一、一氧化氮与移植器官排斥反应（论文文献综述）
刘浩[1]（2021）在《缺血损伤相关的新生表位在器官移植术后体液性排斥中的作用及机制研究》文中研究表明新型免疫抑制剂的发明应用使器官移植术后的排斥反应发生率逐渐下降。临床上广泛使用的免疫抑制剂主要机制为T细胞抑制,这是因为既往认为细胞性排斥反应是移植术后发生排斥的直接原因,然而不断有临床数据发现即使采取了足量的T细胞免疫抑制治疗,仍然有排斥反应发生。直到后来研究发现是供体特异性抗体介导了排斥反应的发生,并对移植物失功甚至移植失败产生重要影响,进而影响着受体术后生存质量和存活率。抗体介导的排斥反应主要是由B细胞为主、T细胞辅助的体液免疫反应介导参与的。导致体液性排斥反应发生的抗体有很多,主要是抗供者HLA的抗体或ABO血型系统抗原的抗体。但越来越多的研究发现“非HLA抗体”也在损害移植器官中发挥了重要作用,“非HLA抗体”在移植中一般指的是自身反应性抗体和同种异体反应性抗体,种类繁多,其特异性针对HLA以外的靶点。炎症环境、抗原表达的增加以及通过翻译后修饰形成的新抗原都有助于非HLA抗体的形成,随后对移植物造成损伤。缺血再灌注损伤是影响器官移植术后受体发病率和死亡率的重要原因,因为缺血再灌注损伤与围手术期并发症息息相关,包括再灌注后综合征、移植延迟、原发性无功能以及急、慢性排斥反应。研究发现,细胞在缺血再灌注损伤的过程中会产生新抗原表位,然后引起机体产生获得性免疫分泌抗体与之结合进而加重再灌注损伤。这些缺血损伤相关的新生表位所带来的危害可能并不局限于缺血再灌注损伤本身,可能也会诱发或加重器官移植后机体的体液性排斥反应。一、缺血损伤导致新生表位的产生我们通过建立小鼠单次和二次肾脏缺血再灌注损伤模型来进行此部分研究（单次缺血:左肾行假手术,100天后行右肾缺血手术;二次缺血:左肾先行缺血手术,100天后再行右肾缺血手术）。病理及生化结果发现经历二次缺血的右肾组织和功能比单次缺血的右肾损害严重（p<0.05）,且首次左肾缺血时间越长,右肾损害越明显,表明首次左肾缺血对后期缺血的右肾产生了影响。ELISA结果提示血清中新生抗原表位ANAX4的抗体滴度在二次缺血损伤后较单次缺血小鼠显着升高（p<0.01）,提示ANAX4抗体可能与肾损害相关。流式细胞技术检测发现二次缺血损伤后小鼠脾脏中Tfh细胞、生发中心B细胞、记忆性B细胞比例增高,说明二次缺血损伤诱导了体液免疫的发生。免疫荧光结果显示ANAX4的新生抗原表位在各组中的表达情况无明显差异（p>0.05）,而血清中ANAX4抗体在二次缺血损伤后却增高,可能与记忆性B细胞激活分化为可分泌抗体的浆细胞有关。我们进一步在左肾缺血期间加用了T细胞免疫抑制剂FK506,结果显示FK506不仅可以减少二次缺血损伤后Tfh细胞在脾脏中的比例,也减少了生发中心B细胞、记忆性B细胞在脾脏中的比例,同时减少了血清中ANAX4抗体水平,右肾功能和病理损伤情况也得到好转,再次证明新生表位激活了体液免疫分泌抗体参与对机体的损害。此外,免疫荧光结果证实C4d和Ig G在肾缺血损伤时候会浸润肾组织,说明补体系统也参与了肾缺血损伤引起的体液免疫反应。二、缺血损伤相关的新生表位在器官移植中的作用及机制此部分我们建立了小鼠肾缺血100天后行异种小鼠肾移植的动物模型,在肾缺血时候或肾移植术时加用FK506,观察其对移植效果的影响。具体分组如下:sham,肾移植+FK506,肾缺血+肾移植,肾缺血+肾移植+FK506,肾缺血+FK506+肾移植+FK506。结果发现在肾缺血+移植组中的肾组织损害最严重,血清中ANAX4抗体水平也最高。而肾移植+FK506组与肾缺血+肾移植+FK506组比较,病理损害则较轻,ANAX4抗体水平也较低,这提示前期肾缺血对后期的移植肾组织产生不利影响,且可能与新生表位产生有关。而在移植肾的免疫荧光中,ANAX4抗原表位在各组间无明显差异,表明ANAX4抗体水平的变化与移植术后体液免疫反应有关。此外C4d和Ig G在肾缺血+肾移植+FK506组中沉积比在肾移植+FK506组中多（p<0.05）,也说明早期肾缺血更易导致补体对移植肾的损害。我们进一步检测了脾脏和移植肾引流淋巴结中的Tfh细胞、生发中心B细胞、记忆性B细胞的比例,结果显示肾缺血+肾移植+FK506小鼠的三种细胞比例较肾移植+FK506组更高（p<0.05）,这些结果再次表明早期肾缺血损伤更易导致移植术后体液免疫发生,从而对移植肾造成损害。而在肾缺血+FK506+肾移植+FK506组中,由于缺血期间应用了FK506,其病理损害、C4d和Ig G沉积较肾缺血+肾移植+FK506都有所下降,三种免疫细胞比例也降低（p<0.05）,提示早期应用FK506可以适当减轻损伤和免疫反应。移植术后体液免疫的活跃可能预示抗体介导的排斥反应的发生,于是我们进一步对供体特异性抗体进行了检测,如预期所料,前期肾缺血会导致肾移植术后DSA-Ig G升高,说明了抗体介导的排斥反应的发生,从而对移植肾造成排斥。三、新生表位诱导的移植术后体液性排斥反应的防治探讨第二部分证实早期肾血损伤相关新生表位会诱发移植术后的体液性排斥反应,此部分,针对免疫反应不同环节,我们将眼镜蛇毒因子、CTLA4-Ig和（或）FTY720用于移植术后体液排斥反应的治疗。结果发现眼镜蛇毒因子可以减轻移植肾病理损害,改善肾功能,同时降低血清中ANAX4抗体和DSA-Ig G水平,尤其在抑制补体沉积上作用明显,但其对新生表位生成和免疫细胞的比例变化上无作用。而CTLA4-Ig除了改善移植肾功能和损害等效果外,还能通过抑制Tfh细胞、生发中心B细胞、记忆性B细胞的活化、增值进而抑制体液性排斥反应。当与FTY720合用后这些效果进一步增强。以上结果说明CTLA4-Ig和FTY720联用是预防和治疗缺血损伤相关表位诱导的移植术后体液性排斥反应的有效方法。四、褪黑素对肾缺血再灌注损伤的作用及机制研究减轻缺血再灌注损伤也一直是研究热点。因为褪黑素具有调节节律、抗炎、抗氧化等作用,因此我们将褪黑素用于肾脏缺血再灌注损伤的研究。实验证明褪黑素预处理对肾脏有保护作用,褪黑素预处理后的小鼠即使经历缺血再灌注,组织损伤也较少,血清肌酐和尿素氮水平没有明显升高。褪黑激素的保护作用进一步通过降低氧化应激得到证实,表现为脂质过氧化降低,抗氧化能力增强。随后研究证明褪黑素预处理显着限制了肾缺血损伤时引起的促炎细胞因子产生和中性粒细胞、巨噬细胞的浸润。透射电镜和Western blot等结果提示褪黑素在缺血再灌注过程中可以诱导肾脏自噬产生,TUNEL结果证实褪黑素预处理可以减少细胞凋亡。进一步研究发现褪黑素可通过下调TLR4/My D88激发自噬发挥保护作用,此外,MEK/ERK/m TORC1通路的下调对于褪黑素介导的自噬也是必需的。综上所述,我们通过小鼠二次肾缺血损伤模型验证了新生抗原表位的产生以及对体液免疫的影响。然后通过肾缺血+肾移植模型明确了缺血损伤相关的新生表位可以诱导移植术后的体液性排斥反应并对移植物造成损害,进一步实验表明缺血早期或移植术后通过干预抑制免疫反应可减轻移植物损害和排斥反应。最后我们证实褪黑素可以在肾缺血损伤中通过诱导自噬发挥保护性作用。
王小东[2]（2019）在《过表达sFgl2的MSCs调节巨噬细胞抑制小鼠心脏移植急性排斥反应研究》文中研究说明研究背景:器官移植仍然是器官功能衰竭最有效的治疗方法,为了提高移植器官的存活时间,新的技术及免疫抑制剂的开发是主要的研究方向。然而,即使免疫抑制剂已经广泛应用,急性排斥反应（acute rejection,AR）仍是影响接受器官移植患者存活的主要障碍之一。而且,器官移植后长期使用免疫抑制剂通常会引起全身性的副作用,严重影响受者的长期存活与生活质量。寻求替代的抗排斥疗法来减少,甚至避免使用免疫抑制剂是一直以来的研究热点。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有低抗原性,可塑性强,向炎症部位聚集等特点,目前已经成为器官移植免疫排斥细胞治疗的重要候选者之一。但是MSCs抑制免疫排斥的能力有限,并且MSCs具有多个细胞亚型,难以确定哪种亚型在免疫排斥过程中发挥关键作用。由于MSCs具有较强的可塑性,通过转染的方法增强MSCs的功能是可行的方法之一。可溶性纤维蛋白原样蛋白2（soluble fibrinogen-like protein 2,sFgl2）,是一种主要由CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞和耐受性CD8+CD45 RC low Treg细胞分泌的免疫抑制因子。SFgl2主要通过与巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞表面FcγⅡB受体（FcγⅡB receptor,FcγⅡBR）结合发挥免疫调节作用。Sfgl2在出现耐受的小鼠心脏移植和肝脏移植模型中表达增高,并可以通过诱导M2型巨噬细胞分化抑制大鼠急性肝移植排斥反应。在肿瘤微环境中,sFgl2增高会促进肿瘤相关巨噬细胞分化并促进肿瘤进展。这些研究提示sFgl2可能通过调节巨噬细胞功能抑制排斥反应。研究目的:本研究的目的是寻找可以增强MSCs免疫抑制功能的方法,减少细胞治疗中MSCs的使用剂量。通过转染的方式使MSCs过表达sFgl2,进一步探究sFgl2-MSCs对巨噬细胞分化的影响及抑制小鼠心脏移植急性排斥反应的能力。研究方法:本研究共分为三个部分。第一部分,分离培养小鼠脂肪来源的MSCs,通过流式细胞术鉴定表型。克隆FGL2基因片段,将目的基因片段插入真核表达质粒中,获取含有目的基因的真核表达质粒,并构建慢病毒载体系统。转染MSCs并通过药物筛选获取稳定过表达sFgl2的MSCs。通过划痕实验,细胞增殖检测（cell counting kit-8,CCK-8）及流式细胞术分析,证实转染不会影响MSCs迁移能力,增殖能力及表型。通过体外炎症环境刺激,证实在炎症环境下sFgl2-MSCs过表达sFgl2的能力不受影响。在第二部分,通过将野生型MSCs（wild type MSCs,WT-MSCs）,阴性对照病毒（包含空载质粒）转染的MSCs（negative control MSCs,MSCs-NC）,sFgl2-MSCs或CsA与体外诱导的小鼠骨髓来源的巨噬细胞进行共培养,探究sFgl2-MSCs对巨噬细胞凋亡、功能及分化的影响,并探讨其发挥作用的机制。共培养条件为,将MSCs接种于transwell上室（0.4μm孔径）,初始巨噬细胞（M0）接种于tranwell下室进行共培养或接种初始巨噬细胞同时添加LPS+IFN-γ（M0+LPS+IFN-γ）进行共培养。通过transwell实验（8μm孔径）,检测共培养处理后的巨噬细胞迁移能力的变化。通过流式细胞术检测共培养处理后巨噬细胞凋亡比例及分化情况,western blot及qRT-PCR探究sFgl2-MSCs诱导巨噬细胞分化的可能机制。通过混合淋巴细胞反应,检测共培养处理后巨噬细胞对T细胞分化的影响。并检测巨噬细胞对微血管内皮细胞（microvascular endothelial cell,MVEC）凋亡的影响及高迁移率族蛋白B1（high-mobility group protein 1,HMGB1）表达影响。在第三部分,在小鼠心脏移植模型中,探究了sFgl2-MSCs对小鼠心脏移植急性排斥反应的抑制作用及对小鼠体内巨噬细胞分化的影响。首先通过显微外科技术建立了小鼠腹腔异位心脏移植模型,通过小鼠尾静脉或阴茎背静脉给予小鼠生理盐水,CsA或MSCs治疗。统计各组小鼠心脏移植物存活时间,苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）确认各组小鼠心脏移植物急性排斥反应情况,免疫组织化学染色确认各组小鼠心脏移植物中巨噬细胞浸润情况。流式细胞术分析受体小鼠脾脏细胞中巨噬细胞分化情况及比例,确认sFgl2-MSCs在小鼠体内对巨噬细胞分化的影响。研究结果:1.第一部分,成功分选并培养小鼠脂肪来源的MSCs,表型鉴定显示细胞高表达CD44,CD105,CD29及CD90,基本不表达CD45及CD34。成功构建了含有sFgl2基因的慢病毒载体,通过转染预实验,选择感染复数（multiplicity of infection,MOI）为200进行正式感染实验。转染后的MSCs通过嘌呤霉素筛选,可以获得在体外培养条件下稳定过表达sFgl2的MSCs。转染不会改变MSCs的增殖、迁移能力及表型。并且,在非炎症和体外模拟炎症培养环境下,sFgl2-MSCs可以稳定分泌sFgl2（745.59±13.31ng/mL vs 754.00±10.31 ng/mL）。2.第二部分,在急性排斥反应过程中,受体小鼠脾脏及心脏移植物中M1型巨噬细胞比例增加（P<0.05）,M2型巨噬细胞细胞比例降低（P<0.05）,促进巨噬细胞活化的因子HMGB1表达增加。这个结果提示巨噬细胞是参与急性排斥反应的重要细胞。进一步的研究探究了sFgl2-MSCs在体外对巨噬细胞凋亡、功能及分化的影响。流式分析结果显示在共培养条件下,各组巨噬细胞凋亡比例无差异（P>0.05）。吞噬实验结果显示,与M0共培养时,sFgl2-MSCs,WT-MSCs及MSCs-NC组FITC阳性细胞比例较对照组及CsA组增加（P<0.05）,但三组之间FITC阳性细胞比例无差异（P>0.05）;加入LPS+IFN-γ刺激时,对照组、CsA组WT-MSCs及MSCs-NC组FITC阳性细胞比例降低（P<0.05）,sFgl2-MSCs组阳性细胞比例增高（M0:46.93±1.02 vs M0+LPS+IFN-γ:58.53±2.50%）（P<0.05）。CsA不影响巨噬细胞迁移能力及分化。对于M0,sFgl2-MSCs,WT-MSCs及MSCs-NC组迁移能力及M2型巨噬细胞比例无差异（P>0.05）;加入LPS+IFN-γ刺激时,sFgl2-MSCs组巨噬细胞迁移能力增强并且高于其他处理组（P<0.05）,CD68+CD206+M2型巨噬细胞比例增高（M0:11.04±1.15%vs M0+LPS+IFN-γ:69.57±3.91%）（P<0.05）,并且明显高于其他处理组（P<0.05）。这提示sFgl2-MSCs发挥功能的节点可能在巨噬细胞活化、分化的过程中,而不是对M0发挥作用。与M0+LPS+IFN-γ共培养后,western blot检测sFgl2-MSCs组巨噬细胞中STAT1及P65表达及磷酸化均受到抑制,IκB表达增加但磷酸化受抑制,同时STAT3的表达及磷酸化明显增加。混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）结果显示,sFgl2-MSCs处理后巨噬细胞明显抑制Th1分化,促进Treg分化及活化。并且,sFgl2-MSCs处理后巨噬细胞促进MVEC凋亡能力减弱。3.第三部分,生存期分析结果显示,对照组心脏移植物存活时间为8.33±0.52天,CsA治疗组小鼠心脏移植物平均生存时间为58.83±7.67天,WT-MSCs及MSCs-NC组心脏移植物存活时间分别为15.3±1.03天,15.7±0.82天。SFgl2-MSCs治疗组小鼠心脏移植物生存时间为52.0±10.67天,较对照组及WT-MSCs及MSCs-NC组明显延长（P<0.05）。HE染色显示14天时,sFgl2-MSCs组急性排斥反应明显受抑制。在CsA及sFgl2-MSCs治疗组中,部分小鼠生存期可超过60天。在小鼠心脏移植模型中,sFgl2-MSCs诱导小鼠体内M2型巨噬细胞分化,小鼠脾脏Treg及TIGIT+Treg比例均增加,促进多种炎症抑制因子如IL-4,IL-10,TGF-β1的表达,抑制TNF-α,IL-6及IFN-γ的表达。与CsA广泛抑制T细胞功能的作用不同,通过抑制M1型巨噬细胞分化,促进M2型巨噬细胞分化可能是sFgl2-MSCs抑制急性排斥反应的机制。研究结论:经慢病毒转染系统可以获得稳定过表达sFgl2的MSCs细胞。SFgl2-MSCs可以通过JAK-STAT及NF-κB通路调节M2型巨噬细胞分化,并抑制M1型巨噬细胞细胞分化。在小鼠心脏移植急性排斥反应模型中,sFgl2-MSCs抑制急性排斥反应的能力优于WT-MSCs。并可以通过诱导炎症抑制因子如IL-10,IL-4,TGF-β1等表达,同时抑制炎症因子的表达。通过调控巨噬细胞功能可能是sFgl2-MSCs抑制小鼠心脏移植急性排斥反应的作用机制之一。
曲泽澎,贾兆锋,黄曦,蔡志明,牟丽莎[3]（2018）在《间充质干细胞在器官移植中的应用研究进展》文中指出器官移植是终末期器官功能衰竭的有效治疗方法。然而,移植受体需长期使用免疫抑制剂以降低器官移植免疫排斥反应。间充质干细胞（MSC）具有独特的免疫学特性,有望在器官移植中发挥重要作用。本文总结了MSC的免疫学特性,并就其在器官移植中减轻免疫排斥反应、诱导免疫耐受、促进组织修复、诱导新生血管形成以及在异种器官移植中的作用等方面的研究进展进行了简述,以期为MSC应用于器官移植提供参考。
张艺馨[4]（2017）在《GDF-15的过表达通过Foxo3a信号通路在心脏移植冷缺血再灌注损伤中起保护作用》文中认为心血管疾病始终是威胁人类生命和生活质量的主要问题之一。对于各种心血管疾病末期的患者心功能的减弱造成了生活质量的极度下滑,并实时都有生命危险。对于此类患者常规的内科治疗已不能有效的改善患者的症状和生活质量,而心脏移植给这些患者提供了一条可供选择的出路。然而心脏移植的成功与否受到很多因素的制约,其中缺血再灌注损伤是在心脏移植过程中导致移植术后心脏功能衰竭和免疫排斥反应发生的最主要因素之一。为了发现心脏移植过程中冷缺血再灌注损伤的新治疗靶点,我们通过前期的实验发现在心脏冷缺血再灌注损伤发生后,心肌细胞内GDF-15的水平增高,而GDF-15早有报道证明在机体各种炎性反应中对机体起到保护作用,那么在冷缺血再灌注损伤这一应激反应过程中GDF-15是否也能起到保护作用我们通过体内实验与体外实验两部分来研究GDF-15在冷缺血再灌注损伤过程中是否具有保护作用及其产生保护作用的作用机制。体内实验我们通过小鼠移植心脏24小时的冷缺血及移植后的再灌注来建立模型,体外实验我们应用H9C2细胞在低温缺氧的环境下模拟体内缺血再灌注模型。在我们的实验中,发现冷缺血再灌注损伤可以导致野生型C57BL/6小鼠非常明显的心脏内膜、心肌层、外膜的损伤,而在GDF-15转基因C57BL/6小鼠的移植心脏中我们观察到这种损伤明显的减弱,具体表现为:更少的炎性细胞浸润,更少的细胞凋亡与坏死,心肌组织保留更多的正常结构。同时我们还发现过表达的GDF-15能够抑制磷酸化的Rel A p65的表达,而Rel A p65被广泛的认知为前炎性因子和前凋亡因子。GDF-15的过表达还能在体内模型及体外模型中增加磷酸化的Foxo3a的表达。GDF-15还抑制细胞的凋亡和炎性细胞的浸润。因为心脏移植过程中成功与否的限制因素不仅仅由缺血再灌注损伤一项来掌控,术后的免疫排斥反应也占有很重要的地位。因此,我们也研究了GDF-15对移植术后免疫排斥反应的影响。树突状细胞是人体免疫系统的重要组成部分,树突状细胞的抗原提成作用在移植物和机体免疫反应之间起到重要的连接作用,我们通过比较从野生型C57BL/6小鼠骨髓中培养出的树突状细胞和GDF-15转基因C57BL/6小鼠骨髓中培养出的树突状细胞发现,GDF-15的过表达能够抑制树突状细胞的成熟和功能的发挥。在免疫排斥的环节中对移植物起到杀伤效的效应细胞是T细胞,我们发现GDF-15的过表达对T细胞的凋亡也有影响。GDF-15过表达能够使T细胞内的凋亡基因大量的激活,从而使T细胞凋亡,减弱T细胞对移植物的杀伤作用,从而减弱移植物的免疫排斥反应。应总而言之,本实验首次证明了GDF-15在心脏移植过程中的冷缺血再灌注损伤过程中起到保护作用,并且说明这种保护作用是通过调节Foxo3a信号通路和NFκB信号通路来实现的。结果:1在移植的冷缺血再灌注损伤过程中GDF-15起到保护作用。2 GDF-15能减少移植心脏细胞的凋亡并且减少炎性因子前体的产生。3 GDF-15在冷缺血再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡的过程中起到保护作用。4在心肌细胞的冷缺血再灌注损伤过程中GDF-15是通过Foxo3a信号通路来实现对心肌细胞的保护作用的。5 GDF-15可影响受体小鼠体内树突状细胞的成熟与功能。结论:在冷缺血再灌注损伤的过程中GDF-15高表达。通过GDF-15转基因小鼠与野生型小鼠的比较,我们观察到GDF-15能够在心脏的冷缺血再灌注损伤中起到保护作用,表现为在体内模型中使转基因小鼠的移植心脏保留更多的正常心肌结构,更少的炎性细胞浸润,更少的纤维化生成;在体外模型中H9C2细胞凋亡与死亡更少。并且这种对缺血再灌注的保护作用是通过上调磷酸化的Foxo3a和抑制磷酸化的Rel A p65的表达来实现的。同时GDF-15的过表达还能抑制树突状细胞的成熟和功能,并且GDF-15的过表达能够诱导T细胞的凋亡,从而缓解机体的免疫排斥反应。
庄权[5]（2014）在《宿主树突状细胞在器官移植中的来源与功能》文中进行了进一步梳理摘要：[目的]以前,人们认为由供体来源的树突状细胞（DC）介导的直接抗原识别途径在器官移植后的急性排斥反应中拥有主导地位；然而,近来的研究却表明宿主来源的树突状细胞介导的间接抗原识别途径在急性排斥反应中起到了更为重要的作用。供体树突状细胞存在于移植器官中,并且会被宿主来源的树突状细胞所代替。然而,这些组织定植的宿主树突状细胞的来源与功能却未被揭示。[方法]通过流式细胞技术和双光子活体显微技术（2PIM）对小鼠肾脏和心脏移植模型进行观察。[结果]我们可以观察到无论在同系还是同种异体移植的小鼠心脏和肾脏模型中,移植后3天内,宿主树突状细胞便会迅速取代供体树突状细胞；并且,大多数宿主树突状细胞都来源于宿主骨髓或脾脏起源的单核细胞,我们称之为单核细胞来源的树突状细胞（Mono-DC）。移植后第7天,同种异体移植物中的Mono-DC细胞数量5倍多于同系移植物,10倍多于未经移植的供体器官。但是,这种宿主树突状细胞集聚在移植器官中的现象会被环孢霉素A所抑制,说明树突状细胞在宿主同种异体免疫反应中起到了非常重要的作用。接着,我们利用骨髓嵌合体小鼠作为受体进行心脏移植,我们观察到宿主树突状细胞迁移进入移植器官需要趋化因子受体CX3CR1的参与,这种趋化因子受体多表达在单核细胞上。宿主树突状细胞进入移植器官后,定植在移植器官血管周围,将突触伸向血管内部,并介导抗原特异性的效应T细胞迁移至移植器官,之后,与这些效应T细胞形成稳定的接触,并帮助这些抗原特异性的效应T细胞从血液循环中迁移到移植器官组织中,形成更加持久稳定的相互作用。[结论]因此,宿主来源的Mono-DC迅速积累在移植器官并取代供体树突状细胞的过程,通过移植器官中T细胞的招募,滞留和进一步活化最终加速了器官移植后排斥反应的进程。同时,我们的结果也为同种异体移植排斥反应的病理过程和治疗提供了新思路。
张松林[6]（2010）在《诱导受体产生一氧化碳减轻小鼠移植心缺血再灌注损伤和排斥反应的机制研究》文中研究指明第一部分应用Tail-cuff技术改良小鼠颈部异位心脏移植模型目的小鼠颈部心脏移植模型是研究移植缺血再灌注损伤和排斥反应的理想模型,由于显微血管吻合的技术问题,限制了其在医学研究中的广泛应用。在本实验室既往应用套管法（cuff technique）建立该模型的基础上,本研究应用Tail-cuff技术（带尾套管法）改良小鼠颈部异位心脏移植模型。方法昆明小鼠用作预实验,C57BL/6和BALB/c小鼠用作正式试验。应用24G和22G静脉内导管制作成带有尾巴的动脉或静脉套管（Tail-cuff）,在准备受体血管时,Tail-cuff通过右颈外静脉或右颈总动脉近心端后,用显微血管夹一起固定其近心端和Tail-cuff管的尾巴,翻转血管并固定后分别与供心的肺动脉主干和升主动脉连接固定。结果应用这种改良技术,预实验手术成功率为72.2%（13/18）,总操作时间为56.2±8.9min。正式实验总操作时间为49.6±7.4 min,血管翻转和与供心连接时间分别为3.6±1.4min和4.1±1.1 min,正式实验（12例同系移植,24例同种移植）的成功率为100%（36/36）。结论应用Tail-cuff技术建立小鼠颈部异位心脏移植模型显示出一定的优越性,是一种理想的方法。第二部分诱导受体产生一氧化碳减轻小鼠移植心的冷缺血再灌注损伤目的一氧化碳（carbon monoxide, CO）是血红素加氧酶催化亚铁血红素生成的代谢产物之一,对大鼠肝、肺、肾和小肠的缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury, IRI）具有明显的保护作用。本研究在小鼠心脏移植模型的基础上,观察以二氯甲烷（methylene chloride, MC）诱导受体小鼠产生CO对移植心冷IRI的影响,并探讨其可能的机制。方法以Balb/c小鼠作为供、受者,建立颈部异位心脏移植模型。实验共分为4组,分别为MC100mg组（n=10）、MC500mg组（n=12）、橄榄油组（IR组,n=10）和正常对照组（N,n=5）。前3组在麻醉前3 h分别用经橄榄油稀释的MC100mg/kg、MC500mg/kg以及单纯橄榄油0.15ml（IR组）对受者进行灌胃处理,然后行颈部异位心脏移植；N组小鼠仅作麻醉处理,不进行心脏移植。分别于灌胃后0、1、3、6、12和24 h剪尾采血,测定血液中CO的含量[用碳氧血红蛋白（COHb）占总血红蛋白的百分比表示],并于相应时间点取心肌组织,检测心肌组织中CO的含量；各组移植后3h和24 h分别处死半数受者,检测移植后3h和24 h血清中肌钙蛋白I（cTnI）、心肌组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）、细胞凋亡与相关基因Bcl-2和Bax mRNA以及核因子κB（NF-κB）的表达,并观察移植心心肌的超微结构。结果与橄榄油灌胃比较,以MC100 mg和MC500 mg灌胃受者血液中COHb浓度与心肌组织中CO含量明显升高,均在灌胃后3 h达到峰值（P<0.01）。与IR组比较,MC100 mg和MC500 mg组受者心脏移植后3h和24 h,能显着降低血清中cTnI水平（P<0.01）,并以MC500 mg组降低最为明显;可明显下调促炎症基因TNF-a mRNA水平（P<0.01）,而抗炎症基因IL-10 mRNA上调不明显（P>0.05）,同时可以显着上调抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平（P<0.01）,并抑制促凋亡基因Bax mRNA的转录（P<0.01）；心肌超微结构损伤明显减轻,以MC500mg组最为显着。正常对照组可见少量NF-κB表达,而IR组、MC100mg组和MC500 mg组NF-κB活性均显着增强（P<0.01）,但后三组之间在相同时间点的NF-κB活性无明显区别（P>0.05）。结论诱导受体小鼠产生CO明显减轻小鼠移植心冷IRI,其主要机理与CO的抗炎和抗凋亡作用有关,且不受NF-κB信号转导通路的调节。第三部分诱导受体产生一氧化碳经PI3K/Akt信号途径抑制冷缺血再灌注诱导的移植心细胞凋亡目的CO是体内的一种重要信号分子。外源性低浓度的CO具有缓解血管损伤、排斥反应和急性肺损伤等功能,但涉及到的信号机理尚未完全阐明。本研究在小鼠心脏移植的基础上,观察诱导受体产生CO对移植心冷IRI中细胞凋亡的影响,并探讨其可能的信号机制。方法以Balb/c小鼠建立同系移植心冷IRI模型。受体用二氯甲烷（MC,500mg/kg体重）灌胃诱导受体小鼠产生CO（MC组,n=12）,或用橄榄油灌胃（IR组,n=12）,在MC组的基础上受体在移植心恢复血供前1h腹腔注射PI3K抑制剂LY294002（40mg/kg,LY组,n=10）或二甲亚砜（DMSO组,n=10）；检测移植后3h和24h（每一时间点n=5～6／组）移植心细胞凋亡并计算凋亡指数（AI）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白、Bcl-2与Bax蛋白的表达及Caspase-3蛋白酶活性;设立正常对照组（N组,n=5）。结果受体以MC灌胃后血液中COHb浓度与心肌组织CO含量均在3h达到峰值,分别为（9.82±0.84）%和2.25±0.08 pmol/mg；与IR组比较,MC组明显降低移植心AI[3h:（8.65±2.01）％vs.（19.28±4.94）％,P<0.01；24h:（5.82±2.36）％vs.（10.54±3.66）％,P<0.05].激活Akt蛋白（3h:P<0.01；24h:P<0.05）.抑制Caspase-3蛋白酶活性（3h:2.19±0.18 vs.3.31±0.36,P<0.05）、上调Bcl.2/Bax比值（3h：1.97±0.16比0.46±0.07,P<0.01；24h：1.89±0.10比0.51±0.04,P<0.01）；而与MC组比较,LY组明显增加AI[3h:（17.95±4.92）％,P<0.01:24h:（9.75±3.14）%；P<0.01]、抑制Akt蛋白激活（3h：P<0.01；24：P<0.05）、增强Caspase-3蛋白酶活性（3h：3.27±0.24,P<0.05）、下调Bcl.2/Bax比值（3h：0.47±0.06,P<0.01；24h:0.52±0.03,P<0.01）,从而逆转其抗凋亡作用；DMSO组与MC组的各个指标无明显统计学意义（P>0.05）。结论诱导受体产生CO能明显抑制冷缺血再灌注诱导的移植心的细胞凋亡,其机理可能与通过P13K/Akt信号途径对凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的调节有关。第四部分诱导受体产生一氧化碳减轻同种移植心排斥反应不依赖于Foxp3表达的上调目的CO由于具有强大的干扰体内氧运输的特性而通常被认为是一种有害的废弃物。事实上,低浓度的CO通过调节血管张力、抗炎、抗凋亡等作用缓解移植物缺血再灌注损伤。本研究在小鼠心脏移植的基础上,观察诱导受体小鼠产生CO对同种移植排斥反应和移植心存活时间的影响,并探讨其可能的机制。方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型（C57BL/6→Balb/c小鼠）。受体小鼠自移植前1d至移植后第6d（MC1w组,n=11）或至第13d（MC2w组,n=10）以含二氯甲烷（MC）100mg/kg体重灌胃,或以同体积不含MC的橄榄油灌胃（Tx组,n=6）。观测移植心存活时间,并于移植后6d、10d分别检测受体血清TNF-α、IL-10的含量、心脏移植物和受体脾脏TNF-α、IL-10、Foxp3 mRNA及Foxp3蛋白的表达、心脏移植物ICAM-1（细胞间粘附分子-1）及Caspase-3蛋白的表达；观察移植后6d、10d或移植物心跳停止时移植心胶原纤维增生程度及组织病理学变化。结果受体以MC灌胃后血液中COHb浓度在3h达到峰值,为（5.24±0.45）%；受体诱导CO可以明显延长移植心存活时间[Tx:（6.33±0.56）d; MC1w: （12.14±0.87）d, P<0.01vs.Tx; MC2w组：（19.38±0.95）d,P<0.01vs.Tx and MC1w];降低血清TNF-a的含量（MC1w组：P<0.01vs.Tx; MC2w组:P<0.01vs.Tx and P<0.05 vs. MC1w）;抑制心脏移植物和受体脾脏TNF-αmRNA的表达（MC1w组：P<0.01vs.Tx; MC2w组：P<0.01vs.Tx and MC1w）;抑制心脏移植物ICAM-1 （MC1w组及MC2w组：P<0.01vs.Tx）及Caspase-3的表达（MC1w组：P<0.01vs.Tx; MC2w组：P<0.01vs.Tx and MC1w）;减轻移植物内胶原纤维增生及淋巴细胞和单核细胞侵润的程度,以MC2w组最为明显；各组血清IL-10含量、心脏移植物和受体脾脏IL-10mRNA、Foxp3 mRNA及Foxp3蛋白的表达无统计学意义（P>0.05）。结论受体小鼠诱导CO明显减轻同种移植排斥反应并延长移植心的存活时间,其主要机制与可能与CO的抗炎症和抗凋亡功能密切相关,而并不依赖于移植物和受体脾脏内Foxp3表达的上调。
王丹[7]（2010）在《同种排斥CD4+T细胞差异表达基因筛选及PAE抗移植排斥作用的研究》文中进行了进一步梳理器官移植排斥反应是一种复杂的病理生理过程,伴有大量基因的表达变化,并且各个基因之间相互影响,形成一个复杂的基因调控网络系统,特别是那些与移植排斥密切相关的低表达基因及其意义难以探测和研究。迄今为止,同种移植排斥的分子机理尚未被完全阐明,器官移植排斥反应目前为止仍是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。近年来随着新型免疫抑制剂的不断涌现,一般情况下的临床急性移植排斥反应都得到有效控制。但是长期应用抗排斥药物,除高昂的费用外,所产生多种毒副作用,包括药物非特异性免疫抑制所致感染、肿瘤及药物的肝、肾及神经毒性是目前临床面临的严重问题。因此,深入研究并阐明移植排斥反应的分子机理,寻找特异性强,毒副作用小,效果更好的抗移植排斥药物,是移植免疫学领域迫切需要解决的问题。既往研究显示,T淋巴细胞和巨噬细胞在同种移植排斥中发挥关键作用。其中CD4+T细胞,无论是直接识别途径还是间接识别途径,与CD8+T细胞相比在介导同种移植排斥方面都显得更为重要。实验证明,在无其它种类的淋巴细胞存在的条件下,CD4+T细胞单独就足以引起同种移植排斥；外周缺失CD4+T细胞可使移植皮片存活时间明显延长。因此CD4+T细胞已经成为研究同种移植排斥的关键靶细胞,CD4+T细胞的移植排斥相关基因的表达状况受到高度关注。基因在组织器官中的差异表达是机体分化、发育、衰老等生命现象的分子基础,基因的差异表达特征为其功能研究提供了重要信息。应用RT-PCR及微阵列法对肾、肝、心脏、角膜及皮肤移植模型的研究证明,上述移植模型都存在基因表达的显着差异。以往研究报道,在同种移植排斥中,CD4+T细胞有多种基因异常表达,尽管研究表明这些基因与移植排斥密切相关,但是利用相关基因敲除小鼠或用特异性单克隆抗体阻断相关基因通路,对已知的移植相关免疫活化基因进行敲除或阻断,并不能完全阻断移植排斥,甚至某些条件下对移植物的生存无显着影响。研究结果提示,在同种移植排斥过程中除了已知的高拷贝表达基因外,可能还有一些低拷贝表达基因发挥重要作用。而以往的研究手段难以发现这些基因。主要原因一是目前常用的基因表达分析方法敏感度较低,不能发现低拷贝差异表达基因；二是大多数研究采用移植物组织或外周血细胞等多种细胞在内的复合组织为样本,由于多种细胞基因型及其表达谱的差异,目标细胞的基因表达情况被其他细胞亚群的数据干扰,许多有用的信息被淹没在背景信息之中。因此目前急需要构建一种能够限定目标细胞纯度,排除其他细胞及手术、创伤、感染等因素对目标细胞基因表达情况干扰的模型,并应用更敏感的基因表达检测手段进行分析,从而更好地筛选CD4+T细胞差异表达的移植排斥密切相关低拷贝基因,阐明CD4+T细胞介导移植排斥的确切机制。基因表达序列分析（Serial Analysis of Gene Expression, SAGE）是一种能够快速、详细、准确地反映生物体在不同的发育期及生理、病理状态下基因表达水平的有效工具,它不需已知基因序列,对低丰度转录本敏感,可发现新基因。凭借这些独特优势,SAGE现已广泛应用到生命科学的各个领域,为了解正常作用机制、肿瘤发病机制、信号分子调控机制提供了有效工具,但其在移植领域的应用尚处于起步阶段。应用SAGE技术寻找同种移植排斥相关低拷贝基因,并进行功能确定、封闭或敲除,对于深入研究移植排斥反应分子机理,发现早期特异性预测指标,研制特异性抗排斥药物都有着深远的影响。本课题第一部分利用SCID小鼠作为同种皮肤移植受体,采用CD4+T细胞过继性转输诱导同种移植排斥,有效排除手术、创伤、感染等因素的影响,避免CD4+T细胞的基因表达情况被其他类型T细胞亚群和B细胞的干扰,使背景更加清晰,并应用更敏感的SAGE技术建立基因表达文库,准确全面的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况,通过对差异表达基因进行功能分析,在基因组水平全面了解同种移植免疫排斥反应的基因表达的特点,为进一步探讨CD4+T细胞介导的同种移植排斥反应机理奠定坚实的实验和理论基础。氧化应激是指机体内高活性分子如活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species, RNS）产生过多或消除减少,从而导致组织损伤。研究证明氧化应激是引起多种移植物损伤的主要因素,近来研究发现抗氧化治疗能够减轻环孢霉素A（CsA）引起的器官毒性。因此寻找一种既能有效诱导移植耐受又能对抗氧化应激的免疫抑制剂,具有重要的临床应用价值。近年发现,非洲臀果木提取物（Pygeum africanum extract, PAE）具有抗炎、抗肿瘤、抑制细胞增殖、抑制细胞迁移的作用。本课题首先应用大鼠糖尿病膀胱内氧化应激模型,证明PAE可从多个指标上改善氧化应激状态。一氧化氮（Nitric oxide, NO）是活性氮簇之一,在免疫系统中发挥重要的生理病理作用。NO可作为一种重要的效应分子参与移植排斥。以往研究显示,人、小鼠、大鼠器官或组织移植后,血浆NO及组织NOS水平与移植排斥反应的严重程度呈正相关。特异性抑制NO生成,可以有效延长移植物存活时间。应用免疫抑制剂如CsA有效诱导移植耐受后,血浆NO水平也明显降低。研究证明,NO生成受多因素调节,巨噬细胞生成NO完全依赖于活化的CD4+T细胞,应用抗Thy1.2或抗CD4+T细胞的抗体能明显抑制浸润巨噬细胞产生NO,而用抗CD8+T细胞抗体后,NO生成无明显变化。CD4+T细胞依赖的NO生成可能与Th1／Th2平衡有关,Thl型细胞因子如IFN-γ,TNF-α促进诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）的表达,而Th2型细胞因子则通过上调精氨酸活化,抑制L-Arg的生物利用度,抑制NO生成和巨噬细胞活化。近年来干扰素调节因子家族（Interferon Regulatory Factors, IRFs）在机体免疫应答中的作用受到高度关注。IRF-1是γ-干扰素下游基因的转录激活因子,可以活化iNOS、IL-12、P40表达及Thl、CD8+T、NK细胞的免疫应答,在移植免疫领域受到高度关注。最初研究显示,IRF-2可作为拮抗剂与IRF-1竞争同一转录位点。但近来研究发现,IRF-2也是组蛋白H4、Bcl2、FasL的转录激活因子,IRF-2还与其他转录因子协同活化基因转录,例如与Statl形成复合物,参与细胞因子依赖的TAP1转录活化；与IRF-1协同活化CHTA和GBP1。此外,IRF-1和IRF-2基因缺失小鼠在Th1细胞分化缺陷,NK细胞发育异常和细胞因子分泌方面都有很大相似性,Bernd Elser等人研究结果显示IFN-γ通过IRF-1和IRF-2在转录水平上抑制IL-4表达,提示IRF-1和IRF-2是IFN-γ对抗Th2型免疫应答的重要调节因子。IRF-2在同种移植排斥中的作用尚未有报道。本研究建立的SAGE文库中,多个参与调节体内氧化应激水平的IFN-γ信号转导通路成员差异表达,同种移植排斥组干扰素调节因子-2明显升高（Interferon regulatory factor 2, IRF-2,同种移植排斥组：对照组=8：3,p=0.041）,因此我们推测机体接受同种抗原刺激后,CD4+T细胞上调IRF-2表达,调节CD4+T向Th1漂移,进而活化巨噬细胞生成NO,NO作为效应分子参与同种移植排斥。因此本课题第二部分在进一步验证IRF-2在同种移植排斥中的作用后,研究非洲臀果木提取物（Pygeum africanum extract, PAE）抗同种移植排斥反应的作用及机理。第一部分同种排斥CD4+T细胞差异表达基因的筛选目的：应用CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠的同种皮肤移植排斥模型,限定同种移植排斥中CD4+T细胞纯度,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对目标细胞基因表达情况干扰,并应用更敏感SAGE技术,准确全面的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况,为阐明CD4+T移植排斥反应机理奠定理论基础。材料和方法：建立CD4+T细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥组和对照组模型。同种移植组发生完全排斥时取脾,制备脾细胞悬液,用CD4+T细胞纯化柱纯化CD4+T细胞,流式细胞术鉴定细胞CD4+表型,确定细胞纯度。提取CD4+T细胞总RNA,构建SAGE文库,筛选鉴定出小鼠同种移植排斥相关低拷贝基因,并应用EASE软件对差异表达基因进行功能分析。结果：1.以SCID小鼠为移植受者,B6小鼠或BABL／c小鼠为移植皮片供者,3周后皮片愈合良好。此时过继输入野生型BABL／c小鼠纯化CD4+T细胞,14天后B6-SCID小鼠移植皮片发生排斥,而BABL／c-SCID小鼠移植皮片无排斥发生,表明成功建立了CD4+T细胞介导的小鼠同种移植排斥模型和同系对照组模型。通过对同种排斥高峰期脾CD4+T细胞基因表达SAGE文库确定的185个差异表达基因进行功能分析,发现68个基因具有已知生物学功能,包括37个在同种移植组高表达的基因和31个在同种移植组低表达的基因。主要涉及抗原递呈、细胞增殖、细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、细胞活化、防御反应、磷酸化、转录调节、细胞生长与维持、信号传导等功能,研究结果为从基因组水平深入研究移植排斥机理、寻找同种排斥关键基因,从根本上治疗和预防移植排斥奠定了实验基础。2.功能分析显示,多个参与调节体内氧化应激水平的IFN-γ信号转导通路相关基因显着性差异表达,如Statl（10：1,p=0.003）、Jak2（1：5,p=0.047）、Irf2（8：3,p=0.041）,提示氧化应激在同种移植排斥中具有重要意义。结论及意义：1.成功建立CD4+T细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对CD4+T细胞表达情况干扰,更准确的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况。2.SAGE文库确定的185个排斥高峰期脾CD4+T细胞差异表达基因与多种生物学功能密切相关,主要涉及细胞凋亡、转录调节、细胞生长及维持、信号转导和氧化应激调节等。3.参与IFN-γ信号转导通路的氧化应激相关基因在同种移植排斥中发挥重要的作用。第二部分PAE抗移植排斥作用的研究目的：氧化应激是引起多种移植物损伤的主要因素,抗氧化治疗可以减轻环孢霉素A等免疫抑制剂引起的肾脏毒性,延长移植物存活时间。本课题第一部分研究发现,同种移植排斥中,多个参与调节体内氧化应激水平的IFN-γ信号转导通路相关基因差异表达,提示氧化应激在同种排斥过程中具有重要意义。非洲臀果木提取物（PAE）具有抗炎、抗肿瘤、抑制细胞增殖、抑制细胞迁移的作用,推测该药物对同种移植排斥具有潜在的应用价值。但是该药物在移植免疫学领域的应用尚未见报道。本课题首次体内研究PAE对小鼠同种皮肤移植排斥的影响,并进一步探讨该药物对氧化应激模型和同种皮肤移植排斥过程中氧化应激相关基因IFN-γ、IRF-2、iNOS表达及活性的调节,旨在进一步探讨氧化应激相关基因在同种排斥中的作用及PAE的抗移植排斥机理。材料和方法：1.PAE对同种移植皮片存活状况的研究：建立脾细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,从建立模型第2天开始,药物组每天分别腹腔注射PAE 12.5 mg／kg、25 mg／kg、50 mg／kg、100 mg／kg,对照组给予相应剂量佐剂。逐日观察并记录移植物存活状态。2.PAE对氧化应激的作用：Wistar大鼠经股静脉注射STZ方法构建糖尿病膀胱组织氧化应激模型,对照组大鼠注射相应剂量佐剂。成功建立模型4周后,药物组大鼠每天灌胃给予PAE 100 mg／kg,对照组给予相应剂量佐剂,药物应用4周后,各组分别检测PAE对氧化应激组织的iNOS表达,CAT和SOD活性的影响。3.PAE抗移植排斥机理的研究：建立脾细胞过继转输-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,药物组分别给予不同浓度PAE,对照组给予相应剂量佐剂,移植第14天时（此时对照组完全排斥）,应用一氧化氮合成酶试剂盒,检测各组小鼠血清中总NOS活性；免疫组化检测移植皮片及脾脏iNOS表达状况；RT-PCR检测移植受者脾脏组织IRF-2、IFN-γmRNA表达情况；放射免疫分析法检测各组小鼠血清中TNF-α水平。在同种移植对照组排斥高峰期处死各组小鼠,取脾,制备脾细胞悬液,体外培养24h,收集上清。在LPS刺激的腹腔巨噬细胞培养中,加入上述不同组脾细胞培养上清,24h后检测培养上清中总NOS活性。结果：1.给小鼠同种皮肤移植模型体内应用PAE,25mg／kg／day,连续14天,可明显延长移植皮片的存活时间,改善移植物生存状况（p<0.05）。2.体内应用PAE,可明显降低氧化应激模型膀胱组织中iNOS蛋白表达,升高CAT及SOD活性（p<0.05）3.与对照组相比,25mg／kg PAE处理同种移植模型小鼠14天后,血清中总NOS活性,移植皮片及脾脏组织中iNOS蛋白表达明显受到抑制；脾脏IFN-γ和IRF-2 mRNA表达显着下调,模型小鼠血清中TNF-α水平明显降低（p<0.05）体外实验表明,25mg／kg PAE处理组第14天的小鼠脾细胞培养上清能够明显抑制巨噬细胞总NOS活性（p<0.05）。结论：25mg／kg／day PAE可以有效延长同种移植皮片存活时间；PAE抗排斥机理与其抗氧化应激作用有关,可下调同种移植排斥中氧化应激相关基因IFN-γ和IRF-2的表达,下调受体及移植物局部NOS表达及活性,抑制巨噬细胞分泌NOS和TNFα,有效改善移植物存活状态。研究结果为进一步阐明CD4+T细胞依赖的巨噬细胞分泌NO的机理奠定了基础,也为PAE应用于抗移植排斥提供了重要的实验依据。结论和意义1.本课题成功建立了CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对CD4+T细胞基因表达情况干扰,更准确地反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况。该模型构建的SAGE文库筛选出185个排斥高峰期脾CD4+T细胞差异表达基因,发现其具有多项生物学功能,最主要参与细胞凋亡,转录调节,细胞生长和维持,信号转导通路、氧化应激调节。研究结果为深入研究移植排斥反应分子机理,研制特异性抗排斥药物,从根本上治疗或预防移植排斥反应奠定了坚实的理论基础。2.对差异表达基因进行功能分类表明,多个参与IFN-γ信号转导通路的氧化应激相关基因差异表达,表明该通路在同种移植排斥中发挥重要作用。3.首次探讨了PAE体内应用对同种移植排斥反应的调节及机理,研究结果表明该药物可以明显延长移植物存活时间,其作用机理与通过降低氧化应激相关基因和蛋白,调控Th1／Th2相关细胞因子表达,抑制巨噬细胞生成NO有关。研究结果为进一步阐明CD4+T细胞依赖的巨噬细胞分泌NO的机理奠定了基础,也为PAE应用于抗移植排斥提供了重要的实验依据。创新点1.首次应用CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠同种排斥模型建立SAGE文库；在基因组水平对同种移植排斥中CD4+T细胞进行差异基因表达筛选,筛选出185个排斥相关低拷贝基因。2.筛选出的多数基因在移植领域迄今尚未见报道,表明SAGE是高灵敏、高通量基因转录组研究工具。筛选结果及功能分类研究丰富了同种排斥中CD4+T细胞基因表达信息资源,为今后确定同种移植排斥的关键基因提供了坚实基础,具有重要意义。3.首次探讨了PAE对同种移植排斥反应的作用及机理,研究结果表明该药物可通过调节机体氧化应激水平抗移植排斥,为PAE应用于抗移植排斥提供了重要的实验依据。
万芙荣[8]（2008）在《外周血淋巴细胞MHC-I在急性移植排斥反应中的变化规律》文中指出前言:组织和器官移植是20世纪最重要的医学成就之一。作为公认的终末期器官功能衰竭最有效的治疗手段,器官移植的成功主要取决于组织配型的进步、精湛的外科技术、新型免疫抑制药物的应用以及良好的抗感染处理。然而有些关键问题仍困扰着移植工作,急、慢性排斥反应导致移植器官功能丧失、长期服用免疫抑制剂增加了感染与恶性疾病的发生率等依然是临床移植工作面临的重要挑战。目前国际上公认的诊断急性排斥反应（Acute Rejection,AR）的“金标准”仍然是移植物局部组织病理学活检,但由于其对移植器官创伤大、花费高以及医师操作复杂、取样误差和连续检测困难等原因致使大多数病人不太愿意接受;而临床正在应用的多种无创性诊断方法,如生化学检测（C反应蛋白,CRP）、血液学检查（CD4/CD8比值、可溶性HLA、CD30、细胞因子、趋化因子等）、影像学检查、针对肾移植的尿液检查等等,其准确性、敏感性、特异性等方面的不足也使其在临床上的应用差强人意。由于目前尚缺乏有效、成熟的移植排异反应的早期监测指标,临床只有到脏器发生了实质性损害,功能检查异常时,才发现排异反应,导致治疗滞后,抢救成功率降低,所以,寻找一个早期的、快速的、无创的、特异性和敏感性都非常优越的监测指标能早期诊断AR是移植领域亟待解决的重大课题。众所周知,主要组织相容性复合体（MHC,人类的MHC分子为HLA抗原）是启动移植排斥反应的靶抗原,是移植免疫的主角。MHC分子具有高度的多态性,MHC-Ⅰ基因外显子2、3呈多态性,在移植配型时,决定供、受体是否匹配;外显子4编码的胞外区域和外显子5编码的重链跨膜区属于非多态区,不受多态性影响,能进行个体间定量比较。MHC-Ⅰ类抗原表达于所有有核细胞表面,尤以外周血淋巴细胞（PBLs）表达最多。淋巴细胞是机体对异种抗原发生免疫反应的主要细胞,其功能状态与其表面众多复杂的膜蛋白有关;淋巴细胞表面表达丰富的MHC-Ⅰ,却一直未引起研究者的重视。Le morvan研究发现宿主外周血淋巴细胞HLA-Ⅰ转录水平的表达随年龄增加而降低,使得机体容易诱发感染和肿瘤,认为淋巴细胞HLA-Ⅰ的表达可作为评价机体免疫功能衰退的指标;Hoffmann等研究证实淋巴细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达与其活性及凋亡有关;我们前期曾采用siRNA技术干扰淋巴细胞MHC-Ⅰ基因的表达后发现淋巴细胞的增殖和杀伤活性均明显下降。由此可见,淋巴细胞MHC-Ⅰ分子的表达与机体的免疫功能有关。那么,让我们感兴趣的是:当移植排斥反应发生时,1)移植受者PBLs MHC-Ⅰ有何变化,变化是否有规律性,能否预测移植排斥反应的发生?2)PBLs MHC-Ⅰ表达的变化与全身MHC-Ⅰ表达之间有何关系,能否作为宿主免疫功能的代表? 3)MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ哪个基因位点更适合于移植排斥反应的监测?4)MHC-Ⅰ转录水平和蛋白表达水平之间的关系如何,哪个更适合于移植排斥反应的监测? 5)免疫抑制剂对PBLs MHC-Ⅰ的表达有何影响?这一系列问题值得多角度、系统全面的动物实验加以研究。目前国内外文献对于AR发生时PBLs MHC-Ⅰ蛋白水平一过性升高已有报道,但对MHC-Ⅰ基因转录水平表达变化的研究尚未见报道。在MHC研究中,小鼠由于具有繁殖快、易于饲养并培育出了各种近交系、同类系、重组系,成为MHC研究中最重要的动物模型。本实验采用近交系小鼠进行大样本的动物实验是因为小鼠的MHC复合体（H-2系统）与人类的HLA系统具有极大的同源性,所以研究小鼠的H-2系统在移植排斥反应中的变化规律也能间接反映人类HLA系统的变化特点。本研究着眼于移植受者宿主免疫系统,采用经典的皮肤移植排斥模型,通过连续检测近交系小鼠同种异基因皮肤移植手术前后、排斥反应发生前后外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ类基因和蛋白水平的表达变化及其与免疫抑制剂应用剂量之间的关系,揭示移植排斥反应发生过程中,受者外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ类分子的动态变化规律;并从急性排斥标记物入手,探索PBLs MHC-ⅠmRNA的表达能否成为AR的诊断标记物,拟发现一种敏感的早期诊断急性移植排斥反应的无创性指标,监测急性移植排斥反应的发生,并为临床免疫抑制剂的个体化用药提供实验依据,从而提高移植手术的成功率。目的:1.建立检测移植受者外周血淋巴细胞（PBLs）主要组织相容性复合体（MHC）mRNA表达的实时荧光定量聚合酶链反应（Real Time PCR）的方法。2.通过动态连续检测宿主PBLs MHC-Ⅰ基因和蛋白水平的表达,揭示移植受者PBLs MHC-Ⅰ在急性移植排斥反应过程中的变化规律,探讨其表达与同种异体移植急性排斥反应发生进程的对应关系。3.通过检测不同免疫抑制剂单一和/或联合用药情况下,宿主PBLs MHC-Ⅰ/-ⅡmRNA表达的变化,探索免疫抑制剂剂量与宿主PBLs MHC基因表达之间的关系;并分析MHC-ⅠmRAN表达与环孢霉素A（CsA）血药浓度之间的关系,探讨移植受者外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRAN的表达能否作为评估机体免疫抑制程度的监测参数,从而为指导临床免疫抑制剂的个体化用药提供依据。4.通过与目前学术界已证实的移植排斥反应的无创性指标（外周血淋巴细胞HLA-DR、FasL）进行比较,探讨Real Time PCR方法检测移植受者外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA表达作为监测急性移植排斥反应无创性指标的可行性,筛选诊断AR的敏感指标。方法:1.Real Time PCR检测方法的建立。依据GenBank中小鼠MHC mRNA序列,根据MHC-Ⅰ/-Ⅱ基因外显子4、5中的保守序列自主设计筛选引物;以管家基因β-actin作为内参照,设计引物。运用SYBR GreenⅠ嵌合荧光Real Time PCR定量检测技术扩增MHC mRNA的表达。2.在第一部分（外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ与急性排斥的研究）研究中,将225只SPF（Specific Pathogen Free,无特殊病原菌）级近交系C57BL/6小鼠（组织相容性基因:H-2b）和BALB/C小鼠（组织相容性基因:H-2d）随机分为2组。对照组（n=30,30只正常健康的BALB/C小鼠作为皮肤移植术前对照）;实验组（n=195,移植未用药）:包括Ea组（n=65,同种异基因移植BALB/C组,H-2b to H-2d）,Eb组（n=65,同种异基因移植C57BL/6组,H-2d toH-2b）和Ec组（n=65,同种同基因移植组,H-2d to H-2d）。其中各实验组根据采血时间不同又分为术后不同时间组,每组5只小鼠。采用经典的小鼠皮肤移植排斥模型,标准方法进行皮肤移植手术。对上述各组分别采用实时荧光定量PCR方法连续检测移植受者PBLs MHC-Ⅰ（包括H-2K,H-2D）、MHC-Ⅱ（包括H-2Ia,H-2Ie）和FasL mRNA表达水平的变化,流式细胞术检测CD8+T细胞MHC-Ⅰ类抗原（H-2K）和MHC-Ⅱ类抗原（H-2Ia）的表达,H-E常规病理切片连续监测移植物发生排斥反应的组织学改变,并记录病理分级情况与排斥反应发生的时间。3.在第二部分（免疫抑制剂剂量对外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ表达的影响）研究中,首先,本实验研究了不同剂量免疫抑制剂对非移植手术小鼠PBLs MHC基因表达的影响。将90只SPF级近交系BALB/C小鼠随机分为4组。对照组（n=20,包括10只正常健康的BALB/C小鼠作为用药前对照组和10只给予安慰剂处理的小鼠作为实验对照组）和实验组（n=70,包括环孢素A（CsA）单一用药组,强的松（Pred）单一用药组,CsA和强的松联合用药组）;同时以上各实验组又包括不同剂量组:10mg/kg/day,20 mg/kg/day,40 mg/kg/day,60mg/kg/day,80 mg/kg/day,每组5只小鼠。对上述各组分别采用实时荧光定量PCR方法检测用药的非移植小鼠PBLs MHC-Ⅰ（H-2K,H-2D）和MHC-Ⅱ（H-2Ia,H-2Ie）mRNA表达水平的变化,探索可引起宿主PBLs MHC-Ⅰ基因表达下降的免疫抑制剂剂量,荧光偏振免疫分析法（FPIA）检测不同剂量CsA血药浓度的变化。其次,本实验还研究了不同剂量免疫抑制剂对移植手术小鼠PBLs MHC基因表达的影响。将285只SPF级近交系C57BL/6小鼠（组织相容性基因:H-2b）和BALB/C小鼠（组织相容性基因:H-2d）随机分为2组:对照组（n=30,30只正常健康不用药的BALB/C小鼠作为移植术前对照）和实验组。其中,实验组（n=255,移植用药组）包括:Ea组（n=85,同种异基因移植小剂量用药组,H-2b to H-2d,CsA 30mg/kg+Pred 30mg/kg）、Eb组（n=85,同种异基因移植大剂量用药组,H-2b to H-2d,CsA 60mg/kg+Pred 60mg/kg）和Ec组（n=85,同种同基因移植用药组,H-2d to H-2d,CsA 30mg/kg+Pred30mg/kg）。其中各实验组根据采血时间不同又分为术后不同时间组,每组5只小鼠。结果:1.实验小鼠一般情况和移植物肉眼观察以及组织病理学改变全部存活的实验小鼠一般状况良好,体重略有增加。同种同基因（同系）移植小鼠呈现移植耐受状态,无排斥现象发生,移植物的大体观察及组织病理学检查与移植前相比均无明显改变。与同系移植组不同,同种异基因（异系）移植小鼠均出现严重的排斥反应。当皮肤移植物变黑、变硬,边缘翘起,出现组织坏死,皮片面积缩小至原来的60%以上时,定为完全排斥。肉眼观察移植未用药BALB/C品系和C57BL/6品系组小鼠发生完全排斥的时间均为术后第11天左右,皮肤移植物平均存活时间（MST）为8.20±1.04,而移植用药小剂量组小鼠皮肤移植物发生完全排斥的时间为移植术后第18天左右,移植物MST为17.05±1.17,移植用药大剂量组小鼠皮肤移植物发生完全排斥的时间是移植术后第25天左右,移植物MST为25.08±1.11,与移植未用药小鼠相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。对移植小鼠的皮肤移植物进行局部组织学活检,经H-E染色后,组织病理学切片发现:与同系移植小鼠局部组织学无改变不同,异系移植小鼠移植皮片可见表皮及真皮层出现不同程度淋巴细胞和单核细胞的浸润。根据细胞浸润程度的不同将排斥反应的组织学改变分为病理Ⅰ-Ⅳ级。移植物组织病理学改变与移植排斥反应发生时间的对应关系为:移植未用药组、移植用药小剂量组和移植用药大剂量组分别于移植术后第2-4天、第2-8天和第2-15天出现轻微排斥,镜下可见少量的淋巴细胞和单核细胞浸润,为病理排斥Ⅰ级;于术后第5—8天、第9—15天和第16—22天出现轻度排斥,为病理Ⅱ排斥级;于术后第9-11天、第16-22天和第23天以后出现中度排斥,为病理排斥Ⅲ级;未用药和小剂量组于术后第12-14天、第23-26天出现重度排斥,为病理排斥Ⅳ级,而大剂量组由于受到实验时间的限制,尚未检测到重度排斥的发生。2.移植受者PBLs MHC mRNA表达在急性移植排斥反应过程中的变化规律。同系移植组小鼠PBLs MHC表达无明显变化。但是,异系移植组BALB/C品系和C57BL/6品系小鼠与移植排斥反应发生进程相一致,外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ/-ⅡmRNA表达均出现上调现象,其表达呈双峰升高的趋势,与未排斥小鼠相比差异有统计学意义。移植未用药组于术后第4—8天形成第1个峰,第9天逐渐降低之后又形成第2个峰,但在第9天表达的谷底水平仍高于术前水平。当给予移植受者免疫抑制药物后,小剂量用药异系移植组小鼠PBLs MHC-Ⅰ/-ⅡmRNA表达也升高,分别于术后第7—13天形成第1个峰,第15天左右出现第2个峰;其中第1个峰对应排斥反应病理分级的Ⅰ—Ⅱ级,第2个峰对应病理Ⅲ-Ⅳ级。而大剂量用药异系移植组小鼠由于CsA的强力免疫抑制作用使移植受者免疫功能状态明显受抑制,PBLs MHC-ⅠmRNA表达也有升高,与非排斥小鼠相比差异有统计学意义,但升高的幅度小,且出现的时间明显晚于小剂量组,升高表达呈单峰形式出现于移植术后第20天左右。AR发生时,异系移植（未用药和用药）组与同系移植组相比PBLs MHC-ⅠmRNA表达升高明显（P＜0.05）。以异系移植未用药组为例,PBLs MHC-ⅠmRNA升高表达出现的时间早,发生于移植术后第4天（排斥反应的早期阶段）,对应排斥病理分级的Ⅰ-Ⅱ级,比肉眼观察移植物出现完全排斥的时间早5-8天;升高表达持续移植排斥反应的整个过程,直至术后第13天移植物完全排斥为止,表明检测窗口期（明显检测到MHC-ⅠmRNA表达升高的时间）长;检测窗口期的敏感性较高（93.84%,61/65）。排斥反应发生时,异系移植（未用药和用药）组与同系移植组相比PBLs MHC-ⅡmRNA表达也显着升高（P＜0.05）,但与MHC-ⅠmRNA表达不同的是:MHC-ⅡmRNA升高表达出现的时间明显晚于MHC-ⅠmRNA,分别出现于移植术后第11天和第15天。3.流式细胞术检测结果显示,当排斥反应发生时,异系移植未用药组小鼠CD8+T细胞H-2K、H-2Ia抗原平均荧光强度（MFI）与术前对照组相比呈升高表达趋势,但差异不明显。异系移植用药小剂量组CD8+T细胞H-2K、H-2Ia抗原MFI在免疫抑制剂的作用下出现明显下调,但当排斥发生时H-2K、H-2Ia抗原MFI明显高于移植前水平和非排斥组表达水平（P＜0.05）,表明免疫抑制剂（CsA和强的松联合用药）可明显下调外周血淋巴细胞表面MHC-Ⅰ/-Ⅱ抗原的表达。4.对PBLs MHC-ⅠmRNA表达与其他公认的移植排斥反应的无创性指标进行比较,结果显示:与同系移植（未用药和用药）非排斥组相比,异系移植（未用药和小剂量用药）排斥组小鼠PBLs H-2Ie（相当于人类HLA-DR）)mRNA表达显着升高（P＜0.05）分别出现于移植术后第11天和第15天。同样,PBLs FasLmRNA表达排斥组较非排斥组也明显升高（P＜0.05）,分别出现于移植术后第9-13天和第15天左右,对应排斥病理分级的Ⅲ-Ⅳ级。因此,当急性移植排斥反应发生时,移植受者PBLs MHC-ⅠmRNA（尤其H-2K基因位点）表达升高出现的时间明显早于MHC-Ⅱ和FasL mRNAs的表达,且检测窗口期长,表明PBLsMHC-ⅠmRNA表达更能早期监测移植排斥反应的发生。5.不同剂量免疫抑制剂对非移植手术小鼠PBLs MHC基因表达影响的结果。CsA单一用药对宿主PBLs MHC-Ⅰ基因表达的影响,与给药剂量有关;但对宿主PBLs MHC-Ⅱ基因表达的影响,与给药剂量无关。在血药浓度稳定的初期,小剂量CsA（10,20,40mg/kg/day）单一用药可升高小鼠PBLs MHC-Ⅰ（H-2K,H-2D）mRNA表达,而大剂量CsA（60,80 mg/kg/day）单一用药可降低小鼠PBLs MHC-ⅠmRNA表达。研究中所使用的任何一个剂量的强的松单一用药以及CsA和强的松联合用药均可降低宿主PBLs MHC-Ⅰ/Ⅱ基因mRNA的表达。6.不同剂量免疫抑制剂对移植手术小鼠PBLs MHC-ⅠmRNA表达影响的结果。当排斥反应发生时,与对照组相比,小剂量和大剂量CsA和强的松联合用药异系移植组小鼠PBLs MHC-ⅠmRNA表达均升高,但大剂量组PBLs MHC-ⅠmRNA升高表达出现的时间明显晚于小剂量组,而且升高的幅度也比小剂量组低。从量-效关系上看,大剂量用药异系移植小鼠皮肤移植物的平均存活时间（MST）比小剂量用药和未用药异系移植小鼠的MST明显延长（P＜0.01）。从剂量与MHC基因表达的关系来看,大剂量CsA和强的松联合用药显着降低了宿主PBLs MHC-ⅠmRNA的表达,但当排斥反应发生时,异系移植排斥小鼠PBLs MHC-ⅠmRNA表达较非排斥小鼠明显升高,这说明研究所使用的免疫抑制剂剂量还不足以完全抑制机体对同种异体抗原的免疫反应,但可以延缓机体排斥反应的发生,表现为宿主PBLs MHC-ⅠmRNA表达升高出现的时间明显延迟,表明免疫抑制剂降低移植术后宿主PBLs MHC-ⅠmRNA表达水平与其应用剂量有关。结论:1.Real Time PCR方法连续动态检测移植受者外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ（尤其H-2K基因位点）mRNA表达有助于早期发现急性移植排斥反应的发生。2.大样本的动物实验,研究发现:移植受者外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA表达上调与急性移植排斥反应密切相关。3.移植受者外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA在排斥反应的早期阶段,呈稳定性高表达,且检测窗口期长,优于其它的诊断指标（MHC-Ⅱ,FasL）,可作为诊断早期移植排斥反应的无创性指标。
李向东[9]（2007）在《外周血单个核细胞MHC基因表达与早期急性移植排斥的研究》文中研究表明器官和组织移植是20世纪最重要的医学成就之一，目前移植术已成为组织、器官功能衰竭终末阶段最有效的治疗措施。同种异基因移植是临床最常见的移植类型，无论何种移植，只要移植物表达与受者不同的蛋白质或其他分子，移植物就会被排斥。如何早期诊断排斥反应，是临床医生面临的重要问题。目前临床上观察急性排斥反应主要依据病人的症状，特别是移植脏器的功能指标或活体穿刺，无论何种手段，发现都晚，延误了时机。正在研究的与急性排斥反应有关的指标，例如CD4+或CD8+T淋巴细胞检测，IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ等细胞因子检测，以及蛋白、酶类、补体和sCD30检测等，它们在敏感性、特异性和移植排斥早期检测上都存在一定的缺陷。现在仍未找到公认的、无创伤性的、敏感性和特异性均足以应用于临床监测的指标，本实验的研究目的主要是寻找更好的移植排斥检测指标。外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）主要为淋巴细胞和单核细胞，其中绝大多数为淋巴细胞。MHC-Ⅰ类分子几乎存在于所有有核细胞，外周血淋巴细胞表达MHC-Ⅰ类抗原量最多，现已确定，移植排斥反应所识别的耙抗原主要是表达于移植物细胞表面的MHC分子，MHC在移植中具有重要的作用，器官移植后发生急性排斥反应时宿主MHC有何变化?这方面很少有人研究，由于外周血比较容易检测，因此我们以外周血单个核细胞MHC代表宿主MHC来研究急性移植排斥反应时宿主MHC变化，希望能找到更好的移植排斥检测指标。本实验研究新西兰白兔皮肤移植后外周血单个核细胞表面MHC的变化，由于急性移植排斥反应和感染都可导致MHC异常，所以本实验也研究了新西兰白兔感染时外周血单个核细胞表面MHC的变化。选择新西兰白兔为动物模型，是由于动物相对较大，便于多次抽血连续观察，因此我们选用新西兰白兔作为动物模型，进行不同类型兔的同种异基因皮肤移植，相对于内脏器官移植来说，皮肤的移植排斥反应容易及时观测。以新西兰白兔自体皮肤移植作为实验对照，不同类型兔的皮肤移植作为实验组，观察外周血单个核细胞表面MHC的变化。新西兰白兔感染的研究我们以绿脓杆菌为代表，研究了新西兰白兔皮下注射绿脓杆菌后外周血单个核细胞表面MHC的变化。外周血单个核细胞MHC基因表达与早期急性移植排斥的实验研究中，15只新西兰白兔随机分为三组，3只自体皮肤移植为对照组，实验1组和实验2组各6只做同种异基因皮肤移植，实验1组术前1天及术后每天肌注环孢素（5m g／kg）。术后实验1组和实验2组应用抗生素预防感染，观察移植皮肤发生排斥时间，隔天抽外周血提取单个核细胞，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达，皮肤移植3后隔天取全层皮片进行病理检查。对照组即自体皮肤移植组，皮片生长良好，皮片颜色和硬度始终正常，未见急性排斥反应（AGR）。实验1组和实验2组于AGR发生前2天左右真皮散在单核细胞浸润，发生急性排斥时真皮可见较多淋巴细胞和单核细胞浸润，未见中性粒细胞浸润，证实发生急性排斥反应，并且没有术后感染。同种异体移植皮片发生排斥时间：肌注环孢素的实验1组为（7.75±0.72）天，未用环孢素的实验2组为（6.57±0.53）天。MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA相对定量表达结果表明，对照组移植前后MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达均没有明显变化。MHCⅠ基因mRNA表达在应用免疫抑制剂组呈上升趋势，但上升缓慢，到肉眼可见排斥时，达到最高值，未用免疫抑制剂组表达变化不明显。MHCⅡ基因mRNA表达在应用免疫抑制剂和未用免疫抑制剂组表达趋势基本一致，即在肉眼可见排斥反应前2-3天达迅速达到最高值，随后下降。急性排斥反应发生于移植术后数天至2周左右，以细胞免疫为主，CD4和CD8 T细胞被活化激活。外周血单个核细胞主要是淋巴细胞，其中大部分是T细胞。对上述MHCmRNA表达在皮肤移植后迅速增高可能的解释是，当发生急性排斥时，淋巴细胞被活化，细胞免疫和体液免疫增强，从而使外周血单个核细胞的MHCmRNA表达增高，相应的MHC类分子表达也增高。另外我们也检测了绿脓杆菌感染后血常规和MHC基因mRNA表达的变化。8只新西兰白兔随机分成两组，对照组3只，实验组5只。实验组5只新西兰白兔于实验前1天皮下注射绿脓杆菌，绿脓杆菌浓度为5×109CFU。对照组3只新西兰白兔实验前1天皮下注射相同体积的生理盐水。实验持续8天。术后每2天无菌抽取实验兔外周血1ml，先检测血常规，剩余抗凝血用于分离外周血单个核细胞，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。结果表明：对照组注射前后白细胞总数和中性细胞数没有明显变化。实验组注射绿脓杆菌后白细胞总数和中性细胞数明显升高。对照组注射前后PBMC MHCⅠ和MHCⅡmRNA表达无明显变化。实验组注射绿脓杆菌后PBMC MHCⅠ和MHCⅡmRNA表达较对照组明显升高。细菌感染目前临床上已经很容易发现和检测，血常规中白细胞总数、中性细胞数和中性细胞数的比率升高反应急性细菌感染。而急性移植排斥反应发生时，对照组、实验1组和实验2组实验前后血常规中白细胞总数和中性细胞数无明显变化。因此我们认为，利用外周血单个核细胞MHC基因mRNA表达检测急性排斥反应同时，检测血常规，如果血常规没有明显的白细胞总数、中性细胞数和中性细胞数的比率升高，而外周血单个核细胞MHC基因mRNA表达升高时，可以排除细菌感染引起的MHC基因mRNA表达升高，诊断为急性移植排斥。由于大部分病毒尤其是巨细胞病毒感染后，外周血单个核细胞表面表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子降低，这样如果检测到MHC基因mRNA表达升高，基本可以排除病毒感染，诊断为急性移植排斥。由于MHC分子极为丰富的多态性，制备相应的抗体十分困难。而实时定量RT-PCR是一种快速、准确和高度敏感的实验方法，我们知道MHC具有丰富的多态性，过去的研究难点是由于MHC分子的高度多态性而不能进行MHC分子的mRNA定量，我们首次在MHC的保守区做文章，设计跨保守区的引物，这样就能很容易的进行MHC分子的mRNA定量，这是我们创新性的一个亮点。另外，外周血单个核细胞分离比较容易。以上结果显示，外周血单个核细胞MHCmRNA表达可以考虑作为一种早期无创伤性的移植排斥检测指标，它在肉眼可见排斥反应前2-3天即皮肤移植排斥病理Ⅰ级时就呈明显上升趋势，早于目前已知排斥指标，特别是早于目前临床上的实质脏器功能指标，这样利用外周血单个核细胞MHC mRNA表达可以及时早期检测器官移植后的排斥反应，避免脏器功能损害。但是本实验是以看家基因β-actin作为内参来研究mRNA表达的变化，定量的标准和方法没有标准化，是其不足，以后的研究中应寻求更完善的mRNA表达方法。环孢素和糖皮质激素药物强的松是临床普遍应用的免疫抑制剂。环孢素是否能降低MHC基因的表达?各家说法不一，有的文献指出，环孢素能减少MHC基因的表达，而最近Lim SW则指出环孢素增加MHC基因的表达。环孢素对宿主MHC基因的表达有何影响?我们以新西兰白兔进行动物实验，研究新西兰白兔肌肉注射环孢素后外周血单个核细胞和宿主脏器（肝脏、脾脏、肾脏和胸腺）MHC分子基因表达变化情况，实验连续30天，来检测环孢素对宿主MHC基因表达的影响。糖皮质激素降低MHC基因的表达，这早有报道，但是以往没有系统全面的研究。我们这次是检测新西兰白兔服用强的松后，外周血单个核细胞和宿主多个脏器（肝脏、脾脏、肾脏和胸腺）MHC分子基因表达变化情况。在环孢素影响宿主MHC基因表达的实验中，13只新西兰白兔随机分成三组，对照组3只，低剂量环孢素组5只，大剂量环孢素组5只。低剂量环孢素组每天肌肉注射环孢素（5m g／kg），大剂量环孢素组每天肌肉注射环孢素（20m g／kg），对照组3只新西兰白兔每天肌肉注射相同体积的生理盐水。实验持续30天。实验开始前和实验结束时抽血，测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和血肌酐。每隔5天无菌抽取实验兔外周血1ml，分离单个核细胞，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。第30天实验结束取实验新西兰白兔肝脏、脾脏、肾脏和胸腺少许，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。实验30天结束时，大剂量环孢素组新西兰白兔谷丙转氨酶：实验前平均35IU/L，实验结束时平均73IU/L；谷草转氨酶：实验前平均38IU／L，实验结束时平均78IU／L；尿素氮：实验前平均6.13mmol/L，实验结束时平均21.72mmol／l；血肌酐：实验前平均62μmol／L，实验结束时平均274μmol／L。低剂量环孢素组（5m g／kg）和对照组实验前后没有明显变化。实验30天结束时，对照组和低剂量环孢素组新西兰白兔肝脏和肾脏病理检查无明显变化。大剂量环孢素组新西兰白兔肝脏呈急性环孢霉素中毒，包括肝内胆管淤胆、肝血管内红细胞增多和肝细胞气球样变性。大剂量环孢素组新西兰白兔肾脏呈急性环孢霉素中毒，包括管周毛细血管红细胞增多和近端肾小管上皮细胞等立方的空泡变性。以上血生化和病理检查证明大剂量环孢素（20m g／kg）已造成实验兔肝脏和肾脏损，所应用的环孢素剂量（20m g／kg）确实是大剂量。MHC分子mRNA表达结果表明，低剂量环孢素组和大剂量环孢素组外周血单个核细胞MHCⅠ和MHCⅡ表达在5-10天时呈显着上升趋势，15天后直到30天实验结束，MHCⅠ和MHCⅡ表达又下降到最初用药前水平。实验30天结束时宿主脏器（肝脏、脾脏、肾脏和胸腺）MHCⅠ和MHCⅡ表达没有明显变化。我们的实验结果和Lim SW的一样，应用环孢素后能增加MHC基因的表达。但这种增加是一过性的，只是在应用环孢素的第5-10天左右，随着用药时间延长，并不能连续增加MHC基因的表达。宿主各脏器应用用环孢素后，可能也是一过性地增加MHC基因的表达，由于我们是在实验结束时取各脏器测定，它们的升高趋势已经结束，因此与对照组相比无明显变化。环孢素抑制排斥反应是因为环孢素与胞内的环孢亲和素结为复合体，后者与钙调磷酸酶结合并抑制其酶活性，通过抑制胞浆NT-AT向胞核内移动，而干扰IL-2转录，最终阻断IL-2依赖性T细胞生长和分化。我们的实验表明，环孢素能一过性增加MHC基因的表达，可能的原因是环孢素引起某些细胞因子的升高，需要以后来证明。这是第一次提出关于环孢素能一过性增加MHC基因表达的结论。糖皮质激素作为免疫抑制药物用于临床器官移植的历史已经很长。目前认为它的作用机制是抑制移植免疫活性细胞在“识别阶段”向移植器官集聚并使其裂解，阻止了它们对移植器官上免疫抗原的识别。我们以新西兰白兔进行动物实验，应用实时定量RT-PCR的方法，系统全面研究新西兰白兔服用大剂量强的松后外周血单个核细胞和机体各脏器MHC分子mRNA表达变化情况。8只新西兰白兔随机分成两组，实验组5只，对照组3只。实验组5只新西兰白兔每天用理盐水溶解的强的松（20m g／kg）灌胃，对照组3只新西兰白兔每天以相同体积的生理盐水灌胃。实验组和对照组新西兰白兔连续灌胃8天。第4天和第8无菌抽取实验兔外周血1ml，分离单个核细胞，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。第8天实验结束取实验新西兰白兔肝脏、脾脏、肾脏和胸腺少许，应用实时定量PCR仪测定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表达。结果表明：外周血单个核细胞MHCⅠ基因表达在第4天和第8天明显降低，MHCⅡ基因mRNA表达用药后第4天下降，第8天明显降低；宿主各脏器包括肝脏、脾脏、肾脏和胸腺用药结束后MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达均较对照组降低。相比较而言，外周血单个核细胞在用药结束后MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达降低比宿主各脏器更明显。Giuliani C研究表明，糖皮质激素降低大鼠胸腺MHCⅠ基因表达。更早的研究表明，强的松抑制小鼠巨噬细胞MHCⅡ基因表达。我们的研究表明，糖皮质激素药物强的松能广泛降低宿主各脏器MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达，而降低外周血单个核细胞MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA表达更明显。因此认为可以用外周血单个核细胞代表宿主各脏器来研究宿主应用糖皮质激素后的变化情况。既然强的松能广泛降低宿主各脏器MHC基因mRNA表达，那么宿主进行器官移植后，移植器官作为宿主机体的一部分，糖皮质激素药物强的松也应该能降低移植器官脏器的MHC基因mRNA表达。这样看来，强的松能降低移植排斥反应所识别的靶抗原，也就是表达于移植物细胞表面的MHC基因mRNA表达，从而能部分有效地抑制急性移植排斥反应。
江科[10]（2006）在《血红素加氧酶-1在大鼠肺移植中的作用及机制》文中进行了进一步梳理第一部分大鼠同种异体原位肺移植模型的建立目的改进手术方式，建立一种更为简单有效的大鼠左肺原位移植模型。方法将雄性Wister和SD大鼠随机分为供体、受体两组，SD大鼠作为供体，Wister大鼠作为受体，采用经下腔静脉灌注和供肺原位切除，血管翻转改良的套管吻合技术完成供受体吻合。结果术后行胸部CT扫描显示移植肺肺复张良好，血气分析显示呼吸系统功能正常。术后12天手术成功率达88％。结论本研究应用的改良的手术方式是一种简单有效、实用的方法，可相对简捷有效地建立大鼠左肺原位移植模型。第二部分血红素加氧酶-1（HO-1）与供肺缺血再灌注损伤目的研究血红素加氧酶-1与供肺缺血再灌注之间的关系。方法在大鼠左肺原位移植模型的基础上，采用钴原卟啉（Cobalt protoporphyrin CoPP）HO-1最常用的诱导剂和锌原卟啉（Zinc protoporphyrin ZnPP）HO-1的抑制剂来调节HO-1的表达。将同系SD大鼠随机分为三组：（1）对照组：供体术前24小时腹腔注射生理盐水；（2）CoPP组：供体术前24小时腹腔注射CoPP（5mg/kg）；（3）ZnPP组：供体术前24小时腹腔注射ZnPP（10mg/kg）。分别在再灌注后1h、2h、4h、8h、12h时间点取标本，快速剪取移植肺脏，切成两半，一半用液氮速冻保存；另一半用10％浓度的甲醛固定，石蜡包埋。运用免疫组织化学技术检测HO-1蛋白在供肺组织中的表达情况；用TUNEL技术检测供肺中细胞凋亡的情况；用RT-PCR技术检测供肺中HO-1mRNA的表达。结果再灌注后1小时肺凋亡细胞数即开始升高，再灌注后4小时肺凋亡细胞数达到峰值，之后肺凋亡细胞数逐步下降。同时发现肺缺血再灌注时可诱导HO-1蛋白的表达，且随着再灌注时间的延长，表达逐步增多，再灌注8小时达到高峰；再灌注前使用HO-1蛋白的诱导剂CoPP预处理，可以诱导HO-1蛋白的表达上调；HO-1蛋白可以降低肺再灌注后细胞凋亡发生率。结论细胞凋亡参与了肺移植后缺血再灌注损伤，细胞凋亡与再灌注时间成动态变化，它是发生在肺移植术后早期的事件。供肺CoPP术前预处理可以诱导HO-1表达上调，HO-1过表达可以抑制肺移植缺血再灌注后出现的肺细胞凋亡，从而减轻供肺再灌注损伤。第三部分血红素加氧酶-1（HO-1）与肺移植急性排斥反应目的研究血红素加氧酶-1在肺移植急性排斥反应中的作用以及机制。方法建立大鼠同种异体原位肺移植模型，采用CoPP作为HO-1的诱导剂、采用ZnPP作为HO-1的抑制剂，调节HO-1的表达。实验分为三组：对照组、CoPP组和ZnPP组；供体术前24小时腹腔分别注射生理盐水、CoPP和ZnPP。每天观察移植肺的功能状态，于肺移植术后不同天数分别切取供肺，即术后3、6、9、12天留取标本。HE染色观察移植肺的排斥反应程度和级别；运用免疫组化技术定性判断HO-1蛋白在移植肺中的表达情况；western-blot定量检测HO-1蛋白在移植肺组织中的表达。结果HO-1蛋白表达在同种异体移植中明显强于同系移植，并且肺移植术后，随排斥反应加重，HO-1蛋白表达明显增强，主要在肺泡支气管周围、肺泡上皮细胞以及浸润的炎症细胞中表达。同对照组和ZnPP组相比，CoPP组的移植肺存活时间并未明显延长（平均存活时间对照组12.6天，ZnPP组10.2天，CoPP组14.7天，P＞0.05）。结论HO-1蛋白参与了肺移植后急性排斥反应的病理过程，随急性排斥反应程度加重，HO-1蛋白表达增强，HO-1蛋白的过表达可作为肺移植急性排斥反应的监测指标之一。术前CoPP预处理可以诱导HO-1表达上调，但HO-1过表达不能明显改善肺移植后的排斥反应，也不能明显延长供肺存活时间。
二、一氧化氮与移植器官排斥反应（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一氧化氮与移植器官排斥反应（论文提纲范文）
（1）缺血损伤相关的新生表位在器官移植术后体液性排斥中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 缺血损伤导致新生表位的产生 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 缺血损伤相关的新生表位在器官移植中的作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 新生表位诱导的移植术后体液性排斥反应的防治探讨 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 褪黑素对肾缺血再灌注损伤的作用及机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 抗体介导的排斥反应在器官移植中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（2）过表达sFgl2的MSCs调节巨噬细胞抑制小鼠心脏移植急性排斥反应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、小鼠脂肪来源MSCs分离、培养、鉴定及转染 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 主要实验仪器、器材及试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 小鼠脂肪来源的MSCs培养及鉴定 |
| 1.2.2 成功构建带有目的基因的慢病毒载体 |
| 1.2.3 体外转染,获得稳定表达sFgl2的MSCs |
| 1.2.4 转染不会影响MSCs细胞形态、表型、增殖及迁移能力 |
| 1.2.5 第一部分实验内容汇总 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 间充质干细胞与移植免疫 |
| 1.3.2 MSCs功能调节及转染 |
| 1.4 小结 |
| 二、sFgl2-MSCs对巨噬细胞功能及分化的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要实验仪器、器材及实验试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 小鼠心脏移植排斥反应过程中,M1 比例增加,M2 比例减少 |
| 2.2.2 SFgl2-MSCs对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 2.2.3 SFgl2-MSCs对巨噬细胞功能的影响 |
| 2.2.4 抗原刺激时,sFgl2-MSCs具有更强的促进巨噬细胞表面CD206 表达,抑制CD16/32表达的能力 |
| 2.2.5 外界抗原刺激时,sFgl2-MSCs通过JAK-STAT及 NF-κB通路影响巨噬细胞分化 |
| 2.2.6 SFgl2-MSCs对巨噬细胞诱导T细胞分化能力的影响 |
| 2.2.7 SFgl2-MSCs促进M2 型巨噬细胞细胞相关炎症抑制因子的表达 |
| 2.2.8 在LPS+IFN-γ刺激条件下,共培养处理后巨噬细胞对MVEC细胞凋亡的影响 |
| 2.2.9 第二部分结果汇总 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 巨噬细胞是参与急性免疫排斥反应的重要细胞 |
| 2.3.2 巨噬细胞与T细胞的相互作用 |
| 2.3.3 巨噬细胞与组织损伤 |
| 2.4 小结 |
| 三、sFgl2-MSCs可以缓解小鼠心脏移植模型急性排斥反应 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 主要实验仪器、器材及实验试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 SFgl2-MSCs治疗组小鼠,心脏研磨液及血清中sFgl2 表达增高 |
| 3.2.2 SFgl2-MSCs治疗组小鼠心脏移植物存活时间延长 |
| 3.2.3 SFgl2-MSCs显着抑制急性排斥反应,减少巨噬细胞浸润 |
| 3.2.4 SFgl2-MSCs治疗组中M2 型巨噬细胞比例增加,M1 型巨噬细胞比例减少 |
| 3.2.5 SFgl2-MSCs治疗组中炎症因子水平降低,抗炎因子水平升高 |
| 3.2.6 第三部分结果汇总 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 SFgl2-MSCs比 WT-MSCs有更强的抑制急性免疫排斥的功能 |
| 3.3.2 SFgl2-MSCs治疗组小鼠脾脏中M2 型巨噬细胞比例增加,M2 型巨噬细胞相关抗炎因子增加 |
| 3.3.3 SFgl2-MSCs治疗促进抗炎因子释放,抑制炎症因子的表达 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 单核-巨噬细胞与器官移植排斥的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）间充质干细胞在器官移植中的应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 MSC的免疫学特性 |
| 2 MSC在器官移植中的应用 |
| 2.1 利用MSC减轻免疫排斥反应 |
| 2.2 利用MSC诱导免疫耐受 |
| 2.3 利用MSC诱导组织损伤修复 |
| 2.4 利用MSC诱导新生血管形成 |
| 2.5 MSC在异种器官移植中的作用 |
| 3 小结与展望 |
（4）GDF-15的过表达通过Foxo3a信号通路在心脏移植冷缺血再灌注损伤中起保护作用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 心脏移植 |
| 1.2 缺血再灌注损伤的发生机制 |
| 1.2.1 缺血再灌注损伤后会造成线粒体功能的缺失 |
| 1.2.2 在缺血再灌注损伤过程中活性氧的过量产出 |
| 1.2.3 在缺血再灌注损伤过程中一氧化氮利用率的降低 |
| 1.3 心肌缺血再灌注损伤的保护 |
| 1.3.1 缺血的预调节 |
| 1.3.2 缺血后处理 |
| 1.3.3 远端缺血调节 |
| 1.4 Growth differentiation factor 15 (GDF-15) |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要药品与试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞系与细胞培养 |
| 2.2.2 缺血再灌注心脏移植动物模型 |
| 2.2.3 动物模型分组 |
| 2.2.4 体外缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 2.2.5 体外实验分组 |
| 2.2.6 树突状细胞（DC）的培养 |
| 2.2.7 T 细胞的培养 |
| 2.2.8 si RNA转染 |
| 2.2.9 腺病毒转染 |
| 2.2.10 Reverse transcriptase –polymerase chain reaction (RT-PCT) and quantitative PCR (q PCR) |
| 2.2.11 Western Blot Analysis |
| 2.2.12 组织学分析 |
| 2.2.13 TUNEL染色 |
| 2.2.14 Myeloperoxidase (MPO) Activity |
| 2.2.15 免疫组化染色和半定量分析 |
| 2.2.16 用Incucyte system系统对细胞进行实时定量的细胞死亡分析 |
| 2.2.17 Annexin V/Propidium Iodide (PI) Staining |
| 2.2.18 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 在移植的冷缺血再灌注损伤过程中GDF-15 起到保护作用 |
| 3.2 GDF-15 能减少移植心脏细胞的凋亡并且减少炎性因子前体的产生 |
| 3.3 GDF-15 在冷缺血再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡的过程中起到保护作用 |
| 3.4 在心肌细胞的冷缺血再灌注过程中GDF-15 是通过Foxo3a信号通路来实现对心肌细胞的保护作用的 |
| 3.5 GDF-15 可影响受体小鼠体内DC的成熟与功能 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）宿主树突状细胞在器官移植中的来源与功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 英文缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 2 宿主DC与供体DC的动力学研究 |
| 2.1 方法与材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 移植手术 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 流式细胞样品准备及染色 |
| 2.1.6 光子活体显微镜(2PIM)检测 |
| 2.1.7 数据分析与统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 心脏移植模型 |
| 2.2.2 肾脏移植模型 |
| 2.2.3 免疫抑制药物(环保霉素A)对上述现象的影响 |
| 2.3 小结 |
| 3 宿主DC来源的研究 |
| 3.1 方法与材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 移植手术 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 流式细胞样品准备及染色 |
| 3.1.6 光子活体显微镜(2PIM)检测 |
| 3.1.7 数据分析与统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 心脏移植模型 |
| 3.2.2 肾脏移植模型 |
| 3.3 小结 |
| 4 宿主Mono-DC迁入移植器官机制的研究 |
| 4.1 方法与材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 移植手术 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 流式细胞样品准备及染色 |
| 4.1.6 光子活体显微镜(2PIM)检测 |
| 4.1.7 骨髓嵌合体模型的建立 |
| 4.1.8 数据分析与统计学方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 骨髓嵌合体受体小鼠细胞重建效果 |
| 4.2.2 心脏移植模型中两种单核细胞迁入移植器官的竞争情况 |
| 4.2.3 肾脏移植模型中两种单核细胞迁入移植器官的竞争情况 |
| 4.3 小结 |
| 5 宿主Mono-DC功能的研究 |
| 5.1 方法与材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 移植手术 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 流式细胞样品准备及染色 |
| 5.1.6 双光子活体显微镜(2PIM)检测 |
| 5.1.7 骨髓嵌合体模型的建立 |
| 5.1.8 树突状细胞(DC)培养 |
| 5.1.9 效应T细胞制备 |
| 5.1.10 效应T细胞荧光标记 |
| 5.1.11 数据分析与统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 骨髓嵌合体受体小鼠细胞重建效果 |
| 5.2.2 肾脏移植模型中两种DC与特异性Teff之间的相互作用 |
| 5.2.3 宿主Mono-DC帮助Teff从移植肾脏血管中迁出到组织中 |
| 5.3 小结 |
| 6 讨论 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 8.1 前言 |
| 8.2 哪种DC在肾移植免疫反应中起到了主导作用? |
| 8.3 是什么激活了宿主DC? |
| 8.4 其他固有免疫细胞 |
| 8.5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
（6）诱导受体产生一氧化碳减轻小鼠移植心缺血再灌注损伤和排斥反应的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 正文 |
| 第一部分 应用Tail-cuff技术改良小鼠颈部异位心脏移植模型 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 诱导受体产生一氧化碳减轻小鼠移植心的冷缺血再灌注损伤 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 诱导受体产生一氧化碳经PI3K/Akt信号途径抑制冷缺血再灌注诱导的移植心细胞凋亡 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 诱导受体产生一氧化碳减轻同种移植心排斥反应不依赖于Foxp3表达的上调 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 附录1 英文缩略词表及中文对照 |
| 附录2 攻读博士期间发表的论文目录 |
| 致谢 |
（7）同种排斥CD4+T细胞差异表达基因筛选及PAE抗移植排斥作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 论文正文 |
| 第一部分 同种排斥CD4~+T细胞差异表达基因的筛选 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 PAE抗移植排斥作用的研究 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文以及参与承担的科研课题 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（8）外周血淋巴细胞MHC-I在急性移植排斥反应中的变化规律（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 外周血淋巴细胞MHC-I mRNA表达与急性排斥的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 免疫抑制剂剂量对外周血淋巴细胞MHC-I mRNA表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录与附图 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 发表论文一 |
| 发表论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）外周血单个核细胞MHC基因表达与早期急性移植排斥的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文 |
（10）血红素加氧酶-1在大鼠肺移植中的作用及机制（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、前言 |
| 四、正文 |
| 第一部分 大鼠同种异体原位肺移植模型 |
| 第二部分 血红素加氧酶系统与供肺缺血再灌注损伤 |
| 第三部分 血红素加氧酶系统与肺移植早期急性排斥反应 |
| 五、结论 |
| 六、综述 |
| 七、致谢 |
四、一氧化氮与移植器官排斥反应（论文参考文献）
- [1]缺血损伤相关的新生表位在器官移植术后体液性排斥中的作用及机制研究[D]. 刘浩. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]过表达sFgl2的MSCs调节巨噬细胞抑制小鼠心脏移植急性排斥反应研究[D]. 王小东. 天津医科大学, 2019(02)
- [3]间充质干细胞在器官移植中的应用研究进展[J]. 曲泽澎,贾兆锋,黄曦,蔡志明,牟丽莎. 器官移植, 2018(05)
- [4]GDF-15的过表达通过Foxo3a信号通路在心脏移植冷缺血再灌注损伤中起保护作用[D]. 张艺馨. 吉林大学, 2017(11)
- [5]宿主树突状细胞在器官移植中的来源与功能[D]. 庄权. 中南大学, 2014(02)
- [6]诱导受体产生一氧化碳减轻小鼠移植心缺血再灌注损伤和排斥反应的机制研究[D]. 张松林. 华中科技大学, 2010(11)
- [7]同种排斥CD4+T细胞差异表达基因筛选及PAE抗移植排斥作用的研究[D]. 王丹. 山东大学, 2010(08)
- [8]外周血淋巴细胞MHC-I在急性移植排斥反应中的变化规律[D]. 万芙荣. 山东大学, 2008(12)
- [9]外周血单个核细胞MHC基因表达与早期急性移植排斥的研究[D]. 李向东. 山东大学, 2007(03)
- [10]血红素加氧酶-1在大鼠肺移植中的作用及机制[D]. 江科. 华中科技大学, 2006(03)