜热程度负相关,重复序列对应的RNA二级结构最小自由能、CRISPR位点平均数量与嗜热程度正相关,嗜热菌的CRISPR结构特征与嗜热程度存在相关性。2)cmr1、cmr4基因与腾冲嗜热厌氧杆菌的嗜热相关性分析与验证。PCR扩增cmr1和cmr4基因,构建原核表达载体p ET-28a::cmr1和p ET-28a::cmr4并在大肠杆菌BL21中表达Cmr1和Cmr4蛋白,生物信息学分析发现两种蛋白是亲水性蛋白,均没有跨膜结构。通过荧光定量PCR分析cmr1和cmr4在50℃、60℃、75℃和80℃下的转录水平,发现在50℃和60℃表达量低,在75℃和80℃表达量很高。表明这两种基因在高温条件下发挥着重要作用。利用同源重组构建cmr1和cmr4基因的缺失质粒,导入腾冲嗜热厌氧杆菌中构建缺失株Δcmr1和Δcmr4,在50℃、60℃、75℃和80℃条件下培养并绘制生长曲线,发现Δcmr1和Δcmr4在80℃不生长,在60℃、75℃条件下相比WT生长缓慢,50℃条件下三种菌株生长都十分缓慢,表明这两种基因编码的蛋白在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应过程中发挥着作用。
薛静[9]（2021）在《重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价》文中研究指明禽流感（Avian influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的,严重危害我国养鸡业发展和人类健康的一种重要疫病,其中H9N2亚型AI在我国呈地方流行性,具有重要的经济和公共卫生学意义。灭活疫苗的免疫是我国目前防控的主要措施之一,但存在抗原谱窄,诱导免疫类型单一等问题,难以应对抗原的快速变异,所以免疫的养殖场仍时有暴发疫情的现象。相比之下,冷适应减毒活疫苗易于接种,能快速诱导机体产生黏膜、细胞和体液免疫,且更为安全。本实验室前期研制了一株H9N2亚型重组冷适应疫苗候选株rTX-HA-NA,现进一步对其生物学特性及理化特性进行测定;同时对其安全性和免疫效力进行评价,为疫苗的进一步开发奠定理论基础。1重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的遗传稳定性和理化特性评价首先对rTX-HA-NA进行了纯净性检测;接着将rTX-HA-NA分别在SPF鸡胚和SPF鸡上连续培养,检测其在体外和体内的遗传稳定性;最后将rTX-HA-NA经不同理化条件处理后,接种到鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast,CEF）中,通过测定细胞半数感染量（50%tissue culture infective dose,TCID50）以及血凝试验（HA）结果的变化探究rTX-HA-NA的理化特性。结果表明疫苗株无细菌和支原体污染。疫苗株在鸡胚上连续传代基因未发生突变,未改变生物学特性以及冷适应表型;经SPF鸡连续传代后,疫苗株的病毒检出率的显着降低,无毒力返强风险。疫苗株和母本毒rTX均对高温、乙醚和氯仿高度敏感,而对于1%胰酶具有较强耐受性。pH3.0-9.0范围内rTX-HA-NA的HA变化不显着。2重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的安全性评价将病毒通过滴鼻点眼方式接种SPF鸡和麻鸭,观察临床表现、局部反应和组织病理学变化,同时检测血液理化指标、病毒体内分布、环境传播及接触传播能力,系统评价冷适应疫苗株对靶标动物和非靶标动物的安全性。结果显示rTX-HA-NA接种SPF鸡后,血液的个别指标稍有变化,对增重、体温无影响;组织病理学观察及体内分布结果显示,肺脏充血出血,但较rTX组轻微,其他脏器病变不明显;喉头排毒率显着低于rTX组,泄殖腔不排毒;接触传播结果显示,rTX-HA-NA不发生接触传播;与母本毒相比,饲料、饮水、粪便拭子排毒率降低,对周围环境安全;rTX-HA-NA接种麻鸭后结果显示,疫苗株不引起非靶动物的临床表现,病理组织变化以及血液理化指标的改变。3重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的效力评价本研究通过对rTX-HA-NA免疫SPF鸡后诱导的体液、细胞及黏膜免疫水平进行了评价。血清检测结果显示rTX-HA-NA免疫后1周的HI抗体达5.2 log2,免疫后5周达到峰值8.75 log2。细胞因子检测结果显示,免疫后3 d和5 d,rTX-HA-NA组的细胞因子表达水平均显着高于rTX。黏膜免疫结果显示rTX-HA-NA组鼻腔和气管黏膜诱导产生的IgA表达水平均高于灭活rTX组;而灭活rTX组免疫后7 d鼻腔和气管中IgG表达水平高于rTX-HA-NA组。免疫效力试验结果显示,攻击同源病毒TX,P1和P15的rTX-HA-NA提供喉头排毒保护率分别为80%和90%的,泄殖腔排毒保护率均为100%;灭活rTX组提供喉头排毒保护率为80%,泄殖腔排毒保护率为100%。攻击异源毒株YZ-C,rTX-HA-NA只能提供一定的交叉保护。
张云峰[10]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中提出绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
二、高效畜牧生产的数量遗传工程（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、高效畜牧生产的数量遗传工程（论文提纲范文）
（1）我国豌豆生产和育种的现状与问题（论文提纲范文）
| 1 豌豆的重要用途 |
| 2 国内豌豆生产概况 |
| 3 豌豆育种历程 |
| 3.1 国内育种概况 |
| 3.2 主要育种单位和品种 |
| 4 豌豆育种目标 |
| 4.1 半无叶型豌豆新品种的选育 |
| 4.2 鲜食豌豆的品质改良 |
| 4.3 抗病豌豆育种研究 |
| 4.4 抗旱豌豆培育 |
| 4.5 适宜机械化收获的豌豆新品种选育 |
| 4.6 适于混播的豌豆品种培育 |
| 5 国内外豌豆分子育种进展 |
| 5.1 国内分子育种进展 |
| 5.2 国外分子育种进展 |
| 6 存在问题及相应对策 |
| 6.1 国内豌豆生产中面临问题 |
| 6.2 对策建议 |
（3）长江三角洲白山羊保种群体的SSR遗传多样性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验样品 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 微卫星位点的引物设计 |
| 1.2.2 PCR 扩增 |
| 1.2.3 毛细管电泳 |
| 1.2.4 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三个山羊群体等位基因频率分析 |
| 2.2 三个山羊群体在30个微卫星位点遗传多样性分析 |
| 2.3 三个山羊群体遗传变异结果 |
| 2.4 微卫星位点的遗传分化 |
| 2.5 三个山羊群体遗传距离及聚类分析 |
| 3 讨论 |
（4）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）山羊SNP芯片设计与内蒙古绒山羊重要经济性状全基因组关联分析及基因组选择研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 绒山羊育种研究进展 |
| 1.1.1 绒山羊概述 |
| 1.1.2 绒山羊育种现状 |
| 1.2 SNP芯片的研究进展 |
| 1.2.1 SNP分型芯片的特点 |
| 1.2.2 SNP分型芯片的分类及原理 |
| 1.2.3 SNP分型芯片在畜牧领域的概况及应用 |
| 1.3 全基因组关联分析研究进展 |
| 1.4 羊基因组选择研究进展 |
| 1.4.1 基因组选择理论 |
| 1.4.2 基因组选择方法 |
| 1.4.3 基因组选择影响因素 |
| 1.4.4 羊基因组选择研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 研究一 内蒙古绒山羊重要经济性状遗传参数的评估 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据来源 |
| 2.1.2 非遗传因素分析-广义最小二乘法 |
| 2.1.3 多性状重复力混合模型估计遗传参数 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 基本统计分析 |
| 2.2.2 固定效应的确定 |
| 2.2.3 遗传参数估计 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 遗传力 |
| 2.3.2 遗传相关 |
| 2.4 小结 |
| 3 研究二 山羊70KSNP芯片的研发设计与测试 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 芯片设计数据来源 |
| 3.1.2 芯片测试数据来源 |
| 3.1.3 主要分析软件及工具 |
| 3.1.4 主要试剂及仪器 |
| 3.1.5 位点筛选 |
| 3.1.6 位点优化 |
| 3.1.7 DNA提取 |
| 3.1.8 基因分型 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 70K SNP芯片的设计 |
| 3.2.2 70K SNP芯片与Illumina 52K SNP芯片的比较 |
| 3.2.3 位点检出率 |
| 3.2.4 位点MAF统计 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 研究三内蒙古绒山羊重要经济性状全基因组关联分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 样品采集 |
| 4.1.2 表型数据处理 |
| 4.1.3 数据质控 |
| 4.1.4 全基因组关联分析 |
| 4.1.5 GO、KEGG富集分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 表型数据的基本统计 |
| 4.2.2 数据质控及群体遗传结构分析 |
| 4.2.3 绒长性状的全基因组关联分析 |
| 4.2.4 绒细性状的全基因组关联分析 |
| 4.2.5 产绒量性状的全基因组关联分析 |
| 4.2.6 功能富集分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 研究四内蒙古绒山羊重要经济性状基因组选择研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 构建参考群 |
| 5.1.2 基因型数据 |
| 5.1.3 GBLUP |
| 5.1.4 SSGBLUP |
| 5.1.5 基因组准确性评估 |
| 5.1.6 世代间隔 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 群体结构和遗传参数 |
| 5.2.2 基因组预测准确性比较 |
| 5.2.3 世代间隔 |
| 5.2.4 选择效果分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论 |
| 7 创新点 |
| 8 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（7）共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 重组腺病毒在肝癌治疗中的研究进展 |
| 1.1.1 肝癌的研究背景 |
| 1.1.2 腺病毒载体的研究现状和问题 |
| 1.1.2.1 腺病毒载体的研究现状 |
| 1.1.2.2 腺病毒载体在肿瘤治疗中的进展 |
| 1.2 肿瘤靶向肽与细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.1 肿瘤靶向肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.2 细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.3 蜂毒肽的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.3.1 蜂毒肽的抑瘤机制 |
| 1.3.2 蜂毒肽的研究进展 |
| 1.4 凋亡素的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.4.1 凋亡素的抑瘤机制 |
| 1.4.2 凋亡素的研究进展 |
| 1.5 研究方案 |
| 1.5.1 技术路线 |
| 1.5.2 研究内容及意义 |
| 第二章 共表达GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.1.2 试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 溶液和培养基 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物设计 |
| 2.1.2.2 重组质粒pMD-TAT-Apoptin和 pMD-UBI-RGD-MEL提取 |
| 2.1.2.3 高保真扩增目的基因TAT-Apoptin和 UBI-RGD-MEL |
| 2.1.2.4 PCR产物胶回收 |
| 2.1.2.5 重组腺病毒载体构建 |
| 2.1.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因特异性扩增 |
| 2.2.2 GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.2.3 GV-TAT-Apoptin重组质粒鉴定 |
| 2.2.4 GV-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 共表达Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.1.4 溶液和培养基 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 细胞培养 |
| 3.1.2.2 重组腺病毒穿梭质粒与大骨架质粒提取 |
| 3.1.2.3 共转染HEK293A细胞 |
| 3.1.2.4 重组腺病毒扩增与纯化 |
| 3.1.2.5 重组腺病毒滴度测定 |
| 3.1.2.6 RT-PCR检测目的基因的表达 |
| 3.1.2.7 间接免疫荧光检测目的基因表达 |
| 3.1.2.8 Western blotting检测目的蛋白表达 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 各重组腺病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.2 RT-PCR检测目的基因转录情况 |
| 3.2.3 各重组腺病毒感染SMMC-7721 肝癌细胞情况 |
| 3.2.4 Western blotting检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达情况 |
| 3.2.5 间接免疫荧光检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组腺病毒体外抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 重组腺病毒和细胞系 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 CCK-8 法检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞、Huh7 细胞、L-02 细胞的杀伤作用 |
| 4.1.2.2 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达 |
| 4.1.2.3 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.4 细胞划痕试验检测SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.5 细胞趋化试验检测FBS介导的SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.6 细胞侵袭试验检测SMMC-7721 细胞侵袭能力 |
| 4.1.2.7 ROS检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞活性氧含量影响 |
| 4.1.2.8 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.9 扫描电镜观察 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 各重组腺病毒抑制L-02 细胞增殖 |
| 4.2.2 各重组腺病毒抑制SMMC-7721 细胞增殖 |
| 4.2.3 各重组腺病毒抑制Huh7 细胞增殖 |
| 4.2.4 各重组腺病毒SMMC-7721 细胞凋亡蛋白表达 |
| 4.2.5 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡结果 |
| 4.2.6 细胞划痕试验结果 |
| 4.2.7 细胞趋化试验结果 |
| 4.2.8 细胞侵袭试验结果 |
| 4.2.9 ROS含量检测结果 |
| 4.2.10 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡 |
| 4.2.11 扫描电镜观察各重组腺病毒诱导SMMC-7721 细胞形态变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒体内抑瘤作用研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 细胞系和试验动物 |
| 5.1.1.2 主要试剂 |
| 5.1.1.3 主要仪器 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 SMMC-7721 实体瘤模型的建立与荷瘤裸鼠治疗 |
| 5.1.2.2 病理切片制备及HE染色 |
| 5.1.2.3 免疫组织化学染色 |
| 5.1.2.4 TUNEL染色 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 荷瘤裸鼠体重变化曲线 |
| 5.2.2 各重组腺病毒对荷瘤裸鼠内脏器官及肿瘤重量影响 |
| 5.2.3 裸鼠各组织HE染色结果 |
| 5.2.4 肿瘤组织免疫组织化学结果 |
| 5.2.5 TUNEL染色结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读硕士学位论文期间发表的论文及着作 |
（8）腾冲嗜热厌氧杆菌cmr1和cmr4的热适应机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词中英文对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 极端环境微生物概述 |
| 2 嗜热菌及其嗜热机制概述 |
| 3 CRISPR及 Cmr1和Cmr4 概述 |
| 4 腾冲嗜热厌氧杆菌研究进展 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 嗜热菌中CRISPR结构特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 数据源 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 CRISPR位点查找 |
| 1.2.2 CRISPR结构的生物信息学分析 |
| 1.2.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CRISPR位点的数量与长度分析 |
| 2.2 CRISPR-Cas系统的类型分析 |
| 2.3 CRISPR重复序列分析 |
| 2.4 CRISPR间隔序列分析 |
| 2.5 CRISPR结构特征与生长温度之间的关系 |
| 3 讨论 |
| 第三章 腾冲嗜热厌氧杆菌cmr1、cmr4 基因的原核表达及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 主要培养基 |
| 1.1.5 主要溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 腾冲嗜热厌氧杆菌的复苏和培养 |
| 1.2.3 腾冲嗜热厌氧杆菌全基因组的提取 |
| 1.2.4 腾冲嗜热厌氧杆菌总RNA的提取 |
| 1.2.5 cDNA的合成 |
| 1.2.6 cmr1、cmr4 基因的扩增 |
| 1.2.7 原核表达载体的构建 |
| 1.2.8 Cmr1和Cmr4 蛋白的原核表达及纯化 |
| 1.2.9 荧光定量PCR |
| 1.2.10 生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 cmr1 基因和cmr4 基因的扩增 |
| 2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.3 Cmr1和Cmr4 蛋白的原核表达及SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.4 不同温度下的转录水平分析 |
| 2.5 生物信息学分析 |
| 2.5.1 cmr1和cmr4 基因序列及编码蛋白序列分子特征 |
| 2.5.2 cmr1和cmr4 基因编码蛋白质的疏水性分析 |
| 2.5.3 Cmr1和Cmr4 蛋白跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点的预测 |
| 2.5.4 Cmr1和Cmr4 蛋白结构预测 |
| 2.5.5 Cmr1 和 Cmr4 互作蛋白预测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 腾冲嗜热厌氧杆菌cmr1和cmr4 的缺失株构建及其耐热性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 主要培养基配制 |
| 1.1.5 主要溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 腾冲嗜热厌氧杆菌的复苏和培养 |
| 1.2.3 腾冲嗜热厌氧杆菌全基因组的提取 |
| 1.2.4 腾冲嗜热厌氧杆菌总RNA的提取 |
| 1.2.5 cDNA的合成 |
| 1.2.6 cmr1 左臂和右臂、cmr4 左臂和右臂的扩增 |
| 1.2.7 缺失质粒的构建 |
| 1.2.8 缺失株的构建及鉴定 |
| 1.2.9 生长曲线测定 |
| 1.2.10 相关基因荧光定量PCR |
| 2 结果 |
| 2.1 cmr1 左臂和右臂、cmr4 左臂和右臂的扩增 |
| 2.2 缺失质粒的构建 |
| 2.2.1 重组质粒MB::p BOL01::cmr1-L和 MB::p BOL01::cmr4-L的构建 |
| 2.2.2 重组质粒MB::Δcmr1和MB::Δcmr4 的构建 |
| 2.3 缺失株的构建及鉴定 |
| 2.4 生长曲线测定 |
| 2.5 相关基因荧光定量PCR |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（9）重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: H9N2亚型AIV疫苗研究进展及生物安全评价 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒的致病性研究 |
| 2 H9N2亚型AIV疫苗研究进展 |
| 3 疫苗生物安全评价 |
| 4 本研究的目的意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的遗传稳定性和理化特性评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的安全评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的效力评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
四、高效畜牧生产的数量遗传工程（论文参考文献）
- [1]我国豌豆生产和育种的现状与问题[J]. 仪登霞,庞永珍. 中国草地学报, 2022
- [2]江苏省人民政府办公厅关于印发江苏省“十四五”新型基础设施建设规划的通知[J]. 江苏省人民政府办公厅. 江苏省人民政府公报, 2021(15)
- [3]长江三角洲白山羊保种群体的SSR遗传多样性分析[J]. 李丹阳,孙玲伟,吴彩凤,张树山,张德福,戴建军. 中国农业科技导报, 2021(10)
- [4]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [5]FGF5基因编辑细毛羊的遗传稳定性和自身健康评估[D]. 胡慧宇. 新疆农业大学, 2021
- [6]山羊SNP芯片设计与内蒙古绒山羊重要经济性状全基因组关联分析及基因组选择研究[D]. 王凤红. 内蒙古农业大学, 2021
- [7]共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究[D]. 武静桥. 天津农学院, 2021(08)
- [8]腾冲嗜热厌氧杆菌cmr1和cmr4的热适应机制研究[D]. 俞海山. 甘肃农业大学, 2021(09)
- [9]重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价[D]. 薛静. 扬州大学, 2021
- [10]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)